CN116769027B - 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 - Google Patents
一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116769027B CN116769027B CN202310681965.0A CN202310681965A CN116769027B CN 116769027 B CN116769027 B CN 116769027B CN 202310681965 A CN202310681965 A CN 202310681965A CN 116769027 B CN116769027 B CN 116769027B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nanobody
- amino acid
- xaa
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 115
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 115
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 claims abstract description 90
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 73
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 abstract description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 63
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 63
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 63
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 101100203200 Danio rerio shha gene Proteins 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 6
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 description 4
- 101710186083 Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 4
- -1 gly-CSF Proteins 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101710186071 Interleukin-17 receptor B Proteins 0.000 description 3
- 102100035014 Interleukin-17 receptor B Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000039989 IL-17 family Human genes 0.000 description 2
- 108091069193 IL-17 family Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- KUQWVNFMZLHAPA-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KUQWVNFMZLHAPA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 description 1
- 101000797758 Homo sapiens C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100035012 Interleukin-17 receptor C Human genes 0.000 description 1
- 101710186068 Interleukin-17 receptor C Proteins 0.000 description 1
- 102100035016 Interleukin-17 receptor E Human genes 0.000 description 1
- 101710186076 Interleukin-17 receptor E Proteins 0.000 description 1
- 102100033096 Interleukin-17D Human genes 0.000 description 1
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 1
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000002661 Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003735 brodalumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 229940010466 cosentyx Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033706 glycylserine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- WJKYOQDIQYJXSD-UHFFFAOYSA-N propan-1-imine Chemical compound CCC=N WJKYOQDIQYJXSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940060681 taltz Drugs 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一种抗IL‑17纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用,其中,该纳米抗体的氨基酸序列包含特殊结构的互补决定区和框架区。本发明的纳米抗体,是通过噬菌体库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗白介素‑17纳米抗体,该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性,能够特异性地识别并结合白介素‑17,基于该纳米抗体的检测试剂和吸附剂对白介素‑17的结合能力极强,可应用于白介素‑17的检测和血液净化领域,有助于改善白介素‑17介导的炎症反应和自身免疫性疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种可以特异性地识别并结合IL-17的纳米抗体或其抗原结合片段,以及包括由一种或多种所述纳米抗体组成的多肽。本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸;涉及表达或能够表达所述氨基酸序列和多肽的宿主或宿主细胞;并且涉及所述氨基酸序列和多肽的应用。
背景技术
白介素-17(IL-17)是由Th17细胞分泌的细胞因子,与炎性疾病、自身免疫疾病和感染性疾病密切相关。
IL-17是一种糖蛋白,由包含信号肽在内的155个氨基酸构成,其成熟形式由136个氨基酸组成,分子内存在6个半胱氨酸残基和一处Asn-糖链结合位点,通常以二聚体存在。
IL-17家族包括6个成员:IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)和IL-17F,均具有类似的蛋白结构。一般而言,IL-17指IL-17A,它是该家族的原型成员(Metoseley TA,Haudenschild DR,Rose L,Reddi AH.Interleukin-17family and IL-17receptors.Cytokine Growth Factor Rev.14(2):155-74(2003)),分子量为17kDa。IL-17A与其他家族成员之间有17%-55%的同源性,其中,IL-17A与IL-17F同源性最高,可以复合形成异二聚体IL-17A/F,并结合相同的受体(Gaffen,S.Structure and signalling inthe IL-17receptor family.Nat Rev Immunol 9,556–567(2009))。
IL-17受体(IL-17R)家族包括5个成员(IL-17RA、B、C、D和E)。由于IL-17家族细胞因子通常以二聚体存在,所以IL-17受体也是由同源二聚体或异源二聚体构成。例如,IL-17RA与IL-17RC组成的异源二聚体是IL-17及IL-17F的同源二聚体及异源二聚体的受体,IL-17RA及IL-17RB组成的异源二聚体是IL-17E的受体,IL-17RA及IL-17RE组成的异源二聚体是IL-17C的受体,IL-17RB是IL-17B和IL-17E的受体(Rickel,E.A.etal.Identification of Functional Roles for Both IL-17RB and IL-17RA inMetediating IL-25-Induced Activities.J.Immunol.181,4299–4310(2008))。IL-17R广泛存在于各种组织和细胞中,与IL-17结合产生促炎症反应。
IL-17具有强大的募集中性粒细胞及促进多种炎性细胞因子释放的作用,参与机体多种炎症和免疫性疾病的发生和发展,特别是属于生物技术领域P-1)或细胞因子(IL-6、Gly-CSF、GM-CSF、IL-1β、TGF-β、TNF-α),参与组织重塑,参与急性期反应。IL-17与其他细胞因子协同作用,可以增强各种靶细胞的促炎反应。
特别是在许多人类自身免疫性疾病(如牛皮癣、类风湿性关节炎、发性硬化和炎性肠病)中观察到IL-17表达量较高。临床前动物模型和人类临床试验的研究已经证明,抑制IL-17可以改善疾病活动。在风湿性关节炎(RA)研究中,中和IL-17或其受体可消退风湿性关节炎的症状;在关节炎小鼠模型中,IL-17缺陷可保护宿主小鼠免受胶原诱导的关节炎的侵害,而IL-17上调可加重病情。所以,IL-17在风湿性关节炎中既能导致炎症又能造成骨损坏。这是由于IL-17可以诱导软骨、滑膜细胞、巨噬细胞和骨细胞分泌TNFα、IL-1β与IL-6等促炎症细胞因子。这些促炎症因子导致风湿性关节炎突然发作。IL-17还能刺激多种趋化因子的产生,包括IL-8/CXCL8、CXCL1、CXCL2、CCL20、CCL2与CCL7,这些因子将粒细胞、巨噬细胞与淋巴细胞招募到滑膜从而加重炎症。
综上,体内过多的IL-17会导致过度的炎症反应进而引起组织损伤,也可能引发自身免疫疾病,对健康造成负面影响,需要及时进行治疗。更可怕的是,当IL-17等炎症因子在体内含量持续升高,可能会引发炎症因子风暴,伴随大量炎症介质的释放,导致体内炎症反应失控,对身体健康造成严重危害,如多器官功能衰竭、休克、中枢神经系统功能受损等。
基于这些发现,IL-17已成为一个重要治疗靶点,目前已有四款同靶点药物获得上市:Taltz、Siliq、Efleira和Cosentyx,适应症为中重度斑块型银屑病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎和放射学阴性中轴脊柱关节炎等。国内也有不少于8款IL-17抗体新药申报临床,如智翔生物的单抗药物(CN105315371B)和珠海丽珠的单抗制剂(CN112915201A)等。
然而,单克隆抗体培养周期长、制备成本高,只能作为抗体药物制剂,无法快速清除大量IL-17。
发明内容
本发明为了克服现有技术中存在的问题,提供一种具有特定结构的氨基酸序列的纳米抗体、具有该纳米抗体的多肽、编码该纳米抗体和/或多肽的核酸以及能够表达该纳米抗体和/或多肽的宿主或宿主细胞,以及该纳米抗体和/或多肽在制备IL-17检测试剂和吸附剂上的应用。
本发明的第一方面,本发明提供一种抗IL-17纳米抗体,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR,
所述互补决定区CDR包含:氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的CDR1,氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的CDR2,以及氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的CDR3;
其中,所述CDR1和CDR3的氨基酸序列中:
Xaa11选自Thr或Ser;和/或,
Xaa12选自Thr或Ser;和/或,
Xaa31选自Asp或Glu;和/或,
Xaa32选自Asp或Glu。
SEQ ID No:1:Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala;
SEQ ID No:2:Ser-Val-Ser-Gly-Tyr-Arg-Thr;
SEQ ID No:3:Arg-Trp-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr;
SEQ ID No:4:Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr;
对于一些优选的方式,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列还包括4个框架区FR1~FR4,或者包括与4个所述框架区FR1~FR4的同源性为50%以上的氨基酸序列框;其中:
所述框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,
所述框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID No:6或SEQ ID No:7所示,
所述框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID No:8或SEQ ID No:9所示,
所述框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。
SEQ ID No:5:Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala;
SEQ ID No:6:Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ala-Ile;
SEQ ID No:7:Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ser-Asp;
SEQ ID No:8:Tyr-Ile-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys;
SEQ ID No:9:Asp-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys;
SEQ ID No:10:Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser。
对于一些优选的方式,所述框架区FR1~4与所述互补决定区CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。具体顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
对于一些优选的方式,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:11或SEQID No:12所示,其中,
Xaa11选自Thr或Ser;和/或,
Xaa12选自Thr或Ser;和/或,
Xaa31选自Asp或Glu;和/或,
Xaa32选自Asp或Glu。
SEQ ID No:11:
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ala-Ile-Ser-Val-Ser-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Ile-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser;
SEQ ID No:12:
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ser-Asp-Arg-Trp-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser。
对于一些优选的方式,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如:SEQ ID No:13、SEQID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:18、SEQ ID No:19、SEQID No:20、SEQ ID No:21、SEQ ID No:22、SEQ ID No:23、SEQ ID No:24、SEQ ID No:25、SEQID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29、SEQ ID No:30、SEQ ID No:31、SEQID No:32、SEQ ID No:33、SEQ ID No:34、SEQ ID No:35、SEQ ID No:36、SEQ ID No:37、SEQID No:38中的任一种所示。
本发明的第二方面,提供一种人源化抗IL-17纳米抗体,由任一所述抗IL-17纳米抗体人源化得到。对于一些优选的方式,所述的人源化抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如:SEQ ID No:39、SEQ ID No:40、SEQ ID No:41、SEQ ID No:42中的一种所示。
本发明的第三方面,提供一种多肽,其主要由上述记载的纳米抗体组成,
可选地,所述多肽是多价多肽;
可选地,所述多价多肽包括二价、三价或四价的多肽;
可选地,所述多价多肽是人源化多肽;
可选地,所述多价多肽是特异性多肽;
可选地,所述多价多肽的氨基酸序列为:SEQ ID No:57、SEQ ID No:58、SEQ IDNo:59、SEQ ID No:60;SEQ ID No:61、SEQ ID No:62、SEQ ID No:63、SEQ ID No:64、SEQ IDNo:65、SEQ ID No:66、SEQ ID No:67、SEQ ID No:68。
可选地,所述多肽包括任一上述纳米抗体,所述纳米抗体的N-端和/或C-端具备标签、铰链或保护氨基酸中的一种或多种;所述标签包括His-tag、GST-tag、Myc-tag、SUMO-tag、Strep-tag、Flag-tag;所述铰链包括GS铰链、IgG铰链、IgA铰链、PEG;所述保护氨基酸包括Ala、Gln、Glu、Met或其两种以上的组合。
对于一些优选的方式,上述带有标签、铰链、保护氨基酸的多肽,其序列为SEQ IDNo:43、SEQ ID No:44、SEQ ID No:45、SEQ ID No:46、SEQ ID No:47、SEQ ID No:48、SEQ IDNo:49、SEQ ID No:50、SEQ ID No:51、SEQ ID No:52、SEQ ID No:53、SEQ ID No:54、SEQ IDNo:55、SEQ ID No:56;
本发明的第四方面,提供一种核酸,其是通过编码任一上述记载的纳米抗体和/或上述记载的多肽而成的。
本发明的第五方面,提供一种宿主或宿主细胞,其能够表达任一上述的纳米抗体和/或上述的多肽。
本发明的第六方面,提供一种吸附剂,其包括任一上述的纳米抗体或任一上述的多肽,以及载体基质。
本发明的第七方面,提供一种任一上述的纳米抗体和/或任一上述的多肽在制备IL-17吸附剂上的应用。
本发明的第八方面,提供一种任一上述的纳米抗体和/或任一上述的多肽在免疫检测、富集和/或纯化等中的应用。
本发明的有益效果为,所提供的纳米抗体,是通过噬菌体库筛选发现的具有新的氨基酸序列的抗IL-17的纳米抗体,因此该纳米抗体及其多肽具有很高的亲和力和活性,能够特异性地识别并结合IL-17。应用所述纳米抗体制备的吸附剂对IL-17的吸附能力极强,可应用于IL-17血液净化领域;应用所述纳米抗体制备的检测试剂可应用于IL-17检测领域。有助于诊断、缓解或治疗IL-17引起的相关疾病。
附图说明
图1是纯化后的纳米抗体。
图2是纳米抗体动力学传感图;(a)L-001,(b)L-002。
图3是ELISA检测的标准曲线。
具体实施方式
本发明的上述内容及其他方面将通过下文进一步描述清楚,其中:
(1)除非指明或者另外定义,使用的所有术语具有在本领域中的通用意义,为本领域技术人员所共知。
(2)除非另外指明,术语“序列”用于本文时(如在类似“抗体序列”“可变区序列”“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关氨基酸序列及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列,除非上下文需要更狭义的解释。
(3)除非另外指明,所有没有具体描述的方法、步骤、技术和操作为已知的并如本领域技术人员所熟知的。例如,参照所引用的综合背景技术以及其他参考文献。
(4)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示。
(5)术语“特异性”是指特定的抗原结合分子(如本发明的纳米抗体或多肽)可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的能力。一种抗原结合分子的特异性可以根据其亲和力和/或活性而确定。亲和力表示为抗原与抗原结合分子的解离平衡常数(KD),是抗原与抗原结合分子之间的结合强度的测量,KD值越小,抗原和抗原结合分子之间的结合强度越强,反之,KD值越大,抗原和抗原结合分子之间的结合强度越弱。Ka表示结合常数,Ka越大,表明结合越快,Ka越小,表明结合越慢;Kd表示解离常数,Kd越大,解离越快,Kd越小,解离越慢;并且KD=Kd/Ka。
(6)术语“固载量”是指单位体积亲和介质所偶联的配基的总量。
本发明的纳米抗体的氨基酸序列基本上包括互补决定区CDR和框架区FR。
上述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1、互补决定区CDR2和互补决定区CDR3,上述框架区FR包括框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4。
上述互补决定区CDR1为包括下述式(I):
Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala式(I)(SEQ ID No:1),
上述互补决定区CDR2为:
Ser-Val-Ser-Gly-Tyr-Arg-Thr(SEQ ID No:2)或Arg-Trp-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr(SEQ ID No:3),
上述互补决定区CDR3为下述式(II):
Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr式(II)(SEQ ID No:4),
其中,
Xaa11独立地选自Thr和Ser;和/或,
Xaa12独立地选自Thr和Ser;和/或,
Xaa31独立地选自Asp和Glu;和/或,
Xaa32独立地选自Asp和Glu。
其中,氨基酸取代通常可以描述为这样的氨基酸取代,即,其中氨基酸残基可以被具有相似化学结构的氨基酸取代,也可以被与其不相似化学结构的氨基酸取代,只要对其多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或基本上没有影响即可。优选为氨基酸残基可以被具有相似化学结构的氨基酸取代。
对于上述的取代方式,例如,可以列举文献WO04/037999,WO 98/49185,WO 00/46383和WO 01/09300中公开的情形,但并不限于此,此外,还可以列举基于WO 04/037999和WO 06/122786中所引用的其他参考文献的相关信息而选择所述取代的(优选)类型和/或结合。
本发明的氨基酸取代,可列举但不限于如下这样的取代方式,即,下列组(a)~(e)内的一个氨基酸被同组内另一个氨基酸取代:(a)Ala、Ser、Thr、Pro和Gly;(b)Asp、Asn、Glu和Gln;(c)His、Lys和Arg;(d)Met、Leu、Ile、Val和Cys;(e)Phe、Tyr和Trp。
优选的氨基酸取代可列举但不限于如下方式:Ala被取代成Gly或Ser;Arg被取代成Lys;Asn被取代成Gln或His;Asp被取代成Glu;Cys被取代成Ser或Thr;Gln被取代成Asn;Glu被取代成Asp;Gly被取代成Ala或Pro;His被取代成Asn或Gln;Ile被取代成Leu或Val;Leu被取代成Ile或Val;Lys被取代成Arg、Glu或Gln;Met被取代成Leu、Tyr或Ile;Phe被取代成Met、Tyr或Leu;Ser被取代成Thr;Thr被取代成Ser;Tyr被取代成Trp;Trp被取代成Tyr。
对于一些优选的方式,上述式(I)中,上述Xaa11独立地选自Thr和Ser;和/或,Xaa12独立地选自Thr和Ser;上述式(II)中,上述Xaa31独立地选自Asp和Glu;和/或,Xaa32独立地选自Asp和Glu。
上述纳米抗体的氨基酸序列和结构除了3个互补决定区(CDR1~CDR3)以外,还包括框架区。
对于框架区,其与互补决定区相比更保守。本领域技术人员会根据纳米抗体的实际用途和功能对框架区的序列结构进行合理的筛选。作为框架区的氨基酸序列,优选同源性为50%以上的氨基酸序列,进而优选同源性为70%以上的氨基酸序列,进而优选为同源性为95%以上的氨基酸序列。
作为框架区,可列举例为框架区FR1、框架区FR2、框架区FR3和框架区FR4,但可以认为不限于此。
作为上述框架区的具体例子,可列举如下:
上述框架区FR1为:Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala(SEQ ID No:5),
上述框架区FR2为:Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ala-Ile(SEQ ID No:6)或Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ser-Asp(SEQ ID No:7),
上述框架区FR3为:Tyr-Ile-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys(SEQ ID No:8)或Asp-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Le u-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys(SEQ ID No:9),
上述框架区FR4为:Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ IDNo:10)。
作为上述纳米抗体的氨基酸序列,可列举如下:
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ala-Ile-Ser-Val-Ser-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Ile-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-As n-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID No:11)
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ser-Asp-Arg-Trp-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gl n-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID No:12)
其中,Xaa11独立地选自Thr和Ser;和/或,Xaa12独立地选自Thr和Ser;和/或,Xaa31独立地选自Asp和Glu;和/或,Xaa32独立地选自Asp和Glu。
还可以进行CDR移植改造,如将两个纳米抗体的原序列为:FR1-1-CDR1-1-FR2-1-CDR2-1-FR3-1-CDR3-1-FR4-1和FR1-2-CDR1-2-FR2-2-CDR2-2-FR3-2-CDR3-2-FR4-2的CDR区互换,新序列为:FR1-1-CDR1-2-FR2-1-CDR2-2-FR3-1-CDR3-2-FR4-1和/或FR1-2-CDR1-1-FR2-2-CDR2-1-FR3-2-CDR3-1-FR4-2,
或单独替换其中一个对应的CDR,即新序列为FR1-1-CDR1-1-FR2-1-CDR2-2-FR3-1-CDR3-1-FR4-1和/或FR1-2-CDR1-2-FR2-2-CDR2-1-FR3-2-CDR3-2-FR4-2。
作为上述纳米抗体的氨基酸序列,可列举如下:
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ser-Asp-Ser-Val-Ser-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Ile-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Le u-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Asp-Asp-Val-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID No:13)、
Val-Gln-Leu-Gln-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-Gln-Ala-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Thr-Ser-Ala-Leu-Gly-Trp-Phe-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Glu-Arg-Glu-Glu-Arg-Glu-Phe-Val-Ala-Ala-Ile-Arg-Trp-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ala-Gln-Asn-Thr-Val-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Asn-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Phe-Cys-Val-Cys-Trp-Asp-Asp-Val-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID No:14)。
但并不限于上述这些例子,只要对其多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有或者基本上没有影响即可。
此外,纳米抗体的残基总数可以在110-120个区间,优选112-115个,并且最优选113个。然而,纳米抗体的部分、片段或类似物不特别局限于它们的长度和/或大小,只要这样的部分、片段或类似物满足下文列出的进一步要求且还适于本文所述的目的。
作为“纳米抗体”的制备方法,不限于具体的生物资源或具体的制备方法。例如,本发明的纳米抗体可以这样获得:(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域;(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列;(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如下文所述)或者通过表达编码所述人源化VHH结构域的核酸;(4)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或者其他氨基酸序列;(5)通过应用核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸,然后表达这样获得的核酸;和/或(6)通过前述的任何结合。
此外,基于本发明纳米抗体的一种变型,还包括具有与天然存在的VHH结构域相对应但已被人源化的氨基酸序列的纳米抗体。人源化即用来自人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH结构域序列的一个或多个氨基酸残基。
作为人源化的氨基酸序列的纳米抗体的具体例子,可列举SEQ ID No:39、SEQ IDNo:40、SEQ ID No:41、SEQ ID No:42,但并不限于此。
此外,本发明还涉及包含至少一个VHH结构域或至少一个基于其的蛋白或多肽。
按照本发明的一个非限制性的实施方案,上述多肽基本上由纳米抗体组成。“主要由……组成”指本发明的多肽的氨基酸序列与纳米抗体的氨基酸序列完全相同或相对应,其中有限数目的氨基酸残基,如1~10个氨基酸残基,并且优选的1~6个氨基酸残基,如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基,加到所述纳米抗体或多肽的氨基末端(N-端)和/或羧基末端(C-端)。
上述氨基酸残基可以不改变纳米抗体的生物学特性,并且可以给所述纳米抗体加入其他官能性。例如,所述氨基酸残基可以:
a是纯化标签,即利于所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基,例如,使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。这种残基的一些优选的但非限定的实例是多组His-tag(His6或His8)、GST-tag、MBP-tag、Myc-tag、Strep-tag、Flag-tag、HA-tag、V5-tag、S-tag、E-tag;
b是可溶标签,即利于增加纳米抗体可溶性的标签,例如SUMO-tag;
c是N-端氨基酸残基(即保护氨基酸),例如,Met、Ala、Gln、Glu或其两种以上的组合(如MetAlaGln、AlaGln),借此可以在异源宿主细胞或宿主生物体内表达;
d是C-端Cys残基,例如,借此可以与配基上的-SH反应或与Au表面反应;
e是铰链,以提供纳米抗体与其他基团的链接或间隔,例如,GlySer的组合、IgG铰链、IgA铰链,或其他人工合成的铰链;
f是以已知的方式可以提供有官能团和/或已经被官能化的一个或多个氨基酸残基,例如,如本领域已知,氨基酸残基如赖氨酸或半胱氨酸允许聚乙二醇(PEG)基团附着。
本发明的多肽还可以包括2个或多个所述纳米抗体,也称为多价多肽。
本发明的二价多肽包括2个纳米抗体,任选地通过一个铰链序列连接,本发明的三价多肽包括3个纳米抗体,任选地通过两个铰链序列连接,本发明的四价多肽包括4个纳米抗体,任选地通过三个铰链序列连接。
在本发明的多价多肽中,所述2个或多个纳米抗体可以是相同的或不同的。例如,本发明的多价多肽中的2个或多个纳米抗体:可以针对同一抗原,即针对所述抗原的相同表位或者针对所述抗原的2个或多个不同表位;可以针对不同抗原;或其组合。
例如,本发明的二价多肽AA或AB,可以包括2个相同的纳米抗体A,也可以包括两个不同的纳米抗体A和纳米抗体B,其中,纳米抗体A和B中至少一条选自本发明的纳米抗体;可以包括针对第一抗原的某一表位的第一纳米抗体和针对所述抗原同一表位或不同表位的第二纳米抗体;可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体。作为二价多肽的氨基酸序列的具体例子,可列举例如SEQ ID No:57、SEQ ID No:58、SEQ ID No:59、SEQ ID No:60,但不限于此。
例如,本发明的三价多肽AAA、AAB、ABC,可以包括3个相同的纳米抗体A,可以包括2个相同的纳米抗体A和另一纳米抗体B,可以包括三个不同的纳米抗体A、纳米抗体B和纳米抗体C,其中,纳米抗体A、B、C中至少一条选自本发明的纳米抗体,三者顺序不限;可以包括针对同一抗原的相同的或不同的纳米抗体;可以包括针对第一抗原的相同的或不同的表位的2个相同或不同的纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体;可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体,针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体,和针对于所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体。
例如,本发明的四价多肽AAAA、AAAB、AABC、ABCD(顺序不限),可以包括4个相同的纳米抗体A,可以包括3个相同的纳米抗体A和另一纳米抗体B,可以包括2个相同的纳米抗体A和另外2个不同的纳米抗体B、纳米抗体C,可以包括4个不同的纳米抗体A、纳米抗体B、纳米抗体C和纳米抗体D,其中纳米抗体A、B、C、D中至少一条选自本发明的纳米抗体,四者顺序不限;可以包括针对同一抗原的相同的或不同的纳米抗体;可以包括针对第一抗原的相同的或不同的表位的2个相同或不同的纳米抗体和针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第三纳米抗体;可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体,针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体,和针对于所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体;可以包括针对第一抗原的第一纳米抗体,针对与所述第一抗原不同的第二抗原的第二纳米抗体,针对于所述第一和第二抗原不同的第三抗原的第三纳米抗体,和针对于所述第一和第二抗原不同和第三抗原不同的第四抗原的第四纳米抗体。
包含至少2个纳米抗体的本发明的多肽,其中至少1个纳米抗体针对第一抗原,并且至少1个纳米抗体针对不同于所述的第一抗原的第二纳米抗体(或针对第一抗原的不同表位的第二纳米抗体),还叫做“多特异性”抗体。因此,双特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体和至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体,而三特异性抗体是包括至少1个针对第一抗原的纳米抗体,至少1个针对第二抗原的其他纳米抗体,和至少1个针对第三抗原的其他纳米抗体;等等。
作为多价多肽的氨基酸序列的具体例子,可列举三价多肽,其氨基酸序列为:SEQID No:61、SEQ IDNo:62、SEQ ID No:63、SEQ ID No:64,可举例四价多肽,其氨基酸序列为SEQ ID No:65、SEQ ID No:66、SEQ ID No:67、SEQ ID No:68,但不限于此。
关于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备,可参考EP0822985中的记载。上述多价或多特异性多肽,可以是融合表达的多价多肽,也可以是体外技术连接而成。
用于多价和多特异性多肽的铰链(linker)应该是本领域技术人员所熟知的,例如包括Gly-Ser,如在WO 99/42077中记载的(Gly4Ser)3或(Gly3Ser2)3;或天然存在的重链抗体铰链区或其部分区域。对于其他适宜的铰链,也可参考上文引用的综合背景技术。
此外,除了所述1个或多个纳米抗体之外,本发明的多肽还可以包含官能团、部分或残基,如治疗活性物质,和/或标签,如荧光素标记、同位素标记、生物素标记和酶催化标签等。
此外,本发明的纳米抗体或多肽与IL-17结合的解离平衡常数(KD)为10-6~10-11摩尔/升(M),优选为10-7~10-11摩尔/升(M),更优选为10-8~10-10摩尔/升(M)。
上述抗原与抗原结合分子之间的特异性结合可以用已知的任何适当的方法确定,其包括,斯卡查德分析(Sercatchard Analysis)和/或竞争结合检测如放射性免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA),以及本领域已知的其他新方法,如等离子共振技术(SPR)和/或生物膜干涉(BLI)技术等。
本发明的纳米抗体、多肽、及编码其的核酸,可以以已知的方式制备,本领域技术人员可有本文进一步描述而清楚。关于制备所述纳米抗体、多肽和核酸的一种特别有用的方法通常包括如下步骤:
(1)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另一种适宜的表达体系中,表达编码所述本发明的纳米抗体或多肽的核酸,任选地接着进行;
(2)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。
也可以是,采用其他方法,包括如下步骤:
(3)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主,使本发明的宿主表达和/或生产一种本发明的纳米抗体和/或多肽;任选地接着进行;
(4)分离和/或纯化这样获得的本发明的纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式,并且优选的是双链DNA形式。例如,本发明的核酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA,即,密码子优化)。
本发明的纳米抗体或多肽可以特异性结合所述抗原IL-17,因此本发明的一个优选但非限制性的应用为IL-17吸附剂,前述吸附剂包括载体基质和所述纳米抗体或多肽。
前述载体基质可以为多孔材料,例如,琼脂糖凝胶微球、纤维素球、磁珠、硅胶微球、活性炭或树脂微球等。
用于前述吸附剂的载体可以通过商业购买来获得,作为具体例产品,例如,琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B(GE Healthcare,US),树脂微球Nanomicro系列(苏州纳微科技有限公司),但并不限于这些产品。
在使用上述载体时,优选地,可以将上述载体活化。该活化方式例如可以使用但不限于如下方法:首先进行环氧活化,其次再进行二胺丙基亚胺(DADPA)活化,最后进行碘乙酸活化,等。
前述吸附剂通过将纳米抗体或多肽偶联到经过活化的载体上而得到,具体的方法没有特别限定,例如,可通过将纯化的纳米抗体或多肽溶液与载体混合,并通过离心分离,最终通过对凝胶进行清洗/过滤而得到最终的吸附剂。
本发明的吸附剂可以用来特异性识别IL-17。
本发明的纳米抗体或多肽或吸附剂可用于吸附和纯化IL-17,还可用于制备检测IL-17的试剂盒。
实施例
以下,举出实施例来说明本发明的具体实施方式,但本发明的实施方式不受如下这些实施例的限制,可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。
A.筛选特异性结合IL-17的纳米抗体
实施例1抗IL-17纳米抗体文库的构建。
本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的免疫库,建立步骤如下:
(1)用IL-17免疫羊驼(两只),免疫四次后采取两只羊驼的颈静脉血,分离外周血淋巴细胞,并提取总RNA(PuerLinkTM RNA Mini Kit,Life Technologies:12183018A);
(3)将总RNA反转录为cDNA,并用采用两轮巢式PCR扩增VHH基因;
其中第一轮PCR以cDNA为模版,以UP primer1和DOWN primer1分别为上游和下游引物,扩增后回收大小为650~750bp的条带,并以此为第二轮PCR的模板,上、下游引物分别为UP primer2,DOWN primer2,回收450~500bp的PCR产物;
UP primer1:CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT
DOWN primer1:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
UP primer2:TATCTAGTCGAATTCCGCCCAGGTGCAGCTC
DOWN primer2:AGCGACTAAGCTT TTGTGGTTTTGGTGTC
(3)用EcoRΙ和HindⅢ双酶切PCR产物,并进行琼脂糖电泳,回收350~500bp的基因条带,即为VHH基因片段;
(4)用T4连接酶连接T7载体(10-3Cloning Kit,Meterck Metillipore:70550-3)和VHH基因片段;
(5)将连接产物与包装蛋白混合,组成完整的T7噬菌体,将混合物进行扩增,得到噬菌体原始文库;
(6)经检测,该原始库的滴度为3.14×1010pfu/mL,多样性为1.7×106。
实施例2纳米抗体的筛选
首先将抗原(IL-17)用TBS稀释为10μg/mL,取100μL加入96孔板中,4℃孵育12h。将孔中的抗原稀释液吸出,用TBS洗板3次,拍干,加入1%无蛋白封闭液(购自生工生物工程有限公司),300μL/孔,室温孵育2h(筛选时1%无蛋白封闭液和1%BSA交替使用)。将孔中封闭剂吸出,用TBST洗板6次,拍干,加入扩增的噬菌体,100μL/孔,室温孵育30min。用TBST洗板10次,加入T7洗脱缓冲液(1%SDS)洗脱噬菌体,室温孵育30min,并将洗脱液扩增,用于下一轮筛选。再重复3次。
实施例3基因工程菌的构建
(1)经过四轮筛选之后,将筛选洗脱液进行固体扩增,挑取噬菌斑,以噬菌斑扩增液为模板,以UP primer3和DOWN primer3为上、下游引物,进行PCR扩增;
UP primer3:TTCCTTAACATATGGCCCAGGTGCAGCTCGT
DOWN primer3:TTAAGGAACTCGAGCACGGTGACCAGGGTC
(2)将一部分PCR产物委外测序,即得到所述纳米抗体序列信息,将其命名为L-001和L-002,序列信息详见序列表。
(3)将另一部分PCR产物用NdeΙ和XhoΙ进行双酶切,并回收酶切产物。同时用相同的方法进行酶切并回收载体,用T4连接酶连接酶切产物及载体,将连接产物转入大肠杆菌,得到表达IL-17特异性纳米抗体的基因工程菌。
实施例4IL-17纳米抗体的制备
(1)纳米抗体的基础培养基为TB培养基,按照5%接种量接种,37℃培养3~5h,加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM,下同)进行过夜诱导;
(2)诱导结束后,在4000rpm的条件下离心20min,获得含有纳米抗体的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1:10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB),使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎;
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min,取上清;
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤,然后经过亲和层析柱(GE Healthcare,US)进行IL-17纳米抗体的分离纯化,其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance;
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳以判断纯度,选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。纯化的纳米抗体的SDS-PAGE显示在图1中。
实施例5应用SPR技术分析纳米抗体对IL-17的结合能力。
将IL-17以500~800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上,以1~100nM范围内的7个不同浓度注射纳米抗体,在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD(表A-1和图2)。图2中曲线从上到下依次为纳米抗体在100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM浓度下的响应曲线,左图为L-001的,右图为L-002。通过方程拟合计算出如表A-1所示的动力学参数,L-001(SEQ ID No:15)和L-002(SEQ IDNo:16)对IL-17的亲和力分别为1.72×10-8M和2.67×10-9M。
表A-1抗IL-17纳米抗体的动力学参数
B.抗IL-17纳米抗体的序列优化
实施例6:序列优化策略1
(1)通过CDR移植法对L-001和L-002的CDR2进行替换,得到序列如SEQ ID:13和SEQID:14所示,分别命名为T-001和T-002。
(2)通过定点突变的方法,对L-001和L-002进行保守氨基酸取代,取代策略为:所述CDR1:Ser-Arg-Arg-Xaa11-Xaa12-Ala式(I)(SEQ ID No:1)和CDR3:Val-Cys-Trp-Xaa31-Xaa32-Val-Tyr-Gln-Tyr式(II)(SEQ ID No:4)中的Xaa11独立地选自Thr和Ser;Xaa12独立地选自Thr和Ser;Xaa31独立地选自Asp和Glu;Xaa32独立地选自Asp和Glu。获得保守氨基酸取代的纳米抗体序列,如SEQ ID:17至SEQ ID:38所示。
应用SPR技术分析保守氨基酸取代的纳米抗体对IL-17的结合能力。简言之,将IL-17以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上,以1~200nM范围内的不同浓度梯度注射纳米抗体,在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD(表B-1)。
表B-1保守氨基酸取代的纳米抗体的动力学参数
表B-1的结果表明,
(1)L-001与L-002互换CDR2后,T-001与L-001亲和力处于同一数量级(10-8),T-002与L-002亲和力处于同一数量级(10-9),最终取代结果的效果也很优异,可视为改造后亲和力不变(大致相当)。
(2)基于L-001序列改造的序列:
L-003(SEQ ID No:17)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Asp;
L-005(SEQ ID No:19)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Asp,Xaa32为Asp;
L-007(SEQ ID No:21)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-009(SEQ ID No:23)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-011(SEQ ID No:25)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-013(SEQ ID No:27)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-015(SEQ ID No:29)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-017(SEQ ID No:31)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-019(SEQ ID No:33)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
L-021(SEQ ID No:35)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
L-023(SEQ ID No:37)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
这些序列的亲和力均与L-001的亲和力处于同一数量级(10-8),最终取代结果的效果也很优异,可视为改造后亲和力不变(大致相当)。
基于L-002序列改造的序列:
L-004(SEQ ID No:18)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Asp;
L-006(SEQ ID No:20)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Asp,Xaa32为Asp;
L-008(SEQ ID No:22)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-010(SEQ ID No:24)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-012(SEQ ID No:26)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Asp,Xaa32为Glu;
L-014(SEQ ID No:28)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-016(SEQ ID No:30)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-018(SEQ ID No:32)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Glu,Xaa32为Asp;
L-020(SEQ ID No:34)其Xaa11为Thr,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
L-022(SEQ ID No:36)其Xaa11为Ser,Xaa12为Ser,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
L-024(SEQ ID No:38)其Xaa11为Ser,Xaa12为Thr,Xaa31为Glu,Xaa32为Glu;
这些序列的亲和力均与L-002的亲和力处于同一数量级(10-9),最终取代结果的效果也很优异,可视为改造后亲和力不变(大致相当)。
实施例7:序列优化策略2
纳米抗体人源化改造及亲和力测定
人源化方法1
将纳米抗体L-001、L-002的蛋白序列与人种系进行比对,在框架区标记出差异氨基酸,然后用定点突变的方式将二者部分具有差异的氨基酸替换为人源氨基酸,产生人源化的纳米抗体L-025、L-026。随后进行人源化纳米抗体的表达与纯化。
人源化方法2
将纳米抗体的蛋白序列与人种系进行比对,将L-001、L-002的互补决定区序列移植到人种系抗体框架区,通过基因合成方式产生人源化的纳米抗体序列L-027和L-028。随后进行人源化纳米抗体的表达与纯化。
(1)人源化纳米抗体的基础培养基为TB培养基,按照5%接种量接种,37℃培养3~5h,加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导;
(2)诱导结束后,在4000rpm条件下离心20min,获得含有人源化纳米抗体的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1:10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB),使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎;
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min,取上清;
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤,然后经过亲和层析柱(GE Healthcare,US)进行人源化纳米抗体的分离纯化,其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose HighPerfomance;
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度,选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。
应用SPR技术分析人源化纳米抗体对IL-17的结合能力
将IL-17以500~800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上,以1~100nM范围内的6个不同浓度注射纳米抗体,在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD,曲线从上到下依次为人源化纳米抗体在100nM、50nM、25nM、12.5nM、3.125nM、0.8nM浓度下的响应曲线,经计算,得到人源化抗体的亲和力:
L-001的人源化形式L-025(SEQ ID No:39)和L-027(SEQ ID No:41),其动力学参数分别为Ka=8.58×105Ms、Kd=2.80×10-2 1/s、KD=3.27×10-8M;Ka=4.69×105Ms、Kd=1.80×10-2 1/s、KD=3.84×10-8M。与L-001的亲和力处于同一数量级(10-8),最终取代结果的效果也很优异,可视为改造后亲和力不变(大致相当)。
L-002的人源化形式L-026(SEQ ID No:40)和L-028(SEQ ID No:42),其动力学参数分别为Ka=5.35×105Ms、Kd=1.80×10-3 1/s、KD=3.36×10-9M;Ka=8.19×105Ms、Kd=2.70×10-3 1/s、KD=3.30×10-8M。与L-001的亲和力处于同一数量级(10-9),最终取代结果的效果也很优异,可视为改造后亲和力不变(大致相当)。
实施例8序列优化策略3
纳米抗体N-端、C-端氨基酸改造及亲和力测定。
可以通过基因工程改造、翻译后修饰以及蛋白质工程等技术,在纳米抗体或多价纳米抗体的N-端、C-端分别或同时增加一个或多个氨基酸标签(如组氨酸标签、生物素连接酶标签、HA标签、SUMO标签、GST标签、巯基标签、聚赖氨酸标签、凝血酶标签、肠激酶标签等),必要时可以在氨基酸标签上增加氨基酸接头,以实现纳米抗体高效表达、修饰、纯化、功能化等目的,而不影响纳米抗体的抗原结合能力。
设计纳米抗体N-端修饰的氨基酸序列,如L-029(SEQ ID No:43)、L-030(SEQ IDNo:44)、L-031(SEQ ID No:45)、L-032(SEQ ID No:46)、L-033(SEQ ID No:47)、L-034(SEQID No:48)所示。L-029和L-030分别由L-001、L-002与N-端氨基酸Gln组成;L-031和L-032分别由L-001、L-002与N-端氨基酸AlaGln组成;L-033和L-034分别由L-001、L-002与N-端氨基酸MetAlaGln组成。
设计纳米抗体C-端修饰的氨基酸序列,如L-035(SEQ ID No:49)、L-036(SEQ IDNo:50)、L-037(SEQ ID No:51)、L-038(SEQ ID No:52)、L-039(SEQ ID No:53)、L-040(SEQID No:54)、L-041(SEQ ID No:55)、L-042(SEQ ID No:56)所示。L-035和L-036分别由L-001、L-002与C-端6×His-tag组成;L-037和L-038分别由L-001、L-002与C-端GGGGS和6×His-tag组成;L-039和L-040分别由L-001、L-002与C-端HA-tag(TyrProTyrAspValProAspTyrAla)组成;L-041和L-042分别由L-001、L-002与C-端IgA铰链(SerThrProProThrProSerProSerThrProPro)和HA-tag(TyrProTyrAspValProAspTyrAla)组成。
人工合成上述纳米抗体的DNA序列,并将DNA片段连接到pET23a载体上,构建质粒,并转化进入大肠杆菌,得到改造后的纳米抗体工程菌。
随后进行改造纳米抗体的表达与纯化:
(1)基础培养基为TB培养基,按照5%接种量接种,37℃培养3~5h,加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)进行过夜诱导;
(2)诱导结束后,在4000rpm条件下离心20min,获得含有目的序列的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1:10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB),使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎;
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min,取上清;
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤,然后经过亲和层析柱(GE Healthcare,US)进行分离纯化,其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance;
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度,选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。
应用SPR技术分析改造纳米抗体对IL-17的结合能力
将IL-17以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上,以1-50nM范围内(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、1.5625nM)的5个不同浓度注射纳米抗体,在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HCl pH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD。如表B-2所示,与原序列L-001和L-002相比,改造后的纳米抗体与抗原IL-17的亲和力基本维持不变。
表B-2N-端和C-端氨基酸改造的纳米抗体的动力学参数
实施例9序列优化策略4
多价抗体改造及亲和力测定
1.二价抗体制备
设计特异性结合IL-17的二价多肽序列的氨基酸序列,如L-043(SEQ ID No:57)、L-044(SEQ ID No:58)、L-045(SEQ ID No:59)、L-046(SEQ ID No:60)所示。其由C-末端纳米抗体A、15氨基酸Gly/Ser接头和C-末端纳米抗体B组成。其中,纳米抗体A和纳米抗体B可以相同,也可以不同。L-043的纳米抗体A为L-001,纳米抗体B与A相同;L-044的纳米抗体A为L-002,纳米抗体B与A相同;L-045的纳米抗体A为L-001,纳米抗体B为L-002;L-046的纳米抗体A为L-003,纳米抗体B为L-004。
人工合成这些二价多肽的DNA序列,并将DNA片段连接到pET23a载体上,构建二价多肽质粒,并转化进入大肠杆菌,得到二价多肽工程菌。
随后进行二价多肽的表达与纯化:
(1)二价多肽的基础培养基为TB培养基,按照体积比为5%的接种量进行接种,37℃培养3~5h,加入诱导剂半乳糖苷(IPTG)(终浓度0.25mM)进行过夜诱导;
(2)诱导结束后,在4000rpm的条件下离心20min,获得含有二价多肽的湿菌。
(3)向所得的湿菌中按照1:10的比例加入裂解液(10mM咪唑,500mM NaCl,pH7.40.02M PB),使用700bar高压匀浆机进行细胞破碎;
(4)在4℃、10000rpm的条件下离心20min,取上清;
(5)将上清液通过0.45μm滤器过滤,然后经过亲和层析柱(GE Healthcare,US)进行二价多肽的分离纯化,其中亲和层析柱的填料为Ni Sepharose High Perfomance;
(6)将经过亲和层析纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳判断纯度,选取纯度较高的蛋白溶液使用BCA法进行蛋白浓度的测定。
2.三价抗体制备
设计特异性结合IL-17的三价多肽序列的氨基酸序列,如L-047(SEQ ID No:61)、L-048(SEQ ID No:62)、L-049(SEQ ID No:63)、L-050(SEQ ID No:64)所示。其由纳米抗体A-(GGGGS)3-纳米抗体B-(GGGGS)3-纳米抗体C组成。其中,纳米抗体A、纳米抗体B和纳米抗体C可以相同,也可以不同,顺序也可以调换。L-047的纳米抗体A、B、C相同为L-001;L-048的纳米抗体A、C相同为L-001,纳米抗体B为L-002;L-049的纳米抗体A、B相同为L-001,纳米抗体C为L-002;L-050的纳米抗体A为L-001,纳米抗体B为L-002,纳米抗体C为L-003。
人工合成这些三价多肽的DNA序列,并将DNA片段连接到pET23a载体上,构建三价多肽质粒,并转化进入大肠杆菌,得到三价多肽工程菌。
随后进行三价多肽的表达与纯化,表达纯化过程同上。
3.四价抗体制备
设计特异性结合IL-17的四价多肽序列的氨基酸序列,如L-051(SEQ ID No:65)、L-052(SEQ ID No:66)、L-053(SEQ ID No:67)、L-054(SEQ ID No:68)所示。其中,四价多肽可以由纳米抗体A-(GGGGS)3-纳米抗体B-(GGGGS)3-纳米抗体C-(GGGGS)3-纳米抗体D组成,也可以通过体外连接的方式组成,如VHH1-PEG-VHH2,其中VHH1和/或VHH1可以是单价、二价或多价纳米抗体或多肽。
其中,纳米抗体A、纳米抗体B、纳米抗体C和纳米抗体D可以相同,也可以不同,顺序也可以调换。L-051的纳米抗体A、B、C、D相同为L-001;L-052的纳米抗体A、C、D相同为L-001、纳米抗体B为L-002;L-053的纳米抗体A、D相同为L-001、纳米抗体B为L-002,纳米抗体C为L-003;L-054的纳米抗体A为L-001,纳米抗体B为L-002,纳米抗体C为L-003,纳米抗体D为L-004。
人工合成这些四价多肽的DNA序列,并将DNA片段连接到pET23a载体上,构建四价多肽质粒,并转化进入大肠杆菌,得到四价多肽工程菌。
随后进行四价多肽的表达与纯化,表达纯化过程同上。
还可以利用双功能交联试剂在体外构建四价纳米抗体,双功能交联试剂可以为NHS-PEG-Mal。
VHH1和带有巯基标签的VHH2(等摩尔比,均为0.5mM)混合于PBS缓冲液中,加入10mM TCEP,0.5mM NHS-PEG-Mal,轻柔混匀后4℃避光反应12小时,进行凝胶筛分纯化四价纳米抗体。
在该实施例中,当VHH1为二价抗体L043,VHH2为二价抗体L044(N端巯基化)时,反应产物为L-055。当VHH1为二价抗体L045,VHH2为二价抗体L046(N端巯基化)时,反应产物为L-056。
应用SPR技术分析多价多肽对IL-17的结合能力。
将IL-17以500-800RU的密度氨基偶联到CM5传感器芯片上,以1-50nM范围内的5个不同浓度注射纳米抗体,在所有实验中流速为45μL/min。芯片再生条件为甘氨酸-HClpH1.5。使用在不同纳米抗体浓度下获得的结合曲线来计算动力学参数Ka、Kd和KD。具体数据结果见表B-3。
由此可知,与单价纳米抗体相比,多价形式的纳米抗体与抗原IL-17的亲和力有不同程度的提高。主要表现为解离常数Kd减小,解离变慢,导致亲和力增加,增加程度从数倍到数百倍不等。
表B-3多价多肽的动力学参数
C.IL-17的应用
实施例10IL-17吸附剂制备及性能评价
琼脂糖凝胶的活化。取琼脂糖微球2g,加入2mol/L NaOH,1,4-丁二醇二缩水甘油醚0.8mL,按该比例混合后,反应60min以上。反应结束后,用大量去离子水洗涤凝胶后将其抽滤成湿饼。
IL-17纳米抗体的固载。取活化后的载体材料,加入2mL纳米抗体(L-001,15mg/mL)溶液,37℃、250rpm反应24h。反应结束后加入3倍体积的乙醇胺(体积比6%,pH 9.0)过夜封闭,得到IL-17吸附剂,吸附剂的纳米抗体偶联量为12.88mg/g。
将1mL制备的IL-17吸附剂装进色谱柱,柱高2厘米。装柱后首先使用平衡缓冲液冲洗;随后进行上样,上样后再使用平衡缓冲液冲洗;随后以洗脱缓冲液进行洗脱。测定上样、流穿、平衡液及洗脱液中IL-17的总量,计算IL-17结合量为10.28mg/g。
实施例11IL-17检测试剂盒制备
按下述方法制备IL-17检测试剂盒,VHH1和VHH2可以是本发明所制备的任一纳米抗体,也可以是可以结合IL-17的其他生物大分子。本实施例所用VHH1为本发明所述L-001,VHH2为本发明所述L-002。
a)VHH2使用生物素偶联试剂盒(ab201795)按产品说明书进行生物素化,并利用脱盐柱纯化。
b)10μg/mL VHH1溶于PBS,在疏水96孔板上,每孔加入100μL VHH1,4℃包被过夜。
c)移除孔内溶液,使用PBST洗板5次。
d)每孔加入300μL的3%脱脂奶粉,置于水平摇床上室温孵育2小时。
e)移除孔内溶液,使用PBST洗板5次。
f)每孔加入100μL的IL-17标准品,浓度梯度为0,1,2,5,10,20,50,100ng/μL,设置3个平行孔。或者加入100μL不同稀释倍数的待测样品。置于水平摇床上室温孵育2小时。
g)移除孔内溶液,使用PBST洗板5次。
h)使用含有0.1%脱脂奶粉的PBS将VHH2稀释到5μg/mL,每孔加入100μL,置于水平摇床上室温孵育2小时。
i)移除孔内溶液,使用PBST洗板5次。
j)HRP偶联链霉亲和素(ab7403)按产品说明书稀释,每孔加入100μL稀释后的链霉亲和素,置于水平摇床上室温孵育2小时。
k)移除孔内溶液,使用PBST洗板5次。
l)加入HRP反应底物(如TMB工作液),避光室温静置反应0.5小时,加入50μL 2M硫酸终止反应,酶标仪测定OD450。
m)平行孔计算平均值,绘制标准曲线,计算待测样品浓度。
标准曲线如图3所示,R2达到0.99以上,线性程度好;检测限为ng/μL,灵敏度度高。
Claims (18)
1.一种抗IL-17纳米抗体,其特征在于,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区CDR,所述互补决定区CDR为下述CDR1~CDR3:
氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的CDR1,
氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的CDR2,
以及氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的CDR3;
其中,所述CDR1和CDR3的氨基酸序列中:
Xaa11选自Thr或Ser;和
Xaa12选自Thr或Ser;和
Xaa31选自Asp或Glu;和
Xaa32选自Asp或Glu;且Xaa11和Xaa12不同时选自Thr。
2.根据权利要求1所述的抗IL-17纳米抗体,其特征在于,还包括
框架区FR1~FR4,或者
与所述框架区FR1~FR4的同源性为50%以上的氨基酸序列框;
其中:
框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示;
框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID No:6或SEQ ID No:7所示;
当CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示,框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示;
当CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示,框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示;
框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。
3.根据权利要求2所述的抗IL-17纳米抗体,其特征在于,所述框架区FR1~FR4与所述互补决定区CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。
4.一种抗IL-17纳米抗体,其特征在于,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo:11或SEQ ID No:12所示,其中:
Xaa11选自Thr或Ser;和
Xaa12选自Thr或Ser;和
Xaa31选自Asp或Glu;和
Xaa32选自Asp或Glu;且Xaa11和Xaa12不同时选自Thr。
5.一种抗IL-17纳米抗体,其特征在于,所述抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如:SEQ IDNo:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:18、SEQ IDNo:19、SEQ ID No:20、SEQ ID No:21、SEQ ID No:22、SEQ ID No:23、SEQ ID No:24、SEQ IDNo:25、SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29、SEQ ID No:30、SEQ IDNo:31、SEQ ID No:32、SEQ ID No:33、SEQ ID No:34、SEQ ID No:35、SEQ ID No:36、SEQ IDNo:37、SEQ ID No:38中的任一种所示。
6.一种人源化抗IL-17纳米抗体,其特征在于,由权利要求1-5中任一所述抗IL-17纳米抗体人源化得到。
7.根据权利要求6所述的人源化抗IL-17纳米抗体,其特征在于,所述人源化抗IL-17纳米抗体的氨基酸序列如:SEQ ID No:39、SEQ ID No:40、SEQ ID No:41、SEQ ID No:42中的任一种所示。
8.一种多肽,其特征在于,包括权利要求1-7任一所述纳米抗体,所述纳米抗体的N-端和/或C-端具备标签、铰链或保护氨基酸中的一种或多种;所述标签包括His-tag、GST-tag、Myc-tag、SUMO-tag、Strep-tag、Flag-tag;所述铰链包括GS铰链、IgG铰链、IgA铰链、PEG;所述保护氨基酸包括Ala、Gln、Glu、Met或其两种以上的组合。
9.一种多肽,其特征在于,由任一权利要求1~7中所述的纳米抗体组成,所述多肽是多价多肽。
10.根据权利要求9所述的多肽,其特征在于,所述多价多肽包括二价、三价或四价的多肽。
11.根据权利要求9所述的多肽,其特征在于,所述多价多肽是人源化多肽。
12.根据权利要求9所述的多肽,其特征在于,所述多价多肽是特异性多肽。
13.根据权利要求9所述的多肽,其特征在于,所述多价多肽的氨基酸序列为:SEQ IDNo: 57、SEQ ID No: 58、SEQ ID No: 59、SEQ ID No: 60;SEQ ID No: 61、SEQ ID No: 62、SEQ ID No: 63、SEQ ID No: 64、SEQ ID No: 65、SEQ ID No: 66、SEQ ID No: 67或SEQ IDNo: 68。
14.一种核酸,其特征在于,其是通过编码权利要求1~7任一所述的纳米抗体和/或权利要求8~13任一所述的多肽而成的。
15.一种宿主细胞,其特征在于,其能够表达权利要求1~7任一所述的纳米抗体和/或权利要求14所述的核酸。
16.一种吸附剂,其特征在于,包括权利要求1~7任一所述纳米抗体或权利要求8~13任一所述的多肽,以及载体基质。
17.一种权利要求1~7中任一所述纳米抗体和/或权利要求8~13中任一所述多肽在制备IL-17吸附剂中的应用。
18.一种权利要求1~7中任一所述纳米抗体和/或权利要求8~13中任一所述多肽在制备免疫检测、富集和/或纯化IL-17试剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310681965.0A CN116769027B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310681965.0A CN116769027B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116769027A CN116769027A (zh) | 2023-09-19 |
CN116769027B true CN116769027B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88012602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310681965.0A Active CN116769027B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116769027B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117843778B (zh) * | 2023-12-21 | 2024-07-26 | 北京贝来药业有限公司 | 针对白介素家族成员的新型纳米抗体及其产品和应用 |
CN118005785B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-10-22 | 北京贝来药业有限公司 | 用于疾病治疗的串联纳米抗体 |
CN117843805B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-09-06 | 北京贝来药业有限公司 | 抗体分子、核酸分子、药物组合物以及应用 |
CN117843803A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-09 | 北京贝来药业有限公司 | 新型串联单域抗体及其在疾病治疗中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103717618A (zh) * | 2011-05-05 | 2014-04-09 | 默克专利股份有限公司 | 抗il-17a,il-17f和/或il17-a/f的氨基酸序列以及包含其的多肽 |
CN105190314A (zh) * | 2013-01-21 | 2015-12-23 | 阿布维公司 | 用于炎性疾病的抗-tnf和抗-il17联合疗法生物标志物 |
CN110003329A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-12 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 多肽、il17a/f单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 |
-
2023
- 2023-06-09 CN CN202310681965.0A patent/CN116769027B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103717618A (zh) * | 2011-05-05 | 2014-04-09 | 默克专利股份有限公司 | 抗il-17a,il-17f和/或il17-a/f的氨基酸序列以及包含其的多肽 |
CN105190314A (zh) * | 2013-01-21 | 2015-12-23 | 阿布维公司 | 用于炎性疾病的抗-tnf和抗-il17联合疗法生物标志物 |
CN110003329A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-12 | 深圳普瑞金生物药业有限公司 | 多肽、il17a/f单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
IL17A/F nanobody sonelokimab in patients with plaque psoriasis: a multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 2b study;Kim A Papp等;Lancet.;第397卷(第10284期);1564-1575 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116769027A (zh) | 2023-09-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN116769027B (zh) | 一种抗il-17纳米抗体、多肽及其应用 | |
CN112778416B (zh) | 一种纳米抗体、涉及该纳米抗体的多肽及其应用 | |
WO2021244089A1 (zh) | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 | |
CN101248075A (zh) | 作为选择性吸附IG的色谱吸附剂的[1,2,4]三唑并[I,5-a]嘧啶衍生物 | |
KR20220140535A (ko) | 크로마토그래피 수지 및 이의 용도 | |
CN114380906B (zh) | 一种抗il-17a的单域抗体及其用途 | |
JP2009195184A (ja) | IgG−Fab断片抗体結合性ペプチド | |
CN110573626A (zh) | 抗体选择方法 | |
CN110885374A (zh) | 一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用 | |
WO2024124637A1 (zh) | 抗cll1单域抗体及其应用 | |
CN111349159A (zh) | 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用 | |
CN108179149B (zh) | S100b突变体及其应用 | |
CN111410692B (zh) | 一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用 | |
EP4289863A9 (en) | Bispecific antibody targeting il-17a and il-36r and application thereof | |
CN113461823B (zh) | 靶向人IgE的单域抗体、人源化单域抗体及其应用 | |
WO2022037031A1 (zh) | Il-5的结合分子及其制备方法和应用 | |
JP4690044B2 (ja) | 3量体サイトカイン用の3量体結合タンパク質 | |
CN106928358B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb168 | |
CN106928355B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb184 | |
CN114805559A (zh) | 全人源抗新冠病毒受体结合域单链抗体No4及其应用 | |
CN116751284B (zh) | 一种纳米抗体、包含该纳米抗体的多肽及其应用 | |
CN111909267A (zh) | 低免疫原性抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX063及其应用 | |
CN106928359B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb59 | |
CN117209606B (zh) | 纳米抗体及其应用 | |
CN106928360B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb68 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |