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CN1167795C - 肽、dna及抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抑制老化活性的多肽；编码该多肽的DNA；用该DNA改良家畜的方法；将该DNA插入到载体中得到的重组DNA；含有该重组体的转化体；用该转化体生产本发明多肽的方法；识别抗多肽的抗体；本发明多肽的配体；抑制本发明的多肽与其配体进行特异结合的化合物；增加编码本发明老化抑制多肽的老化抑制基因表达的化合物；包含上述DNA碱基序列中10-50个碱基序列的寡核苷酸；以及应用它们的早老症治疗药、成人病治疗药或老化抑制药。

Description

肽、DNA及抗体
技术领域
本发明涉及一种新型的抑制动物老化的多肽、编码这种多肽的DNA、识别这种多肽的抗体、与本发明的多肽相对应的配体、抑制本发明的多肽与配体特异性结合的化合物、并涉及一种能增加编码本发明抑制老化多肽的抑制老化基因表达的化合物。
背景技术
老化现象是随着年龄的增加而出现的进行性的个体功能及外在的变化，它意味着个体的退化。已知，伴随着老化各种成人疾病的发病率增加。因此期待以某种方式控制老化的药剂能成为成人疾病的治疗药、预防药或者成为对抗功能及外在性退化的保护药和预防药。到目前为止尚无科学证明具有该效果的药剂。
从世界范围来看，在基因水平研究个体的老化才刚刚开始，到目前为止，与个体老化相关的分子基因学的信息尚未见报道。但是已知几种遗传性早期老化症，有代表性的维尔纳综合征、郝-吉二氏病(早老症)综合征(凸额)、唐氏综合征、特纳综合征、路易巴综合征、罗-汤综合征等(藤木大三郎编：老化的机制及控制、IPC，1993年)。
已鉴定出与维尔纳综合征相关的基因[科学， 272，258(1996)]。考虑维尔纳综合征的原因基因为螺旋酶(helicase)，在维尔纳综合征患者的基因中发现各种变异。在该疾病患者体内，因为该基因发生变异，因此不能产生正常的螺旋酶蛋白质，因为该蛋白质的机能未表达，因此出现早期老化症状。
由以上可知，存在与老化相关的基因，由于该基因的变异促进了老化。因为还存在与其它遗传性早期老化症相关的原因基因，因此认为有多种基因与老化相关。
基因与老化相关基因的功能丧失而产生早老症状，那么应用补充该基因功能的方法，即，施与该基因编码的蛋白产物或者通过基因治疗来表达这些产物等治疗方法将是有益的。另外，若除遗传性早老症之外的老化能被控制的话，那么出现的与老化密切相关的各种成人疾病就能得到治疗和预防。
本发明的基因不同于人维尔纳综合征的原因基因。
发明内容
随着老化成人疾病的发生频度增加，但到目前为止尚没有方法来治疗、预防和诊断疾病，保护、预防、诊断伴随老化而出现的功能性、外在性退化以及治疗和诊断早期老化症。本发明对这些方法有益。
本发明涉及具有抑制包括人在内的动物老化的活性多肽；包含该多肽的早期老化症的治疗药、成人疾病的治疗药或老化抑制药物；编码该多肽的DNA；含有该DNA的早期老化症的治疗药、成人疾病治疗药物或老化抑制药物；应用该DNA改良家畜的方法；将该DNA插入载体所得到的重组DNA；含有该重组体的转化体；应用该转化体生产本发明多肽的方法；识别该多肽的抗体；应用该抗体对本发明的多肽进行定量的方法或诊断老化的方法；寻找本发明多肽配体的方法；有关配体；筛选抑制该配体与本发明多肽进行特异性结合的化合物的方法；以及用这种筛选方法所得到的化合物。
可参照下面的工程1～7来制备本发明的多肽。
(工程1)
应用转基因小鼠，如应用导入了外来基因如连接到人伸长因子-1α启动子(FE-1α启动子)的Na+/H+反相转运子等外来基因的纯合子转基因小鼠(特开平5-268856)，从这些小鼠的纯合子中找出具有显著早老症的小鼠。以下将导入到转基因小鼠成为标志物的外来基因称作导入基因。导入基因只要是导入小鼠中能检测出的基因就可以应用。
显示早老症状的小鼠表现为小鼠高发寿命缩短、青少年动脉硬化、骨质疏松、腺组织萎缩、神经细胞减少等症状。具体而言，可应用在第18次日本分子生物学年会(锅岛等，2K-02，1995)报告的显示早老样症状的小鼠。
显示该早老样症状的小鼠，具有以下观察结果中所显示的特性。
[观察例1]外观：老化小鼠的纯合子(8-9周龄)体长约4cm，明显小于同周龄的野生型小鼠(约6cm)。此外，与躯干的长度相比，头部的比例大。老化小鼠(8周龄，雄性)虽然躯体矮小但体毛的光泽、四肢的甲未见异常，行动也正常。
关于寿命
1)出生后3周左右开始出现成长停止，逐渐地活动性降低。
2)寿命缩短：平均寿命是雄性8.0±0.9周(n＝13)、雌性9.3±0.9周(n＝13)，这些小鼠出现典型的早老症状，到出生后15周左右全部死亡。
以下是应用8周龄左右的纯合子雄性、雌性各5只及其同胞生的野生型小鼠雄性、雌性各4只，将其解剖进行肉眼观察后，依照常规的方法(渡边庆一、中根一穗编，酶抗体法，学际企画，1992年，修订3版)进行甲醛固定，石蜡包埋，超薄切片，HE染色后进行病理观察。(以下一直到观察例12，均用同一方法进行观察。)
[观察例2]下垂体的病理观察：可看到嗜酸性细胞减少。下垂体的嗜酸性细胞是产生生长激素(Growth Hormone，GH)或催乳素(Prolactin，PRL)的细胞，但是其数目减少。已知高龄者的GH分泌低下。
[观察例3]性腺的病理观察：可看到性腺显著萎缩，表明不生育。雄性个体中肉眼可观察到睾丸显著萎缩。输精管的直径萎缩到野生型的1/3左右，精子成熟只发展到精母细胞的粗线期，但根本没见到精子。雌性个体中可肉眼看到卵巢和子宫显著萎缩。卵子成熟只发展到初级卵泡，但未看到顶级卵泡和黄体。
[观察例4]颌下腺的病理观察：正常雄性个体的线状部位有大量的嗜酸性颗粒，但在纯合体中线状部的细胞长度大大降低，几乎看不到嗜酸性细胞。
[观察例5]肾脏的病理观察：可看到输尿管上皮、肾小球囊壁有矿石沉着。肾小球囊壁为扁平上皮。
[观察例6]血管系统的病理观察：首先，纯合体的动脉硬化显著。胸主动脉的直径不规则，可看到中膜高度矿化，内膜肥厚。在肾动脉等中血管以至到实质脏器内的小血管均可看到以中膜矿化和内膜肥厚为主的动脉硬化。特别是肾实质内血管中膜矿化尤为显著，但肾小球体和输尿管基本正常。通过Kossa染色可以确认沉着物明确为Ca2+。在高龄者中常看到大动脉中膜矿化。
[观察例7]肺组织的病理观察：伴随肺泡壁破坏的肺泡结构破坏显著。可看到肺泡壁上有矿石沉着。
[观察例8]软组织、软骨的观察：气管粘膜固有层、胃粘膜固有层、粘膜筋膜、肺泡上皮上有石灰沉着。胃底腺细胞及粘膜下结缔组织、肌肉上有矿石沉着。胃粘膜的矿化与在长期饲养的大鼠、小鼠中所见到的类似。此外在一些个体中也可看到心脏的僧帽状环形矿化。僧帽状轮样石灰化是高龄者的特征性表现。另外，在关节软骨、气管软骨、肋软骨上也可看到石灰沉着。这类软骨的石灰化常在高龄者中看到。
[观察例9]骨组织病理观察及X线观察：股骨远端干骺端的骨密度上升，软骨骺肥厚。在关节软骨中可看到软骨细胞的不规则石灰沉着像。股骨、胫骨的X线显示X线的透射度增加，表明骨盐密度降低。通过测定实际骨盐密度将骨干部、胫骨远端、股骨近端的骨盐密度相比发现前者最多约降低到一半。组织学显示皮质骨显著降低。但是，在胫骨远端和股骨远端的干骺端，初级海绵骨例外地增生，只在该部分骨盐密度反而上升。
[观察例10]小脑的病理观察：可看到小脑神经细胞层的浦肯野细胞数目减少和孤立性坏死，轴索膨胀。已知，在小脑内，伴随着老化浦肯野细胞减少，与之相伴的是轴索突起膨胀。
[观察例11]肝脏的病理观察：几乎看不到嗜酸的染色的糖元颗粒。与正常细胞相比，肝细胞的细胞质稍微缩小。
[观察例12]胸腺的病理观察：胸腺显著缩小，有的肉眼无法确认。
(工程2)
从显示早老样症状的小鼠中分离、分析由导入的基因所破坏的失活了的染色体，将该染色体区存在的DNA进行克隆。
(工程3)
确定该DNA在正常小鼠各组织中的表达状态，在显示早老症状的小鼠中基本不表达的就可确认为早老症状的原因基因(以下称作老化抑制基因)。
(工程4)
从人等cDNA文库中筛选出与这种小鼠老化抑制基因具有高度同源性的基因进行克隆化，确定出人类等的老化抑制基因。
(工程5)
应用基因重组技术，通过常规方法，使人、小鼠等的老化抑制基因在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳类细胞中表达，这样就可生产、蓄积该基因所编码的多肽。
(工程6)
用常规方法纯化所蓄积的多肽，以这种多肽作免疫原，应用大鼠、小鼠、兔子、绵羊、豚鼠、马、牛、猴子等获得这种多肽的抗体。
(工程7)
确证该抗体能够识别大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳类细胞等所生产、蓄积的多肽。
以下对本发明进行详细说明。
本发明的DNA为能够编码具有抑制老化活性的多肽的DNA，例如，可以为编码具有序列号1、2、3、4和5中所选氨基酸序列的多肽的DNA；或者是能够编码这样肽的DNA，该肽含有的氨基酸序列是具有序列号1、2、3、4和5中所选氨基酸序列的多肽的氨基酸序列中有一个以上的氨基酸缺失、置换或增加，且该肽具有抑制老化的活性；或者在严格条件下能与该DNA进行杂交的DNA。
这种在严格条件下能进行杂交的DNA是指以编码具有抑制老化活性多肽的DNA为探针，应用集落杂交法、噬斑杂交法或蛋白质印迹法而得到的DNA。具体而言，集落或噬斑杂交而来的DNA可这样进行鉴定：应用固定了的滤膜，在0.7～1.0M NaCl存在的条件下，65℃杂交之后，用0.1-2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为150mM氯化钠、15mM枸橼酸钠)，在65℃条件洗涤滤膜。可参照《分子克隆：实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory manual)第2版(Sambrook、Fritsch、Maniatis编辑，冷泉港实验室出版)，1989年出版(以下简称分子克隆第2版)所记载的方法进行杂交。可以杂交的DNA的特殊实例为与编码具有从序列号1、2、3、4和5中所选氨基酸序列多肽的DNA的碱基序列至少有60％以上的同源性的DNA，优选具有80％以上同源性的DNA，最优选具有95％以上同源性的DNA。
本发明的寡核苷酸可以为含有与含有上述DNA碱基序列的一部分碱基序列相同的碱基序列或互补碱基序列的寡核苷酸，例如含有与从序列号6～10所选DNA的碱基序列中的连续5～60个残基、优选10～50个残基的碱基序列相同的碱基序列或互补碱基序列的寡核苷酸及该寡核苷酸的衍生物。
本发明的多肽是上述DNA所编码的多肽，具体而言是含有从序列号1、2、3、4和5中代表的氨基酸序列所选的氨基酸序列的多肽，或者这种多肽含有的氨基酸序列是具有从序列号1、2、3、4和5代表的氨基酸序列中所选氨基酸序列的多肽的氨基酸序列中有一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加了的氨基酸序列，且这种多肽具有抑制老化的活性。
具有多肽的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加了的氨基酸序列，且具有抑制老化活性的肽的制备可按照核酸研究，10，6487(1982)、美国国家科学院院刊， 79，6409(1982)、美国国家科学院院刊， 81，5662(1984)、科学， 224，1431(1984)、PCT WO 85/00817(1985)、自然， 316，601(1985)、基因，34，315(1985)、核酸研究， 13，4431(1985)、现代分子生物学技术方法(Current Protocols in Molecular Biology)，8章克隆DNA的诱变，John Wiley & Sons，Inc.(1989)等所记载的方法进行。
本发明的抗体是可以识别上述多肽的抗体。
本发明的配体指与本发明的多肽进行特异结合的分子，只要是能与本发明的多肽进行特异性结合的分子均可用作本发明的配体。
以下为编码本发明的具有抑制老化活性多肽的DNA的制备方法。1)与基因导入部位相邻小鼠染色体DNA的克隆
(i)导入基因的检测
导入基因多拷贝整合到转基因小鼠中，但通常以前后顺序插入到染色体DNA上的一个部位。
为了确认在显示上述早老样症状的小鼠中导入基因的插入部位为一个部位，用对导入基因没有酶切作用的限制性内切酶( EcoRV、 XbaI等)消化分别从野生型、杂合体、纯合体肝脏制备的染色体DNA，以导入基因的全长作探针进行Southern印迹。
通过Southern印迹法证实在杂合体、纯合体中检测出单一信号，表明导入基因只插入到小鼠染色体上的一个部位。
另外，可通过以导入基因作探针进行荧光原位杂交法(Fluorescencein situ hybridization：FISH)来进行确认。
(ii)与基因导入部位相邻小鼠染色体DNA的克隆可如下进行。
如果插入到转基因小鼠的导入基因中含有pUC等质粒载体的时候，可用质粒拯救的方法。
即，用任意的对该质粒载体无切断作用的限制性酶消化纯合体的染色体DNA，自身环化后转染大肠杆菌，只有包含含有来源于质粒载体的耐药基因(如氨苄青霉素耐药基因等)的质粒的自身环化DNA的大肠杆菌在选择培养基上形成集落。从该大肠杆菌中所得质粒可能包含所导入的基因本身和与该基因相邻的小鼠染色体DNA的片段。
以拯救的质粒所包含的小鼠染色体DNA部分的片段作探针，用与上述Southern印迹所用的同样的膜进行Southern印迹，以确认与导入基因相邻的部分来源于小鼠染色体DNA的片段。即，可以确定在野生型小鼠中只见到野生型等位基因(wild allele；以下以+表示野生型等位基因)的信号，在纯合体中只见到变异型等位基因(mutant allele，以下有时以pg表示)的信号，在杂合体中可看到来源于双方等位基因的信号。
除拯救法以外还可应用常规的染色体DNA克隆化的方法。即，用限制性酶消化染色体DNA，用质粒载体或噬菌体载体将该酶切片段克隆化，制成文库。以导入基因片段作探针，用与上述拯救方法同样的方法，通过从该文库中筛选来进行与基因导入部位相邻的小鼠染色体DNA的克隆化。
2)来源于小鼠的老化抑制基因的克隆
用通过染色体DNA克隆化法或拯救法所得的质粒所包含的小鼠染色体DNA部分的片段作探针，按照添付的手册筛选野生型小鼠基因组文库(Stratagene，mouse genomic library，λFIXII)可得到与探针进行杂交的噬菌体克隆。
为了鉴定老化抑制因子，以染色体DNA克隆化法或拯救法所得质粒包含的小鼠染色体DNA部分为中心，按照常规方法顺序检测碱基序列。
已知基因的第1外显子和第2外显子多存在于CpG岛(BruceAlberts等，细胞分子生物学，中村桂子、松原谦一翻译，教育社，昭和60年4月25日)，所以在检测碱基序列的时候要确定CpG岛区域。用合适的限制性酶，如 SacII等酶切用染色体DNA克隆化法或拯救法取得的质粒中所包含的小鼠染色体DNA部分，使之含有CpG岛。
观察不到CpG岛区域的时候，要用外显子捕获法(例如外显子捕获系统(GIBCO BRL))或者应用预测碱基序列的外显子部分的计算机软件(例如HEXON：因特网上的Human Genome Center，BaylorCollege of Medicin，Houston，网址为http：//dot.imgen.bcm.tmc.edu：9331/gene-finder/gf.html，用它来作为TX基因结构分析的位点)来预测外显子部分，可以用限制性酶分离认为含有外显子的DNA片段。
可通过以下方法确定该DNA片段与老化抑制基因相关。
用α-[32-P]-dCTP标记该DNA片段，例如可用Megaprime DNA标记试剂盒(Amersham公司)等进行。
以这种标记的DNA作探针，应用小鼠心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、脾脏的poly(A)+RNA滤膜[Mouse Multiple TissueNorthern Blots的滤膜(Clontech)]，按照Hybond N+手册的条件进行Northern杂交(Northern hybridization)。
通过Northern杂交，鉴定出获得带的组织。
从野生型、纯合体和杂合体小鼠中获取上述鉴定出的组织，用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司制备)从该组织中制备poly(A)+RNA。
将从各小鼠组织中获得的RNAs进行电泳后，按常规的方法转移到Hybond N+滤膜上，以上述标记的DNA片段作探针，进行与上述相同的Northern杂交。
通过Northern杂交所得的带可以确定在纯合体中的表达不同于在野生型及杂合体内的表达。异常表达的例子是没有检测出带，完全没有表达。通过这种确定可以证实限制性酶切断的DNA片段与老化抑制因子相关。
然后从野生型小鼠中取出上述鉴定出的组织，按照常规的方法用该组织制备cDNA文库。例如，应用cDNA Synthesis System(GIBCOBRL)从野生型小鼠的肾脏poly(A)+RNA合成cDNA，在其两端附加EcoRI-NotI-SalI衔接头(SuperScript Choice System forcDNA Synthesis；GIBCO BRL公司)之后，插入到克隆化载体λZAP II[λZAP II Cloning Kit(STRATAGENE公司)的EcoRI部位，就可制备成cDNA文库。
制备cDNA文库时所应用的克隆化载体，只要是在大肠菌K12中能自主复制，噬菌体载体、质粒载体均可应用。具体而言，可用ZAPExpress[Strategene公司，Strategies， 5，58(1992)]、pBluescriptII SK(+)[核酸研究， 17，9494(1989)]、λZAP II(Stratagene公司)、λgt10、λgt11[DNA克隆化，实用方案， 1，49(1985)]、λTriplEx(CloneTech公司)、λExCell(Pharmacia公司)、pT7T318U(Pharmacia公司)、pcD2[H.Okayama and P.Berg；分子细胞生物学， 3，280(1983)]等。
作为宿主微生物，只要是属于大肠杆菌的微生物任一种均可应用。适宜的为 大肠杆菌XL1-Blue等。
具体而言，可应用 大肠杆菌XL2-Blue、 大肠杆菌XL1-BlueMRF′[STRATAGENE公司，策略， 5，81(1992)]、 大肠杆菌C 600[R.K.Appleyard；遗传学， 39，440(1954)]、 大肠杆菌Y 1088[R.A.Young和R.W.Davis；科学， 222，778(1983)]、 大肠杆菌Y 1090[R.A.Young和R.W.Davis；科学， 222，778(1983)]、 大肠杆 菌NM 522[J.A.Gough与N.E.Murray；分子生物学杂志， 166，1(1983)]、 大肠杆菌K 802[W.B.Wood；分子生物学杂志， 16，118(1966)]、 大肠杆菌JM 105[L.J.Reha-Kranta；基因， 38，275(1985)]、 大肠杆菌DH1、 大肠杆菌MC 1000等。
cDNA文库的制作实例为应用cDNA合成系统(cDNA SynthesisSystem，GIBCO BRL公司)从野生型小鼠的肾脏poly(A)+RNA合成cDNA，在其两端附加衔接头 EcoRI- NotI- SalI(SuperScriptChoice System for cDNA Synthesis，GIBCO BRL公司)之后插入到克隆化载体λZAP II(λZAP II Cloning Kit；STRATAGENE公司)的 EcoRI部位制成cDNA文库。
用上面标记的DNA片段作探针，按常规方法进行集落或噬斑杂交，筛选该cDNA文库。
按常规方法从通过筛选而获得的克隆(转化体)中分离老化抑制基因，按常规方法，如按Sanger等的双脱氧法[美国国家科学院院刊， 74，5463(1977)]测定基因序列。利用碱基序列自动分析装置，如应用Applied Biosystems公司的373A DNA测序仪进行碱基序列的分析。
如此决定出的老化抑制基因的序列的例子是含有序列号8中所示序列的DNA。包含含有该DNA的质粒pNKM 101的大肠杆菌ENKM 101以FERM BP-5765于1996年12月5日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)。
另外，可以所测定的DNA的碱基序列为基础，利用DNA合成仪通过化学合成来制备上述所获得的DNA。
当用硫代磷酸法合成DNA的时候，可用岛津公司制备的DNA合成仪；当用亚磷酰胺法时可利用Perkin Elmer公司的392型合成仪。以下测定了序列的本发明的DNA也同样可用DNA合成仪进行合成。
此外，可用与选自序列号6～10所记载的DNA的DNA碱基序列中连续10～50个碱基具有相同序列的DNA作为有义引物，以含有与该DNA互补序列的DNA作反义引物，以由表达该DNA互补mRNA细胞的mRNA所制备的cDNA作模板，进行PCR，以制备本发明的目的DNA。有义引物和反义引物，优选应用二者的融解温度(Tm)和碱基数没有太大差异的上述寡核苷酸。
由上面所得老化抑制因子编码的多肽的例子为含有序列号3中所示序列的多肽。
3)小鼠分泌型老化抑制基因cDNA的克隆
应用上面(2)或下面(4)中所得的老化抑制基因可获得小鼠的分泌型老化抑制基因。具体而言可用如下方法获得。
参考由人肾脏poly(A)+RNA所得序列号2中所示氨基酸序列与序列号1中不同的第535-549号氨基酸序列，以编码与本序列具有同源性氨基酸序列的合成DNA作引物，用5′RACE法从人肾脏的cDNA文库进行筛选。用与上面相同的方法对所得cDNA片段进行基因分离和碱基测序。
碱基序列与序列号2同源性高的基因可作为目的性小鼠分泌型老化抑制基因。例如可以是含有序列号9中所示序列的DNA。另外，作为基因编码的多肽的例子是含有序列号4中所示序列的多肽。
包含含有该DNA的质粒pNKM 112的大肠杆菌ENKM 112以FERM BP-6184于1997年11月28日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)。
4)人老化抑制基因cDNA的克隆
(i)应用上面所获得的小鼠老化抑制基因，按照如下所示的方法，可获得其他动物，如人的老化抑制基因。
用α-[32P]-dCTP标记上面所获得的包含小鼠老化抑制基因的DNA片段，如用Megaprime DNA标记试剂盒(Amersham)进行标记。
从动物的目的组织，如人肾脏或人海马组织、用与上面小鼠时同样的方法制作cDNA文库。
以上面标记的DNA片段作探针，进行集落或噬斑杂交，筛选该cDNA文库。
用与上面小鼠时同样的方法，对通过筛选所获得的克隆(转化体)进行基因分离、碱基测序。
该碱基序列与小鼠老化抑制基因的碱基序列的同源性较高，可作为目的动物的老化抑制基因。
该基因序列的例子为含有人肾脏来源的序列号6或7所示序列的DNA。含有包含该DNA的质粒pNKM 103的大肠杆菌ENKM 103和含有质粒pNKH 106的大肠杆菌ENKH 106分别以FERM BP-5942和FERM BP-5767于1997年5月15日和1996年12月5日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编号305)。
(ii)应用如上所得的动物老化抑制基因，按以下所示的方法，可获得该动物其他组织来源的或其动物来源的老化抑制基因的cDNA。
以α-[32P]-dCTP，如使用Megaprime DNA标记试剂盒(Amersham公司)标记含有上面所得老化抑制基因的DNA片段，当作探针。或者应用适当的引物系列，以目的动物的组织，如人脾脏来源的RNA和cDNA文库作模板进行PCR反应，用上面的同位素标记扩增出的DNA片段，或用地高辛配体(DIG)，如应用DIG DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司)进行标记，用作探针。引物系列中尤为合适的为含有序列号19和序列号20中所示碱基序列的合成DNA。
用上面标记的DNA片段作探针，对动物的目的组织，如人胰脏的cDNA文库进行集落或斑点杂交，以筛选该cDNA文库。
用与上面小鼠、人相同的方法，从通过筛选而获得的克隆(转化体)进行基因分离、碱基测序。
该碱基序列与小鼠或人老化抑制基因的碱基序列的同源性高，认为是与目的动物的老化抑制基因相同的基因。
该基因序列的例子为含有来源于人胰脏的序列号10所示序列的DNA。包含含有该DNA的质粒pPYHH 02的大肠杆菌XL1-Blue/pRYHH 02，以FERM BP-6193，于1997年12月4日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)。
5)抑制老化多肽的生产
为了让如上所得的老化抑制基因在宿主细胞中表达，首先用限制性酶类或DNA分解酶类酶切含有老化抑制基因的DNA片段，获得含有编码老化抑制多肽的DNA的适宜长度的DNA片段，之后，将其插入到表达载体中启动子的下游，然后将插入了上述DNA的表达载体导入适合表达载体的宿主细胞。
作为宿主细胞，只要能表达目的基因，任一种均可应用。例如可以应用属于埃希杆菌属、沙雷菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、微杆菌属的原核生物，克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母菌、丝孢酵母属、许旺酵母属的酵母和动物细胞宿主等。
作为表达载体可以应用那些能在上述宿主细胞中进行自主复制的、或者能整合到染色体中且在老化抑制基因转录的位置上含有启动子。
当用细菌等原核生物作宿主细胞的时候，优选的老化抑制基因表达载体是在原核生物中能进行自主复制，同时又是由启动子、核糖体结合序列、老化抑制基因、转染终止序列构成的重组载体。最好含有启动子调控基因。
表达载体的实例为pBTrp 2、pBTacl、pBTac 2(均购自Boehringer Mannheim公司)、pKK 233-2(Pharmacia公司)、pSE 280(Invitrogen公司)、pGEMEX-1(Promega公司)、pQE-8(QIAGEN公司)、pKYP 10(特开昭58-110600)、pKYP 200[农业生物化学， 48，669(1984)]、pLSA1[农业生物化学， 53，277(1989)]、pGEL1[美国国家科学院院刊， 82，4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司)、pGEX(Pharmacia公司)、pET-3(Novagen公司)、pTerm 2(US 4686191、US 4939094、US 5160735)、pSupex、pUB 110、pTP 5、pC 194等。
作为启动子只要是能在大肠杆菌等宿主细胞中表达就可应用。例如，可以应用 trp启动子(P trp)、 lac启动子(P lac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来源于大肠杆菌和噬菌体的启动子和SPO1启动子、SPO2启动子、pen启动子等。另外也可应用将2个P trp连接在一起的启动子(P trp×2)、 tac启动子、letI启动子、lacT7启动子等人为设计改变了的启动子。
作为核糖体结合序列，只要是能在大肠杆菌等宿主细胞中表达均可应用，但优选应用能将Shine-Dalgarno序列与起始密码子间调整到适当距离(例如6-18个碱基)的质粒。
虽然转录终止序列对本发明老化抑制基因的表达并非必要，但优选在结构基因的正下游配置转录终止序列。
可用属于埃希杆菌属、沙雷菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属的微生物作宿主细胞。例如应用 大肠杆菌XL1-Blue、 大肠杆菌XL2-Blue、 大肠杆菌DH1、 大肠杆菌MC 1000、大肠杆菌KY 3276、 大肠杆菌W 1485、 大肠杆菌JM 109、 大肠杆菌HB 101、 大肠杆菌No.49、 大肠杆菌W 3110、 大肠杆菌NY 49、 枯草 芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 产氨短杆菌、 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14068、 解糖短杆菌ATCC 14066、 谷氨酸棒状 杆菌ATCC 13032、 谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067、 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869、 嗜醋酸棒状杆菌ATCC 13870、 嗜氨微杆菌ATCC 15354等。
任何一种将DNA导入上述宿主细胞的方法均可用于导入重组载体的方法，例如应用钙离子的方法[美国国家科学院院刊， 69，2110(1972)]、原浆法(特开昭632483942)或应用基因 17，107(1982)和分子与普通遗传学 168，111(1972)中所记载的方法等。
若应用酵母菌株作宿主细胞的时候，作为表达载体可以应用YEp 13(ATCC 37115)、YEp 24(ATCC 37051)、YCp 50(ATCC37419)、pHS 19、pHS 15等。
作为启动子只要能在酵母菌株中表达无论哪种均可，例如可应用PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
作为宿主细胞可以应用啤酒糖酵母( Saccharomyces  cerevisae)、粟酒裂殖糖酵母( Schizosaccharomyces  pombe)、乳克鲁维氏酵母( Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母( Trichosporon  pullulans)，河岸许旺氏酵母 Schwanniomyces  alluvius等。
将DNA导入酵母的方法均可用作导入重组载体的方法，例如可应用电穿孔法[酶学方法， 194，182(1990)]、原生质球法[美国国家科学院院刊， 75，1929(1978)]、醋酸锂法[细菌学杂志(J.Bacteriol.)153，163(1983)]、美国国家科学院院刊 75，1929(1978)等方法。
用动物细胞作宿主细胞的时候，可用pcDNAI、pcDM8(购自Funakoshi公司)、pAGE 107[特开平3-22979；细胞工程学， 3，133，(1990)]、pAS 3-3(特开平2-227075)、pCDM8[自然， 329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司)、pREP4(Invitrogen公司)、pAGE 103[生化杂志， 101，1307(1987)]、pAGE 210等作表达载体。
至于启动子只要能在动物细胞中表达任一种均可应用，例如可应用巨细胞病毒(人CMV)的IE(立早)基因的启动子、SV 40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白和SRα启动子等。另外，将人CMV IE基因的增强子与启动子一起应用较好。
作为宿主细胞可应用Namarba细胞、HBT 5637(特开昭63-299)、COS1细胞、COS7细胞、CHO细胞等。
将DNA导入动物细胞的方法均可用于将重组载体导入动物细胞、例如可应用电穿孔法[细胞工程学， 3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质体转染法[美国国家科学院院刊， 84，7413(1987)]和病毒学 52，456(1973)所记载的方法。可按照特开平2-227075号公报或特开平2-257891号公报所记载的方法来获取、培养转化体。
以昆虫细胞作宿主的时候可遵照杆状病毒表达载体-实验室手册(Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual)、现代分子生物学实验技术，补充1-38(1987-1997)、生物/工程学6，47(1988)中所记载的方法表达蛋白质。
也就是说，将重组的基因转移载体和杆状病毒共同导入昆虫细胞，在昆虫细胞的培养上清中获得重组病毒后再用重组病毒感染昆虫细胞就能表达蛋白质。
该方法中所应用的基因导入载体，如可应用pVL 1392、pVL1393、pBlue Bac III(均购自Invitrogen公司)等。
杆状病毒，如可应用感染夜盗蛾科昆虫的病毒，如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
昆虫细胞，可应用草地贪夜蛾的卵巢细胞Sf9、Sf2[杆状病毒表达载体，实验室手册，W.H.Freeman and Company，纽约(NewYork)，(1992)]和粉纹夜蛾的卵巢细胞High 5(Invitrogen公司)等。
制备重组病毒时将上述重组基因导入载体与上述杆状病毒共同导入昆虫细胞的方法，如可用磷酸钙法(特开平2-227075)、Lipofectin法[美国国家科学院院刊， 84，7413(1987)]等。
基因的表达方法，除直接表达外可按照分子克隆第2版中记载的方法进行分泌生产、融合蛋白质表达等。
应用酵母、动物细胞或昆虫细胞表达的时候，可得到添加了糖或糖链的多肽。
在培养基中培养含有导入了老化抑制基因的重组体DNA的转化体，老化抑制多肽在培养物中生产、蓄积，从该培养物中收集老化抑制多肽，这样就能制备老化抑制多肽。
在培养基中培养制备本发明老化抑制多肽所用的转化体时所用的方法，可按照培养宿主时所用的常规方法进行。
制备本发明老化抑制多肽所用的转化体为大肠杆菌等原核生物、酵母等真核生物时，培养这些生物的培养基只要是含有该生物能吸收的碳源、氮源、无机盐等，并能有效地培养转化体，无论是天然培养基、合成的培养基均可应用。
作为碳源只要是能被各种微生物吸收即可，如可应用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些物质的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。
氮源可用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机酸和有机酸的铵盐，其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉浸膏、酵母提取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、大豆糟和大豆糟水解物、各种发酵菌及其消化产物等。
无机盐可用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养可在振荡培养或涤部通气搅拌培养等良好的通气条件下进行。培养时间通常为16～96小时。培养过程中pH值保持在3.0～9.0。调整pH时可应用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等。
另外在必要的情况下可向培养基中加入氨苄青霉素、四环素等抗生素。
当培养用含有诱导的启动子的表达载体转化的微生物时，必要时可向培养基中加入诱导物。例如当培养含有 lac启动子的表达载体转化的微生物时，可向培养基中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，当培养含有 trp启动子的表达载体转化的微生物时，可用培养基中添加吲哚乙酸(IAA)。
培养以动物细胞作宿主细胞而得到的转化体时所使用的培养基，一般使用RPMI 1640培养基[美国医学协会杂志， 199，519(1967)]、Eagle氏MEM培养基[科学， 122，501(1952)]、DMEM培养基[病毒学， 8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society forthe Biological Medicine， 743，1(1950)]或者使用向这些培养基中添加了胎牛血清的培养基。
通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在的条件下培养1～7天。
另外，必要时可向培养基中加入卡那霉素、青霉素等抗生素。
培养以昆虫细胞作宿主细胞所得到的转化体时，一般使用TNM-FH培养基[Pharmingen公司]、Sf-900 II SFM培养基(GIBCD BRL公司)、ExCell 400、ExCell 450(均购自JRH Biosciences公司)、Grace′s昆虫培养基[Grace，T.C.C.，自然， 195，788(1962)]等。
通常在pH6～7、25～30℃等条件下培养1～5天。
另外，必要时可向培养基中加入庆大霉素等抗生素。
从制造老化抑制多肽的转化体的培养物中分离、纯化本发明的老化抑制多肽时可应用分离、纯化酶的常规方法。
例如本发明的多肽在细胞内以溶解状态表达时，培养结束后，离心分离细胞，回收，悬于水性缓冲液中，用超声波破碎机，French Press、Manton-Gaulin匀浆机，Dinomill等将细胞破碎，得到无细胞的提取液。将这种无细胞提取液离心分离，得到上清，应用常规的酶的分离纯化方法得到纯品，即单独应用或联合应用溶剂提取法、应用硫铵等盐析法、脱盐法、应用有机溶剂的沉淀法、应用二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(三菱化成公司)等树脂的阴离子交换色谱法、应用S-Sepharose FF(Pharmacia公司)等树脂的阳离子交换色谱法、应用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、应用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电点电泳等电泳方法。
另外，当这种多肽在细胞内以不溶性形式表达时，同样将细胞收集后破碎，离心分离后得到沉淀级分，用常规方法将这种多肽回收后，用多肽变性剂将多肽的不溶部分溶解。将这种可溶液体稀释或透析到不含有多肽变性剂或多肽变性剂的浓度不能使多肽变性的程度，该多肽构成正常立体结构之后，再用与上面相同的方法进行分离、纯化，得到纯品。
当本发明的多肽或其糖修饰体等衍生物在细胞外分泌的时候，可从培养上清中回收该多肽或其糖链附加体等衍生物。即，利用与上述同样的离心分离等手法处理该培养物，获得可溶性部分，应用与上面相同的分离、纯化方法可从可溶性部分中获得纯化品。
此外，应用上述方法表达的多肽可用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法进行制备。另外也可利用桑和贸易(美国Advanced ChemTech公司)、Perkin Elmer Japan(美国Perkin-Elmer公司)、Pharmacia Biotech(瑞士PharmaciaBiotech公司)、Aloka(美国Protein Technology Instrument公司)、Kurabo(美国Synthecell-Vega公司)、日本PerSeptive有限公司(美国PerSeptive公司)、岛津公司的合成仪来进行合成。
6)识别老化抑制多肽的抗体的生产
(i)多克隆抗体的制备
将上述(4)或(5)中获得的老化抑制多肽的全长或部分片段的纯品(抗原)，以50～100μg/只的剂量，与适当的佐剂(例如氟氏完全佐剂(Complete Freund′s Adjuvant)或氢氧化铝胶和百日咳疫苗等)一起皮下、静脉或腹腔内施与兔子、山羊或者3～20周龄的大鼠、小鼠或仓鼠。
该抗原的施与方法是，施用1次后，每1-2周施与3-10次。每次施与后，在第3-7天从眼底静脉采血，用酶联免疫测定法[酶免疫测定法(ELISA法)：医学书院刊，1976年，抗体，实验室手册，冷泉港实验室(1988)]等来确认血清与免疫抗原间的反应。
从血清对免疫抗原显示充分抗体价的兔子、山羊、小鼠、大鼠或仓鼠中获得血清，可用40％-50％饱和硫酸铵进行盐析的方法、辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖色谱、蛋白A柱或凝胶过滤等色谱法等常规的方法从血清获取纯化抗体。
(ii)单克隆抗体的制备
(a)抗体产生细胞的制备
应用其血清对免疫用的老化抑制部分片段多肽产生有效高抗体效价的大鼠作为抗体产生细胞的供给源。
在最后施与抗原物质3-7天后，从显示抗体效价的大鼠摘除脾脏。
在MEM培养基(日水制药)中剪断脾脏，用镊子散开，1200r/min5分钟离心后，弃上清。
用Tris-NH4Cl缓冲液(pH7.65)处理所得沉淀部分的脾细胞，处理1-2分钟，除去红细胞后，用MEM培养基洗3次，所得脾细胞用作抗体产生细胞。
(b)骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞，可应用从小鼠或大鼠而来的建株细胞系。例如可应用耐8-氮鸟嘌呤小鼠(来源于BALB/c)的骨髓瘤细胞株P3-X63 Ag 8-U1(以下，略作P3-U1)[Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.， 81，1(1978)]、[欧洲免疫学杂志， 6，511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[自然， 276，269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[免疫学杂志， 123，1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[自然， 256，495(1975)]等。这些细胞株在8-氮鸟嘌呤培养基[RPMI-1640培养基中加入了谷氨酸(1.5mM)、2-巯基乙醇(5×10-5M)、庆大霉素(10μg/ml)和胎牛血清(FCS)(CSL公司，10％)的培养基(以下叫做正常培养基)中再加入8-氮鸟嘌呤(15μg/ml)的培养基]中进行传代，细胞融合前3-4天用正常培养基培养，融合时该细胞用2×107个以上。
(c)杂交瘤的制备
用EME培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、食盐7.65g、蒸馏水1升，pH7.2)彻底洗涤(a)中所得的抗体产生细胞和(b)中所得的骨髓瘤细胞，以抗体产生细胞：骨髓瘤细胞＝(5～10)∶1的细胞数进行混合，1200r/min离心5分钟后，弃上清。
充分分散所得沉淀部分的细胞群，边搅拌边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)2g、MEM  2ml和二甲基亚砜(DMSO)0.7ml组成的混合溶液，37℃、每108个抗体产生细胞加入0.2-1ml，每1-2分钟再添加MEM培养基1-2ml。
添加后，加入MEM培养基，全量达50ml。
将配制的溶液在900r/min离心5分钟，然后弃上清。
将所得沉淀部分的细胞缓慢打开后，用吸量管吸入，缓慢吹到100mlHAT培养基[正常培养基中加入次黄嘌呤(10-4M)、胸苷(1.5×10-5M)和氨基喋呤(4×10-7M)]中，混悬。
将该混悬液加入到96孔培养板中，100μl/孔，在5％CO2培养箱中，于37℃培养7-14天。
培养后，吸取培养上清的一部分，应用抗体[抗体，实验室手册，冷泉港实验室，14(1998)]所叙述的酶免疫测定法，筛选能与老化抑制部分片段多肽进行特异性反应的杂交瘤。
酶免疫测定法的具体实例如下。
将免疫时用作抗原的老化抑制多肽的部分片段铺到适宜的板上，以杂交瘤培养上清或后面(d)中所得的纯化抗体做第一抗体进行反应，然后以生物素、酶、化学发光物质或放射性化合物等标记的抗大鼠免疫球蛋白抗体作为第二抗体进行反应，反应依赖标记物质进行，作为生产抗老化抑制多肽单克隆抗体的杂交瘤，筛选能与老化抑制多肽能进行特异反应的。
该杂交瘤株的具体例为杂交瘤KM 1902。杂交瘤KM 1902株于1997年6月17日以FERM BP-5983保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所。
应用该杂交瘤，用有限稀释法处理克隆2次[第1次用HT培养基(HAT培养基中去除氨基喋呤)，第2次使用正常培养基]，作为抗老化抑制多肽抗体的生产杂交瘤株选择稳定的、能产生强抗体效价的细胞株。
(d)单克隆抗体的制备
将(c)中取得的生产抗老化抑制多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞(5-20)×106细胞/只腹腔内注射到[腹腔内施用2，6，10，14-四甲基十五烷(Pristane)0.5ml后，饲养2周]的处理8-10周龄的小鼠或裸鼠内。10-21天杂交瘤转化为腹水癌。
从腹水癌小鼠的腹腔中抽取腹水，3000r/min离心5分钟去除固形物。
应用40-50％饱和硫酸铵盐析法，辛酸沉淀法[Antibodies，ALaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)]，DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或Cellulofine GSL 2000(生化学工业公司)等色谱柱法从所得上清中收集IgG或IgM级分，作为纯化单克隆抗体使用。
应用小鼠单克隆抗体分型试剂盒或大鼠单克隆抗体分型试剂盒来检测抗体的亚类。应用Lowry′s-法或280nm的吸光度值算出蛋白质量。
7)应用单克隆抗体进行免疫细胞染色
用粘附细胞进行免疫细胞染色的时候，优选应用通过预先作如下处理从培养瓶剥下的细胞。
即，用PBS缓冲液洗涤培养的粘附细胞，加入含0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS缓冲液3ml，去除多余的溶液后，37℃培养5分钟，细胞从培养瓶脱落(以下称这种操作为胰蛋白酶-EDTA处理)。
悬浮细胞仍用作培养细胞。
对免疫细胞进行染色时，将细胞混悬到免疫细胞染色用的缓冲液中(含1％BSA、0.02％EDTA、0.05％叠氮钠的PBS)，以每(1-20)×105个细胞分到圆底形96孔板中。
将(c)中获得的生产抗老化抑制多肽单克隆抗体的杂交瘤的培养上清、(d)中获取的纯化单克隆抗体或用众所周知的方法(酶抗体法：学际企画刊1985年)经生物素标记的这种单克隆抗体用免疫细胞染色用缓冲液或含有10％动物血清的免疫细胞染色用缓冲液稀释，稀释到0.1-50μg/ml的浓度，以20-500μl/孔分到培养板中，冰浴中放置30分钟。
上面应用(c)中所得生产抗老化抑制多肽单克隆抗体的杂交瘤的培养上清或(d)中所得纯化单克隆抗体时，在上述板中加入免疫细胞染色用缓冲液，洗涤细胞后，加入含有浓度为0.1-50μg/ml的FITC或藻红蛋白等荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体或抗大鼠免疫球蛋白抗体的免疫细胞染色用缓冲液，50-500μl/孔，冰浴下避光放置30分钟。
当应用生物素标记的单克隆抗体时，将链霉素抗生物蛋白以50-500μl/孔加入到上述板中，冰浴避光放置30分钟。
在两个过程中，放置后，向板中加入免疫细胞染色用缓冲液，充分洗涤后，用细胞分选器进行分析。
8)老化抑制多肽的免疫沉降
在培养皿等培养容器中培养表达本发明老化抑制多肽的CHO细胞或昆虫细胞。
向培养容器中加入PBS洗涤细胞。
向培养容器中加入预冷的由1％Triton  X100、20mMTris-HCl、150mM NaCl组成的缓冲液(以后称作缓冲液1)等可溶化细胞膜的缓冲液100～500μl，冰上放置30分钟后，每隔5分钟缓慢振荡进行可溶化处理。
从培养上清中制备样品的时候，用超滤膜和冷冻干燥等方法将上清浓缩后，应用其样品利用如下方法进行免疫沉降反应。
将上述可溶化处理液回收到1.5ml离心管中，14,000r/min离心分离30分钟。
向所得上清中加入10-50μl用上述缓冲液平衡过的蛋白质G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖，4℃振荡1小时以上，之后5000r/min离心2分钟，回收上清。
向该上清中加入(c)中所得生产抗老化抑制多肽单克隆抗体的杂交瘤的培养上清或加入(d)中所得纯化单克隆抗体，浓度达0.01～50μg/ml，4℃振荡1小时以上。
向该振荡液中加入10-50μl蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖，4℃振荡1小时以上，之后5000r/min离心2分钟。
向所得沉淀部分中加入200μl上述可溶化细胞膜的缓冲液，混悬沉淀。同样的操作重复3次以上，洗净沉淀部分。
向沉淀中加入进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用的样品缓冲液，用热阻滞加热后进行SDS-PAGE。
SDS-PAGE终了后，将所得凝胶中的多肽转移到PVDF膜上，应用本发明的抗老化抑制多肽部分片段的多克隆抗体，利用Western印迹法来检测老化抑制多肽。
通过从PVDF膜上切出检测出的老化抑制多肽，可对该蛋白质进行纯化。可应用蛋白质化学中常用的方法，如按照基因克隆中的蛋白质结构分析(平野久著，东京化学同人发行，1993年)中记载的方法进行纯化的本发明多肽的结构分析。
9)应用小鼠来源的老化抑制基因从显示早老症的小鼠获得该症状得到改善的小鼠(通过导入老化抑制基因来改善早老症状，以证明治疗有效)。
为了制备能过剩表达上面获得的老化抑制基因的转基因小鼠，构建能导入小鼠并在其中表达的含有老化抑制基因的DNA(以下称作导入老化抑制DNA)。将导入老化抑制DNA注入野生型小鼠的受精卵的雄性前核，移植到诱发假孕的雌性小鼠中。
新的过剩表达老化抑制基因的转基因小鼠(+/+)与来自显示早老症小鼠的杂合体(pg/+)进行交配，获得表达老化抑制基因、显示pg/+的小鼠。
将这种小鼠相互交配或者与显示pg/+的小鼠进行交配，获得表达老化抑制基因、显示pg/pg的小鼠。
通过确认这种小鼠不显示早老症状这一事实来证明用上述所得老化抑制基因的治疗有效。
例如，根据如下所示的方法可从显示早老样症状的小鼠获得该症状得到改善的小鼠。
(i)导入老化抑制DNA的构建
优选导入老化抑制DNA由启动子、老化抑制基因和SV 40早期拼接区及多聚腺苷硬化信号的盒(以下略作SV 40盒)构成。
启动子，只要能在小鼠中表达任一种均可应用，但优选应用强启动子，例如应用人延伸因子1α(human elongation factor 1α)[PEF321 CAT(kim DW等，基因， 91，217，1990)的 HindIII处理片段(含有5′UTR的第1外显子和第2外显子一部分的2.5kb的启动子部分]等。
老化抑制基因，上述(2)中所得的基因任一种均可应用，具体而言，可以是编码序列号3中氨基酸序列的DNA。
SV 40盒可利用购自Clontech的表达载体pMAMneo的碱基号1551-2427。
按照常规方法将启动子、老化抑制基因、SV 40盒顺序连接，用适当的限制性酶，如 NotI切断，溶解到PBS缓冲液中，浓度为500拷贝/ml，作为导入的老化抑制DNA使用。
(ii)转基因小鼠的制备
可应用常用的显微注射(microinjection)法来制作转基因小鼠(发育工程学实验手册-转基因小鼠的制作方法，野村达次责任编辑、胜木元也编辑，讲谈社Scientific，1987)。
具体而言，给C57BL/6和C3H的F1(BCF1)雄性(8-16周龄)小鼠腹腔内施与7单位的Serotropin(帝国脏器公司)。48小时后腹腔内施用7单位的促性腺激素(帝国脏器公司)，与雌性C3H进行交配。
次目从交尾的雌性小鼠的输卵管膨大部分收集受精卵，在垂直显微镜下应用显微操作仪(成茂公司)将DNA液注入该受精卵的雄性前核。
将该受精卵移植到前几天与精管结扎的雄性(ICR)进行交配，诱发了假妊娠的雌性(ICR，8-16周龄)小鼠的输卵管中。
在移植20天后出生的小鼠4-5周龄时，剪切小鼠的尾部，提取染色体DNA，应用PCR，如下进行基因型分析。
(iii)基因型的分析
向上面所得的小鼠尾中加入2ml裂解缓冲液[lysis buffer：含有50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、20mM EDTA、1％SDS、蛋白酶K(SIGMA)0.15mg/ml、Pronase E(SIGMA)1mg/ml的缓冲液]，50℃放置一晚。
用等量的酚提取该缓冲液，以1ml的上清作为PCR的模板。
制备以下5种引物，混合使用作为PCR的引物。
从(2)中获得的老化抑制基因来源的碱基序列和基因组DNA与其序列中插入内含子的区域相当的区域制备2种引物(引物1，2)；从共同存在于变异型等位基因和野生型等位基因中的区域(引物3)、从只存在于变异型等位基因的区域(引物4)、从只存在于野生型等位基因的区域(引物5)各制作一种引物。
引物1和2的实例为具有序列号25或26中所示序列的DNA。
引物3的实例为具有序列号27中所示序列的DNA。
引物4的实例为具有序列号28中所示序列的DNA。
引物5的实例为具有序列号29中所示序列的DNA。
假若小鼠中存在(2)中所得的老化抑制基因，应用引物1和2，通过PCR可生成扩增片段；在纯合体(pg/pg)中应用引物3和4可生成扩增片段；在野生型(+/+)小鼠中，应用引物3和引物5可生成扩增片段；在杂合体中应用引物3和4、引物3和5可生成2个扩增片段。由此可进行小鼠基因型的分析。
可按常法进行PCR。具体而言，在50μl体系[1×LA  PCR缓冲液II(Mg plus)、dNTP混合液各成分为400mM、引物各0.2mM、TakaRa LATaq 2.5U]中，应用TakaRa PCR Thermal Cycler480和LA PCR试剂盒(宝酒造)，94℃加热1.5分钟后，以94℃30秒、56℃30秒、72℃1.5分钟为1个循环，进行30个循环，再在72℃加热10分钟。
(iv)转基因小鼠与pg/+小鼠的交配
按照(iii)中的方法分析(ii)中所得转基因小鼠与pg/+小鼠交配所得子代小鼠的基因型，确认表达老化抑制基因、显示pg/pg的小鼠是否显示早老症状。
10)应用含小鼠来源的老化抑制基因的重组腺病毒，从显示早老症的小鼠获得症状改善了的小鼠
为了将上述所得的老化抑制基因导入小鼠使其表达，需构建含有老化抑制基因的重组腺病毒。将该重组腺病毒施与显示早老症的小鼠，通过确认该小鼠不显示早老症来判断上述获得的老化抑制基因治疗有效。
例如可按下面所示的方法，从显示早老症的小鼠获得症状得到改善的小鼠。
(i)含老化抑制剂基因的重组粘粒的制备
导入老化抑制基因的DNA优选含有启动子、老化抑制基因、拼接区域和poly(A)附加信号，缺少E1A、E1B和E3的5型腺病毒基因组DNA。
除老化抑制基因外含有各构成要素的粘粒可为pAxCAwt[核酸研究， 23，3816(1995)]。
老化抑制基因，只要是上面(2)中所得的基因任一种均可，具体的为编码序列号3中氨基酸的DNA。
按照常规方法，用适当的限制性酶，如 SwaI等切断粘粒，与老化抑制基因连接构成重组粘粒。
(ii)含有老化抑制基因的重组腺病毒的制作
可按照已报道的三宅等的方法[美国国家科学院院刊， 93，1370(1996)]来制作重组病毒。
具体而言，将(i)中制作的含有老化抑制基因的重组粘粒与 EcoT221切断了的、缺少E3、E1A、E1B的5型腺病毒Ad5dIXDNA[病毒学杂志， 54，711(1985)]混合，然后，如应用磷酸钙法(特开平2-227075)导入含E1A、E1B基因的细胞株，如导入人胎肾来源的293细胞。如果粘粒和腺病毒DNA的重组在细胞内发生，就生成重组腺病毒，细胞死亡，以该细胞死亡为指标可以证实含有老化抑制基因的重组腺病毒的生成。回收死亡细胞，应用细胞破碎机，通过进行反复冻融等将细胞破碎，获得含有老化抑制基因的重组腺病毒。
然后应用常规方法，从所得的重组病毒提取其DNA，用限制性酶，如 XhoI等进行酶切，以证实其结构。
(iii)重组腺病毒的纯化
遵照Kanegae等的方法[日本生物医学科学杂志， 47，157(1994)]，如将所得的重组病毒通过氯化铯密度梯度纯化2次，然后混悬到含10％甘油的PBS、含10％甘油的HEPES-MgCl2、含10％甘油的HEPES-EDTA等溶液中，-80℃保存备用。
(iv)将含有老化抑制基因的重组腺病毒施与显示早老症的小鼠
将如上所得的重组病毒，以108-1010噬斑形成单位(PFU)施用给显示早老症的小鼠，优选尾静脉施与3-4周龄的小鼠，施与后观察早老症的消除情况。
11)与本发明的老化抑制多肽进行特异性结合配体的筛选和鉴定
通过将本发明的老化抑制多肽与被测样品接触可筛选、鉴定其配体。
被测样品，如可应用哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、绵羊、牛、马、狗、猫、猴子、人等)的尿、体液、组织提取物、细胞培养上清、细胞提取物等。
例如，将尿、体液、组织提取物、细胞培养上清、细胞提取物等进行适当稀释、浓缩、分级分离后，与本发明的老化抑制多肽进行接触，以细胞刺激活性等为指标再进行分级分离，最终可分离得到单一的配体。
具体而言，将被测样品与本来不表达本老化抑制基因的细胞和向这种细胞中导入、表达了该老化抑制基因的细胞2种细胞进行接触，测定两种细胞内的各种细胞刺激活性，如细胞内钙、cAMP、cGMP等细胞内信号传递分子的浓度变化，细胞内蛋白质的磷酸化，早期转录因子基因的表达变化，细胞膜电位的变化，细胞内pH的变化，细胞外信号传递分子的游离，细胞的形态变化等，通过详细比较、分析两细胞中的差异来筛选、鉴定配体。
用放射性同位素等标记合成的化合物、天然存在或人工合成的蛋白质、糖、脂质及其修饰体、衍生物等，通过测定该标记的化合物与本老化抑制多肽的表达细胞、表达细胞的膜级分或固定于微量滴度板中的本发明老化抑制多肽的结合量来鉴定是否为本发明的配体。
另外可利用众所周知的方法[自然， 368，558(1994)]将本发明的老化抑制多肽或其部分修饰体和部分肽与BIAcore(PharmaciaBiotech公司)的传感器片共结合，然后与被测样品接触，以此来筛选、鉴定配体。
另外可应用标记的本老化抑制基因多肽或非标记的多肽与该多肽的标记抗体，通过以下方法筛选、鉴定与该多肽进行特异性结合的配体。
即，尿、体液、组织提取物、细胞培养上清、细胞提取物等经适当分级分离后，再通过聚丙烯酰胺电泳、琼脂糖电泳、二维电泳等电泳和HPLC等柱层析、薄层层析等方法进行分级分离，通过详细比较、分析与表达和不表达本老化抑制基因个体间的差异或与表达和不表达本老化抑制基因的细胞间的差异来鉴定出现(或消失)的与本老化抑制基因的表达特异相关的带、点和峰。
应用印迹法将这些带、点和峰从胶或薄层板上转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜等支持物上，然后应用标记的本老化抑制基因多肽或非标记的多肽与该多肽的标记抗体，筛选与多肽进行特异性结合的带、点，从这些带和点中提取配体进行鉴定。
12)抑制本发明的老化抑制多肽与本发明的配体进行特异性结合的化合物的筛选和鉴定
将本发明的老化抑制多肽与本发明的配体进行接触时的情况与本老化抑制多肽、本发明的配体和试验化合物进行接触时的情况进行比较，通过比较可以从被验样品中筛选出抑制本老化抑制多肽与配体进行特异结合的化合物(例如蛋白质、肽、糖、脂质、非肽类化合物、合成化合物、发酵化合物、生物成分等)。通过筛选所得到的化合物包含具有阻止配体与老化抑制多肽进行特异性结合、抑制老化抑制多肽活性作用的化合物(拮抗剂)，以及能抑制特异性结合但具有与配体相同的功能或具有替代活性的化合物(激动剂)。
被测样品除应用合成化合物、天然存在或人工合成的蛋白质、糖、脂质及其修饰体、衍生物等之外还可应用哺乳动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、绵羊、牛、马、狗、猫、猴子、人等)的尿、体液、组织提取物、细胞培养上清、细胞提取物以及发酵产物、植物和其他生物的提取物。
筛选该化合物的方法举例如下。
将本发明的配体单独或本发明的配体与被测样品一起接触导入、表达本老化抑制基因的细胞或接触原本就表达本老化抑制基因的细胞，比较单独应用配体时和配体与被测样品一起应用时的各种细胞刺激活性，如细胞内钙、cAMP、cGMP等细胞内信号传递分子浓度的变化，细胞内蛋白质的磷酸化，初期转录因子基因的表达变化，细胞膜电位的变化，细胞内pH值的变化，细胞外信号传递分子的游离，细胞的形态变化等，通过这种比较来筛选、鉴定能抑制本发明的老化抑制多肽与本发明的配体进行特异结合的化合物的方法。
另外，用放射性同位素标记本发明的配体，利用该标记测定标记的配体与本发明的老化抑制多肽的表达细胞、该细胞的膜级分或固定于微量滴度板中的本发明的老化抑制多肽的结合量，通过比较单独应用配体与配体和被测样品同时接触时的差异来筛选、鉴定抑制本老化抑制基因多肽和配体结合的化合物。
13)本发明的老化抑制多肽和本发明的配体相结合所诱导的化合物的筛选和鉴定
表达本发明多肽的细胞和不表达该多肽的细胞分别与本发明的配体接触和不接触的情况下，将其培养上清、细胞、细胞质、细胞膜部分进行聚丙烯酰胺电泳、琼脂糖电泳、二维电泳等电泳和HPLC等柱层析、薄层层析等，分级分离各成分，对各成分进行比较，以此来鉴定与配体接触时出现的、或消失的特异的或与该多肽的表达特异相关的带、点和峰，从这些带、点和峰可获得目的分子。
另外，人们认为表达本发明多肽的个体中，该多肽和配体的特异性结合恒常发生，在不表达的个体(具体的适宜例为本说明书中的早老小鼠)中这种相互作用不发生。因此，将正常小鼠和本说明书中的早老小鼠的各种脏器、组织、体液、血液、尿等进行适当分级分离后，通过聚丙烯酰胺电泳、琼脂糖电泳、二维电泳等电泳和HPLC等柱层析、薄层层析等方法进行分级分离，通过比较筛选出两者显示差异的带、点和峰，由这些带、点、蜂回收分子，从这些带、点和峰鉴定目的化合物。14)增强本发明的老化抑制多肽表达的化合物(以下略称表达增强化合物)的筛选和鉴定
(i)应用识别本发明老化抑制多肽的抗体进行筛选和鉴定
将表达本发明的老化抑制多肽的细胞与被验样品接触后，通过应用识别本发明老化抑制多肽的抗体可筛选、鉴定存在于细胞中、细胞培养上清中的表达增强化合物。
表达本发明老化抑制多肽的细胞可应用，例如从小鼠肾脏而来的输尿管细胞，可应用浓度梯度法、渗透压耐性分离法、输尿管分离法等已知的方法[肾和透析，增刊，588(1991)]进行制备。
被测样品除应用合成化合物、天然存在或人工合成的蛋白质、肽、非肽性化合物、糖、脂质及其修饰体、衍生物之外，还可应用，如哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、  羊、牛、马、狗、猫、猴、人等)的尿、体液、组织提取物、细胞培养上清、细胞提取物及发酵产物、植物和其他生物的提取物，但并不限于此。
将表达本发明老化抑制多肽的细胞悬浮到该细胞可以增殖的培养基上，将被测样品添加到该培养基中，与该细胞接触后，用上面(6)中记载的多克隆抗体或单克隆抗体，按(7)中的方法对该细胞表达的老化抑制多肽的含量进行定量。
与没有添加被测样品的系统进行比较，筛选能增加老化抑制多肽含量的被测样品，由此可鉴定表达增强化合物。
(ii)利用本发明老化抑制基因的转录产物的定量系统进行筛选和鉴定
表达本发明老化抑制多肽的细胞与被测样品接触后，可通过对本发明老化抑制基因的转录产物进行定量来筛选、鉴定表达增强化合物。
表达本发明老化抑制多肽的细胞和被样品可应用上面(i)中的。
将表达本发明老化抑制多肽的细胞悬浮到该细胞能够增殖的培养基上，将被测样品加入培养基，接触该细胞后，可应用通常的Northern印迹杂交法、RNA点杂交法、RT-PCR等方法对该细胞表达的老化抑制基因的转录产物进行定量。
杂交中可应用的探针和RT-PCR中可应用的引物可以是本发明的老化抑制基因的片段。具体而言，可应用含有选自序列号6、7、8、9和10中DNA序列的DNA片段。
与未加被测样品的系统进行比较，通过筛选能增加本发明老化抑制基因的转录产物含量的被测样品，鉴定表达增强化合物。
(iii)利用报告基因进行筛选和鉴定
将含有连接于控制编码本发明的老化抑制多肽的基团转录的区域(以下略称转录控制区域)下游的报告基因的DNA的质粒转化的转化体与被测样品接触后，可通过对报告基因所编码的多肽的表达量进行定量来筛选、鉴定增强表达的化合物。
转染控制区域可为老化抑制基因上游约6kb左右的地方存在的约8kb的区域，该区域在后述实施例2中的纯合体中缺如。另外也可用适当的限制性酶剪切该区域，用适当长度的片段作为转染控制区域。
任何报告基因，只要是该基因的翻译产物在细胞内稳定，且其翻译产物的量容易测定，任一种均可应用，例如，可应用氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、虫荧光素酶(luc)、绿荧光蛋白(GFP)等。
被测样品可用上面(i)中的物质。
可用常规的方法将报告基因连接到转录控制区域的下游，然后按常规方法用制备的质粒转化宿主细胞。
将转化体悬浮到能使该细胞增殖的培养基中，把被测样品加到培养基中，与该细胞接触后用适于转录产物的方法检测、定量该细胞表达的报告基因的转染产物。
CAT的时候，检测、定量方法可用，如分子克隆，第2版，16章，60页所记载的方法；β-gal的时候可应用，如分子克隆第2版，16章，66页所记载的方法；luc的时候可应用，如实验医学分册，生物手册系列4基因导入和表达分析法，81(1994)记载的方法；GPP的时候，可应用如美国国家科学院院刊， 94，4653(1997)所记载的方法。
与未加被测样品的系统进行比较，通过筛选能增强本发明老化抑制基因转录产物含量的被测样品来鉴定增强表达的化合物。
15)本发明寡核苷酸的制备
应用本发明的DNA和该DNA片段，通过常规方法或DNA合成仪可制备含有本发明DNA部分序列的反义寡核苷酸、有义寡核苷酸等寡核苷酸。
这种寡核苷酸可为与上面DNA碱基序列中的连续10-50个碱基具有相同序列的DNA或者是具有该DNA互补序列的DNA，具体而言，是与选自序列号6-10中DNA碱基序列中的连续10-50个碱基具有相同序列的DNA，或者是具有该DNA互补序列的DNA。
上述的寡核苷酸可作为本发明的寡核苷酸，但该寡核苷酸的衍生物亦可作为本发明的寡核苷酸。衍生的DNA可以是DNA中的磷酸二酯结合变换或硫代磷酸酯结合的衍生DNA，DNA中磷酸二酯结合换成N3′-P5′氨基磷酸酯(phosphoramidate)结合的衍生DNA，DNA中的核糖与磷酸二酯的结合变成肽核酸结合的衍生DNA，DNA中的尿嘧啶替换成C-5丙酰基尿嘧啶的衍生DNA，DNA中的尿嘧啶替换为C-5噻唑尿嘧啶的衍生DNA，DNA中的胞嘧啶替换为C-5丙酰基胞嘧啶的衍生DNA，DNA中的胞嘧啶被吩噁嗪修饰的胞嘧啶(phenoxazine-modified cytosine)替换了的衍生DNA，DNA中的核糖被2′-O-丙基核糖替换了的衍生DNA或DNA中的核糖被2′-三甲氧基核糖替换了的衍生DNA等[细胞工程学， 16，1463(1997)]。
16)老化抑制多肽、编码该多肽的DNA、识别该多肽的抗体、本发明的寡核苷酸、本发明的配体和表达增强化合物的应用
(i)应用本发明的抗老化抑制多肽的抗体可检测血液、部分脏器、细胞等样品中的老化抑制多肽，并能进行定量。具体而言，可利用适宜的方法，如应用微量滴度板的ELISA法、荧光抗体法、Western印迹法等，也可应用病理组织切片进行免疫组织染色。因此该抗体可用于伴随老化抑制多肽的表达低下，早老症和各种成人疾病发生可能性的诊断。同样也可在以该多肽为对象进行的研究中作为研究试剂应用。
(ii)把本发明的老化抑制多肽的全长或其部分片段施用给生物体可抑制老化。因此可作为与老化的进展密切相关的各种成人疾病，如动脉硬化、高血压、骨质疏松等的治疗药和预防药应用。另外，通过抑制老化还具有延长寿命的效果。
(iii)通过将本发明的老化抑制基因整合到逆转录病毒、腺病毒等病毒载体和其他载体中进行基因治疗的方法，它可用于治疗。
(iv)应用本发明的老化抑制基因或寡核苷酸，通过Northern杂交法或PCR，可测定该基因的表达量，诊断老化和成人疾病，同时本发明的老化抑制基因或寡核苷酸可用于老化抑制和成人疾病发生的抑制。此外，应用该老化抑制基因或寡核苷酸，通过Sonthern印迹杂交法和PCR可检测出因老化抑制基因先天性缺失而造成老化加速、易患成人疾病的个体，在所检测出的个体的核酸序列信息的基础上可进行基因诊断。再者，该老化抑制基因或寡核苷酸作为基因研究工作中的试剂也极为有用。
(v)将来源于本发明所提供的目的家畜动物，如牛、绵羊、山羊、猪、马、小鸡等的老化抑制基因产物施用于相应的动物，或者基因治疗时，通过应用适当的载体，如病毒等，在个体中表达该基因，可以延长目的家畜的寿命，或者可以抑制老化。因此可以长期、很好地饲养家畜，这样也就可长期获得奶、蛋和胎儿。此外，通过将该基因导入受精卵，把该基因插入全身细胞的染色体中使其表达，也就是说通过制备所谓的转基因动物预料有同样的效果，这在畜产领域的育种方面有很高的应用性。
应用含有该基因的载体，通过已知的同源重组的方法[如，自然，326，6110，295(1987)；细胞， 51，3，503(1987)等]可制备胚胎干细胞(embryonic stem cell)染色体上的老化抑制基因失活或任意序列发生置换了的突变克隆[例如，自然， 350，6315，243(1991)]。应用如此制备的胚胎干细胞克隆，通过应用到动物受精卵胚囊的注入嵌合法或集合嵌合法，可制备胚胎干细胞克隆和正常细胞组成的嵌合体。通过该嵌合体与正常个体进行交配可得到全身细胞的老化抑制基因存在任意突变的个体，再将这些个体进行交配，可得到同源染色体双方均插入突变的纯合体。
这样所得的动物个体中，可向老化抑制基因的任意位置导入突变。例如，可通过向老化抑制基因的翻译区域中导入碱基替换、缺失、插入等突变来改变其产物的活性。另外，可通过向表达控制区域导入同样的突变来改变表达的程度、时间、组织特异性等。通过与Cre-loxP系的组合，可更积极地控制表达时期、表达部位和表达量等。这样的实例有应用在脑中某特定区域表达的启动子，目的基因只在该区域缺失[细胞，87，7，1317(1996)]；应用表达Cre的腺病毒，目的基因在目的时期、脏器特异性缺失[科学， 278，5335，(1997)]。因此本发明的老化抑制基因也能象这样控制在任意时期和组织中表达，或者能制备在翻译区域和表达控制区域能发生任意插入、缺失、置换的动物个体。这种动物能在任意时间、任意程度或任意部位诱发老化症状和伴随老化出现的成人疾病等各种疾病的症状。因此就成为老化和成人疾病等各种疾病的治疗和预防中极为有用的动物模型。尤其是作为评价治疗药、预防药或功能性食品、健康食品等的动物模型非常有用。
(vi)本发明的老化抑制多肽，作为筛选、鉴定与该多肽特异性结合的配体时的试剂有用。
(vii)应用本发明的老化抑制多肽和本发明的配体可筛选、鉴定抑制该多肽和配体特异性结合的化合物。
(viii)利用本发明之老化抑制多肽及其配体可筛选及鉴定多肽结合到配体而诱导产生的分子。
(ix)本发明的配体、抑制本发明的老化抑制多肽和本发明的配体特异性结合的化合物、本发明的多肽和配体结合所诱导的分子可替代或补充本老化抑制多肽的老化抑制功能，含有这些分子的药剂作为早老症的治疗药、成人疾病的治疗药和老化抑制药有用。
(x)增加编码本发明老化抑制剂多肽，该多肽作为早老症治疗药、成人疾病治疗药、老化抑制药有益，的老化抑制基因表达的化合物(表达增强化合物)与老化抑制多肽同样对老化的抑制、成人病的治疗和预防有益。
附图简述
图中所用的符号说明如下：
bp：碱基对(base pairs)
kb：千碱基对(kilobase pairs)
IFN-γ：干扰素γ基因
Amp、Ap或Apr：来源于pBR 322的氨苄青霉素耐性基因
rop+：rop基因
PletI：letI启动子
Ptrp：trp启动子
PSE：猿病毒(simian virus)40(SV 40)早期基因启动子
PMO：Moloney小鼠白血病病毒的长末端重复序列(long terminalrepeat，LTR)的启动子
Hyg：潮霉素耐药基因
G418r：G418耐性基因
dhfr：二氢叶酸还原酶基因
P1：来源于pBR 322的P1启动子
Ptk：单纯疱疹病毒(Herpes simlpex virus；HSV)胸苷激酶(tk)基因的启动子
Sp.βG：兔β球蛋白基因拼接信号序列
A.βG：兔β球蛋白基因poly A添加信号
A.SE：猿病毒(simian virus)40(SV 40)早期基因poly A添加信号
Atk：单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus；HSV)胸苷激酶(tk)基因的poly A添加信号
以下对附图进行简单说明。
图1是以导入基因全长作探针，显示染色体Southern印迹杂交结果的电泳图。1道为纯合体，2道为杂合体，3道为野生型小鼠的结果。
图2为导入基因和实际上发生自救的质粒的限制性酶谱。
图3是以自救的质粒中包含的染色体片段作探针，显示染色体Southern印迹杂交结果的电泳图。1道是纯合体的结果，2道是杂合体的结果，3道为野生型小鼠的结果。
图4在导入基因插入的近旁含有染色体DNA的噬菌体克隆的限制性酶谱。
图5是以 SacII 450bp作探针，与小鼠各脏器poly(A)+RNA进行Northern印迹杂交的结果的电泳图。
图6是电泳图，它表明应用由每个野生型、杂合体、纯合体(显示早老症状)和出生时(0W)到7周(7W)各时期的野生型小鼠的肾脏制备的poly(A)+RNA和以 SacII 450bp作探针进行Northern印迹杂交的结果。
图7是人全长(上)、人分泌型(中)、小鼠全长(下)老化抑制多肽的cDNA和该cDNA编码的蛋白质的简单模式图。
图8表示质粒pNKM 101的限制性酶图谱。长箭头表示小鼠的老化抑制基因和转录方向。
图9为质粒pNKM 112的限制性酶图谱。长箭头表示小鼠分泌型老化抑制基因和转录方向。
图10是一电泳图，它表明通过对小鼠各脏器poly(A)+RNA进行RT-PCR来检测小鼠分泌型老化抑制基因表达的结果。
图11是质粒pNKM 103的限制性酶谱图。长箭头表示人的老化抑制基因和转录方向。
图12是质粒pNKM 106的限制性酶谱图。长箭头表示人的分泌型老化抑制基因和转录方向。
图13是质粒pSupex的构建过程图。
图14是质粒pYT 102的构建过程图。
图15是证实包含有pYT 102的大肠杆菌生产的老化抑制多肽片段的SDS-聚丙烯酰胺电泳图。1泳道表示未加入IAA时包含pYT 102的大肠杆菌NY 49生产的老化抑制多肽的片段，2泳道表示加入IAA时包含pYT 102的大肠杆菌NY 49生产的老化抑制多肽片段。
图16是应用针对老化抑制多肽片段的多克隆抗体，通过Western印迹法来证实大肠杆菌中老化抑制多肽片段表达的电泳图。
图17是pAGE 210的构建过程图。
图18是pYT 103的构建过程图。
图19是应用针对老化抑制多肽片段的多克隆抗体，通过Western印迹法来证实动物细胞中老化抑制多肽全长表达的电泳图。1泳道是应用CHO dhfr-细胞(宿主单独控制)的结果，2泳道是应用CHO dhfr-/pYT103 MTX扩增细胞的结果。
图20表示pAS 104的构建过程图。
图21是证实昆虫细胞中老化抑制多肽全长表达的SDS-聚丙烯酰胺电泳图。1泳道是分子量标记物，2泳道是应用Sf9细胞的结果，3泳道是应用表达老化抑制多肽的病毒感染的Sf9细胞时的结果。
图22是应用针对老化抑制多肽片段的多克隆抗体，通过Western印迹法来证实在昆虫细胞中老化控制多肽全长表达的电泳图。1泳道是应用Sf9细胞时的结果，2泳道是应用表达老化抑制多肽的病毒感染的Sf9细胞时的结果。
图23表示质粒pYS 110的构建过程图。
图24是应用针对老化抑制多肽片段的单克隆抗体KM 1902，通过Western印迹法来证实在CHO细胞(CHO dhfr-)中老化抑制多肽全长表达的电泳图。1泳道是应用CHO细胞进行Western反应的结果，2泳道是应用表达人老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYS 110)进行反应的结果，3泳道是应用表达小鼠老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pT 103)进行Western反应的结果。
图25表示质粒pYS 111的构建过程图。
图26是应用针对老化抑制多肽片段的单克隆抗体KM 1902，通过Western印迹来证实在CHO细胞(CHO dhfr-)人分泌型老化抑制多肽全长表达的电泳图。1泳道是应用CHO细胞进行反应的结果，2泳道是应用表达人分泌型老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYS 111)进行Western反应的结果。
图27表示质粒pYS 150的构建过程图。
图28是应用针对老化抑制多肽片段的单克隆抗体KM 1902，通过Western印迹法来证实在昆虫细胞中人分泌型老化抑制多肽全长表达的电泳图。表示的是应用表达人分泌型老化抑制多肽的病毒感染的Sf21细胞时的结果。
图29表示质粒pYS 112的构建过程图。
图30是应用针对老化抑制多肽片段的单克隆抗体KM 1902，通过免疫沉降法来证实在CHO细胞(CHO dhfr-)中小鼠分泌型老化抑制多肽全长表达的电泳图。1泳道是应用CHO细胞进行反应的结果，2泳道是应用表达小鼠分泌型老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYS112)进行Western反应的结果。
图31表示质粒pYS 151的构建过程图。
图32是应用针对老化抑制多肽片段的单克隆抗体KM 1902，通过免疫沉降法来证实小鼠分泌型老化抑制多肽在昆虫细胞中全长表达的电泳图。1泳道是应用Sf21细胞的结果，2泳道是应用表达小鼠分泌型老化抑制多肽的病毒感染的Sf21细胞时的结果。
图33是应用流式细胞仪对单克隆抗体KM 1902的反应性进行分析的图。(A)是向CHO细胞(CHO dhfr-)中添加单克隆抗体KM 1902或不添加时进行比较的结果，(B)是向表达老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYT 103)中添加单克隆抗体KM 1902和不添加时进行比较的结果。
图34是Western印迹图，它表示应用表达老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYT 103)与单克隆抗体KM 1902的免疫沉降结果。1泳道是应用表达老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYT 103)与单克隆抗体KM 1902的免疫沉降结果，2泳道是应用表达老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYT103)，不添加单克隆抗体KM 1902时的免疫沉降结果。
图35是质粒pEFSA的构建过程图。
图36是质粒pRES的构建过程图。
图37是施用了包含小鼠老化抑制基因的重组腺病毒的结果。A野生型不施用，B施用病毒的野生型，C施用了病毒的纯合体(显示早老症的小鼠)，D不施用的纯合体(显示早老症的小鼠)。
图38是质粒pYS 201的构建过程图。
图39是包含pYS 201的大肠杆菌生产的人老化抑制多肽N末端区(肽SUHN)的SDS-聚丙烯酰胺电泳图。
图40是质粒pYS 202的构建过程图。
图41是包含pYS 202的大肠杆菌生产的人老化抑制多肽C末端区(肽SUHC)的SDS-聚丙烯酰胺电泳图。
图42是表示应用KM 2076、小鼠组织的提取物以及表达小鼠膜型全长的CHO细胞的提取液进行Western印迹杂交结果的电泳图。用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离小鼠肾、肝的膜部分和细胞质部分以及表达小鼠膜型全长的CHO细胞的提取液。用KM 2076进行Western印迹，用化学发光试剂感光X线膜来进行检测。
图43是表示应用KM 2119、KM 2116，小鼠组织和表达小鼠膜型全长的CHO细胞的提取液进行Western印迹杂交结果的电泳图。用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离小鼠肾、肝的膜部分和细胞质部分以及表达小鼠膜型全长的CHO细胞的提取液。用KM 2119或KM 2116进行Western印迹，通过化学发光试剂感光X线膜进行检测。
图44是表示Western印迹杂交结果的电泳图，包括从表达小鼠膜型全长的CHO细胞制备细胞提取液，用KM 2076、KM 2119和ProteinG-Sepharose 4FF进行免疫沉降后，用SDS-聚丙烯酰胺电泳进行分离，然后进行Western印迹。
图45是表示Western印迹杂交结果的电泳图，包括用KM 2076和Protein G-Sepharose 4FF免疫沉降人分泌型表达CHO细胞的培养上清后，用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离，用KM 2076进行Western印迹分析。1泳道是用KM 2076和Protein G-Sepharose 4FF免疫沉降人分泌型表达CHO细胞的培养上清的结果，2泳道是用KM 2076免疫沉降无血清培养基的结果，3泳道是用NRIgG免疫沉降人分泌型表达CHO细胞的培养上清的结果。
本发明的最佳实施方案
以下为实施例。除特殊说明外，根据已知的分子克隆第2版中的方法进行基因操作。
实施例1：基因导入部位邻接的小鼠染色体DNA的克隆
(1)导入基因的检测
制备导入了连接到人延长因子-1α启动子(EF1α启动子)的Na+/H+逆输运体的外来基因的转基因小鼠(特开平5-268856)，将得到的杂合体进行交配得到显示早老症的个体。应用从纯合体中得到的显示明显早老症的小鼠[第18届日本分子生物学年会(锅岛等，2K-02，1995年)]和为获得该纯合体而应用的杂合体小鼠用于以后的实验。
分别从上述杂合体、纯合体和野生型小鼠的肝脏制备染色体DNA。用 EcoRV或 XboI完全消化各种染色体DNA 10μg。
将各消化的DNA片段进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳后，点到HybondN+膜(Amersham公司)上。
应用Megaprine DNA标记试剂盒(Amersham公司)以α-[32P]-dCTP标记制备转基因小鼠时应用的质粒pEFNaH(特开平5-268856)，以标记的质粒作探针，按照Hybond N+滤膜附加的说明与上述点的Hybond N+膜进行杂交。
结果如图1所示。在杂合体、纯合体中，于150kb附近检测到单一带，由此判断导入基因仅插入到小鼠染色体上的一个部位。以导入基因作探针应用FISH也能得到该结果。即，在第6染色体长臂的端粒(6G2-3)检测出单一的信号。
(2)基因导入部位邻近的小鼠染色体DNA的克隆
用 EcoRI或 KpnI完全消化10μg(1)中的纯合体小鼠的染色体DNA，用DNA Ligation Kit(宝酒造公司)在10ng/ml的浓度下，16℃进行30分钟的结合反应。
用该反应液10μl转染大肠杆菌XL1-BlueMRF′(EpicurianColi，STRATAGENE公司)，37℃培养18小时后，从所得集落回收质粒。
上面用 EcoRI消化染色体的时候，E50、E70 2种质粒作为包含小鼠基因组DNA片段的质粒被拯救；用 KpnI消化的时候，K8质粒作为这种质粒被自救。
导入基因和实际上拯救的质粒的限制性酶图谱如图2所示。3种质粒每一种均包含与导入基因不同的DNA片段，这表明这些DNA片段为导入基因邻近的染色体片段。
然后制备拯救的质粒E50中包含的小鼠染色体DNA部分的 EcoRI- PvuII片段后，按与(1)同样的方法进行放射性标记，以此作探针，应用去杂交后(1)中应用的滤膜进行Southern印迹(Southernblotting)。
结果如图3所示。在野生型小鼠中只见到来源于野生型等位基因(wild allele)的带，在纯合体中只见到来源于突变型等位基因(mutant allele)的带，在杂合体中可看到双方等位基因(allele)的带，这证实拯救的质粒中包含的染色体DNA片段是与导入基因相邻接的部分。
实施例2：小鼠老化抑制基因的克隆
应用实施例1中(2)的探针，按照附加的说明来筛选野生型小鼠基因组文库(Stratagene公司，mouse genomic library，λFIXII)，与探针杂交后得到3个独立的噬菌体克隆(E8.5，E2.6，E11.1)(图4)。
与实施例1(2)中从纯合体拯救的基因组DNA进行比较，发现纯合体的老化抑制基因内的区域缺失大约8kb(图4)。
为了鉴定该区域转录的基因，应用Li-Cor社的14000L型测序仪(以下相同)，以缺失部分为中心顺次确定其碱基序列，发现距缺失部分约6kb的地方存在CpG岛。
用 SacII从该缺失部分切出450bp的片段，用与实施例1(1)同样的方法进行标记，以此为探针，应用小鼠心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏等的poly(A)+RNA滤膜[Mouse Multiple TissueNorthern Blots的滤膜(Clontech)]，依照Hybond N+说明的条件进行Northern杂交。
结果如图5所示。在肾脏中可看到大约5.3kb的带，证实450bp的SacII酶切片段中包含有外显子。
应用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司)分别从野生型、纯合型、杂合型小鼠的肾脏制备poly(A)+RNA，将其5μg进行8％琼脂糖凝胶电泳后，转移到Hybond N+滤膜上(Amersham公司)。
以上面450bp的 SacII酶切片段作探针进行与上面同样的Northern杂交。
结果如图6所示。野生型和杂合体中可看到带，这可确定老化抑制基因的表达，但纯合体中未检测到带，这表明该基因完全没有表达。
同样从出生后各时期小鼠的肾脏制备poly(A)+RNA，以上面的450bp  SacII的酶切片段作探针进行Northern杂交。如图6所示，出生后1-2周，老化抑制基因完全没有表达，表达量从新出儿期慢慢增加，到出生后第3、4周表达量有增加的趋势。
实施例3：小鼠老化抑制基因cDNA的克隆化
用cDNA合成系统(cDNA Synthesis System，GIBCO BRL)从野生型小鼠肾脏的poly(A)+RNA合成cDNA，在其两端添加 EcoRI- NotI- SalI衔接体(SuperScript Choice System for cDNA Synthesis；GIBCO BRL)后，插入到克隆化载体λZAP II(λZAP II CloningKit，STRATAGENE)的 EcoRI部位，通过 体外包装后(Stratagene公司，Gigapack II Gold)制作cDNA文库。
以实施例2中450bp的 SacII酶切片段作探针，对该cDNA文库的5×105克隆进行噬斑杂交。杂交过程中，将滤膜在由2倍SSPE[1倍浓度的SSPE由180mM氯化钠、10mM磷酸二氢钠、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)构成(pH7.4)]、0.1％SDS构成的缓冲液中，65℃浸渍10分钟的条件下洗涤2次，在由1倍SSPE、0.1％SDS构成的缓冲液中65℃浸渍15分钟的条件下洗2次，在由0.2×SSPE、0.1％SDS构成的缓冲液中65℃浸泡10分钟的条件下洗涤2次。
通过杂交得到40个独立的杂交克隆。通过 体内切除(excision)从该克隆回收质粒，进行限制性酶分析、测定其碱基序列。
通过测定其碱基序列明了：质粒pNKM 101中包含序列号8中约5kb的cDNA，该cDNA中存在3042bp的开放阅读框架(以下略作ORF)。该ORF能编码由1014个氨基酸残基构成的新型蛋白质，如序列号3中所示，N末端具有由35个氨基酸构成的信号序列，C末端有由19个氨基酸构成的跨膜区(图7)。pNKM 101的构造如图8所示。
实施例4：小鼠分泌型老化抑制的分离
为了从含有小鼠基因组DNA的文库(Bacterial artificialchromosome，BAC)中分离出包含小鼠老化抑制基因基因组区域的克隆，可用实施例3中所得到的小鼠老化抑制基因cDNA中、序列号11和序列号12中所示2个区域的序列作引物，以小鼠染色体DNA作模板进行PCR，可以证实得到127bp的DNA的扩增片段。
应用PERKIN ELMER公司的DNA Thermal Cycler 480进行PCR反应，以94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟为一个循环，进行30个循环。
应用上述引物和扩增条件，通过PCR可从包含平均100kb的小鼠染色体DNA的BAC文库(Research Genetics公司)筛选扩增出127bpDNA片段的BAC克隆。
将10μg所得BAC克隆样品加入到50μl缓冲液B中后，加入3单位的 Sau 3AI，37℃反应10分钟。
用酚-氯仿提取该反应液，用乙醇沉淀，可得到5μg的DNA片段。
将5μg粘粒载体pWE 15(Clontech公司)加入到30μl缓冲液C中后，加入30单位的 BamHI 37℃反应2小时。用酚-氯仿提取该反应液，乙醇沉淀，得到约2μg的DNA片段。
将上面 Sau 3AI处理的BAC克隆片段1μg和 BamHI处理的pWE 15片段100ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1单位的T4DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。用Gigapack II Gold Extract(Stratagene公司)对该反应液进行体外包装处理，以制备粘粒文库。
应用选择上述BAC克隆时所应用的引物和扩增条件，通过PCR，可从该文库得到扩增出127bp片段的克隆。
将粘粒亚克隆化的小鼠老化抑制基因相应区域的DNA序列与后面实施例5中获得的人分泌型老化抑制多肽C末端相应的碱基序列进行比较，结果发现能编码与人分泌型老化抑制多肽、序列号2中535氨基酸-549氨基酸多肽序列具有同源性的DNA序列。
应用Mouse Kidney Marathon Ready cDNA kit(Clontech公司)作模板，加入来源于序列号13中所示文库的衔接-引物和序列号14中所示上述的小鼠来源的人分泌型老化抑制多肽C侧同源区域的相应引物后，通过PCR来进行基因扩增。
应用PERKIN ELMER公司的DNA Thermal Cycler 480进行PCR反应，以94℃1分钟、55℃3分钟、72℃1分钟为1个循环，反应进行30个循环。
将所得产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，证实得到约2kb的扩增片段，将该片段插入到pCR 2.1载体(Invitrogen公司)。
通过检测碱基序列得到序列号9中的序列，由此可知本cDNA为小鼠分泌型老化抑制基因，它由1650bp组成、包含编码550氨基酸残基的ORF。
应用本基因以及序列号15和序列号16中所示的合成DNA进行PCR反应，在基因两端添加 HindIII、 BamHI酶切部位后，插入到质粒载体pUC 118的 HindIII、 BamHI酶切部位，制作pNKM 112。(图9)
为了检测该基因在小鼠组织中的表达，以应用序列号17和序列号18中所示的引物，以及QuiekPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia公司)从各脏器制备的poly(A)+mRNA 500ng作模板，应用TakaRa RNALA PCR kit(AMV)Ver.1.1(宝酒造)，以随机9聚体作引物进行逆转录后，应用LA-Taq DNA聚合酶(宝酒造)进行PCR反应。
应用PERKIN ELMER公司的DNA Thermal Cycler 480进行PCR反应，以94℃20秒、60℃30秒、72℃1分钟为1个循环，反应进行30个循环。
用琼脂糖凝胶电泳对所得反应物进行分析，结果如图10所示。证实在肾脏、脑、下垂体、卵巢、精囊、胰脏中有所表达。
实施例5：人老化抑制基因cDNA的克隆化
(1)来源于人肾脏的老化抑制基因的获得
应用人肾脏poly(A)+RNA(Clontech公司)，与实施例3同样构建人肾脏cDNA文库。应用实施例2中小鼠cDNA中5′端衔接体来源的NotI部位和cDNA中存在的 NotI部位酶切出的4.2kb片段作探针，用与实施例3同样的方法对该文库的大约100万克隆进行噬斑杂交。
通过杂交获得6个独立的强杂交的克隆。通过体内剪切从这些克隆中回收质粒，进行限制性酶谱分析和碱基序列的测定。
通过碱基测序表明从2个克隆得到的质粒中包含约3.2kb的、与序列号6中的小鼠序列全长具有高度同源性的cDNA，该cDNA由3036bp构成，存在编码序列号1中1012氨基酸残基的ORF。
因为该序列具有与小鼠高达86％的同源性，所以得出这样的结论：该氨基酸序列为人同系物(human homologue)。(图7)
含该cDNA的质粒pNKM 103的构造如图11所示。
从另外4个克隆所得到的质粒中包含序列号7中的、约3.4kb的cDNA，该cDNA由1647bp构成存在编码序列号2中多肽的ORF。
与序列号1中的多肽进行比较，发现序列号2中多肽的C末端附近不含有跨膜区，因此认为这种多肽为分泌型蛋白质(图7)。
含有该cDNA的质粒pNKM 106的构造如图12所示。
(2)来源于人胰脏的老化抑制基因
以人胰脏cDNA文库(Clontech公司)的噬菌体液1μl(含有1×108个噬菌体)为模板，与序列号19中所示的10μM有义引物(RYHH-02-5′)1μl、10μM序列号20中所示的无义引物(RYHH-02-3′-2)1μl、1×PCR缓冲液(应用添加了酶的缓冲液)4μl、2.5mM dNTP 3.2μl混合，放置到热循环仪上。97℃反应5分钟后，在冰上迅速致冷5分钟，与0.5μl Taq DNA聚合酶(宝酒造，5单位/μl)混合后，以95℃60秒、65℃1分钟、72℃1分钟为1个循环进行30个循环的PCR，通过琼脂糖凝胶电泳进行确认，发现约400bp的带得到扩谱。
从琼脂糖凝胶上纯化这0.2kb的扩增片段，应用DNA连接试剂盒ver.2(宝酒造)整合到pT7Blue T-载体(Novagen公司)中。按照试剂盒中的方法进行。用该溶液转化大肠杆菌XL1-Blue株，得到青霉素耐药株。用质粒提取仪PI-100(Kurabo公司)从该转化体中回收质粒，用DNA测序仪377[Perkin Elmer公司]测定这2个克隆的碱基序列，结果检测到与老化抑制基因具有同源序列的pT7-02。
应用DIG DNA labeling Kit(Boehringer Mannhcin公司)用毛地黄毒苷(DIG)标记质粒pT7-02的插入片段，作为探针。标记方法按试剂盒的指示进行。
在5个直径为15cm的平皿中培养人胰脏cDNA文库，使每个平皿中达到约2×105个斑点，然后点到尼龙滤膜。按照BoehringerMannhcin公司的方案(DIG Luminescent Ditection Kit forNucleic Acids)进行DNA变性、固定，与探针进行杂交，洗涤滤膜。所用杂交液包含5×SSC、1％封闭液[DIG Luminescent DitectionKit for Nucleic Acids(Boehringer Mannhcin公司)]、0.1％Sacrcosyl、0.02％SDS，68℃杂交一晚上。然后边振荡边在含有0.1％SDS的2×SSC中室温洗涤2次，每次10分钟，之后在含有0.1％SDS的0.1×SSC中8℃洗涤15分钟，洗涤2次，然后应用DIG检测试剂盒(Boehringer Mannhcin公司)用抗DIG抗体检测阳性斑点。将该斑点与琼脂培养基一起取出，放入到SM缓冲液(0.1M NaCl、0.008MMgSO4·7H2O)500μl中，室温放置一晚，将噬菌体溶到缓冲液中。以该缓冲液1μl作模板进行与上面同样的PCR，通过0.4kb的片段得到扩增证实确定含有目的cDNA之后，用 EcoRI从该阳性克隆切出约3.5kb的插入序列，亚克隆到pBluescript SKII+的 EcoRI部位。用质粒提取仪PI-100(Kurabo公司)从转化体中回收质粒，用DNA测序列仪377(Perkin Elmer公司)检测1克隆的碱基序列，结果发现含有序列号10中碱基序列的质粒pRYHH 02。证明该基因中存在能编码序列号5中1015氨基酸蛋白的ORF。由该碱基序列所预测的氨基酸序列全长与老化抑制基因有大约45％的同源性，由此表明，该基因为老化抑制基因家族中的一个。
应用信号序列切断部位预测软件SignalP ver 1.2[蛋白质工程，10，1(1997)]和SPScan(Genetics Computer Group，Inc.)，以序列号10中氨基酸序列N末端的100个氨基酸为对象进行分析。结果2个软件预测的信号序列切断位置一致，即在第23位的Gly和第24位的Phe间。因此得出这样的结论：本多肽的第1位到第23位氨基酸序列形成信号序列，第24位以后为成熟型肽。
实施例6：在大肠杆菌中表达小鼠老化抑制多肽的部分片段时所用质粒pYT 102的构建
在大肠杆菌中表达小鼠老化抑制多肽部分片段是这样的：将含有编码小鼠老化抑制多肽片段cDNA的DNA片段插入到如下所示的大肠杆菌应用的表达载体pSupex中，制作pYT 102，然后将pYT 102导入到大肠杆菌中。
pSupex的制作是通过将图13所示的、已报道的pGHA 2(特开昭60-221091)、pTerm 2(特开平3-22979)、pGKA 2(特开昭60-221091)组合起来，按如下5步工程进行。
(工程1)质粒pTerm 4的构建
将3μg质粒pGHA 2加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁、50mM氯化钠和1mM DTT构成的缓冲液(以下略称Tris A缓冲液)后，向缓冲液中加入10单位的 HindIII，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取，乙醇沉淀，然后回收DNA片段。将该DNA加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁、100mM氯化钠和1mM DTT构成的缓冲液(以下略作Tris B缓冲液)中后，向该反应液中加入10单位的 PstI，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中的经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg含有 letI启动子的、约0.94kb的pGHA 2  PstI/ HindIII处理片段。
将3μg质粒pTerm 2加入到30μl Tris A缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的 HindIII，37℃，反应4小时。
通过乙醇沉淀从该反应液中回收DNA片段。将该DNA加入到30μlTris B缓冲液中后，向该反应液中加入10单位的 PstI，37℃反应4小时。
通过琼脂糖凝胶分离该反应液中的上述DNA片段，回收到大约0.8μg含有复制开始区域和翻译终止密码子的1.1kb的pTerm 2的 PstI/HindIII处理片段。
将上述pGHA 2的 PstI/ HindIII处理片段100ng和pTerm 2的 PstI/HindIII处理片段50ng溶解到20μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，向该溶解液中加入100单位的T4 DNA连接酶(宝酒造，以下相同)，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应中所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图13所示的质粒pTerm 4。
(工程2)质粒pGBZ 2的构建
将3μg pGKA 2加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、70mM氯化镁、150mM氯化钠、0.01％牛血清白蛋白和7mM 2-巯基乙醇构成的缓冲液(以下略作Tris C缓冲液)中后，向该缓冲液中加入10单位的 NruI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收pGKA 2的 NruI处理片段。
合成 BglII接头(5′-pCAGATCTG-3′)，将该接头50ng和上述pGKA 2的 NruI处理片段加入到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中溶解，然后用该溶解液中加入100单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应中所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图13所示的质粒pGBZ 2。
(工程3)质粒pTerm 5的构建
将3μg质粒pTerm 4加入到30μl Tris B缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的 PstI和10单位的 BglII，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，回收到约0.8μg含有 letI启动子和翻译终止密码子的1.15kb的pTerm 4的 PstI/BglII处理片段。
将3μg的质粒pGBZ加入到30μl Tris B缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的 PstI和 BglII，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg含有复制起始点，耐青霉素基因和rop基因的约2.63kb的pGBZ 2的 PstI和 BglII处理片段。
将上述pTerm 4的 PstI/ BglII处理片段100ng和pGBZ 2的 PstI/BglII处理片段50ng溶解到20μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，然后向该溶解液中加入100单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应中所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图13所示的质粒pTerm 5。
(工程4)质粒pTerm 6的构建
将3μg的质粒pTerm 5加入到30μl Tris C缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的 NruI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA加入到30μl Tris A缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的ClaI，37℃反应4小时。
通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg含有复制起始点、青霉素耐基因、 letI启动子和rop基因的约3.7kb的pTerm 5的 NruI/ ClaI处理片段。
分别将合成的、具有序列号21和22中所示碱基序列的DNA各1μg溶解到10μl蒸馏水中，95℃加热5分钟后，放置30分钟冷却至室温，以进行退火(以下叫做合成DNA-1)。
将上述pTerm 5的 PstI/ ClaI处理片段50ng和50ng的合成DNA-1溶解到T4 DNA连接酶缓冲液20μl中，然后加入100单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
将该反应中所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图13所示的质粒pTerm 6。
(工程5)质粒pSupex的构建
将3μl的质粒pTerm 6加入到30μl由50mM醋酸钠、20mMTris-醋酸盐(pH7.9)、10mM醋酸镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的 NsiI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA加入到30μl Tris A缓冲液中后，向该缓冲液中加入10单位的HindIII，37℃反应4小时。
通过琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中的经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg含有复制起始点、耐青霉素基因、 letI启动子和rop基因的大约3.7kb的pTerm 6的 NsiI/ HindIII处理片段。
将合成的、具有序列号23和24中所示碱基序列的DNA各1μg溶解到10μl蒸馏水中，95℃加热5分钟后，放置30分钟至室温，进行退火(以下，叫做合成DNA-2)。
将上述pTerm 6的 NsiI/ HindIII处理片段50ng和50ng合成DNA-2溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，然后加入100单位的T4DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图13所示的质粒pSupex。
(工程6)质粒pYT 102的构建
将实施例3中获得的pNKM 101 3μg加入到由30μl由50mMTris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁、100mM氯化钠和1mMDTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的 Eco 47 III，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的KpnI，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中的经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg、0.7kb的pNKM 101的 Eco 47 III/ KpnI处理片段(图14)，该片段包含编码序列号3所示老化抑制多肽的Ala35-Tyr267氨基酸残基片段的DNA。
将工程5中得到的大肠杆菌所用的表达载体pSupex 3μg加入到30μl的Tris A缓冲液中，然后用该缓冲液中加入10单位的 StuI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的KpnI，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，回收到约0.3μg、3.8kb的pSupex的 StuI/ KpnI处理片段。
将上述pNKM 101的 Eco 470 III/ KpnI处理片段50ng和pSupex的StuI/ KpnI处理片段100ng溶解到20μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，然后加入100单位的T4 DNA连接酶(宝酒造)，16℃进行18个小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图14所示的质粒pYT 102。
实施例7：大肠杆菌中老化抑制多肽部分片段的表达
将实施例6中所得的pYT 102导入到大肠杆菌NY 49中。在添加了75μg/ml氨苄青霉素和2mg/ml酪蛋白水解物的400ml M9极限培养基(分子克隆，实验室手册中记载的培养基)中，37℃，将该菌株培养2小时，添加50μg/ml的吲哚辛酸后，再于37℃培养18个小时。
将400ml该培养液3000×g离心15分钟，将含有大肠杆菌的沉淀悬浮到7ml的缓冲液1[由10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、150mM氯化钠组成的缓冲液]中，通过超声波处理破坏菌体。
将该处理液10000×g离心30分钟，将所得沉淀溶解到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用的样品缓冲液[由6mM Tris-HCl(pH6.8)、2％SDS、10％甘油、5％2-巯基乙醇构成的缓冲液]中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对该溶液进行分级分离，用考马斯亮蓝进行染色。结果如图15所示。结果证实生产出分子量约27kD的老化抑制多肽部分片段。该电泳中应用磷酸化酶b(97,400)、牛血清白蛋白(66,200)、卵蛋白(45,000)、碳酸酐酶(31,000)、大豆胰蛋白酶抑制物(21,500)、溶菌酶(14,400)作分子量标记物。
实施例8：与小鼠老化抑制多肽部分片段进行反应的抗小鼠老化抑制多肽抗体的产生
(1)应用2mm厚的胶、在还原条件下、根据常规方法，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离实施例7中的以大肠杆菌作宿主表达的小鼠老化抑制多肽部分片段。
用0.1％考马斯亮蓝水溶液对该胶进行染色，然后在水中脱色，切出与老化抑制多肽部分片段相应的约27kD的带。
将胶磨碎，用0.1％SDS-PBS，4℃提取老化抑制多肽部分片段，提取一晚上后，回收。以BAS作为蛋白浓度测定的标准品，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求出蛋白浓度。
(2)按照常规方法，用(1)中获得的老化抑制多肽部分片段免疫大鼠。
即，仅在初次施用时加入佐剂(氢氧化铝2mg、百日咳疫苗1×109细胞/只)，以50μg/只的浓度腹腔内施予老化抑制多肽部分片段，在初次施用的第2周、第3周只施用老化抑制多肽部分片段。
最后免疫3天后局部采血，应用如下所述的ELISA法测定血中的抗体效价。
[ELISA法]
在PBS缓冲液[磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g和7.65g氯化钠溶到蒸馏水中，定容到1升，pH7.2]中将上述老化抑制多肽部分片段调配成10μg/ml的浓度。将配制的该溶液加入到96孔EIA用板中(Gleiner公司)，50μl/孔，4℃放置1晚。
用PBS缓冲液洗涤该板，然后加入含1％BSA的PBS缓冲液(以下，略作BSA-PBS)，100～200μl/孔，室温放置1-2小时或4℃放置1-2晚上。放置后，弃去BSA-PBS，用PBS缓冲液充分洗涤该板。
用BSA-PBS稀释采集的抗血清后，以20-100μl/孔加入到该板中，室温放置2小时。
放置后，用含有0.5％吐温20的PBS缓冲液(以下略作PBS-0.05吐温)洗涤该板，每孔加入50～100μl的过氧化物酶标记的抗大鼠免疫球蛋白或过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白(DAKO公司)，室温放置1小时。
放置后，用PBS-0.05％吐温洗涤该板，用ABTS底物溶液[将2，2-二连氮基(3-乙苯并噻唑-6-磺酸)铵(550mg)溶到1升0.1M枸橼酸缓冲液中(pH4.2)，使用前加入1μl/ml的过氧化氢]进行显色，测定OD415nm的吸光度(NJ 2001，日本Nippon Intermed公司)。
(3)通过Western印迹证实该血清与上述的小鼠老化抑制多肽部分片段进行反应。
按照实施例7中的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来分级分离证实能表达老化抑制多肽部分片段的大肠杆菌的菌体蛋白质。
将从胶中分级分离出的蛋白质转移到转移膜(Immobilon TransferMembranes，Millipore公司)上。转移时应用的转移膜先在100％甲醇中浸泡20秒钟，然后在含有10mM CAPS(3-环己氨基丙磺酸)、10％甲醇和0.03％SDS的溶液(pH11.0)中浸泡30分钟以上，在2mA/cm2恒流的条件下进行2小时。
在200ml BSA-PBS中将该转移膜振荡1小时后，用PBS缓冲液洗1次。
将转移膜和在PBS缓冲液中以1/2500稀释了的大鼠血清2ml加入到乙烯袋中，封闭，4℃缓慢振荡一晚。
将该转移膜浸泡到PBS-0.05吐温20中，浸泡2次，每次5分钟，洗净后在PBS缓冲液中浸泡5分钟，洗净。
将该转移膜和溶解于PBS缓冲液中的0.5mg/ml的过氧化物氧标记的抗大鼠IgG抗体(anti-ratimmunoglobulin，Amersham公司)3ml加入到乙烯袋中，封闭，室温振荡1小时。
振荡后，将该转移膜浸泡在PBS-0.05吐温中，浸泡2次，每次5分钟，洗净后在PBS缓冲液中浸泡5分钟，洗净。
通过发光法(ECL Western blotting detection reagents，Amersham公司)可检测出与大鼠血清中的抗体进行交叉反应的、该转移膜上的蛋白质。
结果如图16所示。
在与实施例7中所得约27kD带的相同位置可检测到一条带，这表明实施例8(2)中采集的大鼠血清中的抗体能识别作为抗原的小鼠老化抑制多肽部分片段，可在Western印迹法中使用。
以下将该大鼠血清中的抗体叫做抗老化抑制多肽抗体。
实施例9：抗老化抑制多肽单克隆抗体的制备
(1)抗体产生细胞的制备
从实施例8(2)中所得的血清显示有效抗体效价的3只大鼠中摘取脾脏。
在MEM培养基(日水制药公司)中将脾脏剪碎，用镊子散开，1200r/min离心5分钟，弃上清。
用Tris-NH4Cl缓冲液(pH7.65)处理所得沉淀部分的脾细胞，处理1-2分钟，去除红细胞后，用MEM培养基洗3次，所得的脾细胞用作抗体产生细胞。
(2)小鼠骨髓瘤细胞的制备
在正常培养基中培养在8-氮鸟嘌呤培养基中进行传代的、8-氮鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞株P3-UI，用作细胞融合用的骨髓瘤细胞。细胞融合时使用2×107个以上的细胞。
(3)杂交瘤的制备
用EME培养基充分洗涤(1)中取得的抗体产生细胞和(2)中取得的骨髓瘤细胞，以抗体产生细胞∶骨髓瘤细胞＝10∶1的比例进行混合，1200r/min离心5分钟，弃上清。
将所得沉淀部分的细胞群充分散开，于37℃，边搅拌边向细胞群中加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)2g、MEM 2ml和二甲基亚砜(DMSO)0.7ml组成的溶液，每108抗体产生细胞加入0.2-1ml混合液，然后每1-2分钟添加数次1～2ml的MEM培养基。
添加后加入MEM培养基，使全量达50ml。
将制备的该溶液以900r/min离心5分钟，弃上清。
将所得沉淀部分的细胞缓慢散开后，用吸量管吸入，吹出，缓慢悬浮到GAT培养基100ml中。
将该悬浮液加入到96孔培养板中，100μl/孔，在5％CO2培养箱中、37℃培养7-14小时。
培养后，取一部分培养上清，按照实施例8(2)中所述的酶免疫测定法筛选出大约1000株与大肠杆菌生产的老化抑制多肽部分片段进行特异反应的杂交瘤。
应用该杂交瘤通过有限稀释法进行克隆，首次稀释用HT培养基，第2次稀释用正常培养基，得到生产抗老化抑制多肽抗体的杂交瘤KM1902。
通过酶免疫分析，用亚型分型试剂盒，测定了杂交瘤KM 1902产生的单克隆抗体KM 1902的抗体类型是IgG 2a。
(4)单克隆抗体的纯化
将(3)中取得的杂交瘤以(5-20)×106细胞/只腹腔注射到经Pristane处理的8周龄雌性裸小鼠(Balb/c)体内，10-21日间杂交瘤腹水瘤化。
从腹水瘤小鼠中采集腹水(1-8ml/只)，3000r/min离心5分钟，除去固形物。
用辛酸沉淀法[抗体，实验室手册，冷泉港实验室(1988)]纯化所得上清，获得IgG，用作纯化的单克隆抗体。
实施例10：在动物细胞中表达小鼠老化抑制多肽时应用的质粒pYT 103的构建
(工程1)动物细胞应用的表达载体pAGE 210的构建(图17)
应用动物细胞用的表达载体pAGE 207(特开平6-46841)和pAGE148(特开平6-205694)如下构建动物细胞用表达载体pAGE 210。
将pAGE 207或pAGE 148 3μg溶解到30μl的Tris A缓冲液中，然后向该溶解液中加入10单位的 ClaI和 KpnI，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，从pAGE 207中得到约0.5μg、包含SV 40初期启动子和增强子(以下称作PSE)、潮霉素抗基因和氨苄青霉素抗性基因(以下称作AP)的pAGE207的 ClaI/ KpnI处理片段，从pAGE 148中回收到约0.5μg、包含二叶酸脱氢还原酶基因(以下称作dhfr)的约4.3kb的pAGE 148的 ClaI/ KpnI处理片段。
将上述pAGE 207的 ClaI/ KpnI处理片段50ng和pAGE 148的 ClaI/KpnI处理片段50ng溶解到T4 DNA连接酶缓冲液20μl中，加入200单位的T4 DNA连接酶，12℃进行16小时的结合反应。
用该反应中得到的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到如图17所示的质粒pAGE 210。
(工程2)
通过连接工程1中获得的pAGE 210的 XbaI片段和实施例6(工程6)中pNKM 101的包含编码老化抑制多肽DNA的 XbaI片段，如下构建小鼠老化抑制多肽表达用载体pYT 103(图18)。
将3μg pAGE 210加入到30μl Tris A缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的 XbaI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取，乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA溶解到50μl的1M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，然后向该溶解液中加入1单位的碱性磷酸酶，37℃反应1小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，从该提取液中回收到大约0.5μg的pAGE 210的 XbaI-去磷酸化处理片段。
将3μg pNKM 101加入到添加了0.01％BSA的Tris A缓冲液30μl中，然后向该缓冲液中加入10单位的 XbaI，37℃反应4小时。
通过琼脂糖电泳分离该反应液后，回收到大约0.3μg的3.2kb的pNKM 101的 XbaI处理片段。
将该pNKM 101的 XbaI处理片段50ng和上述pAGE 210的 XbaI-去磷酸化处理片段300ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，向该溶液中加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应得到的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到图18所示的质粒pYT 103。
实施例11：动物细胞中小鼠老化抑制多肽的表达
按照宫地等的方法应用电穿孔法[细胞工程学，3，133(1990)]将质粒导入动物细胞中。
将实施例10(工程2)中所得的pYT 103以每4×106个细胞4μg的比例导入到缺失了dhfr基因的CHO细胞[国家科学院院刊，77，4216(1980)]，然后悬浮到10ml MEMα2000-dFCS(5)[含有5％dFCS、1/40体积的7.5％NaHCO3、3％200mM L-谷氨酰胺溶液(GIBCO公司)、0.5％青霉素-链霉素溶液(GIBCO公司，含有5000单位/ml青霉素和5000μg/ml链霉素)的MEMα2000培养基(GIBCO公司)]，加入到10cm平皿(Iwaki Glass公司)。
37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，然后加入潮霉素(GIBCO公司)，达到0.3mg/ml的浓度，培养1-2周。
当培养的转化体达到融合状态时回收该转化体的细胞。
将该细胞悬浮到含0.3mg/ml潮霉素、50nM甲氨蝶呤(以下略作MTX)的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，1-2×105细胞/ml，然后2ml分到F75培养瓶(Gliner公司)，然后在37℃的CO2培养箱中培养1～2周，诱导50nM MTX抗性克隆。
将该克隆以(1-2)×105细胞/ml悬浮到含0.3mg/ml潮霉素100nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，2ml分到F 75培养瓶中，在37℃的CO2培养箱中培养1～2周，诱导抗100nM MTX的克隆。
将该克隆以(1-2)×105细胞/ml悬浮到含有0.3mg/ml潮霉素、50nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)的培养基中，以2ml分到F75培养瓶中，于37℃的CO2培养箱中培养1～2周，诱导耐500nMMTX的克隆。
将该500nM MTX耐性克隆，以(1-2)×105细胞/ml悬浮到含有500nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，以15ml分到F75培养瓶中，于37℃的CO2培养箱中培养5-7天，当培养到耐性克隆80％-100％达到融合状态时，与CHO细胞应用的无血清培养基CHO-S-SFMII培养基(GIBCO公司)15ml进行交换，再培养3天。
用胰酶-EDTA处理培养得到的细胞，悬浮到10ml MEMα2000培养基中。
将该悬浮液1500×g离心5分钟，收集细胞。
向该细胞中加入7ml的PBS缓冲液，洗涤后，1500×g离心5分钟，收集细胞。
该细胞可在-20℃保存，必要时解冻使用。
通过与实施例8(3)中同样的方法，应用该细胞的总蛋白质(一道相当于1×105个细胞)进行Western印迹。
结果如图19所示。证实了与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的带，这表明应用动物细胞老化抑制多肽能显著表达。
另外可根据蛋白质化学的常规方法测定小鼠膜结合型老化抑制多肽的N末端氨基酸序列。
即，从达到融合点、来源于20个10cm平皿的、能表达实施例10中的老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr/pYT 103)，用后面实施例25中记载的免疫沉降法纯化出约140kDa的老化抑制多肽，用气相蛋白质测序仪(PPSQ-10、岛津制作所)，根据厂家推荐的方法来分析N末端的9个氨基酸残基的序列。
该分析结果与序列号3中氨基酸序列的N末端第36个残基以后的9个氨基酸序列一致。
实施例12：在昆虫细胞中表达老化抑制多肽所应用的重组病毒的制备
为了在昆虫细胞中生产蛋白质，有必要制备整合了目的基因的重组病毒，其制备过程包括(工程1)将叫做转移载体、编码目的蛋白质的DNA整合到特殊的质粒中，(工程2)将野生型病毒和转移载体共转染昆虫细胞，通过同源重组获得重组病毒。
为了实施该工程，可应用Pharmingen公司的BaculoGold StarterKit(产品号PM-21001K)，根据该试剂盒中的手册如下进行。
(工程1)转移载体的制备(图20)
将3μg的pNKM 101加入到30μl添加了0.01％牛血清白蛋白和0.01％Triton X-100的Tris B缓冲液(以下叫做Tris D缓冲液)中，然后向该缓冲液中加入10单位的 NotI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA片段。将该DNA加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁、0.01％牛血清白蛋白和1mM DTT组成的缓冲(以下称作Tris E缓冲液)中，然后加入10单位的 XbaI，于37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳分离该反应液中经上述处理的DNA片段，回收到大约0.3μg、含有编码小鼠老化抑制多肽片段DNA的、约3.2kp的pNKM101的 NotI- XbaI处理片段。
将3μg Pharmingen公司BaculoGold starter Kit中包含的质粒pVL 1392加入到Tris D缓冲液中，然后加入10单位的 NotI，37℃反应4小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收DNA。将该DNA加入到30μl的Tris E缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的XbaI，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶分离该反应液中的经上述处理的DNA片段，回收到大约0.9μg的约9.6kb的pVL 1392的 NotI- XbaI处理片段。
将pVL 1392的NotI- XbaI处理片段200ng和上述pNKM 101的NotI- XbaI处理片段50ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到质粒pAS104(图20)。
(工程2)重组病毒的制备
通过将线性杆状病毒DNA[BaculoGold杆状病毒DNA(BaculoGold baculovirus DNA)、Pharmingen公司]和上述的质粒pAS 104导入用TMN-FH昆虫培养基(Pharmingen)培养的昆虫细胞Sf9(Pharmingen)[蛋白质核酸酵素， 37，2701(1992)]中，如下制作重组杆状病毒。
将1μg pAS 104和20ng线性杆状病毒DNA溶解到12μl蒸馏水中，然后加入6μl lipofectin和6μl蒸馏水混合形成的混合物，室温放置15分钟。
将Sf9细胞1×106个悬浮到2ml的Sf900-II培养基(GIBCO)中，加入到直径35mm的细胞培养用塑料皮氏培养皿中，然后加入全量的由上述质粒DNA、线性杆状病毒DNA和lipofectin构成的混合溶液，27℃培养3天。
从该培养液中收集含有重组病毒的培养上清1ml。在取得该培养上清的皮皿中加入新的Sf900-II培养基，再在27℃培养3天，同样可再得到1.5ml含有重组病毒的培养上清。
实施例13：昆虫细胞中小鼠老化抑制多肽的表达
(工程1)重组病毒的增殖
将2×107个Sf9细胞悬浮到10ml Sf900-II培养基中，加入到175cm的培养瓶(Gliner公司)中，室温放置1小时，细胞贴附于培养瓶中。
放置后弃上清，向培养瓶中加入15ml的TMN-FH昆虫培养基和包含实施例12中获得的重组病毒的培养上清1ml，27℃培养3天。
培养后将上清1500×g离心10分钟，除去Sf9细胞，得到重组病毒溶液。
应用以下方法计算重组病毒溶液中病毒的滴度(Pharmingen公司，BaculoGold Starter试剂盒操作手册)。
将6×106个Sf9细胞悬浮到4ml Sf900-II培养基中，加入到直径60mm培养细胞用的塑料皮氏培养皿中，室温放置1小时，细胞贴附到培养皿上。
放置后，弃上清，向培养皿中加入Sf900-II培养基400μl和用Sf900-II培养基稀释的上述重组病毒溶液，室温放置1小时。
放置后，除去培养基，将5ml的含有1％低融点琼脂糖[琼脂斑琼脂糖(Agarplaque Agarose)，Pharmingen公司]的培养基(灭菌的1ml5％琼脂斑加琼脂糖水溶液和4ml TMN-FH昆虫培养基混合，42℃保温)倒入培养皿中，室温放置15分钟。
放置后为了预防干燥，用乙烯带包缠培养皿，将该培养皿放置到可密闭的塑料容器中，  27℃培养6天。
将1ml含有0.01％中性红的PBS缓冲液加入到该培养皿中，再培养1天后，计算出现的斑点数。
通过以上操作证明该重组病毒溶液中含有大约1×108噬斑形成单位(PFU)/ml的病毒。
(工程2)昆虫细胞中老化抑制多肽的表达
按照Pharmingen公司BaculoGold Starter试剂盒附加的手册说明，按如下顺序来进行小鼠老化抑制多肽的表达。
将Sf9细胞6×106个悬浮到225cm培养瓶(Gliner公司)中的包含10％FCS的45ml Grace′s昆虫培养基(Grace′s Insect Medium，GIBCO公司)中，27℃培养3-4天。
培养后弃培养上清，向培养瓶中加入30ml新的含10％FCS的Grace′s昆虫培养基和1ml包含大约1×108PFU/ml浓度的、(工程1)中获得的来源于pAS 104的重组病毒的溶液，27℃培养1天。
培养后弃上清，向培养瓶中加入45ml新的Sf900-II培养基，培养2-3天。
培养后通过1500×g离心5分钟除去上清，用胰酶-EDTA处理细胞，使之脱落。
将所得细胞部分悬浮到10ml的Sf900-II培养基中，1500×g离心5分钟，收集细胞。
向细胞中加入7ml的PBS缓冲液，洗净后，1500×g离心5分钟，收集细胞。
细胞可在-20℃保存，必要时解冻应用。
(工程3)表达的验证
通过与实施例7同样的方法，用工程2中获得的细胞的总蛋白质(每一道相当于1×105细胞)进行SDS-PAGE。
结果如图21所示。证实在120kD附近有一特异的带。
另外可按与实施例8(3)中相同的方法，用工程2中获得的细胞的总蛋白质(每一泳道相当于1×105细胞)进行Western印迹。
结果如图22所示。证实通过Western印迹，在与SDS-PAGE相同的位置可得到与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的特异带。
通过以上事实表明应用昆虫细胞可显著表达与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的老化抑制多肽。
另外按照实施例8(1)中的方法可从该昆虫细胞获得老化抑制多肽
实施例14：在动物细胞中表达人膜结合型老化抑制多肽时应用的质粒pYS 110的构建
通过连接实施例10(工程1)中获得的pAGE 210的( KpnI平端化处理)- BamHI片段和实施例5中记载的pNKM 103的含有编码人膜结合型老化抑制多肽的DNA的 BamHI- HpaI片段，如下构建人膜结合型老化抑制多肽的表达载体pYS 110(图23)。
将5μg的PAGE 210加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入20单位的 KpnI，37℃反应2小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收到约3μg的DNA片段。应用DNA blunting kit(宝酒造)对该DNA进行平端化处理后，进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀，溶解到50μl的由20mMTris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入20单位的 BamHI，37℃反应2小时。
通过琼脂糖凝胶电泳对该反应液进行分级分离后，从胶中切出9.0kb的pAGE 210的 BamHI-( KpnI平端化处理)片段。通过玻璃粉末法[Gene Clean II(Bio 101公司)]进行纯化，回收大约1μg。
将10μg的pNKM 103加入到50μl的由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入30单位的 BamHI和30单位的 HpaI，37℃反应2小时。
通过琼脂糖电泳对该反应液进行分离后，回收到大约0.5μg的3.2kb的pNKM 103的 BamHI- HpaI处理片段。
将pNKM 103的 BamHI- HpaI处理片段100ng和上述pAGE 210的 BamHI-( KpnI平端化处理)片段100ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，向该溶液中加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到图23所示的质粒pYS 110。
实施例15：动物细胞中人膜结合型老化抑制多肽的表达
依照宫地等的方法，用电穿孔法[细胞工程学， 3，133(1990)]将质粒导入动物细胞。
将实施例14中得到的pYS 110以每4×106个细胞4μg的比例导入到缺失了dhfr基因的CHO细胞[国家科学院院刊， 77，4216(1980)]，然后悬浮到10ml的MEMα2000-dFCS(5)[含有5％dFCS、1/40体积的7.5％NaHCO3、3％200mM的L-谷氨酰胺(GIBCO)溶液、0.5％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，含有5000单位/ml的青霉素和5000μg/ml的链霉素)的MEMα2000培养基(GIBCO)]，加入到10cm的平皿中(Iwaki Glass公司)。以后的操作与实施例11相同，诱导耐500nM MTX的克隆。
将该500nM MTX耐性克隆以(1-2)×105细胞/ml的浓度悬浮到含有500nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，以15ml分到F75培养瓶中，然后在37℃的CO2培养箱中培养5-7天，在耐性克隆80％-100％达到融合的时候终止培养，除去该培养液，用胰酶-EDTA处理，获得细胞。
将所得细胞悬浮到10ml MEMα2000培养基中，然后将悬浮液1500×g离心5分钟，收集细胞。
将该细胞中加入7ml的PBS缓冲液后，洗涤，1500×g离心5分钟，收集细胞。
该细胞可在-20℃保存，必要时解冻应用。
可用与实施例8(3)同样的方法，用该细胞的总蛋白质(每泳道相当于1×105细胞)进行Western印迹。但是一抗应用实施例9中的单克隆抗体KM 1902。
结果如图24所示。证实有与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的带，这表明应用动物细胞能显著表达人膜结合型老化抑制多肽。
另外可按蛋白质化学的常规方法来测定人膜结合型老化抑制多肽的N末端氨基酸序列。
即，从20份在10cm平皿中生长到融合状态的、能表达实施例14中记载的人膜结合型老化抑制多肽的CHO细胞(CHO dhfr-/pYS110)，用免疫沉降法纯化出约140kDa的人膜结合型老化抑制多肽，在2-巯基乙醇还原的情况下进行SDS-PAGE，依照P.Matsudaira的方法[J.B.C.， 262，10035(1987)]电转移到PVDF膜(ProBlott，PERKIN ELMER)上。
用考马斯蓝将转移膜染色，切出本实施例中通过Western印迹得到的140kDa附近的阳性带，应用气相蛋白质测序仪(PPSQ-10，岛津制作所)按照厂家推荐的方法分析N末端10个氨基酸残基的序列。
该分析结果与序列号1中所描述的氨基酸序列的N末端从第34个残基开始的10个氨基酸序列一致。
另外，按照实施例8(1)的方法可从该动物细胞获得人膜结合型老化抑制多肽。
实施例16：动物细胞中表达人分泌型老化抑制多肽所用质粒pYS 111的构建
通过连接实施例10(工程1)中获得的pAGE 210的 BamHI-( KpnI平端化)片段和实施例5中记载的含有编码老化抑制多肽的DNA的pNKH 106的 BamHI- MscI片段，如下构建人分泌型老化抑制多肽的表达载体pYS 111(图25)。
将5μg的pAGE 210加入到30μl由10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入20单位的 KpnI，37℃反应2小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，回收到约3μg的DNA片段。
应用DNA blunting kit(宝酒造)对该DNA进行平端化处理后，进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀，溶解到50μl的由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入20单位的 BamHI，37℃反应2小时。通过琼脂糖凝胶电泳对该反应液进行分级分离后，从胶中切出9.0kb的pAGE 210的 BamHI-( KpnI平端化处理)片段。通过玻璃粉末法[GeneClean II(Bio 101公司)]进行纯化，回收大约1μg。
将10μg的pNKM 106加入到50μl的由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入30单位的 BamHI和30单位的 HpaI，37℃反应2小时。
用该反应液进行酚-氯仿提取、乙醇沉淀后，溶解到50μl由50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸(pH7.9)、10mM醋酸镁、1mMDTT组成的缓冲液中，然后加入30单位的 MscI，37℃反应2小时。
通过琼脂糖电泳对该反应液进行分离后，回收到大约1.9kb的pNKM 106的 BamHI- MscI处理片段0.5μg。
将pNKM 106的 BamHI- MscI处理片段100ng和上述pAGE 210的 BamHI-( KpnI平端化)片段100ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，然后向该溶液中加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到图25所示的质粒pYS 111。
实施例17：动物细胞中人分泌型老化抑制基因的表达
依照宫地等的方法，用电穿孔法[细胞工程学， 3，133(1990)]将质粒导入动物细胞。
将实施例16中得到的pYS 111以每4×106个细胞4μg的比例导入到缺失了dhfr基因的CHO细胞[国家科学院院刊， 77，4216(1980)]，然后悬浮到10ml的MEMα2000-dFCS(5)[含有5％dFCS、1/40体积的7.5％NaHCO3、3％200mM的L-谷氨酰胺(GIBCO)溶液、0.5％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，含有5000单位/ml的青霉素和5000μg/ml的链霉素)的MEMα2000培养基(GIBCO)]，加入到10cm的平皿中(Iwaki Glass公司)。以后的操作与实施例11相同，诱导耐500nM MTX的克隆。
将该500nM MTX耐性克隆以(1-2)×105细胞/ml的浓度悬浮到含有500nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，以15ml分到F75培养瓶中，然后在37℃的CO2培养箱中培养5-7天，在耐性克隆80％-100％达到融合的时候换成15ml CHO细胞应用的无血清培养基CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)，再培养3天。
终止培养后向0.5ml该培养液中加入1.5ml的丙酮，20℃静置30分钟。将样品在-10℃、1500×g离心10分钟，获得沉淀部分后，向其中加入2ml的70％的乙醇，4℃离心5分钟。
随后将所得沉淀干燥，获得培养上清的丙酮浓缩样品。
上述培养上清可在-20℃保存，必要时解冻使用。
应用上述的丙酮浓缩样品，通过Western印迹可进行产物分析。
结果如图26所示。
结果证实了与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的带，这表明应用动物细胞可显著表达人分泌型老化抑制多肽。
另外，应用免疫沉降法可从300ml培养上清中获得浓缩型人分泌型老化抑制多肽，应用实施例15的方法，可测定其N端的氨基酸序列。所得氨基酸序列与序列号2中的氨基酸序列N末端从第34个残基开始的9个氨基酸残基序列一致。
另外可按照实施例8(1)中的方法从该动物细胞的培养上清中获得人分泌型老化抑制多肽。
实施例18：昆虫细胞中表达人分泌型老化抑制多肽所用重组病毒的制作
按照实施例12的方法来制备在昆虫细胞中表达人分泌型老化抑制多肽所用的重组病毒。
具体而言，将10μg的pNKH 106溶解到50μl由20mMTris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入30单位的 BamHI，37℃反应2小时。将反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，溶解到50μl由50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸(pH7.9)、10mM醋酸镁、1mMDTT组成的缓冲液中，然后加入30单位的 MscI，37℃反应2小时。
将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳分离后，从胶中切出1.9kb的pNKH106的 BamHI- MscI片段，通过玻璃粉末法进行纯化，回收大约0.5μg。
将Pharmingen公司BaculoGlod Starter试剂盒中包含的质粒pVL1393 5μg加入到50μl Tris B缓冲液中后，加入30单位的 EcoRI，37℃反应4小时。
对该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，回收DNA片段。用DNA blunting kit(宝酒造)对该DNA进行平端化处理后，进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，溶解到50μl的20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入20单位的 BamHI，37℃反应2小时。
将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳分离后，从胶中切出9.6kb的pVL1393的( EcoRI平端化)- BamHI片段，通过玻璃粉末法进行纯化，回收大约1μg。
将该pVL 1393的( EcoRI平端化)- BamHI片段200ng和上述pNKH 106的 BamHI- MscI处理片段50ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到质粒pYS150(图27)。
重组病毒的制作是使用1μg的pYS 150，与20ng的线性杆状病毒一起，通过Lipofectin法导入到Sf21细胞中，27℃培养3天。从该培养溶液中可得到1.0ml含有重组病毒的培养上清。
实施例19：昆虫细胞中人分泌型老化抑制多肽的表达
(工程1)重组病毒的增殖
将2×107个Sf21细胞悬浮到10ml Sf900-II培养基中，加入到175cm的培养瓶(Gliner)中，室温放置1小时，细胞贴附于培养瓶中。放置后弃上清，向培养瓶中加入15ml的TMN-FH昆虫培养基和包含实施例17中获得的重组病毒的培养上清1ml，27℃培养3天。
培养后将上清1500×g离心10分钟，除去Sf21细胞，得到重组病毒溶液。
应用实施例13中的方法计算重组病毒溶液中病毒的效价，结果表明重组病毒溶液中含有大约2×108噬斑形成单位(PFU)/ml的病毒。
(工程2)昆虫细胞中老化抑制多肽的表达
按照Pharmingen公司的BaculoGold Starter试剂盒中附加的手册说明，按如下的顺序来进行小鼠老化抑制多肽的表达。
将Sf21细胞6×106个悬浮到225cm培养瓶(GIBCO公司)中的包含10％FCS的45ml Grace′s昆虫培养基(Grace′s InsectMedium，GIBCO)中，27℃培养3-4天。
培养后弃培养上清，向培养瓶中加入30ml新的含10％FCS的Grace′s昆虫培养基和0.5ml包含大约2×108PFU/ml浓度的、(工程1)中获得的来源于pSY 150的重组病毒的溶液，27℃培养1天。
培养后弃上清，向培养瓶中加入45ml新的Sf900-II培养基，培养2-3天。
培养后，1500×g离心5分钟，获得培养上清。该培养上清可在-20℃保存，必要时可解冻使用。
(工程3)表达的验证
应用与实施例17相同的方法，使用0.5ml培养上清，通过丙酮浓缩后进行SDS-PAGE电泳，然后进行Western印迹。
结果如图28所示。通过Western印迹法可证实与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的特异带。
通过以上事实表明应用昆虫细胞可显著表达与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的、人分泌型老化抑制多肽。
另外，按照实施例8(1)中的方法可从该昆虫细胞的培养上清中获得人分泌型老化抑制多肽。
实施例20：动物细胞中表达小鼠分泌型老化抑制多肽所用质粒pYS 112的构建
通过连接实施例10(工程1)中获得的pAGE 210的 HindIII-BamHI片段和实施例4中的pNKM 112的含有编码老化抑制多肽DNA的 HindIII- BamHI片段，如下构建表达小鼠分泌型老化抑制多肽所用的质粒pYS 112(图29)。
将5μg的pAGE 210溶解到30μl的由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、10mM氯化钾所组成的缓冲液中，然后向溶解液中加入20单位的 BamHI和20单位的 HindIII，37℃反应2小时。
将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳分离后，从胶中切出9.0kb的pAGE210的 HindIII- BamHI片段，通过玻璃粉末法进行纯化，回收大约1μg。
将10μg的pNKM 112溶解到50μl由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、10mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入30单位的 BamHI和30单位的 HindIII，37℃反应2小时。
将该反应液通过琼脂糖电泳分级后，回收到大约0.5μg、1.6kb的pNKM 112的 HindIII- BamHI处理片段。
将该pNKM 112的 HindIII- BamHI处理片段100ng和上述pAGE210的 HindIII- BamHI片段100ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，向该溶液中加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到图29所示的质粒pYS 112。
实施例21：动物细胞中小鼠分泌型老化抑制多肽的表达
依照宫地等的方法，用电穿孔法[细胞工程学， 3，133(1990)]将质粒导入动物细胞。
将实施例20中得到的pYS 112以每4×106个细胞4μg的比例导入到缺失了dhfr基因的CHO细胞[国家科学院院刊， 77，4216(1980)]，然后悬浮到10ml的MEMα2000-dFCS(5)[含有5％dFCS、1/40体积的7.5％NaHCO3、3％200mM的L-谷氨酰胺(GIBCO)溶液、0.5％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，含有5000单位/ml的青霉素和5000μg/ml的链霉素)的MEMα2000培养基(GIBCO)]，加入到10cm的平皿中(Iwaki Glass)。以后的操作与实施例11相同，诱导耐500nM MTX的克隆。
将该500nM MTX耐性克隆以(1-2)×105细胞/ml的浓度悬浮到含有500nM MTX的MEMα2000-dFCS(5)培养基中，以15ml分到F75培养瓶中，然后在37℃的CO2培养箱中培养5-7天，在耐性克隆80％-100％达到融合的时候换成15ml CHO细胞应用的无血清培养基CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)，再培养3天。
该培养上清可在-20℃保存，必要时解冻使用。
用1ml该培养上清通过后述实施例25中的免疫沉降法进行产物浓缩，然后通过Western法进行产物分析。
结果如图30所示。可以证实与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的带，这表明应用动物细胞小鼠分泌型老化抑制多肽可显著表达。
应用免疫沉降法从45ml该动物细胞培养上清中浓缩小鼠分泌型老化抑制多肽，用实施例15的方法来检测其N末端的氨基酸序列。所得序列与序列号4中氨基酸序列的N末端从第36位氨基酸残基开始的13个氨基酸序列一致。
另外按照实施例8(1)中的方法可从该动物细胞培养上清中获得小鼠分泌型老化抑制多肽。
实施例22：昆虫细胞中表达小鼠分泌型老化抑制多肽所用重组病毒的制作
按照实施例12的方法来制备在昆虫细胞中表达小鼠分泌型老化抑制多肽所用的重组病毒。
具体而言，将10μg pNKM 112的编码老化抑制多肽的DNA溶解到50μl由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mMDTT、10mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入30单位的 HindIII，37℃反应2小时。
将该反应液进行酚-氯仿抽取、乙醇沉淀后，回收DNA。用DNAblunting kit(宝酒造)对该DNA进行平端化处理后进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，溶解到50μl由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、100mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入20单位的 BamHI，37℃反应2小时。
通过琼脂糖电泳将该反应液分级分离后，从胶中切出1.6kb的pNKM 112的( HindIII平端化处理)- BamHI片段，通过玻璃粉末法进行纯化，回收大约0.5μg。
将5μg Pharmingen公司BaculoGold Starter试剂盒中包含的质粒pVL 1392加入到50μl的Tris B缓冲液中，然后加入30单位的EcoRI，37℃反应4小时。
将该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，回收DNA片段。用DNA blunting kit(宝酒造)将该DNA平端化处理后，进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，溶解到50μl由20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM氯化镁、1mM DTT、10mM氯化钾组成的缓冲液中，然后向该溶解液中加入20单位的 BamHI，37℃反应2小时。
将该反应液通过琼脂糖凝胶电泳分级分离后，从胶中切出9.6kb的pVL 1393的( EcoRI平端化处理)- BamHI片段，通过玻璃粉末法进行纯化，回收大约1μg。
将该pVL 1392的( EcoRI平端化处理)- BamHI片段100ng和上述pNKM 112的( HindIII平端化处理)- BamHI片段100ng溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到质粒pYS151(图31)。
重组病毒的制作是应用1μg的pYS 151，和20ng线性杆状病毒一起通过Lipofectin法导入Sf21细胞，27℃培养3天。从该培养液中收集1.0ml含有重组病毒的培养上清。
实施例23：昆虫细胞中小鼠分泌型老化抑制多肽的表达
(工程1)重组病毒的增殖
将2×107个Sf21细胞悬浮到10ml Sf900-II培养基中，加入到175cm的培养瓶(Gliner)中，室温放置1小时，细胞贴附于培养瓶中。
放置后弃上清，向培养瓶中加入15ml的TMN-FH昆虫培养基和包含实施例22中获得的重组病毒的培养上清1ml，27℃培养3天。
培养后将上清1500×g离心10分钟，除去Sf21细胞，得到重组病毒溶液。
按实施例13中的方法计算重组病毒溶液中的病毒效价，结果表明重组病毒溶液中包含大约1×108噬斑形成单位(PFU)/ml的病毒。
(工程2)昆虫细胞中小鼠分泌型老化抑制多肽的表达
按照Pharmingen公司BaculoGold Starter试剂盒中附加的手册说明，按如下顺序来进行小鼠老化抑制基因的表达。
将6×106个Sf21细胞悬浮到225cm培养瓶(Gliner公司)中的包含10％FCS的45ml Grace′s昆虫培养基(Grace′s InsectMidium，GIBCO)中，27℃培养3-4天。
培养后弃培养上清，向培养瓶中加入30ml新的含10％FCS的Grace′s昆虫培养基和1ml包含大约2×108PFU/ml浓度的、(工程1)中获得的来源于pYS 151的重组病毒的溶液，27℃培养1天。
培养后弃上清，向培养瓶中加入45ml新的Sf900-II培养基，培养2-3天。
培养后1500×g离心5分钟，获得培养上清。该培养上清可在-20℃保存，必要时可解冻使用。
(工程3)表达的验证
应用与实施例21同样的方法，应用1ml培养上清进行免疫沉降后，利用Western法来进行产物分析。
结果如图32所示。
通过Western法证实与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的特异带。
以上表明，应用昆虫细胞可显著表达与抗老化抑制多肽抗体进行交叉反应的小鼠分泌型老化抑制多肽。
另外，按照实施例8(1)中的方法可从该昆虫细胞培养上清中获得小鼠分泌型老化抑制多肽。
实施例24：利用单克隆抗体进行免疫细胞染色
将实施例11中制作的老化抑制多肽的表达细胞-CHO细胞(CHOdhfr-/pYT 103)悬浮到免疫细胞染色用的缓冲液中，达到5×106个/ml，加到96孔圆底培养板中，100μl/孔。
对实施例11中作为宿主应用的CHO细胞(CHO dhfr-)进行同样的操作，作对照。
将该板于4℃、350×g离心1分钟，弃上清。
用MabTrapGII(Pharmacia生物技术公司)将5ml实施例9(3)中获得的产生抗老化抑制多肽单克隆抗体的杂交瘤KM 1902的培养上清浓缩20倍，加入到上面的板中，50μl/孔，4℃放置30分钟。
放置后向该板中加入免疫细胞染色用的缓冲液，200μl/孔，4℃、350×g离心1分钟后弃上清，洗涤细胞。
再如此洗涤2回后，向该板中加入用染色缓冲液30倍稀释的包含FITC标记的抗大鼠免疫球蛋白抗体(和光纯药)的免疫细胞染色用缓冲液，50μl/孔，冰浴中避光放置30分钟。放置后，进行同样的洗涤，洗3次，用流式细胞仪(Coulter公司)进行分析。
结果如图33所示。
单克隆抗体KM 1902不与CHO细胞进行反应，但能特异识别表达老化抑制多肽的CHO细胞。
实施例25：老化抑制多肽的免疫沉降
应用实施例11中记载的表达老化抑制多肽的CHO细胞(CHOdhfr-/pYT 103)作为免疫沉降用的老化抑制多肽的样品。
向生长着达到融合状态的CHO细胞的6cm平皿中加入PBS，将CHO细胞洗涤一次。
向该平皿中加入冰冷的缓冲液1 360μl，冰上静置30分钟后，每隔5分钟轻微振荡一次，进行可溶化处理。
将该溶液回收到1.5ml的离心管中，14,000r/min离心30分钟。
向所得上清中加入用缓冲液1平衡过的蛋白-G-琼脂糖(50％v/v)25μl，4℃振荡1小时后，5,000r/min离心2分钟，回收上清.
向该上清中添加实施例9(4)中获得的纯化单克隆抗体，达到10μg/ml，4℃振荡1小时。
向振荡液中加入25μl蛋白G-琼脂糖(50％v/v)，4℃振荡1小时后，5,000r/min离心2分钟。
向所得沉淀部分中加入200μl的缓冲液1，使沉淀悬浮。同样的操作重复3次，洗涤沉淀部分。
向沉淀中加入15μl SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时应用的样品缓冲液[由6mM Tris-HCl(pH6.8)、2％SDS、10％甘油、5％2-巯基乙醇组成的缓冲液]，用加热器加热后，应用市售的SDS-PAGE用梯度胶(Atoh公司)进行电泳。电泳终止后，将胶中的多肽转移到PVDF膜上(Millipore公司)。
用该PVDF膜，按照实施例8中的方法，应用抗老化抑制多肽部分片段的多克隆抗体进行Western印迹，在大约140kDa的位置检测到老化抑制多肽。
结果如图34所示。
单克隆抗体KM 1902免疫沉降了老化抑制多肽。
实施例26：应用来源于小鼠的老化抑制基因，从显示早老症的小鼠获得该症状得到改善的小鼠
(1)导入的老化抑制DNA的构建
利用含有人延长因子-1α启动子的pEF 321 CAT[基因， 91，217(1990)]的 HindIII片段作为含有启动子的DNA片段。该2.5kb的HindIII片段中存在人延长因子-1α 5′非翻译区的第1外显子和第2外显子的一部分、启动子、5′末端的 HindIII接头和3′末端的 EcoRI和 HindIII接头。
将含有老化抑制基因的pNKM 101的 NotI片段(4.2kb)和SV 40早期剪接区与加poly(A)信号的盒[质粒pMAMneo(Clontech)的碱基号1551-2427]连接到该 HindIII片段的下游作为导入老化抑制DNA。
该导入老化抑制DNA的构建方法如图35和图36所示。
具体而言
(i)用 HindIII酶切pEF 321 CAT，用DNA blunting Kit(宝酒造)将所得2.5kb的 HindIII片段平端化。用DNA Ligation Kit(宝酒造)将 XbaI接头(宝酒造，4693P)连接到该平端，然后用 XbaI酶切，得到 XbaI的酶切片段。
(ii)用 BamHI和 SmaI酶切pMAMneo(Clontech公司)，将所得包含poly A盒的870bp的 BamHI/ SmaI片段亚克隆到pBluescriptIISK(-)(STRATAGENE公司)的 BamHI/ EcoRI部位。
亚克隆后，用 BamHI酶切，添加 XhoI接头(宝酒造，4694P)，用 XhoI和 HindIII酶切，切出poly A盒(两末端均 XhoI和 HindIII的末端)。
(iii)将(ii)中得到的poly A盒亚克隆到pBluescript IISK(-)的 HindIII/ XhoI部位，得到含有poly A盒的质粒。
(iv)将(i)中得到的 XbaI酶切片段亚克隆到(iii)中得到的质粒的 XbaI部位。以下将所得质粒叫做pEFSA。
(v)用 NotI酶切pNKM 101，将所得4.2kb的 NotI片段平端化，然后亚克隆到pBluescript IISK(-)的 EcoRV部位。
亚克隆后用 EcoRI和 HindIII酶切，切出4.2kb的 EcoRI/ HindIII片段。
(vi)将(v)中所得的片段亚克隆到pEFSA的 EcoRI/ HindIII部位，得到质粒pRES。
用 NotI酶切该pRES，线状化后，以5.7ng/ml的浓度(约500拷贝/ml)溶解到PBS中，用作显微注射的DNA液。
(2)转基因小鼠的制作
用常规的显微注射法制作转基因小鼠(发育工程学实验手册-转基因小鼠的制作，野村达次主编、胜木元也编辑，讲谈社Scientific，1987)。
具体而言
(i)将7单位的Serotropin(帝国脏器公司)腹腔内施用给C57BL/6和C3H的F1(BCF1)代雌性(8-16周龄)。施用48小时后腹腔内施予7单位的促性腺激素(帝国脏器公司)，与雄性C3H进行交配。
(ii)次日从交尾的雌性小鼠的输卵管膨大部收集受精卵。在直立显微镜下，用显微操作仪(成茂公司)将(1)中制备的显微注射用DNA注入受精卵的雄性前核。
(iii)与实施(1)之前将精管结扎的雄性(ICR)进行交配，将(ii)中制备的受精卵移植到诱发了假妊娠的雌性(ICR，8-16周龄)的输卵管中。
(iv)当移植后第20天出生的小鼠长到4-5周龄时，切断小鼠的尾部，提取染色体DNA，依照以下(3)中的方法，用PCR分析基因型。
(3)基因型的分析
(i)向上述取得的小鼠尾巴中加入2ml裂解液，50℃放置一晚。
(ii)向(i)的放置液中加入等量的酚，用酚进行提取，其1ml上清用作PCR的模板。
用序列号25-29中所示的5种DNA作PCR的引物。
具有序列号25和26中所示碱基序列的DNA是由pNKM 101的cDNA部分的碱基序列合成，只要该cDNA存在就能扩增出339bp的片段。因为来源于染色体的DNA的两引物间存在内含子所以来源于染色体DNA的DNA片段不能扩增。
具有序列号27中所示碱基序列的DNA由共同存在于突变型等位基因(pg)和野生型等位基因(+)中的部分合成，具有序列号28中所示碱基序列的DNA由仅存在于变异型等位基因的部分合成，具有序列号29中所示碱基序列的DNA由仅存在于野生型等位基因的部分合成。
因此，应用Pg/Pg，在具有序列号27中所示碱基序列的DNA和具有序列号28中所示碱基序列的DNA间可扩增出920bp的片段；应用+/+，在具有序列号27中所示碱基序列的DNA和具有序列号29中所示碱基序列的DNA间可扩增458bp的片段；应用pg/+，二者均可生成。
应用LA PCR试剂盒(宝酒造)，在总共50μl的系统中[1×LA PCR缓冲液II(加Mg)、dNTP的各成分为400mM的混合液、每种引物为0.2mM、TaKaRa LATaq 2.5U]，在下述条件下进行PCR。
即，应用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480，94℃加热1.5分钟后，以94℃30秒、56℃30秒、72℃1.5分钟为1个循环，进行30个循环，再于72℃加热10分钟。
(4)转基因小鼠与pg/+小鼠进行交配
按(3)中的方法筛选(2)中获得的161只子代小鼠，得37只含有老化抑制基因的转基因小鼠。
将该转基因小鼠与pg/+小鼠进行交配，在F1代中得到基因型为pg/+、含有老化抑制基因的转基因小鼠。
有31个品系可将导入老化抑制基因传递给F1。
含有老化抑制基因的pg/+小鼠间进行交配，或者pg/+与含有老化抑制基因的pg/+进行交配，在F2代中获得3系含有老化抑制基因的pg/pg。
结果如表1和表2所示。
                                表1
  个体序号   性别   基因型 老化抑制基因   表型*1
    1   雄性     pg/+     -     -
    2   雄性     +/+     -     -
    3   雄性     pg/+     -     -
    4   雄性     pg/+     -     -
    5   雌性     +/+     +     -
    6   雄性     pg/pg     +     -*2
    7   雄性     pg/+     +     -
    8   雄性     pg/pg     +     -*2
    9   雄性     pg/pg     +     -*2
    10   雌性     pg/+     +     -
    11   雌性     pg/+     +     -
    12   雌性     pg/pg     -     +
-*1：+表示显示早老症状，-为不显示早老症状。
-*2：早老症状消失的小鼠。
                          表2
  个体序号   性别    基因型 老化抑制基因   表型*1
    13   雄性     +/+     +     -
    14   雄性     +/+     +     -
    15   雌性     pg/+     +     -
    16   雌性     +/+     +     -
    17   雄性     pg/pg     +     -*2
    18   雌性     pg/+     -     -
-*1：+表示显示早老症状，-为不显示早老症状。
-*2：早老症状消失的小鼠。
结果证实显示早老症的pg/pg小鼠在获得老化抑制基因后不显示该症状。
因此说明该基因是早老小鼠中早老症状的原因基因，同时还表明该基因在显示早老症个体中的表达可抑制早老症。
实施例27：用包含来源于小鼠的老化抑制基因的重组腺病毒，从显示早老症的小鼠获得该症状得到改善的小鼠
基本上按照三宅等的方法[美国国家科学院院刊， 93，1320(1996)]来制作包含来源于小鼠的老化抑制基因的重组腺病毒。
具体讲，用 NotI和 XbaI酶切包含来源于小鼠的老化抑制基因的质粒pNKM 101，通过DNA Blunting kit(宝酒造)使所得包含该基因的3.1kb片段的两末端平端化。
将该片段3μg和缺失了E3、E1A、E1B区域的腺病毒基因组以及包含巨细胞病毒增强子、小鸡β-actin启动子的嵌合启动子(CAG启动子)的粘粒pAxCAwt[Kanegae等，核酸研究， 23，3816(1995)]的 SwaI片段1μg溶解到20μl T4 DNA连接酶缓冲液，向该溶液中加入1单位的T4 DNA连接酶，16℃进行18小时的结合反应。
用该聚合酶反应液和Gigapack II XL Packaging Extract(Stratagene公司)进行体外包装，用所得噬菌体感染大肠杆菌DH5α，获得重组粘粒。
重组粘粒中来源于小鼠的老化抑制基因对启动子方向的确认是通过用 BamHI切断粘粒后检测出1.6kb的片段进行的。
将如此得到的粘粒8μg与1μg因 EcoT 221切断而缺失了E3、E1A、E1B的5型腺病毒[病毒学杂志， 54，711(1985)]混合，用CellPhect Transfection Kit(Pharmacia Biotech公司)，在6cm的平皿中，通过磷酸钙法，将其转染293细胞。
以后按照Kanegae等的方法[生物手册系列， 4，43-58，羊土社(1994)]获得重组病毒。
按照Kanegae等的方法[Jpn.J.Med.Sci.Biol.， 47，157(1994)]，通过两次氯化铯密度梯度来纯化该重组病毒，悬浮到含10％甘油的PBS中，-80℃保存备用。
按照Kanegae等的方法[Jpn.J.Med.Sci.Biol.， 47，157(1994)]计算该重组病毒溶液的病毒效价，发现该溶液含有1×1010pfu/ml的病毒。
将如此得到的重组病毒5×108pfu尾静脉接种到3-4周龄显示早老症的小鼠中，观察其过程。
结果如图37所示。
可以看到接种了该病毒的小鼠体重增加、寿命延长，早老症消失。
实施例28：在大肠杆菌中表达人老化抑制多肽N末端区域所用质粒pYS201的构建
通过连接实施例6中制作的pSupex的( KpnI平端化处理)- EcoRV片段和实施例5中pNKM 103的包含编码来源于人的老化抑制多肽DNA的 SacII的623bp片段，如下构建人老化抑制多肽N末端区域的表达载体pYS 201(图38)。
将实施例5中获得的pNKM 103 10μg加入到30μl由33mMTris-醋酸(pH7.9)、10mM醋酸镁、66mM醋酸钾、0.01％BSA和0.5mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入20单位的SacII，37℃反应4小时。用该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，回收DNA片段，用DNA blunting kit(宝酒造)进行平端化处理。
用琼脂糖凝胶电泳对该反应液中的经上述处理的DNA片段进行分级分离后，回收到大约0.3μg、0.6kb的pNKM 103平端化处理 SacII片段，该片段包含编码含有序列号1中所示老化抑制多肽的Gly55-Pro261氨基酸残基片段的DNA。
将实施例6、工程5中获得的大肠杆菌用表达载体pSupex 3μg加入到30μl由Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的 KpnI，37℃反应4小时。用该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，回收DNA片段，用DNA blunting kit(宝酒造)进行平端化处理。
再进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，将该DNA加入到30μl由50mMTris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁、100mM氯化钠和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入10单位的 EcoRV，37℃反应4小时。
用琼脂糖凝胶电泳对该反应液中经上述处理的DNA片段进行分级分离后，回收到大约2μg、3.8kb的pSupex的(平端化处理 KpnI)-EcoRV处理片段。
将所得片段溶解到44μl H2O中后，添加5μl的含0.5MTris-HCl(pH8.5)、1mM EDTA和1单位碱性磷酸酶(BoehringerMannheim公司)，37℃静置30分钟。
对该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后回收DNA片段。
将上述的pNKM 103的平端化处理 SacII片段50ng和pSupex的碱性磷酸酶处理的(平端化处理 KpnI)- EcoRV处理片段100ng溶解到20μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，然后加入100单位的T4 DNA连接酶(宝酒造)，16℃进行18小时的结合反应。
用该反应所得的重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到质粒pYS201(图38)。
实施例29：大肠杆菌中来源人的老化抑制多肽N末端区域的表达
将实施例28中得到的pYS 201导入到大肠杆菌NY 49中。应用该菌株，按与实施例7中同样的方法来进行来源于人的老化抑制多肽N末端区域的表达。
即，在添加了75μg/ml氨苄青霉素和2mg/ml酪蛋白水解物的400mlM9极限培养基(分子克隆，实验指南中记载的培养基)中培养上述菌株，37℃培养2小时，然后添加50μg/ml的吲哚辛酸，再在37℃培养18小时。
将所得培养液400ml以3000×g离心15分钟，将得到包含大肠杆菌的沉淀悬浮到7ml的缓冲液1[由10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、150mM氯化钠组成的缓冲液]中，通过超声波处理来破坏菌体。
将该处理液10,000×g离心30分钟，将所得沉淀溶解到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用的样品缓冲液[由6mM Tris-HCl(pH6.8)、2％SDS、10％甘油、5％2-巯基乙醇组成的缓冲液]中。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将该溶液分级分离，用考马斯亮蓝对该胶进行染色。
结果如图39所示。
可以证实生产出分子量约26kD的来源于人的老化抑制多肽N末端区(以下叫做肽SUHN)。该电泳中应用磷酸化酶b(94,000)、牛血清白蛋白(67,000)、卵白蛋白(43,000)、磷酸酐酶(30,000)、大豆胰蛋白酶抑制物(20,000)、溶菌酶(14,400)作分子量标记物。
实施例30：人老化抑制多肽C末端区域的表达载体pYS 202的构建
通过连接实施例28中制作的pSupex的( KpnI平端化处理)-EcoRV片段和实施例5中pNKM 103的含有编码来源于人的老化抑制多肽的DNA的 KpnI- ApaI的467bp片段，如下构建人老化抑制多肽C末端区域的表达载体pYS 202(图40)。
将实施例5中获得的pNKM 103 10μg加入到30μl的由10mMTris-HCl(pH7.5)、10mM氯化镁和1mM DTT组成的缓冲液中，然后向该缓冲液中加入20单位的 ApaI和 KpnI，37℃反应4小时。
将该反应液进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，回收DNA片段，用DNA blunting kit(宝酒造)进行平端化处理。
通过琼脂糖凝胶电泳对该反应液中经上述处理的DNA片段进行分级分离后，回收到大约0.3μg、0.5kb的pNKM103的平端化处理的ApaI- KpnI片段，该片段包含能编码含有序列号1中老化抑制多肽的Phe801-Pro954氨基酸残基的片段的DNA。
将上述pNKM 103的平端化处理的 ApaI- KpnI片段50ng和实施例28中pSupex经碱性磷酸酶处理的(平端化处理的 KpnI)- EcoRV处理片段100ng溶解到20μl的T4 DNA连接酶缓冲液中，加入100单位的T4 DNA连接酶(宝酒造)，16℃进行18小时的反应。
用该反应所得重组质粒DNA转化大肠杆菌JM 109，得到质粒pYS202(图40)。
实施例31：在大肠杆菌中人源老化抑制多肽C末端区域的表达
将实施例30中得到的pYS 202导入到大肠杆菌NY 49中。应用该菌株，按与实施例7中同样的方法来进行来源于人的老化抑制多肽C末端区域的表达。
即，在添加了75μg/ml氨苄青霉素和2mg/ml酪蛋白水解物的400mlM9极限培养基(分子克隆，实验指南中记载的培养基)中培养上述菌株，37℃培养2小时，然后添加50μg/ml的吲哚辛酸，再在37℃培养18小时。
将所得培养液400ml以3000×g离心15分钟，将得到包含大肠杆菌的沉淀悬浮到7ml的缓冲液1中，通过超声波处理来破坏菌体。
将该处理液10,000×g离心30分钟，将所得沉淀溶解到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用的样品缓冲液中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将该溶液分级分离，用考马斯亮蓝对该胶进行染色。
结果如图41所示。
可以证实生产出分子量约18kD的来源于人的老化抑制多肽C末端区(以下叫做肽SUHC)。该电泳中应用的标记物与实施例29中应用的相同。
实施例32：与人老化抑制多肽部分片段进行反应的单克隆抗体的生产
应用与实施例8相同的方法纯化实施例29和实施例31中以大肠杆菌作宿主所生产的多肽SUHN和SUHC。
纯化的多肽SUHN和多肽SUHC的分子量分别为26kD和18kD。
按照实施例8中的方法免疫大鼠，按与实施例9相同的方法制作单克隆抗体。
表3是制成的单克隆抗体的一览表。
杂交瘤KM 2070、KM 2076、KM 2105、KM 2116和KM 2119分别以FERM BP-6196、FERM BP-6197、FERM BP-6198、FERM BP-6199、FERM BP-6200于1997年12月9日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本，茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编305)。
                        表3
免疫源   单克隆抗体   动物种类   亚类
人N末端区(SUHN)人N末端区(SUHN)人膜外C末端区(SUHN)人膜外C末端区(SUHN)人膜外C末端区(SUHN)   KM 2070KM 2076KM 2105KM 2116KM 2119     大鼠大鼠大鼠大鼠大鼠   IgMIgG2aIgG1IgG2bIgG2b
实施例33：用与人老化抑制多肽部分片段进行反应的单克隆抗体检测老化抑制多肽
(1)CHO表达的小鼠全长蛋白质以及小鼠组织的Western印迹
在匀浆用的缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.25M蔗糖、1mM EDTA、10mM EGTA、10mM 2-巯基乙醇]中磨碎野生型小鼠的肾、肝和纯合型ICR小鼠(老化小鼠)的肾、肝，离心(100,000×g，4℃，1小时)，分别回收膜部分(沉淀)和细胞质部分(上清)。
在溶解用缓冲液中[1％Triton-X100、200mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl]溶解得到的膜部分。此外，用PBS洗涤实施例11中所示表达小鼠膜全长的CHO细胞，然后用溶解用缓冲液溶解。用各组织的膜部分和细胞质部分(20μg)以及小鼠膜全长表达的CHO细胞的细胞裂解物(2μg)和小鼠膜全长表达的CHO细胞的培养上清(15μl)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质从胶中转移到PVDF膜上。
转移后在含有5％脱脂牛奶的PBS-Tween中封闭20分钟，然后分别于KM 2076、KM 2116、KM 2119各杂交瘤的培养上清室温反应1小时。在PBS-Tween中洗涤1小时后加入二抗-过氧化物酶标记的抗大鼠免疫球蛋白抗体(Amersham公司，4000倍稀释)，室温反应30分钟。
反应后在PBS-Tween中洗涤1小时，然后与ECL Western印迹检测试剂(Amersham公司)进行反应，感光X胶片，检测带。
结果如图42和图43所示。
KM 2076在肾脏膜部分中识别野生型特异的、约130kDa的带。因为这条约130kDa的带与根据氨基酸序列推测出的分子量很接近，并且与在CHO细胞中表达的小鼠膜全长蛋白质的大小几乎一致，所以认为这条带为膜全长蛋白质。另外，KM 2076在小鼠膜全长表达的CHO细胞的培养上清中识别出约70kDa的带。
KM 2119在肾脏膜部分中识别出野生型特异的约130kDa的膜全长的带和约60kDa的带。因为这条大约60kDa的带在KM 2076(人N末端识别抗体)中未检测出只在KM 2119(人C末端识别抗体)检测出，所以认为它是全长蛋白质N末端切割后的残存C末端片段。由此，认为KM 2076在小鼠膜全长表达的CHO细胞的培养上清中所识别的大致70kDa的带为N末端的切割片段。另外，KM 2119在肾和肝脏的细胞质部分中识别出与野生型、纯合型均进行反应的非特异性的约66kDa的带。KM 2116在肾脏膜部分中识别出野生型特异的全长蛋白质，还检测出约70kDa的非特异性带。
(2)CHO表达的小鼠全长蛋白质和CHO表达的人分泌型蛋白的免疫沉降
在溶解用缓冲液[1％Triton-X 100、200mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl]中将实施例11中所示的小鼠膜全长蛋白表达的CHO细胞和CHO细胞可溶化。向200μl该溶液中加入800μl的免疫沉降用缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl]使全量达到1ml，加入25μl的蛋白G-琼脂糖4FF(Pharmacia公司)，4℃反应1小时。通过离心(1000×g，4℃，5分钟)回收上清，加入KM 2076或KM 2119的纯化抗体1μg，4℃反应1小时。再加入25μl的蛋白G-琼脂糖4FF，4℃反应1小时。此外，将实施例17中所示的表达人分泌型蛋白的CHO细胞的培养上清1ml与预先和蛋白G-琼脂糖结合了的KM 2076，同样在4℃反应1小时。用免疫沉降用缓冲液洗涤该反应物后，离心(10,000×g，4℃，5分)，回收沉淀物，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白质从胶上转移到PVDF膜上。在含有5％脱脂奶粉的PBS-Tween中封闭20分钟，用KM 2076、KM 2119进行Western印迹。结果如图44所示。用KM 2076进行免疫沉降回收到膜全长蛋白，用KM 2119进行的免疫沉降回收到膜全长蛋白和C末端片段蛋白。如图45所示，用KM 2076进行免疫沉降同样可回收到人分泌型蛋白。
(3)用人组织切片进行免疫组织染色
将2份人肾脏标本、2份人肝脏标本进行甲醛固定、石蜡包埋后的组织切成4mm薄片，固定到玻片上。用二甲苯脱石蜡后，用乙醇-水逐步提高其亲水性，再在含有1％过氧化氢的甲醇中处理15分钟，封闭内源性的过氧化物酶。用PBS洗涤切片，用稀释的正常牛血清封闭20分钟，分别于KM 2070、KM 2116(10mg/ml)室温反应30分钟。充分洗涤后加入二抗-生物素标记的抗大鼠免疫球蛋白抗体(Vector公司，200倍稀释)，室温反应30分钟，洗涤后，与ABC试剂(Vector公司)室温反应30分钟。用PBS洗涤后，在二氨基联苯胺底物溶液[将50mg二氨基联苯胺溶解到150ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中后，过滤加入50ml的过氧化氢]中显色1分钟，在冰浴中终止反应。用苏木紫进行核染色，用乙醇-水和二甲苯脱水后，用Enteran New封闭，镜下观察。结果如表4所示，KM 2070与人肾脏的肾性输尿管和血管平滑肌进行反应，KM 2116与人肾脏的远端输尿管进行特异反应。KM 2070、KM 2116均与肝细胞进行反应。用KM 2116通过Western印迹在野生型ICR小鼠肾脏的膜部分检测出一条带，而在纯合型小鼠(老化小鼠)肾脏的膜部分未检测出该带，如图43所示，由此说明KM 2116在人病理切片的分析中有用。
(4)用小鼠组织切片进行免疫染色
野生型ICR小鼠的肾、肝各2个样品，纯合型ICR小鼠(老化小鼠)的肾、肝各2个样品，经甲醛固定、石蜡包埋后将组织切成4mm的薄片，固定到玻片上。用KM 2070、KM 2105(10mg/ml)进行与(1)中KM 2070、KM 2116同样的免疫组织染色。结果如表4所示，KM2070、KM 2105与野生型小鼠进行特异的肾性输尿管反应。但KM 2070与野生型、纯合型小鼠的血管平滑肌均无反应。再者，KM 2070、KM2105与野生型、纯合型小鼠的肝细胞均有反应。
                         表4
单克隆抗体     KM 2070     KM 2105   KM 2116
人肾脏人肝脏野生型小鼠肾脏野生型小鼠肝脏纯合子小鼠肾脏纯合子小鼠肝脏 输尿管、血管平滑肌肝细胞输尿管、血管平滑肌肝细胞血管平滑肌肝细胞     --输尿管肝细胞-肝细胞   远端输尿管肝细胞----
产业上利用的可能性
本发明可提供具有抑制老化活性的多肽；含有该多肽的早老症治疗药、成人疾病治疗药或老化抑制药；编码该多肽的DNA；含有该DNA的早老症治疗药、成人病治疗药或老化抑制药；用该DNA改良家畜的方法；将该DNA整合到载体中所得到的重组DNA；含有该重组体的转化体；用该转化体生产本发明多肽的方法；识别该多肽的抗体；用该抗体对本发明的多肽进行定量的方法或诊断老化的方法；寻找本发明多肽配体的方法；该配体；筛选抑制本发明的多肽与其配体进行特异结合的化合物的方法；由该筛选方法所得到的化合物；筛选能增加编码本发明老化抑制多肽的老化抑制基因表达的化合物的方法以及由该筛选方法得到的化合物。
序列表
序列号：1
序列长度：1,012
序列类型：氨基酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：肽
起源：
  生物名：人
  脏器：肾脏
序列
Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser
  1               5                  10                  15
Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg
             20                  25                  30
Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro
         35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly
     50                  55                  60
Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp
 65                  70                  75                  80
Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His
                 85                  90                  95
Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser
        115                 120                 125
Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val
    130                 135                 140
Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr
            180                 185                 190
His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala
        195                 200                 205
Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe
    210                 215                 220
Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro
225                 230                 235                 240
Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly
                245                 250                 255
Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu
            260                 265                 270
Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro
        275                 280                 285
Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn
    290                 295                 300
Pro Arg Arg Met Thr Asp Hi s Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu
305                 3l0                 315                 320
Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp
                325                 330                 335
Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe
            340                 345                 350
Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala
        355                 360                 365
Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met
    370                 375                 380
Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp
385                 390                 395                 400
Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly
                405                 410                 415
Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr
            420                 425                 430
Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp
        435                 440                 445
Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe
    450                 455                 460
Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp
465                 470                 475                 480
Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe
                485                 490                 495
Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn
            500                 505                 510
Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val
        515                 520                 525
Asp Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu
    530                 535                 540
Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val
545                 550                 555                 560
Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala
                565                 570                 575
Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val Thr His
            580                 585                 590
Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln
        595                 600                 605
Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser
    610                 615                 620
Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro
625                 630                 635                 640
Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala
                645                 650                 655
Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu
            660                 665                 670
Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn
        675                 680                 685
Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu
    690                 695                 700
Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His
705                 710                 715                 720
Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu
                725                 730                 735
Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val
            740                 745                 750
Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly
        755                 760                 765
Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe
    770                 775                 780
Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr
785                 790                 795                 800
Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser
                805                 810                 815
Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu
            820                 825                 830
Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val
        835                 840                 845
Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly
    850                 855                 860
Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His
865                 870                 875                 880
Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn
                885                 890                 895
Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr
            900                 905                 910
Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr
        915                 920                 925
Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr
    930                 935                 940
Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu
945                 950                 955                 960
Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe
                965                 970                 975
His Thr Arg Lys Ser Leu Leu Ala Phe Ile Ala Phe Leu Phe Phe Ala
            980                 985                 990
Ser Ile Ile Ser Leu Ser Leu Ile Phe Tyr Tyr Ser Lys Lys Gly Arg
        995                 1000                1005
Arg Ser Tyr Lys
    1010
序列号：2
序列长度：549
序列类型：氨基酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：蛋白质
起源：
  生物名：人
  脏器：肾脏
序列
Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser
  1               5                  10                  15
Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg
             20                  25                  30
Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro
         35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly
     50                  55                  60
Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp
 65                  70                  75                  80
Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His
                 85                  90                  95
Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser
        115                 120                 125
Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val
    130                 135                 140
Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr
            180                 185                 190
His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala
        195                 200                 205
Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe
    210                 215                 220
Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro
225                 230                 235                 240
Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly
                245                 250                 255
Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu
            260                 265                 270
Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro
        275                 280                 285
Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn
    290                 295                 300
Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp
                325                 330                 335
Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe
            340                 345                 350
Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala
        355                 360                 365
Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met
    370                 375                 380
Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp
385                 390                 395                 400
Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly
                405                 410                 415
Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr
            420                 425                 430
Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp
        435                 440                 445
Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe
    450                 455                 460
Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp
465                 470                 475                 480
Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe
                485                 490                 495
Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn
            500                 505                 510
Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val
        515                 520                 525
Asp Asn Tyr Ile Gln Val Ser Gln Leu Thr Lys Pro Ile Ser Ser Leu
    530                 535                 540
Thr Lys Pro Tyr His
545
序列号：3
序列长度：1,014
序列类型：氨基酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：蛋白质
起源：
  生物名：小鼠
  脏器：肾脏
序列
Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu
  1               5                  10                  15
Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala
         35                  40                  45
Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro
     50                  55                  60
Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr
                 85                  90                  95
His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser
        115                 120                 125
Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu
    130                 135                 140
Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg
                165                 170                 175
Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr
            180                 185                 190
Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly
        195                 200                 205
Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp
225                 230                 235                 240
Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala
                245                 250                 25S
Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn
            260                 265                 270
Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe
        275                 280                 285
Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp
    290                 295                 300
Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys
305                 310                 315                 320
Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp
                325                 330                 335
Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro
            340                 345                 350
Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe
        355                 360                 365
Phe Ala Leu Ser Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro
    370                 375                 380
Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu
385                 390                 395                 400
Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu
                405                 410                 415
Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr
            420                 425                 430
Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg
        435                 440                 445
Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp
    450                 455                 460
Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr
465                 470                 475                 480
Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala
                485                 490                 495
Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro
            500                 505                 510
Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly
        515                 520                 525
Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr
    530                 535                 540
Asp Pro Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile
545                 550                 555                 560
Lys Val Asp Gly Val Val Ala Lys Lys Arg Lys Pro Tyr Cys Val Asp
                565                 570                 575
Phe Ser Ala Ile Arg Pro Gln Ile Thr Leu Leu Arg Glu Met Arg Val
            580                 585                 590
Thr His Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly
        595                 600                 605
Asn Gln Thr Gln Val Asn His Thr Val Leu His Phe Tyr Arg Cys Met
    610                 615                 620
Ile Ser Glu Leu Val His Ala Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp
625                 630                 635                 640
Gln Pro Ala Ala Pro His Gln Gly Leu Pro His Ala Leu Ala Lys His
                645                 650                 655
Gly Ala Trp Glu Asn Pro His Thr Ala Leu Ala Phe Ala Asp Tyr Ala
            660                 665                 670
Asn Leu Cys Phe Lys Glu Leu Gly His Trp Val Asn Leu Trp Ile Thr
        675                 680                 685
Met Asn Glu Pro Asn Thr Arg Asn Met Thr Tyr Arg Ala Gly His His
    690                 695                 700
Leu Leu Arg Ala His Ala Leu Ala Trp His Leu Tyr Asp Asp Lys Phe
705                 710                 715                 720
Arg Ala Ala Gln Lys Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp
                725                 730                 735
Ile Glu Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Asn Asp Lys Glu Val Ala Glu
            740                 745                 750
Arg Val Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly
        755                 760                 765
Ser Gly Asp Tyr Pro Arg Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Lys Asn
    770                 775                 780
Asn Phe Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Val Arg
785                 790                 795                 800
Gly Ser Phe Asp Phe Leu Ala Val Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val
                805                 810                 815
Asp Trp Glu Lys Glu Asp Pro Met Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val
            820                 825                 830
Gln Glu Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala
        835                 840                 845
Val Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Arg Phe Lys
    850                 855                 860
Tyr Gly Asp Leu Pro Met Tyr Val Thr Ala Asn Gly Ile Asp Asp Asp
865                 870                 875                 880
Pro His Ala Glu Gln Asp Ser Leu Arg Ile Tyr Tyr Ile Lys Asn Tyr
                885                 890                 895
Val Asn Glu Ala Leu Lys Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ile Asn Leu Cys
            900                 905                 910
Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser Leu Ser Asp Arg Ser Ala Pro Lys Ser Gly
        915                 920                 925
Phe Tyr Arg Tyr Ala Ala Asn Gln Phe Glu Pro Lys Pro Ser Met Lys
    930                 935                 940
His Tyr Arg Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Leu Gly Ser Gly Thr
945                 950                 955                 960
Leu Gly Arg Phe Cys Pro Glu Glu Tyr Thr Val Cys Thr Glu Cys Gly
                965                 970                 975
Phe Phe Gln Thr Arg Lys Ser Leu Leu Val Phe Ile Ser Phe Leu Val
            980                 985                 990
Phe Thr Phe Ile Ile Ser Leu Ala Leu Ile Phe His Tyr Ser Lys Lys
        995                 1000                1005
Gly Gln Arg Ser Tyr Lys
    1010
序列号：4
序列长度：550
序列类型：氨基酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：蛋白质
起源：
  生物名：小鼠
  脏器：肾脏
序列
Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu
  1               5                  10                  15
Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys
             20                  25                  30
Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala
         35                  40                  45
Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro
     50                  55                  60
Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr
                 85                  90                  95
His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser
        115                 120                 125
Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu
    130                 135                 140
Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro
145                 150                 155                 160
Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg
                165                 170                 175
Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr
            180                 185                 190
Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly
        195                 200                 205
Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp
225                 230                 235                 240
Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn
            260                 265                 270
Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe
        275                 280                 285
Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp
    290                 295                 300
Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys
305                 310                 315                 320
Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp
                325                 330                 335
Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro
            340                 345                 350
Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe
        355                 360                 365
Phe Ala Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro
    370                 375                 380
Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu
385                 390                 395                 400
Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu
                405                 410                 415
Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr
            420                 425                 430
Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg
        435                 440                 445
Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp
    450                 455                 460
Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr
465                 470                 475                 480
Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala
                485                 490                 495
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        515                 520                 525
Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Val
    530                 535                 540
Gly Leu Leu Leu Pro His
545                 550
序列号：5
序列长度：1,015
序列类型：氨基酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：蛋白质
起源：
  生物名：人
  脏器：胰脏
序列
Met Ser Asn Gly Gly Leu Gln Arg Ser Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile
  1               5                  10                  15
Leu Leu Arg Ala Val Thr Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ile Trp
             20                  25                  30
Ser Lys Asn Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln Leu Phe Leu
         35                  40                  45
Tyr Gly Thr Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Ile Gly Thr Gly Ala
     50                  55                  60
Leu Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile
 65                  70                  75                  80
Trp Asp His Phe Ile His Thr His Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Asn
                 85                  90                  95
Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser Ala Leu
            100                 105                 110
Asp Phe Ile Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg
        115                 120                 125
Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys Gly Leu Gln
    130                 135                 140
Tyr Tyr Ser Thr Leu Leu Asp Ala Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro
145                 150                 155                 160
Ile Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Gln Glu Lys
                165                 170                 175
Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe Asn Asp Tyr
            180                 185                 190
Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Met Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile
        195                 200                 205
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225                 230                 235                 240
Gly His Asn Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asn
                245                 250                 255
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        275                 280                 285
Lys Cys Gln Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro
    290                 295                 300
Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Arg Lys Lys Leu Phe
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Pro Ile Phe Ser Glu Ala Glu Lys His Glu Met Arg Gly
                325                 330                 335
Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Lys Pro
            340                 345                 350
Leu Asn Thr Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg
        355                 360                 365
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    370                 375                 380
Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Arg Val Lys Thr Glu Asp
385                 390                 395                 400
Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln Val Leu Gln
                405                 410                 415
Ala Ile Arg Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Ser
            420                 425                 430
Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile Arg Arg Gly
        435                 440                 445
Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys
    450                 455                 460
Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn Gly Phe Ser
465                 470                 475                 480
Leu Lys Glu Ser Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro Cys Asp Phe
                485                 490                 495
Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser Val Ala Ser
            500                 505                 510
Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Ala Thr Gly
        515                 520                 525
Asn Arg Leu Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro
    530                 535                 540
Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu Glu Met Leu
545                 550                 555                 560
Ala Arg Met Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Trp Ala Ser
                565                 570                 575
Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln Ala Leu Arg
            580                 585                 590
Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser Ala
        595                 600                 605
Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly Leu Pro Glu
    610                 615                 620
Pro Leu Leu His Ala Asp Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr Ala Glu Ala
625                 630                 635                 640
Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly Asp Leu Val
                645                 650                 655
Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Ile Tyr
            660                 665                 670
Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn Leu Leu Val
        675                 680                 685
Ala His Ala Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Gln Gln Phe Arg Pro Ser
    690                 695                 700
Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp Ala Glu Pro
705                 710                 715                 720
Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu Arg Phe Leu
                725                 730                 735
Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp
            740                 745                 750
Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His Arg Arg Gly
        755                 760                 765
Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu
    770                 775                 780
Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg
785                 790                 795                 800
Phe Val Met His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ser Asp Arg
                805                 810                 815
Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Thr Arg
            820                 825                 830
Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg
        835                 840                 845
Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser Gly Ile Asp
    850                 855                 860
Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys
865                 870                 875                 880
Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Arg Ile
                885                 890                 895
Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg
            900                 905                 910
Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile Gln Phe
        915                 920                 925
Tyr Asn Lys Val Ile Ser Ser Arg Gly Phe Pro Phe Glu Asn Ser Ser
    930                 935                 940
Ser Arg Cys Ser Gln Thr Gln Glu Asn Thr Glu Cys Thr Val Cys Leu
945                 950                 955                 960
Phe Leu Val Gln Lys Lys Pro Leu Ile Phe Leu Gly Cys Cys Phe Phe
                965                 970                 975
Ser Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Ile Ala Ile Phe Gln Arg Gln Lys
            980                 985                 990
Arg Arg Lys Phe Trp Lys Ala Lys Asn Leu Gln His Ile Pro Leu Lys
        995                 1000                1005
Lys Gly Lys Arg Val Val Ser
    1010                1015
序列号：6
序列长度：3,163
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑学：直链
序列种类：cDNA至mRNA
起源：
  生物名：人
  脏器：肾脏
序列特征
  表示特征的记号：CDS
  存在位置：9..3047
  决定特征的方法：实验方法
序列
CGCGCAGC ATG CCC GCC AGC GCC CCG CCG CGC CGC CCG CGG CCG CCG CCG   50
         Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro
           1               5                  10
CCG TCG CTG TCG CTG CTG CTG GTG CTG CTG GGC CTG GGC GGC CGC CGC    98
Pro Ser Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg
 15                  20                  25                  30
CTG CGT GCG GAG CCG GGC GAC GGC GCG CAG ACC TGG GCC CGT GTC TCG    146
Leu Arg Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser
                 35                  40                  45
CGG CCT CCT GCC CCC GAG GCC GCG GGC CTC TTC CAG GGC ACC TTC CCC    194
Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro
             50                  55                  60
GAC GGC TTC CTC TGG GCC GTG GGC AGC GCC GCC TAC CAG ACC GAG GGC    242
Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly
         65                  70                  75
GGC TGG CAG CAG CAC GGC AAG GGT GCG TCC ATC TGG GAC ACG TTC ACC    290
Gly Trp Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr
 80                  85                  90
CAC CAC CCC CTG GCA CCC CCG GGA GAC TCC CGG AAC GCC AGT CTG CCG    338
His His Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro
 95                 100                 105                 110
TTG GGC GCC CCG TCG CCG CTG CAG CCC GCC ACC GGG GAC GTA GCC AGC    386
Leu Gly Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser
                115                 120                 125
GAC AGC TAC AAC AAC GTC TTC CGC GAC ACG GAG GCG CTG CGC GAG CTC    434
Asp Ser Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu
            130                 135                 140
GGG GTC ACT CAC TAC CGC TTC TCC ATC TCG TGG GCG CGA GTG CTC CCC    482
Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro
        145                 150                 155
AAT GGC AGC GCG GGC GTC CCC AAC CGC GAG GGG CTG CGC TAC TAC CGG    530
Asn Gly Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg
    160                 165                 170
CGC CTG CTG GAG CGG CTG CGG GAG CTG GGC GTG CAG CCC GTG GTC ACC    578
Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr
175                 180                 185                 190
CTG TAC CAC TGG GAC CTG CCC CAG CGC CTG CAG GAC GCC TAC GGC GGC    626
Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly
                195                 200                 205
TGG GCC AAC CGC GCC CTG GCC GAC CAC TTC AGG GAT TAC GCG GAG CTC    674
Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu
            210                 215                 220
TGC TTC CGC CAC TTC GGC GGT CAG GTC AAG TAC TGG ATC ACC ATC GAC    722
Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp
        225                 230                 235
AAC CCC TAC GTG GTG GCC TGG CAC GGC TAC GCC ACC GGG CGC CTG GCC    770
Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala
    240                 245                 250
CCC GGC ATC CGG GGC AGC CCG CGG CTC GGG TAC CTG GTG GCG CAC AAC    818
Pro Gly Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn
255                 260                 265                 270
CTC CTC CTG GCT CAT GCC AAA GTC TGG CAT CTC TAC AAT ACT TCT TTC    866
Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe
                275                 280                 285
CGT CCC ACT CAG GGA GGT CAG GTG TCC ATT GCC CTA AGC TCT CAC TGG    914
Arg Pro Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp
            290                 295                 300
ATC AAT CCT CGA AGA ATG ACC GAC CAC AGC ATC AAA GAA TGT CAA AAA    962
Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys
        305                 310                 315
TCT CTG GAC TTT GTA CTA GGT TGG TTT GCC AAA CCC GTA TTT ATT GAT    1010
Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp
    320                 325                 330
GGT GAC TAT CCC GAG AGC ATG AAG AAT AAC CTT TCA TCT ATT CTG CCT    1058
Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro
335                 340                 345                 350
GAT TTT ACT GAA TCT GAG AAA AAG TTC ATC AAA GGA ACT GCT GAC TTT    1106
Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe
                355                 360                 365
TTT GCT CTT TGC TTT GGA CCC ACC TTG AGT TTT CAA CTT TTG GAC CCT    1154
Phe Ala Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro
            370                 375                 380
CAC ATG AAG TTC CGC CAA TTG GAA TCT CCC AAC CTG AGG CAA CTG CTT    1202
His Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu
        385                 390                 395
TCC TGG ATT GAC CTT GAA TTT AAC CAT CCT CAA ATA TTT ATT GTG GAA    1250
Ser Trp Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu
    400                 405                 410
AAT GGC TGG TTT GTC TCA GGG ACC ACC AAG AGA GAT GAT GCC AAA TAT    1298
Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr
415                 420                 425                 430
ATG TAT TAC CTC AAA AAG TTC ATC ATG GAA ACC TTA AAA GCC ATC AAG    1346
Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys
                435                 440                 445
CTG GAT GGG GTG GAT GTC ATC GGG TAT ACC GCA TGG TCC CTC ATG GAT    1394
Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp
            450                 455                 460
GGT TTC GAG TGG CAC AGA GGT TAC AGC ATC AGG CGT GGA CTC TTC TAT    1442
Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr
        465                 470                 475
GTT GAC TTT CTA AGC CAG GAC AAG ATG TTG TTG CCA AAG TCT TCA GCC    1490
Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala
    480                 485                 490
TTG TTC TAC CAA AAG CTG ATA GAG AAA AAT GGC TTC CCT CCT TTA CCT    1538
Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro
495                 500                 505                 510
GAA AAT CAG CCC CTA GAA GGG ACA TTT CCC TGT GAC TTT GCT TGG GGA    1586
Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly
                515                 520                 525
GTT GTT GAC AAC TAC ATT CAA GTA GAT ACC ACT CTG TCT CAG TTT ACC    1634
Val Val Asp Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr
            530                 535                 540
GAC CTG AAT GTT TAC CTG TGG GAT GTC CAC CAC AGT AAA AGG CTT ATT    1682
Asp Leu Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile
        545                 550                 555
AAA GTG GAT GGG GTT GTG ACC AAG AAG AGG AAA TCC TAC TGT GTT GAC    1730
Lys Val Asp Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp
    560                 565                 570
TTT GCT GCC ATC CAG CCC CAG ATC GCT TTA CTC CAG GAA ATG CAC GTT    1778
Phe Ala Ala Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val
575                 580                 585                 590
ACA CAT TTT CGC TTC TCC CTG GAC TGG GCC CTG ATT CTC CCT CTG GGT    1826
Thr His Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly
                595                 600                 605
AAC CAG TCC CAG GTG AAC CAC ACC ATC CTG CAG TAC TAT CGC TGC ATG    1874
Asn Gln Ser Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met
            610                 615                 620
GCC AGC GAG CTT GTC CGT GTC AAC ATC ACC CCA GTG GTG GCC CTG TGG    1922
Ala Ser Glu Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp
        625                 630                 635
CAG CCT ATG GCC CCG AAC CAA GGA CTG CCG CGC CTC CTG GCC AGG CAG    1970
Gln Pro Met Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln
    640                 645                 650
GGC GCC TGG GAG AAC CCC TAC ACT GCC CTG GCC TTT GCA GAG TAT GCC    2018
Gly Ala Trp Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala
655                 660                 665                 670
CGA CTG TGC TTT CAA GAG CTC GGC CAT CAC GTC AAG CTT TGG ATA ACG    2066
Arg Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr
                675                 680                 685
ATG AAT GAG CCG TAT ACA AGG AAT ATG ACA TAC AGT GCT GGC CAC AAC    2114
Met Asn Glu Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn
            690                 695                 700
CTT CTG AAG GCC CAT GCC CTG GCT TGG CAT GTG TAC AAT GAA AAG TTT    2162
Leu Leu Lys Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe
        705                 710                 715
AGG CAT GCT CAG AAT GGG AAA ATA TCC ATA GCC TTG CAG GCT GAT TGG    2210
Arg His Ala Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp
    720                 725                 730
 ATA GAA CCT GCC TGC CCT TTC TCC CAA AAG GAC AAA GAG GTG GCC GAG    2258
Ile Glu Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu
735                 740                 745                 750
AGA GTT TTG GAA TTT GAC ATT GGC TGG CTG GCT GAG CCC ATT TTC GGC    2306
Arg Val Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly
                755                 760                 765
TCT GGA GAT TAT CCA TGG GTG ATG AGG GAC TGG CTG AAC CAA AGA AAC    2354
Ser Gly Asp Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn
            770                 775                 780
AAT TTT CTT CTT CCT TAT TTC ACT GAA GAT GAA AAA AAG CTA ATC CAG    2402
Asn Phe Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln
        785                 790                 795
GGT ACC TTT GAC TTT TTG GCT TTA AGC CAT TAT ACC ACC ATC CTT GTA    2450
Gly Thr Phe Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val
    800                 805                 810
GAC TCA GAA AAA GAA GAT CCA ATA AAA TAC AAT GAT TAC CTA GAA GTG    2498
Asp Ser Glu Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val
815                 820                 825                 830
CAA GAA ATG ACC GAC ATC ACG TGG CTC AAC TCC CCC AGT CAG GTG GCG    2546
Gln Glu Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala
                835                 840                 845
GTA GTG CCC TGG GGG TTG CGC AAA GTG CTG AAC TGG CTG AAG TTC AAG    2594
Val Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys
            850                 855                 860
TAC GGA GAC CTC CCC ATG TAC ATA ATA TCC AAC GGA ATC GAT GAC GGG    2642
Tyr Gly Asp Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly
        865                 870                 875
CTG CAT GCT GAG GAC GAC CAG CTG AGG GTG TAT TAT ATG CAG AAT TAC    2690
Leu His Ala Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr
    880                 885                 890
ATA AAC GAA GCT CTC AAA GCC CAC ATA CTG GAT GGT ATC AAT CTT TGC    2738
Ile Asn Glu Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys
895                 900                 905                 910
GGA TAC TTT GCT TAT TCG TTT AAC GAC CGC ACA GCT CCG AGG TTT GGC    2786
Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly
                915                 920                 925
CTC TAT CGT TAT GCT GCA GAT CAG TTT GAG CCC AAG GCA TCC ATG AAA    2834
Leu Tyr Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys
            930                 935                 940
CAT TAC AGG AAA ATT ATT GAC AGC AAT GGT TTC CCG GGC CCA GAA ACT    2882
His Tyr Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr
        945                 950                 955
CTG GAA AGA TTT TGT CCA GAA GAA TTC ACC GTG TGT ACT GAG TGC AGT    2930
Leu Glu Arg Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser
    960                 965                 970
TTT TTT CAC ACC CGA AAG TCT TTA CTG GCT TTC ATA GCT TTT CTA TTT    2978
Phe Phe His Thr Arg Lys Ser Leu Leu Ala Phe Ile Ala Phe Leu Phe
975                 980                 985                 990
TTT GCT TCT ATT ATT TCT CTC TCC CTT ATA TTT TAC TAC TCG AAG AAA    3026
Phe Ala Ser Ile Ile Ser Leu Ser Leu Ile Phe Tyr Tyr Ser Lys Lys
                995                 1000                1005
GGC AGA AGA AGT TAC AAA TAGTTCTGAA CATTTTTCTA TTCATTCATT           3074
Gly Arg Arg Ser Tyr Lys
            1010
TTGAAATAAT TATGCAGACA CATCAGCTGT TAACCATTTG CACCTCTAAG TGTTGTGAAA  3134
CTGTAAATTT CATACATTTG ACTTCTAGA                                    3163
序列号：7
序列长度：3,435
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑学：直链
序列种类：cDNA至mRNA
起源：
  生物名：人
  脏器：肾脏
序列特征
  表示特征的记号：CDS
  存在位置：9..1655
  决定特征的方法：实验方法
序列
CGCGCAGC ATG CCC GCC AGC GCC CCG CCG CGC CGC CCG CGG CCG CCG CCG    50
         Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro
            1                5                 10
CCG TCG CTG TCG CTG CTG CTG GTG CTG CTC GGC CTG GGC GGC CGC CGC    98
Pro Ser Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg
 15                  20                  25                  30
CTG CGT GCG GAG CCG GGC GAC GGC GCG CAG ACC TGG GCC CGT GTC TCG    146
Leu Arg Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser
                 35                  40                  45
CGG CCT CCT GCC CCC GAG GCC GCG GGC CTC TTC CAG GGC ACC TTC CCC    194
Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro
             50                  55                  60
GAC GGC TTC CTC TGG GCC GTG GGC AGC GCC GCC TAC CAG ACC GAG GGC    242
Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly
         65                  70                  75
GGC TGG CAG CAG CAC GGC AAG GGT GCG TCC ATC TGG GAC ACG TTC ACC    290
Gly Trp Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr
     80                  85                  90
CAC CAC CCC CTG GCA CCC CCG GGA GAC TCC CGG AAC GCC AGT CTG CCG    338
His His Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro
 95                 100                 105                 110
TTG GGC GCC CCG TCG CCG CTG CAG CCC GCC ACC GGG GAC GTA GCC AGC    386
Leu Gly Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser
                115                 120                 125
GAC AGC TAC AAC AAC GTC TTC CGC GAC ACG GAG GCG CTG CGC GAG CTC    434
Asp Ser Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu
            130                 135                 140
GGG GTC ACT CAC TAC CGC TTC TCC ATC TCG TGG GCG CGA GTG CTC CCC    482
Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro
        145                 150                 155
AAT GGC AGC GCG GGC GTC CCC AAC CGC GAG GGG CTG CGC TAC TAC CGG    530
Asn Gly Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg
    160                 165                 170
CGC CTG CTG GAG CGG CTG CGG GAG CTG GGC GTG CAG CCC GTG GTC ACC    578
Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr
175                 180                 185                 190
CTG TAC CAC TGG GAC CTG CCC CAG CGC CTG CAG GAC GCC TAC GGC GGC    626
Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly
                195                 200                 205
TGG GCC AAC CGC GCC CTG GCC GAC CAC TTC AGG GAT TAC GCG GAG CTC    674
Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu
            210                 215                 220
TGC TTC CGC CAC TTC GGC GGT CAG GTC AAG TAC TGG ATC ACC ATC GAC    722
Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp
        225                 230                 235
AAC CCC TAC GTG GTG GCC TGG CAC GGC TAC GCC ACC GGG CGC CTG GCC    770
Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala
    240                 245                 250
CCC GGC ATC CGG GGC AGC CCG CGG CTC GGG TAC CTG GTG GCG CAC AAC    818
Pro Gly Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn
255                 260                 265                 270
CTC CTC CTG GCT CAT GCC AAA GTC TGG CAT CTC TAC AAT ACT TCT TTC    866
Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe
                275                 280                 285
CGT CCC ACT CAG GGA GGT CAG GTG TCC ATT GCC CTA AGC TCT CAC TGG    914
Arg Pro Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp
            290                 295                 300
ATC AAT CCT CGA AGA ATG ACC GAC CAC AGC ATC AAA GAA TGT CAA AAA    962
Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys
        305                 310                 315
TCT CTG GAC TTT GTA CTA GGT TGG TTT GCC AAA CCC GTA TTT ATT GAT    1010
Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp
    320                 325                 330
GGT GAC TAT CCC GAG AGC ATG AAG AAT AAC CTT TCA TCT ATT CTG CCT    1058
Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro
335                 340                 345                 350
GAT TTT ACT GAA TCT GAG AAA AAG TTC ATC AAA GGA ACT GCT GAC TTT    1106
Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe
                355                 360                 365
TTT GCT CTT TGC TTT GGA CCC ACC TTG AGT TTT CAA CTT TTG GAC CCT    1154
Phe Ala Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro
            370                 375                 380
CAC ATG AAG TTC CGC CAA TTG GAA TCT CCC AAC CTG AGG CAA CTG CTT    1202
His Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu
        385                 390                 395
TCC TGG ATT GAC CTT GAA TTT AAC CAT CCT CAA ATA TTT ATT GTG GAA    1250
Ser Trp Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu
    400                 405                 410
AAT GGC TGG TTT GTC TCA GGG ACC ACC AAG AGA GAT GAT GCC AAA TAT    1298
Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr
415                 420                 425                 430
ATG TAT TAC CTC AAA AAG TTC ATC ATG GAA ACC TTA AAA GCC ATC AAG    1346
Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys
                435                 440                 445
CTG GAT GGG GTG GAT GTC ATC GGG TAT ACC GCA TGG TCC CTC ATG GAT    1394
Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp
            450                 455                 460
GGT TTC GAG TGG CAC AGA GGT TAC AGC ATC AGG CGT GGA CTC TTC TAT    1442
Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr
        465                 470                 475
GTT GAC TTT CTA AGC CAG GAC AAG ATG TTG TTG CCA AAG TCT TCA GCC    1490
Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala
    480                 485                 490
TTG TTC TAC CAA AAG CTG ATA GAG AAA AAT GGC TTC CCT CCT TTA CCT    1538
Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro
495                 500                 505                 510
GAA AAT CAG CCC CTA GAA GGG ACA TTT CCC TGT GAC TTT GCT TGG GGA    1586
Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly
                515                 520                 525
GTT GTT GAC AAC TAC ATT CAA GTA AGT CAG CTG ACA AAA CCA ATC AGC    1634
Val Val Asp Asn Tyr Ile Gln Val Ser Gln Leu Thr Lys Pro Ile Ser
            530                 535                 540
AGT CTC ACC AAG CCC TAT CAC TAGTAGATAC CACTCTGTCT CAGTTTACCG       1685
Ser Leu Thr Lys Pro Tyr His
        545
ACCTGAATGT TTACCTGTGG GATGTCCACC ACAGTAAAAG GCTTATTAAA GTGGATGGGG  1745
TTGTGACCAA GAAGAGGAAA TCCTACTGTG TTGACTTTGC TGCCATCCAG CCCCAGATCG  1805
CTTTACTCCA GGAAATGCAC GTTACACATT TTCGCTTCTC CCTGGACTGG GCCCTGATTC  1865
TCCCTCTGGG TAACCAGTCC CAGGTGAACC ACACCATCCT GCAGTACTAT CGCTGCATGG  1925
CCAGCGAGCT TGTCCGTGTC AACATCACCC CAGTGGTGGC CCTGTGGCAG CCTATGGCCC  1985
CGAACCAAGG ACTGCCGCGC CTCCTGGCCA GGCAGGGCGC CTGGGAGAAC CCCTACACTG  2045
CCCTGGCCTT TGCAGAGTAT GCCCGACTGT GCTTTCAAGA GCTCGGCCAT CACGTCAAGC  2105
TTTGGATAAC GATGAATGAG CCGTATACAA GGAATATGAC ATACAGTGCT GGCCACAACC  2165
TTCTGAAGGC CCATGCCCTG GCTTGGCATG TGTACAATGA AAAGTTTAGG CATGCTCAGA  2225
ATGGGAAAAT ATCCATAGCC TTGCAGGCTG ATTGGATAGA ACCTGCCTGC CCTTTCTCCC  2285
AAAAGGACAA AGAGGTGGCC GAGAGAGTTT TGGAATTTGA CATTGGCTGG CTGGCTGAGC  2345
CCATTTTCGG CTCTGGAGAT TATCCATGGG TGATGAGGGA CTGGCTGAAC CAAAGAAACA  2405
ATTTTCTTCT TCCTTATTTC ACTGAAGATG AAAAAAAGCT AATCCAGGGT ACCTTTGACT  2465
TTTTGGCTTT AAGCCATTAT ACCACCATCC TTGTAGACTC AGAAAAAGAA GATCCAATAA  2525
AATACAATGA TTACCTAGAA GTGCAAGAAA TGACCGACAT CACGTGGCTC AACTCCCCCA  2585
GTCAGGTGGC GGTAGTGCCC TGGGGGTTGC GCAAAGTGCT GAACTGGCTG AAGTTCAAGT  2645
ACGGAGACCT CCCCATGTAC ATAATATCCA ACGGAATCGA TGACGGGCTG CATGCTGAGG  2705
ACGACCAGCT GAGGGTGTAT TATATGCAGA ATTACATAAA CGAAGCTCTC AAAGCCCACA  2765
TACTGGATGG TATCAATCTT TGCGGATACT TTGCTTATTC GTTTAACGAC CGCACAGCTC  2825
CGAGGTTTGG CCTCTATCGT TATGCTGCAG ATCAGTTTGA GCCCAAGGCA TCCATGAAAC  2885
ATTACAGGAA AATTATTGAC AGCAATGGTT TCCCGGGCCC AGAAACTCTG GAAAGATTTT  2945
GTCCAGAAGA ATTCACCGTG TGTACTGAGT GCAGTTTTTT TCACACCCGA AAGTCTTTAC  3005
TGGCTTTCAT AGCTTTTCTA TTTTTTGCTT CTATTATTTC TCTCTCCCTT ATATTTTACT  3065
ACTCGAAGAA AGGCAGAAGA AGTTACAAAT AGTTCTGAAC ATTTTTCTAT TCATTCATTT  3125
TGAAATAATT ATGCAGACAC ATCAGCTGTT AACCATTTGC ACCTCTAAGT GTTGTGAAAC  3185
TGTAAATTTC ATACATTTGA CTTCTAGAAA ACATTTTTGT GGCTTATGAC AGAGGTTTTG  3245
AAATGGGCAT AGGTGATCGT AAAATATTGA ATAATGCGAA TAGTGCCTGA ATTTGTTCTC  3305
TTTTTGGGTG ATTAAAAAAC TGACAGGCAC TATAATTTCT GTAACACACT AACAAAAGCA  3365
TGAAAAATAG GAACCACACC AATGCAACAT TTGTGCAGAA ATTTGAATGA CAAGATTAGG  3425
AATATTTTCT                                                         3435
序列号：8
序列长度：5,032
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑学：直链
序列种类：cDNA至mRNA
起源：
  生物名：小鼠
  脏器：肾脏
序列特征
  表示特征的记号：CDS
  存在位置：19..3060
  决定特征的方法：实验方法
序列
CCTCCCGGCT CCCGCAGC ATG CTA GCC CGC GCC CCT CCT CGC CGC CCG CCG    51
                    Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro
                      1               5                  10
CGG CTG GTG CTG CTC CGT TTG CTG TTG CTG CAT CTG CTG CTG CTC GCC    99
Arg Leu Val Leu Leu Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala
             15                  20                  25
CTG CGC GCC CGC TGC CTG AGC GCT GAG CCG GGT CAG GGC GCG CAG ACC    147
Leu Arg Ala Arg Cys Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr
         30                  35                  40
TGG GCT CGC TTC GCG CGC GCT CCT GCC CCA GAG GCC GCT GGC CTC CTC    195
Trp Ala Arg Phe Ala Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu
     45                  50                  55
CAC GAC ACC TTC CCC GAC GGT TTC CTC TGG GCG GTA GGC AGC GCC GCC    243
His Asp Thr Phe Pro Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala
 60                  65                  70                  75
TAT CAG ACC GAG GGC GGC TGG CGA CAG CAC GGC AAA GGC GCG TCC ATC    291
Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile
                 80                  85                  90
TGG GAC ACT TTC ACC CAT CAC TCT GGG GCG GCC CCG TCC GAC TCC CCG    339
Trp Asp Thr Phe Thr His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro
             95                 100                 105
ATC GTC GTG GCG CCG TCG GGT GCC CCG TCG CCT CCC CTG TCC TCC ACT    387
Ile Val Val Ala Pro Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr
        110                 115                 120
GGA GAT GTG GCC AGC GAT AGT TAC AAC AAC GTC TAC CGC GAC ACA GAG    435
Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu
    125                 130                 135
GGG CTG CGC GAA CTG GGG GTC ACC CAC TAC CGC TTC TCC ATA TCG TGG    483
Gly Leu Arg Glu Leu Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp
140                 145                 150                 155
GCG CGG GTG CTC CCC AAT GGC ACC GCG GGC ACT CCC AAC CGC GAG GGG    531
Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly
                160                 165                 170
CTG CGC TAC TAC CGG CGG CTG CTG GAG CGG CTG CGG GAG CTG GGC GTG    579
Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val
            175                 180                 185
CAG CCG GTG GTT ACC CTG TAC CAT TGG GAC CTG CCA CAG CGC CTG CAG    627
Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln
        190                 195                 200
GAC ACC TAT GGC GGA TGG GCC AAT CGC GCC CTG GCC GAC CAT TTC AGG    675
Asp Thr Tyr Gly Gly Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg
    205                 210                 215
GAT TAT GCC GAG CTC TGC TTC CGC CAC TTC GGT GGT CAG GTC AAG TAC    723
Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr
220                 225                 230                 235
TGG ATC ACC ATT GAC AAC CCC TAC GTG GTG GCC TGG CAC GGG TAT GCC    771
Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala
                240                 245                 250
ACC GGG CGC CTG GCC CCG GGC GTG AGG GGC AGC TCC AGG CTC GGG TAC    819
Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr
            255                 260                 265
CTG GTT GCC CAC AAC CTA CTT TTG GCT CAT GCC AAA GTC TGG CAT CTC    867
Leu Val Ala His Asn Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu
        270                 275                 280
TAC AAC ACC TCT TTC CGC CCC ACA CAG GGA GGC CGG GTG TCT ATC GCC    915
Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala
    285                 290                 295
TTA AGC TCC CAT TGG ATC AAT CCT CGA AGA ATG ACT GAC TAT AAT ATC    963
Leu Ser Ser His Trp Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile
300                 305                 310                 315
AGA GAA TGC CAG AAG TCT CTT GAC TTT GTG CTA GGC TGG TTT GCC AAA    1011
Arg Glu Cys Gln Lys Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys
                320                 325                 330
CCC ATA TTT ATT GAT GGC GAC TAC CCA GAG AGT ATG AAG AAC AAC CTC    1059
Pro Ile Phe Ile Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu
            335                 340                 345
TCG TCT CTT CTG CCT GAT TTT ACT GAA TCT GAG AAG AGG CTC ATC AGA    1107
Ser Ser Leu Leu Pro Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg
        350                 355                 360
GGA ACT GCT GAC TTT TIT GCT CTC TCC TTC GGA CCA ACC TTG AGC TTT    1155
Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Leu Ser Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe
    365                 370                 375
CAG CTA TTG GAC CCT AAC ATG AAG TTC CGC CAA TTG GAG TCT CCC AAC    1203
Gln Leu Leu Asp Pro Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn
380                 385                 390                 395
CTG AGG CAG CTT CTG TCT TGG ATA GAT CTG GAA TAT AAC CAC CCT CCA    1251
Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp Lle Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro
                400                 405                 410
ATA TTT ATT GTG GAA AAT GGC TGG TTT GTC TCG GGA ACC ACC AAA AGG    1299
Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg
            415                 420                 425
GAT GAT GCC AAA TAT ATG TAT TAT CTC AAG AAG TTC ATA ATG GAA ACC    1347
Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr
        430                 435                 440
TTA AAA GCA ATC AGA CTG GAT GGG GTC GAC GTC ATT GGG TAC ACC GCG    1395
Leu Lys Ala Ile Arg Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala
    445                 450                 455
TGG TCG CTC ATG GAC GGT TTC GAG TGG CAT AGG GGC TAC AGC ATC CGG    1443
Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg
460                 465                 470                 475
CGA GGA CTC TTC TAC GTT GAC TTT CTG AGT CAG GAC AAG GAG CTG TTG    1491
Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu
                480                 485                 490
CCA AAG TCT TCG GCC TTG TTC TAC CAA AAG CTG ATA GAG GAC AAT GGC    1539
Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly
            495                 500                 505
TTT CCT CCT TTA CCT GAA AAC CAG CCC CTT GAA GGG ACA TTT CCC TGT    1587
Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys
        510                 515                 520
GAC TTT GCT TGG GGA GTT GTT GAC AAC TAC GTT CAA GTG GAC ACT ACT    1635
Asp Phe Ala Trp Gly Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val Asp Thr Thr
    525                 530                 535
CTC TCT CAG TTT ACT GAC CCG AAT GTC TAT CTG TGG GAT GTG CAT CAC    1683
Leu Ser Gln Phe Thr Asp Pro Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His
540                 545                 550                 555
AGT AAG AGG CTT ATT AAA GTA GAC GGG GTT GTA GCC AAG AAG AGA AAA    1731
Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val Asp Gly Val Val Ala Lys Lys Arg Lys
                560                 565                 570
CCT TAC TGT GTT GAT TTC TCT GCC ATC CGG CCT CAG ATA ACC TTA CTT    1779
Pro Tyr Cys Val Asp Phe Ser Ala Ile Arg Pro Gln Ile Thr Leu Leu
            575                 580                 585
CGA GAA ATG CGG GTC ACC CAC TTT CGC TTC TCC CTG GAC TGG GCC CTG    1827
Arg Glu Met Arg Val Thr His Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu
        590                 595                 600
ATC TTG CCT CTG GGT AAC CAG ACC CAA GTG AAC CAC ACG GTT CTG CAC    1875
Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln Thr Gln Val Asn His Thr Val Leu His
    605                 610                 615
TTC TAC CGC TGC ATG ATC AGC GAG CTG GTG CAC GCC AAC ATC ACT CCA    1923
Phe Tyr Arg Cys Met Ile Ser Glu Leu Val His Ala Asn Ile Thr Pro
620                 625                 630                 635
GTG GTG GCC CTG TGG CAG CCA GCA GCC CCG CAC CAA GGC CTG CCA CAT    1971
Val Val Ala Leu Trp Gln Pro Ala Ala Pro His Gln Gly Leu Pro His
                640                 645                 650
GCC CTT GCA AAA CAT GGG GCC TGG GAG AAC CCG CAC ACT GCT CTG GCG    2019
Ala Leu Ala Lys His Gly Ala Trp Glu Asn Pro His Thr Ala Leu Ala
            655                 660                 665
TTT GCA GAC TAC GCA AAC CTG TGT TTT AAA GAG TTG GGT CAC TGG GTC    2067
Phe Ala Asp Tyr Ala Asn Leu Cys Phe Lys Glu Leu Gly His Trp Val
        670                 675                 680
AAT CTC TGG ATC ACC ATG AAC GAG CCA AAC ACA CGG AAC ATG ACC TAT    2115
Asn Leu Trp Ile Thr Met Asn Glu Pro Asn Thr Arg Asn Met Thr Tyr
    685                 690                 695
CGT GCC GGG CAC CAC CTC CTG AGA GCC CAT GCC TTG GCT TGG CAT CTG    2163
Arg Ala Gly His His Leu Leu Arg Ala His Ala Leu Ala Trp His Leu
700                 705                 710                 715
TAC GAT GAC AAG TTT AGG GCG GCT CAG AAA GGC AAA ATA TCC ATC GCC    2211
Tyr Asp Asp Lys Phe Arg Ala Ala Gln Lys Gly Lys Ile Ser Ile Ala
                720                 725                 730
TTG CAG GCT GAC TGG ATA GAA CCG GCC TGC CCT TTC TCT CAA AAT GAC    2259
Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Asn Asp
            735                 740                 745
AAA GAA GTG GCC GAG AGA GTT TTG GAA TTT GAT ATA GGC TGG CTG GCA    2307
Lys Glu Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala
        750                 755                 760
GAG CCT ATT TTT GGT TCC GGA GAT TAT CCA CGT GTG ATG AGG GAC TGG    2355
Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly Asp Tyr Pro Arg Val Met Arg Asp Trp
    765                 770                 775
CTG AAC CAA AAA AAC AAT TTT CTT TTG CCC TAT TTC ACC GAA GAT GAA    2403
Leu Asn Gln Lys Asn Asn Phe Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu
780                 785                 790                 795
AAA AAG CTA GTC CGG GGT TCC TTT GAC TTC CTG GCG GTG AGT CAT TAC    2451
Lys Lys Leu Val Arg Gly Ser Phe Asp Phe Leu Ala Val Ser His Tyr
                800                 805                 810
ACC ACC ATT CTG GTA GAC TGG GAA AAG GAG GAT CCG ATG AAA TAC AAC    2499
Thr Thr Ile Leu Val Asp Trp Glu Lys Glu Asp Pro Met Lys Tyr Asn
            815                 820                 825
GAT TAC TTG GAG GTA CAG GAG ATG ACT GAC ATC ACA TGG CTC AAC TCT    2547
Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser
        830                 835                 840
CCC AGT CAG GTG GCA GTG GTG CCT TGG GGG CTG CGC AAA GTG CTC AAC    2595
Pro Ser Gln Val Ala Val Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn
    845                 850                 855
TGG CTA AGG TTC AAG TAC GGA GAC CTC CCG ATG TAT GTG ACA GCC AAT    2643
Trp Leu Arg Phe Lys Tyr Gly Asp Leu Pro Met Tyr Val Thr Ala Asn
860                 865                 870                 875
GGA ATC GAT GAT GAC CCC CAC GCC GAG CAA GAC TCA CTG AGG ATC TAT    2691
Gly Ile Asp Asp Asp Pro His Ala Glu Gln Asp Ser Leu Arg Ile Tyr
                880                 885                 890
TAT ATT AAG AAT TAT GTG AAT GAG GCT CTG AAA GCC TAC GTG TTG GAC    2739
Tyr Ile Lys Asn Tyr Val Asn Glu Ala Leu Lys Ala Tyr Val Leu Asp
            895                 900                 905
GAC ATC AAC CTT TGT GGC TAC TTT GCG TAT TCA CTT AGT GAT CGC TCA    2787
Asp Ile Asn Leu Cys Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser Leu Ser Asp Arg Ser
        910                 915                 920
GCT CCC AAG TCT GGC TTT TAT CGA TAT GCT GCG AAT CAG TTT GAG CCC    2835
Ala Pro Lys Ser Gly Phe Tyr Arg Tyr Ala Ala Asn Gln Phe Glu Pro
    925                 930                 935
AAA CCA TCT ATG AAA CAT TAC AGG AGA ATT ATT GAC AGC AAT GGC TTC    2883
Lys Pro Ser Met Lys His Tyr Arg Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe
940                 945                 950                 955
CTG GGT TCT GGA ACA CTG GGA AGG TTT TGT CCA GAA GAA TAC ACT GTG    2931
Leu Gly Ser Gly Thr Leu Gly Arg Phe Cys Pro Glu Glu Tyr Thr Val
                960                 965                 970
TGC ACC GAA TGT GGA TTT TTT CAA ACC CGG AAG TCT TTG CTG GTC TTC    2979
Cys Thr Glu Cys Gly Phe Phe Gln Thr Arg Lys Ser Leu Leu Val Phe
            975                 980                 985
ATC TCG TTT CTT GTT TTT ACT TTT ATT ATT TCT CTT GCT CTC ATT TTT    3027
Ile Ser Phe Leu Val Phe Thr Phe Ile Ile Ser Leu Ala Leu Ile Phe
        990                 995                 1000
CAC TAC TCC AAG AAA GGC CAG AGA AGT TAT AAG TAATGTGAAC GTCTGCCTGG  3080
His Tyr Ser Lys Lys Gly Gln Arg Ser Tyr Lys
    1005                1010
CCATTCGCTT TGGGATCAAG ATGTACACGC CGTCAGCCGT TTGCACCTCT CTGTGTTGTG  3140
AGCCGCATTC CACACATTTC GATTCTAGAA AACCCTTTTT GTCATGGGTG GTAGAGGTTT  3200
TAAACAGGAA TTGGTGAGAA TAAAATATTG CAGGGTGAAT GGTATCTGAA TCTGCTCTCT  3260
TTGGTGGCAA TTACGGAATT ATACTCACCA CAGTTTCTAC AGTGCCCCGG AATGGAAGGC  3320
ATAGAATACG GTAGGGATAA CAGTGCCAAG CAGACAGAAG TTTAAAGAAC AACTTTAGGG  3380
ACTTGTTTAT CCATGGCCAT TTTTAAATTC ACTCCTGTTG GGGAGTAACA CTCTCTCAAT  3440
TACCATCTTA ACACCTGGAC TTTACCTGAT CCAGTTTTAC AAGGTGAAGT AGAAAAATAT  3500
CCAGTAAAGG TGGCCAAGAG CCCTGAGTCC AGAGCAGCCC ATTAAGAAGC ACTATTCCTA  3560
CCAAATGCTG CTAATGTCAA TTTACAAATA TACTTAGAAA GCACATTATG GACATTTGTA  3620
TTCTTGTGAA TGTTTTTGAG GTGTGCCCTA AACCCCAGAT CCTTGAGGGC TTTCTCTTAC  3680
CAACTTTCCT TTCAGAGCCT GCTTGTTGGA GATTCTTCCC CAGCCCCCTT CCCCTTTCCC  3740
TCTTGCTCTG CCCCACCTCG CTCCACCCAG CTTGCTCCAG CCCAAAGATT CTTTATTTGT  3800
TTCTCATTAC CGAAGGTTGT GAGCCACCAT GTGGTTTCTG GGATTTGAAC TCATGACCTC  3860
CGGAGGAGCT GTCATGCTCT TAACCAGCCC ATGTTGAAGA TTCTTTTGAT AAATATTCAC  3920
AAAAAATAAA GATGAGCCAT GAGCTGTTGG CCTCTTCGGA AGCGGAAACT GAGTGATTTG  3980
ATTGAACATC CTTTTATCTT TGACCAGACC TTGGAATGAA TGCAATGACC TTTCCCACAG  4040
GAAGAAGGAG GAGCTCTCAG TCAAACTGTA AAGAATGCCT CTTCAGAATA TGCTGTCAGT  4100
GCTTGGATGC CATGATGTTC AACTTTCTTA GTCGATCCGG CAGCAATCAC AGTGTGAGCA  4160
CACTGGGAAC CTGTCCTTGC GGCCGCCGAG ATCTACCGTG TGCTTCTGTG AAGAGGCTTT  4220
GACGTAGCCC CTCTTTGAGC TCTTACACCA TGCTACTGAC TTCTAGAAAG GCTAATTAGG  4280
TCTTCTTCTA CACCTAATAC CCTAAGTCTT ACTGACTCTC ACGGGAGAAG TCTCTGTGCT  4340
ACACCTGAGT GGTCTTATTG ATAACCCTGA TACCAGATCA GGCAAGATAA ATCCGTCATA  4400
GCAGGCATGG CTACCCTTGC TGCCACAGGG TCACAGCACA TAGCTCATCA CCCTGTTATT  4460
CTTCATCTTG CAATGTGGTA TGGTTTTCCT GGTGAATGAT CAGCTTTTGC TGTGGTATTC  4520
TTTATACATC TGGACTTATT ATTGAAATCA AATGCTATAG AATCAATAGT TTATTTTATG  4580
TCTATTTTTC TTGATCGCAG AGTAATATAT ATTAATTGTA AAAAATTTAA GAAACAAAAA  4640
CTATATGTAA AGAAAAAATT ATAATATAAT ACAGAGATGC TGCTGACAGT TCCTATGTGT  4700
TGTGTTTTGT ATACTGAGAT CATGTGATAC GTAGGCATAC ATCTTCTTGG GTTTTTTTGT  4760
TTTTGTTTTT TGTTTTGTTT TGTTTTGTTT TGGTTTTTTG AGATAGGGTT TCTCTGTATA  4820
GCCCTGGCTG TCCTGGAACT CACTTTGCAG ACCAGGCTAG CCTCAAACTC TTATTCATTT  4880
TTACTGAAGT AATTTTTCTG TCATTAGTCT TCAAGAGCAA AACTTTAATA GTTATGGAGA  4940
ATATTGCCAG AACAGCTCAA AACTGTTTTA TTTGTTGGTC CAATTTCCCA TTAATTAGTT  5000
CAATAATAAA TATCATTTAG AAATAAAAAA AA                                5032
序列号：9
序列长度：1650
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑学：直链
序列种类：cDNA至mRNA
起源：
  生物名：小鼠
  脏器：肾脏
序列特征
  表示特征的记号：CDS
  存在位置：1..1650
  决定特征的方法：实验方法
序列
ATG CTA GCC CGC GCC CCT CCT CGC CGC CCG CCG CGG CTG GTG CTG CTC    48
Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu
  1                5                  10                  15
CGT TTG CTG TTG CTG CAT CTG CTG CTG CTC GCC CTG CGC GCC CGC TGC    96
Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys
             20                  25                  30
CTG AGC GCT GAG CCG GGT CAG GGC GCG CAG ACC TGG GCT CGC TTC GCG    144
Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala
         35                  40                  45
CGC GCT CCT GCC CCA GAG GCC GCT GGC CTC CTC CAC GAC ACC TTC CCC    192
Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro
     50                  55                  60
GAC GGT TTC CTC TGG GCG GTA GGC AGC GCC GCC TAT CAG ACC GAG GGC    240
Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly
 65                  70                  75                  80
GGC TGG CGA CAG CAC GGC AAA GGC GCG TCC ATC TGG GAC ACT TTC ACC    288
Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr
                 85                  90                  95
CAT CAC TCT GGG GCG GCC CCG TCC GAC TCC CCG ATC GTC GTG GCG CCG    336
His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro
            100                 105                 110
TCG GGT GCC CCG TCG CCT CCC CTG TCC TCC ACT GGA GAT GTG GCC AGC    384
Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser
        115                 120                 125
GAT AGT TAC AAC AAC GTC TAC CGC GAC ACA GAG GGG CTG CGC GAA CTG    432
Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu
    130                 135                 140
GGG GTC ACC CAC TAC CGC TTC TCC ATA TCG TGG GCG CGG GTG CTC CCC    480
Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro
145                 150                 155                 160
AAT GGC ACC GCG GGC ACT CCC AAC CGC GAG GGG CTG CGC TAC TAC CGG    528
Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg
                165                 170                 175
CGG CTG CTG GAG CGG CTG CGG GAG CTG GGC GTG CAG CCG GTG GTT ACC    576
Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr
            180                 185                 190
CTG TAC CAT TGG GAC CTG CCA CAG CGC CTG CAG GAC ACC TAT GGC GGA    624
Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly
        195                 200                 205
TGG GCC AAT CGC GCC CTG GCC GAC CAT TTC AGG GAT TAT GCC GAG CTC    672
Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu
    210                 215                 220
TGC TTC CGC CAC TTC GGT GGT CAG GTC AAG TAC TGG ATC ACC ATT GAC    720
Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp
225                 230                 235                 240
AAC CCC TAC GTG GTG GCC TGG CAC GGG TAT GCC ACC GGG CGC CTG GCC    768
Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala
                245                 250                 255
CCG GGC GTG AGG GGC AGC TCC AGG CTC GGG TAC CTG GTT GCC CAC AAC    816
Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn
            260                 265                 270
CTA CTT TTG GCT CAT GCC AAA GTC TGG CAT CTC TAC AAC ACC TCT TTC    864
Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe
        275                 280                 285
CGC CCC ACA CAG GGA GGC CGG GTG TCT ATC GCC TTA AGC TCC CAT TGG    912
Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp
    290                 295                 300
ATC AAT CCT CGA AGA ATG ACT GAC TAT AAT ATC AGA GAA TGC CAG AAG    960
Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys
305                 310                 315                 320
TCT CTT GAC TTT GTG CTA GGC TGG TTT GCC AAA CCC ATA TTT ATT GAT    1008
Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp
                325                 330                 335
GGC GAC TAC CCA GAG AGT ATG AAG AAC AAC CTC TCG TCT CTT CTG CCT    1056
Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro
            340                 345                 350
GAT TTT ACT GAA TCT GAG AAG AGG CTC ATC AGA GGA ACT GCT GAC TTT    1104
Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe
        355                 360                 365
TTT GCT CTC TGC TTC GGA CCA ACC TTG AGC TTT CAG CTA TTG GAC CCT    1152
Phe Ala Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro
    370                 375                 380
AAC ATG AAG TTC CGC CAA TTG GAG TCT CCC AAC CTG AGG CAG CTT CTs    1200
Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu
385                 390                 395                 400
TCT TGG ATA GAT CTG GAA TAT AAC CAC CCT CCA ATA TTT ATT GTG GAA    1248
Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu
                405                 410                 415
AAT GGC TGG TTT GTC TCG GGA ACC ACC AAA AGG GAT GAT GCC AAA TAT    1296
Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr
            420                 425                 430
ATG TAT TAT CTC AAG AAG TTC ATA ATG GAA ACC TTA AAA GCA ATC AGA    1344
Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg
        435                 440                 445
CTG GAT GGG GTC GAC GTC ATT GGG TAC ACC GCG TGG TCG CTC ATG GAC    1392
Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp
    450                 455                 460
GGT TTC GAG TGG CAT AGG GGC TAC AGC ATC CGG CGA GGA CTC TTC TAC    1440
Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr
465                 470                 475                 480
GTT GAC TTT CTG AGT CAG GAC AAG GAG CTG TTG CCA AAG TCT TCG GCC    1488
Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala
                485                 490                 495
TTG TTC TAC CAA AAG CTG ATA GAG GAC AAT GGC TTT CCT CCT TTA CCT    1536
Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro
            500                 505                 510
GAA AAC CAG CCC CTT GAA GGG ACA TTT CCC TGT GAC TTT GCT TGG GGA    1584
Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly
        515                 520                 525
GTT GTT GAC AAC TAC GTA CAA GTA AGT CCT TTG ACA AAA CCC AGT GTC    1632
Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Val
    530                 535                 540
GGC CTC TTG CTT CCT CAC                                            1650
Gly Leu Leu Leu Pro His
545                 550
序列号：10
序列长度：3460
序列类型：核酸
链数：双链
拓扑学：直链
序列种类：cDNA至mRNA
起源：
  生物名：人
  脏器：胰脏
序列特征
  表示特征的记号：CDS
  存在位置：60..3107
  决定特征的方法：实验方法
序列
CAGGGAATGA ATGGATTTTC TTCAGCACTG ATGAAATAAC CACACGCTAT AGGAATACA   59
ATG TCC AAC GGG GGA TTG CAA AGA TCT GTC ATC CTG TCA GCA CTT ATT    107
Met Ser Asn Gly Gly Leu Gln Arg Ser Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile
  1               5                  10                  15
CTG CTA CGA GCT GTT ACT GGA TTC TCT GGA GAT GGA AGA GCT ATA TGG    155
Leu Leu Arg Ala Val Thr Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ile Trp
             20                  25                  30
TCT AAA AAT CCT AAT TTT ACT CCG GTA AAT GAA AGT CAG CTG TTT CTC    203
Ser Lys Asn Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln Leu Phe Leu
         35                  40                  45
TAT GGC ACT TTC CCT AAA AAC TTT TTC TGG GGT ATT GGG ACT GGA GCA    251
Tyr Gly Thr Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Ile Gly Thr Gly Ala
     50                  55                  60
TTG CAA GTG GAA GGG AGT TGG AAG AAG GAT GGA AAA GGA CCT TCT ATA    299
Leu Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile
 65                  70                  75                  80
TGG GAT CAT TTC ATC CAC ACA CAC CTT AAA AAT GTC AGC AGC ACG AAT    347
Trp Asp His Phe Ile His Thr His Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Asn
                 85                  90                  95
GGT TCC AGT GAC AGT TAT ATT TTT CTG GAA AAA GAC TTA TCA GCC CTG    395
Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser Ala Leu
            100                 105                 110
GAT TTT ATA GGA GTT TCT TTT TAT CAA TTT TCA ATT TCC TGG CCA AGG    443
Asp Phe Ile Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg
        115                 120                 125
CTT TTC CCC GAT GGA ATA GTA ACA GTT GCC AAC GCA AAA GGT CTG CAG    491
Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys Gly Leu Gln
    130                 135                 140
TAC TAC AGT ACT CTT CTG GAC GCT CTA GTG CTT AGA AAC ATT GAA CCT    539
Tyr Tyr Ser Thr Leu Leu Asp Ala Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro
145                 150                 155                 160
ATA GTT ACT TTA TAC CAC TGG GAT TTG CCT TTG GCA CTA CAA GAA AAA    587
Ile Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu Gln Glu Lys
                165                 170                 175
TAT GGG GGG TGG AAA AAT GAT ACC ATA ATA GAT ATC TTC AAT GAC TAT    635
Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe Asn Asp Tyr
            180                 185                 190
GCC ACA TAC TGT TTC CAG ATG TTT GGG GAC CGT GTC AAA TAT TGG ATT    683
Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Met Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile
        195                 200                 205
ACA ATT CAC AAC CCA TAT CTA GTG GCT TGG CAT GGG TAT GGG ACA GGT    731
Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr Gly Thr Gly
    210                 215                 220
ATG CAT GCC CCT GGA GAG AAG GGA AAT TTA GCA GCT GTC TAC ACT GTG    779
Met His Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Ala Ala Val Tyr Thr Val
225                 230                 235                 240
GGA CAC AAC TTG ATC AAG GCT CAC TCG AAA GTT TGG CAT AAC TAC AAC    827
Gly His Asn Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asn
                245                 250                 255
ACA CAT TTC CGC CCA CAT CAG AAG GGT TGG TTA TCG ATC ACG TTG GGA    875
Thr His Phe Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly
            260                 265                 270
TCT CAT TGG ATC GAG CCA AAC CGG TCG GAA AAC ACG ATG GAT ATA TTC    923
Ser His Trp Ile Glu Pro Asn Arg Ser Glu Asn Thr Met Asp Ile Phe
        275                 280                 285
AAA TGT CAA CAA TCC ATG GTT TCT GTG CTT GGA TGG TTT GCC AAC CCT    971
Lys Cys Gln Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro
    290                 295                 300
ATC CAT GGG GAT GGC GAC TAT CCA GAG GGG ATG AGA AAG AAG TTG TTC    1019
Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Arg Lys Lys Leu Phe
305                 310                 315                 320
TCC GTT CTA CCC ATT TTC TCT GAA GCA GAG AAG CAT GAG ATG AGA GGC    1067
Ser Val Leu Pro Ile Phe Ser Glu Ala Glu Lys His Glu Met Arg Gly
                325                 330                 335
ACA GCT GAT TTC TTT GCC TTT TCT TTT GGA CCC AAC AAC TTC AAG CCC    1115
Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Lys Pro
            340                 345                 350
CTA AAC ACC ATG GCT AAA ATG GGA CAA AAT GTT TCA CTT AAT TTA AGA    1163
Leu Asn Thr Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg
        355                 360                 365
GAA GCG CTG AAC TGG ATT AAA CTG GAA TAC AAC AAC CCT CGA ATC TTG    1211
Glu Ala Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asn Asn Pro Arg Ile Leu
    370                 375                 380
ATT GCT GAG AAT GGC TGG TTC ACA GAC AGT CGT GTG AAA ACA GAA GAC    1259
Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Arg Val Lys Thr Glu Asp
385                 390                 395                 400
ACC ACG GCC ATC TAC ATG ATG AAG AAT TTC CTC AGC CAG GTG CTT CAA    1307
Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln Val Leu Gln
                405                 410                 415
GCA ATA AGG TTA GAT GAA ATA CGA GTG TTT GGT TAT ACT GCC TGG TCT    1355
Ala Ile Arg Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Ser
            420                 425                 430
CTC CTG GAT GGC TTT GAA TGG CAG GAT GCT TAC ACC ATC CGC CGA GGA    1403
Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile Arg Arg Gly
        435                 440                 445
TTA TTT TAT GTG GAT TTT AAC AGT AAA CAG AAA GAG CGG AAA CCT AAG    1451
Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys
    450                 455                 460
TCT TCA GCA CAC TAC TAC AAA CAG ATC ATA CGA GAA AAT GGT TTT TCT    1499
Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn Gly Phe Ser
465                 470                 475                 480
TTA AAA GAG TCC ACG CCA GAT GTG CAG GGC CAG TTT CCC TGT GAC TTC    1547
Leu Lys Glu Ser Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro Cys Asp Phe
                485                 490                 495
TCC TGG GGT GTC ACT GAA TCT GTT CTT AAG CCC GAG TCT GTG GCT TCG    1595
Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser Val Ala Ser
            500                 505                 510
TCC CCA CAG TTC AGC GAT CCT CAT CTG TAC GTG TGG AAC GCC ACT GGC    1643
Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Ala Thr Gly
        515                 520                 525
AAC AGA CTG TTG CAC CGA GTG GAA GGG GTG AGG CTG AAA ACA CGA CCC    1691
Asn Arg Leu Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro
    530                 535                 540
GCT CAA TGC ACA GAT TTT GTA AAC ATC AAA AAA CAA CTT GAG ATG TTG    1739
Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu Glu Met Leu
545                 550                 555                 560
GCA AGA ATG AAA GTC ACC CAC TAC CGG TTT GCT CTG GAT TGG GCC TCG    1787
Ala Arg Met Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Trp Ala Ser
                565                 570                 575
GTC CTT CCC ACT GGC AAC CTG TCC GCG GTG AAC CGA CAG GCC CTG AGG    1835
Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln Ala Leu Arg
            580                 585                 590
TAC TAC AGG TGC GTG GTC AGT GAG GGG CTG AAG CTT GGC ATC TCC GCG    1883
Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser Ala
        595                 600                 605
ATG GTC ACC CTG TAT TAT CCG ACC CAC GCC CAC CTA GGC CTC CCC GAG    1931
Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly Leu Pro Glu
    610                 615                 620
CCT CTG TTG CAT GCC GAC GGG TGG CTG AAC CCA TCG ACG GCC GAG GCC    1979
Pro Leu Leu His Ala Asp Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr Ala Glu Ala
625                 630                 635                 640
TTC CAG GCC TAC GCT GGG CTG TGC TTC CAG GAG CTG GGG GAC CTG GTG    2027
Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly Asp Leu Val
                645                 650                 655
AAG CTC TGG ATC ACC ATC AAC GAG CCT AAC CGG CTA AGT GAC ATC TAC    2075
Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Ile Tyr
            660                 665                 670
AAC CGC TCT GGC AAC GAC ACC TAC GGG GCG GCG CAC AAC CTG CTG GTG    2123
Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn Leu Leu Val
        675                 680                 685
GCC CAC GCC CTG GCC TGG CGC CTC TAC GAC CAG CAG TTC AGG CCG TCA    2171
Ala His Ala Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Gln Gln Phe Arg Pro Ser
    690                 695                 700
CAG CGC GGG GCC GTG TCG CTG TCG CTG CAC GCG GAC TGG GCG GAA CCC    2219
Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp Ala Glu Pro
705                 710                 715                 720
GCC AAC CCC TAT GCT GAC TCG CAC TGG AGG GCG GCC GAG CGC TTC CTG    2267
Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu Arg Phe Leu
                725                 730                 735
CAG TTC GAG ATC GCC TGG TTC GCC GAG CCG CTC TTC AAG ACC GGG GAC    2315
Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp
            740                 745                 750
TAC CCC GCG GCC ATG AGG GAA TAC ATT GCC TCC AAG CAC CGA CGG GGG    2363
Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His Arg Arg Gly
        755                 760                 765
CTT TCC AGC TCG GCC CTG CCG CGC CTC ACC GAG GCC GAA AGG AGG CTG    2411
Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu
    770                 775                 780
CTC AAG GGC ACG GTC GAC TTC TGC GCG CTC AAC CAC TTC ACC ACT AGG    2459
Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg
785                 790                 795                 800
TTC GTG ATG CAC GAG CAG CTG GCC GGC AGC CGC TAC GAC TCG GAC AGG    2507
Phe Val Met His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ser Asp Arg
                805                 810                 815
GAC ATC CAG TTT CTG CAG GAC ATC ACC CGC CTG AGC TCC CCC ACG CGC    2555
Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Thr Arg
            820                 825                 830
CTG GCT GTG ATT CCC TGG GGG GTG CGC AAG CTG CTG CGG TGG GTC CGG    2603
Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg
        835                 840                 845
AGG AAC TAC GGC GAC ATG GAC ATT TAC ATC ACC GCC AGT GGC ATC GAC    2651
Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser Gly Ile Asp
    850                 855                 860
GAC CAG GCT CTG GAG GAT GAC CGG CTC CGG AAG TAC TAC CTA GGG AAG    2699
Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys
865                 870                 875                 880
TAC CTT CAG GAG GTG CTG AAA GCA TAC CTG ATT GAT AAA GTC AGA ATC    2747
Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Arg Ile
                885                 890                 895
AAA GGC TAT TAT GCA TTC AAA CTG GCT GAA GAG AAA TCT AAA CCC AGA    2795
Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg
            900                 905                 910
TTT GGA TTC TTC ACA TCT GAT TTT AAA GCT AAA TCC TCA ATA CAA TTT    2843
Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile Gln Phe
        915                 920                 925
TAC AAC AAA GTG ATC AGC AGC AGG GGC TTC CCT TTT GAG AAC AGT AGT    2891
Tyr Asn Lys Val Ile Ser Ser Arg Gly Phe Pro Phe Glu Asn Ser Ser
    930                 935                 940
TCT AGA TGC AGT CAG ACC CAA GAA AAT ACA GAG TGC ACT GTC TGC TTA    2939
Ser Arg Cys Ser Gln Thr Gln Glu Asn Thr Glu Cys Thr Val Cys Leu
945                 950                 955                 960
TTC CTT GTG CAG AAG AAA CCA CTG ATA TTC CTG GGT TGT TGC TTC TTC    2987
Phe Leu Val Gln Lys Lys Pro Leu Ile Phe Leu Gly Cys Cys Phe Phe
                965                 970                 975
TCC ACC CTG GTT CTA CTC TTA TCA ATT GCC ATT TTT CAA AGG CAG AAG    3035
Ser Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Ile Ala Ile Phe Gln Arg Gln Lys
            980                 985                 990
AGA AGA AAG TTT TGG AAA GCA AAA AAC TTA CAA CAC ATA CCA TTA AAG    3083
Arg Arg Lys Phe Trp Lys Ala Lys Asn Leu Gln His Ile Pro Leu Lys
        995                 1000                 1005
AAA GGC AAG AGA GTT GTT AGC TAAACTGATC TGTCTGCATG ATAGACAGTT       3134
Lys Gly Lys Arg Val Val Ser
   1010                1015
TAAAAATTCA TCCCAGTTCC ATATGCTGGT AACTTACAGG AGATATACCT GTATTATAGA  3194
AAGACAATCT GAGATACAGC TGTAACCAAG GTGATGACAA TTGTCTCTGC TGTGTGGTTC  3254
AAAGAACATT CCCTTAGGTG TTGACATCAG TGAACTCAGT TCTTGGATGT AAACATAAAG  3314
GCTTCATCCT GACAGTAAGC TATGAGGATT ACATGCTACA TTGCTTCTTA AAGTTTCATC  3374
AACTGTATTC CATCATTCTG CTTTAGCTTT CATCTCTACC AATAGCTACT TGTGGTACAA  3434
TAAATTATTT TTAAGAAGAA AAAAAA                                       3460
序列号：11
序列长度：20
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
AGGCTCATCA GAGGAACTGC                                              20
序列号：12
序列长度：20
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
AAGACAGAAG CTGCCTCAGG                                              20
序列号：13
序列长度：27
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC                                      27
序列号：14
序列长度：21
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
TTAGTGAGGA AGCAAGAGGC C                                            21
序列号：15
序列长度：34
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CAAAGCTTCC ACCATGCTAG CCCGCGCCCC TCCT                              34
序列号：16
序列长度：34
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CAGGATCCTT AGTGAGGAAG CAAGAGGCCG ACAC                              34
序列号：17
序列长度：21
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
GGGTTTTGTC AAAGGACTTA C                                            21
序列号：18
序列长度：20
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
AGGCTCATCA GAGGAAGTGC                                              20
序列号：19
序列长度：22
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
GACCAGGCTC TGGACGATGA CC                                           22
序列号：20
序列长度：24
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
GTCTGACTGC ATCTAGAACT ACTG                                         24
序列号：21
序列长度：43
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CGATAAGCTA TGAAAACTAC AGCCTTGGAG GAAGCTTAAA TGG                    43
序列号：22
序列长度：41
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CCATTTAAGC TTCCTCCAAG GCTGTAGTTT TCATAGCTTA T                      41
序列号：23
序列长度：44
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
AGCTTAAATG AGCTCGATAT CAAGGCCTAC CCGGGCGCCA TGCA                   44
序列号：24
序列长度：36
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
TGGCGCCCGG GTAGGCCTTG ATATCGAGCT CATTTA                            36
序列号：25
序列长度：18
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CCTGGTCGAC CATTTCAG                                                18
序列号：26
序列长度：25
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
AGCACAAAGT CGACAGACTT CTGGC                                        25
序列号：27
序列长度：19
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
TGGAGATTGG AAGTGGACG                                               19
序列号：28
序列长度：20
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
CAAGGACCAG TTCATCATCG                                              20
序列号：29
序列长度：20
序列类型：核酸
链数：单链
拓扑学：直链
序列种类：合成DNA
序列
TTAAGGACTC CTGCATCTGC                                              20

Claims (24)

1.一种具有抑制老化活性的多肽，其中所述多肽具有选自序列号1、2、3、4、5所表示的氨基酸序列的氨基酸序列。
2.一种编码具有抑制老化活性的多肽的DNA，其中所述DNA是
(a)编码具有选自序列号1、2、3、4和5所表示的氨基酸序列的多肽的DNA；
(b)包括选自序列号6、7、8、9和10所示的DNA序列的DNA；
(c)在严格条件下能与(a)或(b)中的DNA进行杂交的DNA，其中所述严格条件是指杂交温度为65℃，而且杂交液中包含0.7-1.0M的NaCl而且洗涤滤膜的溶液是0.1-2×SSC。
3.将权利要求2的DNA插入到载体中所得到的重组载体。
4.识别权利要求1中多肽的抗体。
5.生产权利要求4中抗体的杂交瘤。
6.权利要求5中的杂交瘤，选自KM 1902(FERM BP-5983)、KM2070(FERM BP-6196)、KM 2076(FERM BP-6197)、KM 2105(FERM BP-6198)、KM 2116(FERM BP-6199)、KM 2119(FERMBP-6200)。
7.含有权利要求1中多肽的早老症治疗药。
8.含有权利要求1中多肽的成人病治疗药。
9.含有权利要求1中多肽的老化抑制药。
10.应用权利要求4中的抗体，对权利要求1中的多肽进行免疫学定量的方法。
11.含有权利要求2中DNA、用于早老症基因治疗的载体。
12.含有权利要求2中的DNA、用于成人疾病基因治疗的载体。
13.含有权利要求2中的DNA、用于老化抑制基因治疗的载体。
14.包含权利要求3中重组载体的转化体。
15.权利要求14的转化体，其中转化体选自大肠杆菌ENKM 101(FERM BP-5765)、大肠杆菌ENKM 112(FERM BP-6184)、大肠杆菌ENKM 103(FERM BP-5942)、大肠杆菌ENKM 106(FERMBP-5767)和大肠杆菌XL1-Blue/pRYHH 02(FERM BP-6193)。
16.老化抑制多肽的制备方法，其特征在于：在培养液中培养包含权利要求3中重组载体的转化体，在培养过程中让该重组DNA编码的老化抑制多肽生成并蓄积，从该培养液中回收该多肽。
17.一种改良家畜的方法，包括过多表达权利要求2的DNA。
18.用权利要求2的DNA制备基因缺失动物的方法。
19.用权利要求2的DNA制备基因替换动物的方法。
20.为权利要求1的多肽筛选配体的方法，包括让权利要求1的多肽与被测样品接触，然后测定与权利要求1的多肽的结合量。
21.筛选增强编码权利要求1多肽的基因表达的化合物的方法，其特征在于将表达权利要求1的多肽的细胞与被测样品接触，然后检测细胞中基因表达的增强。
22.权利要求21的筛选方法，其中应用权利要求10的方法来检测表达的增强。
23.权利要求21的筛选方法，其中通过测定编码权利要求1的多肽的mRNA的量来检测表达的增强。
24.增强编码权利要求1的多肽的基因表达的化合物的筛选方法，其特征在于用包含有在控制编码权利要求1的多肽的基因转录区域的下游连接了报告基因的DNA的质粒转化所形成的转化体与被测样品接触，并且通过检测由报告基因所表达的多肽的表达量来检测表达的增强。
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