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CN116732099B - 一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法 - Google Patents

一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法 Download PDF

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CN116732099B CN202310984729.6A CN202310984729A CN116732099B CN 116732099 B CN116732099 B CN 116732099B CN 202310984729 A CN202310984729 A CN 202310984729A CN 116732099 B CN116732099 B CN 116732099B
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Abstract

本发明涉及干细胞基因编辑技术领域，具体涉及一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。本发明提供的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法可实现在多能干细胞中进行单步多重基因组编辑，并具有相对较高的编辑效率，不仅极大地简化了基因组编辑的整个过程，从而节省了基因编辑成本和时间，而且减少了干细胞的重复传代、培养和编辑，从而降低了损害基因组完整性的可能性。

Description

一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法
技术领域
本发明涉及干细胞基因编辑技术领域，尤其涉及一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。
背景技术
近年来，CRISPR/Cas技术因其简单性和稳健性已彻底改变了基因编辑领域（Cong,L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P. D., Wu,X., Jiang, W., Marraffini, L. A.,&Zhang, F. (2013). Multiplex genomeengineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.）。然而，在干细胞、尤其是多能干细胞( Pluripotent Stem Cells, PSC)中进行多重基因组编辑由于其效率低而一直面临较大的挑战性，特别是对于大片段敲入的难度更大、效率更低。目前，许多研究人员已经利用病毒，如逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)来提高PSC中目的基因的递送效率（Han, X., et al. (2019). Generation of hypoimmunogenic humanpluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America, 116(21), 10441-10446；Knopp, Y., et al. (2018).Transient Retrovirus-Based CRISPR/Cas9 All-in-One Particles for Efficient,Targeted Gene Knockout. Molecular Therapy. Nucleic Acids, 13, 256；Martin, R.M., et al. (2019). Highly Efficient and Marker-free Genome Editing of HumanPluripotent Stem Cells by CRISPR-Cas9 RNP and AAV6 Donor-Mediated HomologousRecombination. Cell Stem Cell, 24(5), 821-828.e5；Raguram, A., et al. (2022).Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell, 185(15), 2806–2827.）。然而，这可能会诱导意想不到的插入性突变和肿瘤发生；此外，病毒的包装体积相当有限。还有研究人员利用小分子来激活HDR修复途径或抑制NHEJ修复途径，以大大提高PSC中的HDR效率（Lin, S., et al. (2014b). Enhanced homology-directed humangenome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. ELife, 3,e04766；Riesenberg, S.,&Maricic, T. (2018). Targeting repair pathways withsmall molecules increases precise genome editing in pluripotent stem cells.Nature Communications, 9(1)；Zhang, W., et al. (2020). A high-throughput smallmolecule screen identifies farrerol as a potentiator of CRISPR/Cas9-mediatedgenome editing. ELife, 9, 1-25.）。然而，这些小分子的功效仍然存在争议。因此，开发不依赖于病毒和小分子增效剂的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法。
为解决干细胞中难以实现跨不同基因座的多重基因组编辑的问题，本发明以干细胞为研究对象，通过利用和优化CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法，实现了在干细胞中不使用病毒和小分子增效剂进行跨不同基因座的多重和同步基因组编辑。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，所述方法包括：
a）获得核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物，所述核糖核蛋白复合物包含与向导RNA（gRNA）复合的CRISPR/Cas核酸内切酶，所述向导RNA靶向基因组编辑的靶基因；
b）将所述核糖核蛋白复合物和供体模板导入干细胞，所述供体模板包含选择标记基因；
所述选择标记的种类数m小于多重基因组编辑的靶基因数n，其中，m≥1且为整数，n≥2且为整数。
本发明发现，在人源多能干细胞（hPSC）中，使用多种包含Cas和gRNA表达盒的CRISPR/Cas相关质粒并优化质粒与供体模板的比例等多种编辑条件均无法实现多重基因组编辑，而使用CRISPR/Cas RNP（核糖核蛋白复合物）技术则可显著促进干细胞多重基因组编辑的实现。虽然CRISPR/Cas RNP技术能够提升编辑效率，但是，即便使用CRISPR/Cas RNP技术并优化核转染条件、甚至借助于小分子增效剂仍无法获得多重基因组编辑的阳性克隆。本发明意外地发现，与本领域普遍认为的多重基因编辑时针对每个靶基因均分别设置一种选择标记基因不同，在干细胞多重基因组编辑中适当地减少选择标记基因的数量，即将选择标记的数量控制在少于靶基因数的水平，不仅不会影响未设置选择标记基因的靶基因的编辑，反而更有利于提高多重基因编辑的效率，对于实现干细胞的多重基因组编辑具有重要的促进作用。
对于不设置选择标记基因的靶基因，原则上没有特殊限制，可以为所有靶基因中的任意一个或多个。
为简化基因编辑，若所进行的多重基因组编辑同时包含基因敲除和敲入，优选针对基因敲除的靶基因不设置选择标记基因，进而可以省去该靶基因的供体模板。
本发明中，多重基因组编辑中靶基因的数量（即基因编辑位点数量）是几个即为几重基因组编辑，例如，靶基因数量为3个，即为三重基因组编辑。
本发明中，所述选择标记可为任意能够进行阳性克隆筛选的选择标记，包括但不限于抗生素选择标记（例如潮霉素抗性选择标记、嘌呤霉素抗性选择标记等）。
在本发明的一些实施方式中，m（选择标记的种类数）= n（多重基因组编辑的靶基因数）-1。
在本发明的一些实施方式中，n=3，m=2。
本发明中，Cas蛋白优选为Cas9蛋白或与Cas9蛋白具有相同的核酸内切酶功能的蛋白。
以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法中，所述核糖核蛋白复合物的获得包括：分别将各靶基因的向导RNA与CRISPR/Cas核酸内切酶混合孵育制得各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物，再将各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物混合。
本发明发现，与本领域在多重基因组编辑时普遍采用的将多条向导RNA同时与Cas蛋白混合制备核糖核蛋白复合物相比，采用每条向导RNA分别与Cas蛋白混合孵育后、再将各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物混合的方法能够进一步提高干细胞的多重基因组编辑效率。
上述孵育优选为在室温条件下孵育。
此外，为保证基因编辑效率，现有技术多采用两个或更多的向导RNA靶向一个靶基因。本发明发现，在采用上述干细胞多重基因组编辑方法时，使用一个向导RNA靶向一个靶基因，可以显著降低使用CRISPR/Cas编辑基因组时可能出现的脱靶，同时保证多重编辑效率。
优选地，以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法中，针对每个靶基因，设计一个靶向该靶基因的向导RNA。
优选地，本发明所述的干细胞为多能干细胞。
所述多能干细胞包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPS)或化学诱导多能干细胞（CiPS）。
对于多能干细胞的动物来源，本发明没有特殊限制。
在本发明的一些实施方式中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
优选地，以上所述的干细胞多重基因组编辑方法中，在干细胞达到40%-60%汇合度(confluency)时进行核糖核蛋白复合物和供体模板的导入。
本发明发现，对于人源多能干细胞（hPSC）而言，当其达到40%-60%汇合度时进行核糖核蛋白复合物和供体模板导入的效果是最佳的，此时大多数hPSC细胞正处于S/G2期，可以提高HDR的效率。
对于核糖核蛋白复合物和供体模板的导入方法，本发明没有特殊限制，只要能够将核糖核蛋白复合物和供体模板转入干细胞中即可。
在本发明的一些实施方式中，核糖核蛋白复合物和供体模板导入采用核转染技术。将核糖核蛋白复合物和供体模板混合后利用核转染技术转染至干细胞中。
在本发明的一些实施方式中，所述供体模板为质粒。
以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法还包括：
c）利用选择标记进行阳性克隆的筛选；
以及，d）去除阳性克隆的选择标记基因。
上述步骤c）在选择标记进行阳性克隆选择期间，可逐渐增加选择压力，以使所需细胞得到恢复和扩增。
优选地，步骤d）中，利用Cre/LoxP重组系统和HSV-TK/GCV选择系统去除选择标记基因。
在利用选择标记筛选获得基因编辑的阳性克隆后，阳性克隆中的选择标记基因是不必要存在的，尤其是在细胞疗法的应用中，需要去除选择标记基因。本发明利用Cre/loxP重组系统和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因治疗系统去除供体模板中引入的选择标记基因。
在本发明的一些实施方式中，将供体模板所包含的选择标记基因通过T2A/P2A自切割肽与TK融合，并在融合序列的两端引入被Cre重组酶识别的同向的loxP位点。在Cre重组酶核转染后，被侧翼包围的片段将从DNA序列中删除，而由于失去了TK酶，细胞原则上不能将底物GCV代谢为毒性产物，从而能够从细胞群体中筛选得到去除选择标记基因的阳性克隆。
优选地，上述步骤d）中，在Cre重组酶核转染后，将转染产物先进行48-72小时的GCV筛选，然后收集细胞进行亚克隆，对亚克隆再继续利用GCV进行筛选，最后经鉴定获得去除选择标记基因的阳性克隆。
在利用Cre/LoxP重组系统和HSV-TK/GCV选择系统去除选择标记基因时，本发明最初尝试了多种核转染条件和GCV筛选条件但均无法获得同时去除两种或以上选择标记基因的克隆。在不断尝试中，本发明意外地发现，通过对经GCV初筛的Cre重组酶核转染产物进行亚克隆能够显著提高选择标记基因的去除效率、降低克隆的异质性，更有利于获得同时去除两个或以上的选择标记基因的克隆。通过利用Cre/LoxP重组系统和HSV-TK/GCV选择系统结合细胞亚克隆，本发明实现了一步高效去除两个或两个以上的选择标记基因。
优选地，步骤d）中，在Cre重组酶核转染后，将转染产物于含有GCV的培养基中培养48-72h，然后收集细胞进行亚克隆。
进一步优选地，步骤d）中，在Cre重组酶核转染的电穿孔后48-72小时，添加GCV培养48-72h，然后收集细胞进行亚克隆。
优选地，所述GCV筛选的浓度为0.2-1.0μM。
以上所述的鉴定可采用本领域常用的方法，例如PCR鉴定、DNA测序等。
本发明进一步提供一种低免疫原性多能干细胞的制备方法，所述方法包括：采用以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法对多能干细胞进行基因组编辑，使得多能干细胞的免疫原性降低。
采用以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法对多能干细胞进行基因组编辑，不仅能够提高多重基因组编辑的效率，而且在采用基因编辑的多能干细胞生产GMP级功能细胞之前，可以实现选择标记基因的去除。该方法可用于制备低免疫原性的通用型多能干细胞细胞系，具有编辑效率高、难度更低、操作更简单的优势，并且将是以符合或超过GMP要求的方式制备低免疫原性多能干细胞细胞系的理想方法。此外，低免疫原性的通用型多能干细胞细胞系能够更好地克服同种异体移植中免疫排斥的问题，在再生和转化医学领域提供安全、稳定和更低成本的干细胞产品。
上述方法中，使得多能干细胞的免疫原性降低可通过基因组编辑敲入能够使得多能干细胞的免疫原性降低的基因和/或敲除阻碍多能干细胞的免疫原性降低的基因实现。使得多能干细胞的免疫原性降低的基因、阻碍多能干细胞的免疫原性降低的基因可为本领域已知的具有上述功能的任意基因，也可为新发现的具有上述功能的基因。
在本发明的一些实施方式中，所述基因组编辑包括：敲入融合蛋白B2M-HLA E基因、敲入CD47基因以及敲除CIITA基因。
上述融合蛋白B2M-HLA E是B2M与HLA-E的融合蛋白。优选在B2M-HLA E的N端连接有HLA-G 信号肽。
利用以上所述的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法，本发明在多能干细胞中实现了融合蛋白B2M-HLA E基因敲入、CD47基因敲入以及CIITA基因敲除同步进行的三重基因组编辑，极大地提高了干细胞基因编辑的效率。
以上所述的低免疫原性多能干细胞的制备方法中，所供体模板包括第一供体模板和第二供体模板；
所述第一供体模板包括B2M-HLA E表达盒和第一选择标记基因；
所述第二供体模板包括CD47表达盒和第二选择标记基因。
本发明发现，在进行融合蛋白B2M-HLA E表达盒敲入、CD47表达盒敲入以及CIITA基因敲除的三重基因组编辑时，CIITA基因敲除不使用选择标记基因进行筛选，省去CIITA基因敲除的供体模板，仅使用上述第一供体模板和第二供体模板，能够显著提高三重基因组编辑的效率，在一步转染中即可实现融合蛋白B2M-HLA E表达盒敲入、CD47表达盒敲入以及CIITA基因敲除的三重基因组编辑。
在本发明的一些实施方式中，融合蛋白B2M-HLA E表达盒敲入的基因组位点为B2M基因位点。CD47表达盒敲入的基因组位点为AAVS1位点。
在本发明的一些实施方式中，靶向B2M基因位点的sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。靶向AAVS1位点的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。靶向CIITA基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施方式中，融合蛋白B2M-HLA E表达盒包括HLA-G信号肽基因、B2M成熟蛋白基因、连接序列和HLA-E基因， polyA序列。
在本发明的一些实施方式中，CD47表达盒包括CAG启动子，CD47基因和polyA序列。
优选地，所述供体模板还包含敲入基因组位点的上下游同源臂。
在本发明的一些实施方式中，所述第一选择标记基因由EF1a启动子驱动。所述第二选择标记基因由内源性AAVS1启动子驱动。
在本发明的一些实施方式中，第一选择标记与第二选择标记为两种不同的选择标记，例如，为两种不同的抗生素抗性选择标记。
本发明通过对多能干细胞进行单步核转染(one single step nucleofection)，以相对高的效率诱导两个较长的双等位基因敲入和一个双等位基因敲除，从而获得可作为细胞疗法原料的低免疫原性多能干细胞。上述方法中，经过整个抗性筛选期和PCR鉴定，三重基因组编辑效率可达到18.2%（从22个克隆中获得4个期望的克隆，携带有纯合的HLA-E和CAG-CD47敲入以及完全的CIITA敲除）。
本发明还提供一种低免疫原性多能干细胞，所述低免疫原性多能干细胞的CIITA基因和B2M基因失活，且携带纯合HLA-E表达盒和纯合CD47表达盒。
优选地，融合蛋白B2M-HLA E表达盒包括HLA-G信号肽基因、B2M成熟蛋白基因、连接序列和HLA-E基因。
优选地，CD47表达盒包括CAG启动子和CD47基因。
优选地，HLA-E表达盒敲入的基因组位点为B2M基因位点，内源性B2M表达被破坏，且敲入的HLA-E基因在内源性B2M启动子下驱动表达。CD47表达盒敲入的基因组位点为AAVS1位点。
优选地，所述低免疫原性多能干细胞采用以上所述的低免疫原性多能干细胞的制备方法制备得到。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法可实现在干细胞中进行单步多重基因组编辑，并具有相对较高的编辑效率，无需使用病毒或小分子增效剂，不仅极大地简化了基因组编辑的整个过程，从而节省了基因编辑成本和时间，而且减少了干细胞的重复传代、培养和编辑，从而降低了损害基因组完整性的可能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明实施例1中B2M位点敲入B2M-HLA E融合蛋白表达盒的示意图。
图2为本发明实施例1中CIITA基因敲除的示意图。
图3为本发明实施例1中AAVS1位点敲入CD47表达盒的示意图。
图4为本发明实施例1中抗生素筛选得到的阳性克隆的形态。
图5为本发明实施例1中抗生素筛选得到的阳性克隆的基因型鉴定结果，其中，成功敲入B2M-HLA E融合蛋白表达盒的克隆扩增得到1.6kb片段，而未敲入则扩增得到2.1kb片段；成功敲入CD47表达盒的克隆扩增得到1.3kb，未敲入则扩增得到1.9kb；其中，9、21、10、14、33号克隆是双等位基因B2M-HLA E融合蛋白表达盒敲入以及CD47表达盒敲入。
图6为本发明实施例1中成功敲入B2M-HLA E融合蛋白表达盒的克隆以及成功敲入CD47表达盒的克隆的测序结果。
图7为本发明实施例1中CIITA基因敲除克隆的测序结果。
图8为本发明实施例1中利用Cre/LoxP重组系统和HSV-TK/GCV选择系统去除抗生素选择标记基因的策略示意图。
图9为本发明实施例1中利用方法1(Cre核转染和GCV筛选)去除B2M位点和AAVS1位点的抗生素选择标记基因的PCR鉴定结果，结果显示，所有克隆均未去除B2M位点和AAVS1位点的抗生素选择标记基因。
图10为本发明实施例1中利用方法2(亚克隆)去除B2M位点和AAVS1位点的抗生素选择标记基因的PCR鉴定结果，结果显示，#25和#32号克隆仍未去除抗生素选择标记基因，其余克隆成功去除抗生素选择标记基因。
图11为本发明实施例1中利用方法2(亚克隆)去除AAVS1位点的抗生素选择标记基因的测序结果。
图12为本发明实施例1中利用方法2(亚克隆)去除B2M位点的抗生素选择标记基因的测序结果。
图13为本发明实施例1中获得的去除抗生素选择标记基因阳性克隆的核型分析结果。
图14为本发明实施例2中在IFN-γ处理后，低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OE hESC，即U-hESC)和野生型(WT)hESC的HLA-A,B,C表达(A)和CD47表达(B)流式检测，相对于野生型hESC的平均荧光强度(MFIs)在各图的右侧标出。
图15为本发明实施例2中低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC，)和野生型(WT)hESC分化为CD14+单核细胞的形态学检测，其中，明场成像为0-14天细胞形态，标尺为100μm。
图16和图17为本发明实施例2中利用CD14表达检测低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)和野生型(WT)hESC分化为CD14+单核细胞的效率。
图18为本发明实施例2中低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)和野生型(WT)hESC分化为CD14+单核细胞后，通过FCM检测HLA-DR细胞表面蛋白的表达。
图19为本发明实施例3中利用CFSE在野生型hESC和低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)分化的DA祖细胞上检测增殖性CD8+T细胞对HLAs的反应。
图20为本发明实施例3中利用CFSE在野生型hESC和低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)上检测增殖性CD8+T细胞对HLAs的反应。
图21为本发明实施例3中利用CFSE在野生型hESC和低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)分化的单核细胞上检测增殖性CD4+T细胞对HLAs的反应。
图19、图20、图21中单独培养的T细胞作为阴性对照；CD3/CD28处理的T细胞作为阳性对照。
图22为本发明实施例3中与低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)共孵育时，NK细胞的细胞毒性检测。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，Cas9/gRNA复合物（核糖核蛋白复合物）通过按照制造商的说明使用核转染系统(龙沙公司(Lonza) 2B核转染器，程序B016)转染到细胞中。在Cas9与gRNA孵育后得到Cas9/gRNA复合物，供体质粒可直接加入到核转染缓冲液中，然后与Cas9/gRNA复合物混合，得到核转染混合物。
实施例1 干细胞的多重基因组编辑
一、供体模板的构建
1、第一供体模板(B2M-HLA E融合(Etrimer)载体)的制备：载体的构建参考已有文献进行。从人类胚胎干细胞系H1的基因组DNA中扩增B2M左臂和右臂；从hESC(H1) cDNA中扩增HLA-E；B2M信号肽---HLA-G信号肽---连接序列---B2M成熟蛋白---连接序列由公司(通用生物(GENERAL BIOL))合成；从Addgene 60955中扩增EF1a启动子；由公司(通用生物(GENERAL BIOL))合成潮霉素抗性基因(HygroR)；从Addgene165081中扩增HSV-TK序列。在EF1a启动子驱动的HygroR-HSV-TK两侧带有同向loxP位点。
使用In-fusion (Takara)并按照制造商的说明进行无缝克隆，将上述各片段克隆至pUC57载体骨架中。
2、第二供体模板(CAG-CD47载体)的制备：从H1基因组DNA中扩增AAVS1左臂和右臂；从Addgene 60955中扩增嘌呤霉素抗性基因(PuroR)；对Addgene 27077进行消化获得CAG启动子；从hESC(H1) cDNA中扩增CD47基因。从Addgene165081中扩增HSV-TK序列。在PuroR-HSV-TK两侧带有同向loxP位点。
使用In-fusion (Takara)并按照制造商的说明进行无缝克隆，将上述各片段克隆至pUC57载体骨架中。
二、Cas9-gRNA复合物的制备以及核转染
1、在mTesR1(Stem Cell technology)中培养hESC，直至在核转染前达到约50%汇合度。
2、每个gRNA和Cas9的混合物均分别单独制备，即将B2M gRNA、CIITA gRNA、AAVS1gRNA分别与Cas9进行混合孵育，制得各gRNA与Cas9的复合物。混合孵育的具体方法如下：在一个1.5 mL的无菌管中，将15 pmol Cas9蛋白(赛默飞公司(Thermo)，A36496)与90 pmol合成的gRNA (金斯瑞公司(Genescript))混合，再加入核转染缓冲液直至10μL。将反应混合物在室温下孵育约30分钟。在另一个1.5 mL无菌管中，向剩余的核转染缓冲液中加入2 μg供体质粒。
使用的gRNA的序列如下：
B2M gRNA(SEQ ID NO.1)：GAGTAGCGCGAGCACAGCTA；
CIITA gRNA(SEQ ID NO.3)：GATATTGGCATAAGCCTCCC；
AAVS1 gRNA(SEQ ID NO.2)：GTCACCAATCCTGTCCCTAG。
经预测，各gRNA的靶位点切割效率分别为：B2M gRNA，48.12%；CIITA gRNA，49.94%；AAVS1 gRNA，61.02%。
3、用1 ml Accutase消化hESC(6孔板中的1个孔)3分钟，然后用1mL mTesR1终止消化反应。使用1/3的细胞(约1×106)进行核转染。
4、使用2B核转染器(龙沙公司(Lonza)，B016程序)按照制造商的说明进行核转染，将Cas9-gRNA复合物和供体质粒转染至干细胞中。
5、核转染后，将细胞立即转移到预热的培养基（在培养基中加入10μM ROCK抑制剂Y27632或化学混合液CET (50 nM Chroman 1, 5 μM Emricasan和0.7 μM Trans-ISRIB)，以促进核转染后的细胞存活。
6、电穿孔后48-72小时，加入抗生素去除未编辑的细胞。
在选择过程中，逐渐增大选择压力。供体质粒HLA-E融合载体携带潮霉素抗性基因(由EF1a启动子驱动)，供体质粒CAG-CD47携带嘌呤霉素抗性基因(由内源性AAVS1启动子控制)。在进行抗生素选择时，使用10 μg/mL潮霉素2天，然后加入10 μg/mL潮霉素+0.2 μg/mL嘌呤霉素2天，然后加入20 μg/mL潮霉素+0.5 μg/mL嘌呤霉素4天，最后使用40 μg/mL潮霉素+1 μg/mL嘌呤霉素，直到观察到单个克隆。
7、挑选单个克隆，在40 μg/mL潮霉素+1 μg/mL嘌呤霉素中进行培养。
8、针对B2M、AAVS1位点敲入和CIITA位点敲除进行PCR鉴定和Sanger测序。
三、抗生素抗性基因去除
虽然在B2M和AAVS1位点处引入了不同的抗生素抗性基因，但它们的两侧都有同向的LoxP元件。因此，为了缩短编辑过程，本发明试图同时而不是逐步去除这两个抗生素抗性基因。然而，在尝试过程中发现，经过几轮重复试验后，GCV处理并不能保证细胞完全失去TK的表达，在Cre处理后，TK片段仍能以相对较低的强度从克隆中扩增得到。为了降低这些克隆的异质性并获得理想的克隆，对它们进一步进行亚克隆。
依次进行Cre重组酶核转染、GCV处理和亚克隆以去除抗生素抗性基因，方法如下：
1、在mTesR1(Stem Cell technology)中培养上述步骤二获得的B2M、AAVS1位点敲入和CIITA位点敲除的低免疫原性的hESC，直至它们达到约70%的汇合度。
2、用1 mL Accutase消化hESC(6孔板中的1个孔)3分钟，然后用1 mL mTesR1淬灭。使用1/3的细胞进行核转染。
3. 在1.5 mL无菌管中，将40 pmol Cre蛋白(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，SCR508)与100 μL核转染缓冲液混合。
4. 使用2B核转染器(龙沙公司(Lonza)，B016程序)按照制造商的说明进行核转染。
5、核转染后，将细胞立即转移到预热的培养基（在培养基中加入10μM ROCK抑制剂Y27632或化学混合液CET (50 nM Chroman 1, 5 μM Emricasan和0.7 μM Trans-ISRIB)，以促进核转染后的细胞存活。
6、电穿孔后48-72小时加入0.5 μM GCV培养72h去除未编辑的细胞。
7、消化并收集细胞，按照接种0.5-1个细胞/孔的密度，接种到96孔板中进行亚克隆。
注意：在培养基中加入10μM ROCK抑制剂Y27632或化学混合液CET (50 nMChroman 1, 5 μM Emricasan和0.7 μM Trans-ISRIB)，以促进核转染后的细胞存活。
8、72小时后更换培养基，补充0.5 μM GCV。
9、每24小时后更换培养基，并补充0.5 μM GCV，直至克隆长大。
10、针对B2M、AAVS1位点处抗生素抗性基因的去除进行PCR鉴定和Sanger测序。
PCR鉴定的反应条件如下：
1、B2M位点PCR：
对于不存在插入的情况，B2M-nest-F1和B2M-Cy-R得到的产物为2112bp。
对于存在HLA-E表达盒插入的情况，B2M-nest-F1和HLA-E-up-R得到的产物为1654bp。
B2M-nest-F1(SEQ ID NO.4)：GATGCAGTCCAAACTCTCAC；
B2M-Cy-R(SEQ ID NO.5)：GCTCTGGAGAATCTCACGCAG；
HLA E-up-R(SEQ ID NO.6)：CACGGAAGTGTGGAAATACTTC。
PCR反应体系和反应程序如表1所示。
表1
2、CIITA位点PCR：
利用引物CIITA-Lu-F和CIITA-Cy-R得到1904bp片段进行测序验证。
CIITA-seq-1(SEQ ID NO.7)：GCAGGACTTCAGTCAGACTGTC；
CIITA-Cy-R(SEQ ID NO.8)：GCACTTTGCTAGCCAAGCAG。
PCR反应体系和反应程序如表2所示。
表2
3、AAVS1位点PCR：
对于不存在插入的情况，AAVS1-nest-F2和AAVS1-nest-R2得到1890bp；
对于存在插入的情况，CD47-down-F和AAVS1-nest-R2得到1218bp；
AAVS1-nest-F2(SEQ ID NO.9)：
CTTTGAGGCTCTTACTGGCTTCTG；
AAVS1-nest-R2(SEQ ID NO.10)：GATGAGTTTGCCAACAGTC；
CD47-down-F(SEQ ID NO.11)：GAGTATCTTAGCTCTAGCAC。
PCR反应体系和反应程序如表3所示。
表3
4、在B2M位点处的EF1a-HygroR(潮霉素抗性基因)-T2A-TK的去除
对于去除失败的情况，TK-PCR-F3和B2M-confirm-R得到1044bp条带，成功去除则没有条带。
TK-PCR-F3(SEQ ID NO.12)：GCATGTCTTTATCCTGGATTAC；
B2M-confirm-R(SEQ ID NO.13)：
GAAGTCCACACAGCTTCCAGTC。
PCR反应体系和反应程序如表4所示。
表4
5、在AAVS1位点处的T2A-puroR(嘌呤霉素抗性基因)-P2A-TK去除
对于去除失败的情况，AAVS1-seq-1和puro-M-R得到489bp条带，成功去除则没有条带。
AAV S1-seq-1(SEQ ID NO.14)：GAGAGCCTAGCTAGTCTTCTTC；
puro-M-R(SEQ ID NO.15)：GTGAGGAAGAGGTTCTTGCAGC。
PCR反应体系和反应程序如表5所示。
表5
将本发明的干细胞多重基因组编辑的主要实验结果汇总如下：
在Etrimer构建体中，HLA-G信号肽与结构元件B2M融合，随后与HLA-E基因组序列融合，HLA-E蛋白在抑制NK细胞依赖性裂解和呈递HLA-G肽方面发挥关键作用。通过CRISPR/Cas9介导的编辑，将Etrimer供体模板整合到B2M外显子1中(图1)。该插入具有双重作用，一个是破坏内源性B2M表达，另一个是使HLA-E在天然B2M启动子下表达。在CIITA敲除中，在没有供体模板的情况下应用靶向外显子3的gRNA实现CIITA的敲除 (图2)。在CD47过表达构建体中，CD47的表达受组成型强启动子CAG控制(图3)。CD47过表达构建体旨在整合至AAVS1安全港位点(safe harbor)中(图3)。另外，与选择标记基因的表达由EF1a启动子驱动的Etrimer设计不同，CD47构建体中的选择标记基因在整合后由内源性AAVS1启动子驱动。
本发明在研发初期曾尝试使用其中包含Cas9 (D10A)单切酶和gRNA表达盒的CRISPR/Cas9相关质粒(例如Addgene中的PX339)，但均未能在B2M位点获得Etrimer的任何双等位基因插入，甚至未实现一个插入。尽管试图优化Cas9载体与供体之间的比例，但使用质粒进行基因编辑的方法在干细胞中仍然效率相当低。当使用Cas9野生型载体(如Addgene中的PX459)替代时，也观察到了类似的情况。因此，本发明试图使用Cas9/gRNA RNP（RNP法）替代CRISPR/Cas9质粒，并观察到在干细胞中RNP法在获得双等位基因敲入或敲除方面明显优于质粒法。
在引入RNP法的基础上，本发明尝试同时在干细胞中进行三重基因修饰。最初，设计了携带选择标记基因的供体模板来富集CIITA敲除克隆，但当该供体模板与B2M和AAVS1位点的其他两个供体模板同时应用时，在选择过程后，多次尝试仍无法获得任何存活的克隆。考虑到HDR在S/G2期更有效，进一步调整了细胞核转染的细胞密度，并在细胞核转染前后的细胞培养物中补充了小分子增效剂，如已鉴定出的可促进HDR的RS-1和诺考达唑(Nocodazole)，药物筛选后仅形成少数克隆，但最终证明均为假阳性克隆。
在此时，进行三重基因修饰似乎是无法实现的。然而，本发明偶然尝试了从核转染混合物中去除CIITA敲除的供体模板，意外地发现跨越这三个位点的基因修饰可以同时发生，从而可以通过B2M和AAVS1的选择标记来选择CIITA敲除克隆。事实上，利用上述策略在选择过程后形成了大量具有代表性形态特征的克隆(图4)。
进一步对克隆进行：1) 使用与位于同源臂框架外的DNA序列互补的引物进行PCR分析，以排除非特异性整合(图5)；2) Sanger测序以确认所需插入、敲除的序列(图6、图7)；3) 核型分析以检测基因组的完整性；4) 全基因组测序(WGS)以评价基因编辑的潜在影响。最终获得的4个阳性克隆的基因编辑结果和基因编辑效率汇总如表6所示。总体而言，去除CIITA敲除的供体模板后，三重基因编辑效率(18.2%)比应用三种供体模板的先前设计(0%)明显更有效，并且这些克隆保持了正常核型。
表6
接下来，使用Cre重组酶和药物前体GCV去除了B2M和AAVS1位点处的选择标记基因(图8)。与孵育(Cre重组酶需要量较大)相比，Cre重组酶在核转染时需要的量更少，而且能够更有效地介导被LoxP侧翼包围的DNA序列的缺失。Cre重组酶核转染后，用GCV处理细胞，以选择不再携带TK DNA序列的细胞。由于在Cre重组酶核转染后1μM GCV适合B2M位点处的选择，而10μM GCV适合AAVS1位点处的选择，因此GCV浓度很难平衡。最后，考虑到较高浓度的GCV会对这些克隆产生毒性，使用了0.2 μM-1 μM GCV进行选择。然而，40 pmol Cre重组酶核转染和0.5 μM GCV选择的组合能够去除单一位点的抗性标记，但并不能同时有效去除两个位点的抗性标记(图9)。随后，使用三倍和五倍Cre重组酶进行核转染，旨在提高重组效率，但观察到与40 pmol Cre重组酶核转染类似的结果(图9)。本发明意外地发现，经过Cre重组酶处理后，这些克隆的TK片段仍能以相对较低的强度扩增，并据此尝试进行亚克隆，以减少这些克隆的异质性。结果证明，亚克隆有助于选择所需的克隆，在PCR分析和Sanger测序后确定了若干阳性克隆(图10、图11、图12)。对阳性克隆进行核型分析以检测基因组的完整性，结果如图13所示，阳性克隆的基因组完整。
本发明最终获得的低免疫原性hESC细胞在B2M位点携带纯合Etrimer盒(Etrimercassete)(5.2kb)，在AAVS1位点携带纯合CD47过表达盒(overexpression cassette)(5.8kb)，并具有纯合CIITA敲除，命名为B2MEtrimerCIITAnullCD47OE hESC, 简称U-hESC。
实施例2 HLA I/II类分子和免疫调节因子CD47在工程化低免疫原性多能干细胞中的表达验证
对实施例1中经多重基因组编辑获得的低免疫原性hESC，采用流式细胞术分析方法进行HLA I/II类分子和免疫调节因子CD47的表达验证，具体如下：
在37℃下用accutase解离低免疫原性hESC 3分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤单细胞1次。在含有1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中，将低免疫原性hESC悬液与FACS抗体(1:20稀释)在室温下孵育20分钟，并在BD FACSLyric(BD生物科学公司(BD Biosciences))上分析前洗涤两次。采用FlowJo软件(BD)绘制数据。对于IFN-γ处理组，用300 ng/mL IFN-γ(派普泰克公司(peprotech))处理低免疫原性hESC(B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC)和野生型(WT) hESC各48小时，然后收获细胞进行流式细胞术分析。使用的抗体为：与APC缀合的抗HLA-A、B、C抗体(百进科技公司(biolegend)，克隆W6/32)、FITC抗人HLA-DR抗体(百进科技公司(biolegend)，LN3)、PerCP/Cyanine5.5抗人HLA-E抗体克隆(百进科技公司(biolegend)，3D12)、PE抗人CD47抗体(百进科技公司(biolegend)，克隆CC2C6)、APC抗人CD14抗体(百进科技公司(biolegend)，克隆63D3)、PE抗人CD8抗体(百进科技公司(biolegend)，克隆SK1)、APC抗人CD4单克隆抗体(eBioscience™，克隆OKT4)及它们相应的同型对照(百进科技公司(biolegend))。
典型的HLA I类分子对细胞因子刺激具有高度反应性，并且其表达在mRNA水平和蛋白质水平上被干扰素(IFN)-γ刺激强烈上调。为了提高HLA细胞表面表达，检测了细胞因子IFN-γ处理浓度，并使用300 ng/ml IFN-γ处理使HLA I类分子表达水平上调。结果表明，即使在IFN-γ处理下，在B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC中仍未检测到表面典型的HLA I类分子(图14)，证实这些细胞系已完全敲除B2M。
通过靶向hESC中的CIITA消除了HLA II类表达。已知CIITA(主要组织相容性复合体HLA II类反式激活因子)基因对HLA II类基因的转录至关重要，并在HLA II类+细胞和组织中特异性表达。CIITA基因的功能丧失导致缺乏HLA II类，原因是缺少通过HLA II类的抗原呈递能力。为了证明HLA II类表达的丧失，使用STEMdiff单核细胞试剂盒(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))根据制造商的方案，使低免疫原性hESC和野生型hESC分化为CD14+单核细胞，已知CD14+单核细胞同时表达HLA I类和II类基因。经过14天以上的分化后(图15)，使用抗CD14抗体通过FCM确认了CD14+单核细胞的百分比(图16、图17)。这些结果表明，基因编辑并不影响单核细胞的分化。然后，通过FCM检测了HLA-DR细胞表面蛋白的表达，HLA-DR蛋白的细胞表面表达在低免疫原性hESC衍生的单核细胞中丢失，但在野生型单核细胞中未丢失(图18)。
进一步通过流式细胞术(FCM)证实了CD47的过表达(图14)，结果表明，低免疫原性hESC表达的CD47水平显著升高，CD47被靶向整合到AAVS1安全港位点中。
实施例3 B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC及其分化的DA祖细胞的免疫原性的体外鉴定
对B2MEtrimerCIITAnullCD47OEhESC及其分化的DA祖细胞的逃避适应性以及先天性免疫应答的能力进行体外检测，具体如下：
1、在NK细胞下的体外免疫反应性
使用NK92细胞作为效应细胞，低免疫原性和野生型hESC作为靶细胞。用300 ng/mLIFN-γ处理48小时的低免疫原性和野生型hESC为靶细胞；将3×104个细胞/孔的靶细胞和NK92细胞以指定的效应细胞/靶细胞比例在96孔板中的200 µl NK92细胞培养基中共同孵育20小时，然后收获上清液；共孵育后，收集上清液并通过LDH细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物公司(Beyontime))按照制造商的说明进行分析。使用NK92细胞培养基(RPMI-1640)作为背景对照。将单独培养的NK92细胞或单独培养的靶细胞用作自发LDH释放的对照。使用在终点处裂解的靶细胞作为最大LDH释放；将样品在Thermo Scientific™ Varioskan™ LUX上在OD490nm下分析。使用Graphpad prism软件对数据进行标准化和分析。
2、在T细胞下的体外免疫反应性
将hESC、hESC衍生的单核细胞、hESC衍生的DA祖细胞用作靶细胞。将10万个靶细胞置于24孔板上，并在检测前用IFN-γ(300 ng/ml)处理48小时。在共孵育第0天，用CellTraceTM CFSE(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))按照制造商的说明标记分离的CD4+ /CD8+T细胞。贴壁的hESC及hESC衍生的DA祖细胞用丝裂霉素C进行处理，并用PBS洗涤3次，然后与500k CFSE标记的T细胞在补充有20 U/ml IL-2的T细胞培养基中共孵育5天。接着用抗CD4/CD8抗体对T细胞进行染色，然后在BD FACSLyric (BD生物科学公司(BD Biosciences))上分析CFSE强度。使用在没有靶细胞的情况下培养5天的T细胞作为阴性对照。将用Dynabeads™人T-活化剂CD3/CD28珠(DynabeadsTM Human T-ActivatorCD3/CD28 beads)(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))处理5天的T细胞用作阳性对照。采用FlowJo软件(BD)绘制数据。
在hESC中敲除B2M有望消除HLA I类分子的表面表达，并避免CD8+T细胞的直接杀伤活性。为了研究去除多态性HLA分子是否足以阻止T细胞介导的免疫应答，将低免疫原性和野生型hESC与来自健康供体的同种异体CD8+T细胞进行共培养。进一步进行体外T细胞免疫测定：T细胞增殖。据报道，未分化的hESC的免疫原性有限，因此在确定其免疫反应性之前，使hESC分化为仅表达HLA I类的DA祖细胞衍生物。用IFNγ预处理低免疫原性和野生型hESC分化的DA祖细胞，然后与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的同种异体CD8+ T细胞共培养5天。然后通过流式细胞术分析T细胞的CFSE信号稀释度，作为CD8+ T细胞亚群中T细胞增殖的读数。
结果显示(图19)，与野生型hESC分化的DA祖细胞 (13.7%)相比，当与低免疫原性hESC分化的DA祖细胞一起孵育时，总增殖CD8+T细胞的百分比降低(1.67%)。
由于DA祖细胞诱导是较为耗时的，本发明直接对未分化的hESC进行了T细胞免疫测定。在与CD8+T细胞共培养之前，对hESC进行丝裂霉素C处理以抑制其增殖。结果显示(图20)，与野生型hESC (9.7%)相比，在低免疫原性hESC下的CD8+T细胞的增殖明显较低(0.7%)。该趋势与对DA祖细胞进行的CD8+ T细胞增殖试验的结果一致。
为了评价CIITA敲除对hESC的免疫原性影响，如上所述，在IFNγ刺激后，使低免疫原性hESC和野生型hESC分化为表达HLA I类和II类的CD14+单核细胞。由于HLA II类结合对CD4具有特异性，而对CD8不具有特异性，因此使用来自健康供体的同种异体CD4+T细胞进行CSFE分析。CD4+T细胞增殖的免疫测定遵循与CD8+T细胞相似的模式。在CD4+ T细胞中也观察到了相同的趋势。正如预期，见图21，HLA II类表达的WT细胞刺激了CD4+辅助T细胞的增殖(45%)，而CIITA缺陷的低免疫原性hESC则显著降低(21%)。该结果表明，除HLA-I类耗竭外，使用CIITA KO方法耗竭HLA II类分子也能有效地抑制CD4+T细胞的应答。
NK细胞直接介导的杀伤在免疫排斥反应中起重要作用。此外，无HLA I类表面表达的供体细胞可以通过迷失自我反应(missing-self response)引发NK细胞介导的免疫攻击。为了评价NK细胞对低免疫原性hESC的反应，将NK92细胞与WT、B2Mnull、B2MEtrimerCIITAnullCD47OE hESC一起孵育。在与NK92细胞共孵育后，检测凋亡的hESC细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)，以量化NK细胞的细胞毒性。结果表明，当与B2Mnull、B2MEtrimerCIITAnullCD47OE hESC共孵育时，NK细胞的细胞毒性降低(图22)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种低免疫原性多能干细胞的制备方法，其特征在于，采用干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法对多能干细胞进行基因组编辑，使得多能干细胞的免疫原性降低，所述干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法包括：
a）获得核糖核蛋白复合物，所述核糖核蛋白复合物包含与向导RNA复合的CRISPR/Cas核酸内切酶，所述向导RNA靶向基因组编辑的靶基因；
b）通过单步核转染将所述核糖核蛋白复合物和供体模板导入干细胞，所述供体模板包含选择标记基因；
所述选择标记的种类数m小于多重基因组编辑的靶基因数n，其中，m=2，n=3；
c）利用选择标记进行阳性克隆的筛选；
以及，d）去除阳性克隆的选择标记基因；
步骤d）中，利用Cre/LoxP重组系统和HSV-TK/GCV选择系统去除选择标记基因，在Cre重组酶核转染后，将转染产物先进行48-72小时的GCV筛选，然后收集细胞进行亚克隆，对亚克隆再继续利用GCV进行筛选，最后经鉴定获得去除选择标记基因的阳性克隆；
所述基因组编辑包括：敲入融合蛋白B2M-HLA E基因、敲入CD47基因以及敲除CIITA基因；
所述供体模板由第一供体模板和第二供体模板组成；
所述第一供体模板包括B2M-HLA E表达盒和第一选择标记基因；
所述第二供体模板包括CD47表达盒和第二选择标记基因；
其中，融合蛋白B2M-HLA E表达盒敲入的基因组位点为B2M基因位点，CD47表达盒敲入的基因组位点为AAVS1位点；
所述向导RNA为靶向B2M基因位点的sgRNA、靶向AAVS1位点的sgRNA以及靶向CIITA基因的sgRNA，其中，靶向B2M基因位点的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶向AAVS1位点的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，靶向CIITA基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述核糖核蛋白复合物的获得包括：分别将各靶基因的向导RNA与CRISPR/Cas核酸内切酶混合孵育制得各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物，再将各向导RNA对应的核糖核蛋白复合物混合。
3.根据权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞的制备方法，其特征在于，在干细胞达到40%-60%汇合度时进行核糖核蛋白复合物和供体模板的导入。
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