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CN116699020B - 一种hplc-ms检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒 - Google Patents

一种hplc-ms检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒 Download PDF

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CN116699020B CN202310630547.9A CN202310630547A CN116699020B CN 116699020 B CN116699020 B CN 116699020B CN 202310630547 A CN202310630547 A CN 202310630547A CN 116699020 B CN116699020 B CN 116699020B
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Abstract

本发明公开了一种HPLC‑MS检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒，包括如下步骤：向血浆中加入甲醇，血浆与甲醇的体积比为1:1.5‑3，震荡混匀，进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；将上清液与0.05‑0.3％的甲酸水溶液按体积比为1:4‑10进行混合稀释，得稀释液；将得到的稀释液采用液相色谱串联质谱法进行检测，同时检测血浆中的奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N‑乙酰普鲁卡因胺。沉淀后的上清液选取合适的稀释剂进行稀释，有效避免普鲁卡因胺和N‑乙酰普鲁卡因胺由于浓度过高出现峰饱和现象，而且避免了普鲁卡因胺由于保留时间短，受溶剂效应影响导致峰分叉的现象，且可以同时检测不同的抗心律失常药物，是一种样本处理简单、结果可靠、基质效应小、对检测设备友好的检测方法。

Description

一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒。
背景技术
目前，临床上使用抗心律失常药物奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺（N-乙酰普鲁卡因胺）等来控制心律失常疾病，但是针对不同用药个体，由于受到个体代谢酶差异，联合用药影响，病理因素，生活及饮食习惯等因素的影响，药物在体内的代谢程度差异显著，不同个体的体内稳态药物浓度可以相差20倍以上。抗心律失常药物的治疗浓度范围一般都比较窄，中毒浓度和治疗浓度很接近，对于药物在体内代谢比较快的患者，体内药物浓度低于治疗浓度，达不到有效的治疗效果，而药物在体内代谢比较慢的患者，由于药物积累导致体内药物浓度高于治疗浓度，甚至达到中毒浓度。通过对心律失常病人用药后的游离血药浓度快速监测，为临床医生针对心律失常病人最佳用药剂量和用药时间提供强有力的技术支撑，在很大程度上减少用药（包括加量、减量、换药、停药等）的盲目性，使药物在患者体内发挥最佳疗效、减少药物不良反应，节省治疗费用。
目前奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺血药浓度监测的方法有酶联免疫测定法和高效液相色谱(HPLC)法。但是酶联免疫测定法特异性和灵敏性差，因为药物之间化学结构相似，且有着类似的抗原表区，均可发生抗原抗体反应，采用免疫法较难将其完全区分开，从而导致检出的药物浓度与实际情况存在偏差，无法较好地预测疗效和评估不良反应，而且酶联免疫测定法具有专属性，只能针对一种化合物进行检测。高效液相色谱法背景信号高，特异性较差，对样品的前处理要求非常高，需要尽可能去除杂质，排除共流出化合物对检测结果的干扰。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法，包括如下步骤：
向血浆中加入甲醇，血浆与甲醇的体积比为1:1.5-3，震荡混匀，进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；
将上清液与0.05-0.3%的甲酸水溶液按体积比为1:4-10进行混合稀释，得稀释液；
将得到的稀释液采用液相色谱串联质谱法进行检测，同时检测血浆中的奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺。
在一些实施例中，甲酸水溶液的浓度为0.05-0.15%。
在一些实施例中，液相色谱条件为：色谱柱型号：YS LCC 104 MD，2.1mm×50mm，2.6μm；
流动相A：其中，甲酸浓度为0.05%-3%，%为质量百分数；甲酸铵浓度为5-10mmol/L；
流动相B：甲醇；
流速：0.1-0.4mL/min；
柱温：为25-50℃；
进样体积：1-10μL；
梯度洗脱程序：0 min：5%B，3min：98%B，4min：98%B，4.1 min：5%B，5.5 min：5%B。
优选的，所述流动相A为0.05%-1%甲酸，5-8mmol/L甲酸铵水溶液。
进一步优选的，所述流动相A为0.05%-0.5%甲酸，5-6mmol/L甲酸铵水溶液。
再进一步优选的，所述流动相A为0.1%甲酸，5mmol/L甲酸铵水溶液。
在一些实施例中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子喷雾电压：3500V；鞘气：5.58L/min；辅助气：8L/min；吹扫气：1.5L/min；
离子传输管温度：325℃；雾化温度：350℃；扫描模式：多反应监测。
在一些实施例中，四种待测物质的质谱检测离子对见下表：
第二方面，本发明提供一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的试剂盒，至少包括校准品，低、中、高三水平质控品，校准品稀释液（空白血浆），蛋白沉淀剂，样本稀释剂，流动相添加剂，色谱柱和进样板；
所述抗心律失常的药物为奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
本发明针对复杂生物基质建立一种有机溶剂沉淀蛋白，沉淀后的上清液选取合适的稀释剂（0.05%-0.3%甲酸水溶液）进行稀释，有效避免普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺由于浓度过高出现峰饱和现象，而且避免了普鲁卡因胺由于保留时间短，受溶剂效应影响导致峰分叉的现象，且可以同时检测不同的抗心律失常药物，是一种样本处理简单、结果可靠、基质效应小、对检测设备友好的检测方法。
本发明同时建立了奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺的液相色谱-串联质谱法，化合物在3min之内出峰，分析时间短，一针进样可实现四种抗心律失常药物浓度的同时监测，解决了检验人员针对不同药物，还需要采取不同监测手段进行监测的困扰。
本发明应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。
本发明针对每个化合物采集三对母离子/子离子，除定量离子对用于定量之外，还有两对定性离子辅助定性，可有效避免检测结果中假阳性结果的出现。
本发明采用外标法定量检测抗心律失常药物浓度，避免使用昂贵的内标物，极大程度地降低了检测成本。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例的样本前处理流程图；
图2是本发明实施例中的普鲁卡因胺选用0.1%甲酸水溶液作稀释剂，不同用量峰形比较，其中，a用量为120µL，b用量为170µL；
图3是本发明实施例中的总离子流色谱图（TIC）；
图4是本发明实施例中的普鲁卡因胺提取离子色谱图（EIC）；
图5是本发明实施例中的N-乙酰普鲁卡因胺提取离子色谱图（EIC）；
图6是本发明实施例中的利多卡因提取离子色谱图（EIC）；
图7是本发明实施例中的奎尼丁提取离子色谱图（EIC）；
图8是本发明实施例中的普鲁卡因胺标准工作曲线；
图9是本发明实施例中的N-乙酰普鲁卡因胺标准工作曲线；
图10是本发明实施例中的利多卡因标准工作曲线；
图11是本发明实施例中的奎尼丁标准工作曲线；
图12是本发明实施例中的冻干曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
4种抗心律失常药物的中英文名称、CAS号如表1所示：
表14种抗心律失常药物的中英文名称、CAS号等信息
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例
本发明提供一种沉淀蛋白法结合高效液相色谱串联质谱法检测血浆中抗心律失常药物浓度的方法，从线性、携带污染、准确度、精密度、基质效应等方面对该方法的性能进行了充分的验证。并对试剂盒的工艺配方进行了说明，从开瓶/复溶稳定性和效期稳定性等方面对试剂盒的性能进行了验证。
仪器
YSEXACT 9050MD 液质联用仪（山东英盛生物技术有限公司）；电子天平（RADWAG，德国）；24位涡旋混合器（eppendorf，德国）；离心机（eppendorf，德国）；超纯水机（millipore，美国）。
试剂耗材
奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺标准品(天津阿尔塔科技有限公司)；N-乙酰普鲁卡因胺（Sigma-Aldrich）；甲醇为色谱纯（Sigma-Aldrich）；甲酸、甲酸铵（LC-MS级，Fisher）；屈臣氏蒸馏水（再经Milli-Q超纯水器纯化）；色谱柱（山东英盛生物技术有限公司）。
标准母液的配制
准确称取50mg±0.01mg奎尼丁标准品于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到5mg/mL标准母液。其他标准品母液的配制过程同上，得到4种抗心律失常药物对应的标准母液。
标准混合储备溶液的配制
标准混合储备溶液的配制：分别移取奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺标准母液0.6mL、0.6mL、1.2mL、2.4mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。得到混合储备溶液。
校准品溶液配制及标准工作液的配制（血浆基质）
高浓度校准品，是通过向校准品稀释液（空白血浆）中添加一定体积抗心律失常药物奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺的溶剂混合标准溶液制得。
具体地，移取标准混合储备溶液（2.4.4）100µL，加入2mL校准品稀释液（血浆），涡旋混匀，得到高浓度校准品溶液S8。
标准工作液为S1-S8 8个浓度点，通过校准品稀释液（空白血浆）逐级稀释高浓度校准品制得。具体配制过程和浓度点见表2：
表2标准品工作液浓度点和配制过程
低、中、高三水平质控品配制（血浆基质）
高水平质控品，是向校准品溶液（2.4.5）中加入一定体积的校准品稀释液（空白血浆）制得，中浓度质控品是向高水平质控品中加入一定体积的校准品稀释液（空白血浆）制得，低浓度质控品是向中水平质控品中加入一定体积的校准品稀释液（空白血浆）制得。
具体地，将校准品溶液（2.4.5）与校准品稀释液（空白血浆）按照2:1的比例混合，移取校准品溶液（2.4.5）1mL，加入0.5mL校准品稀释液（空白血浆），涡旋振荡混匀，得到高水平质控品溶液；将高水平质控品溶液与校准品稀释液（空白血浆）按照1:1的比例混合，移取高水平质控品溶液500µL，加入500µL校准品稀释液（空白血浆），涡旋振荡混匀，得到中水平质控品溶液；将中水平质控品溶液与校准品稀释液（空白血浆）按照1:4的比例混合，移取中水平质控品溶液250µL，加入1mL校准品稀释液（空白血浆），涡旋振荡混匀，得到低水平质控品溶液。
质控品的浓度见表3：
表3低、中、高三水平质控品浓度点
前处理方法
精密移取标准溶液(血浆基质)，质控样品，或人血浆50μL置于洁净离心管中；加入100μL的甲醇，2000rpm 涡旋震荡混匀2 min，室温下10000rpm离心10min；吸取30μL上清液转移至 1mL 96孔板中，加入170μL 0.1%甲酸水溶液稀释，用200μL排枪反复吸打几次混匀，即可进样。具体前处理流程见图1：
检测方法
色谱条件
色谱柱型号：YS LCC 104 MD (2.1mm×50mm，2.6μm)；
流动相A：0.1%甲酸，5mmol/L甲酸铵水溶液；
流动相B：甲醇；
流速：0.3mL/min；
柱温：为35℃；
进样体积：1μL；
梯度洗脱程序见表4：
表4 梯度洗脱程序
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；
离子喷雾电压：3500V；
鞘气：5.58L/min；
辅助气：8L/min；
吹扫气：1.5L/min；
离子传输管温度：325℃；
雾化温度：350℃；
扫描模式：多反应监测
各个目标物的质谱参数如表5：
表5各目标物质谱参数
实验结果
沉淀剂类型和用量优化
本发明分别考察了甲醇、乙腈和甲醇:乙腈=1:1（v/v）三种沉淀剂，考察的比例分别为样本:沉淀剂=1:2，1:3和1:4，如表6所示，结果发现三种沉淀剂，不同的提取比例条件下，四种药物的响应没有明显变化。从节约成本、降低有机溶剂毒性以及用量综合考虑，最终选用甲醇作为沉淀剂，沉淀比例为样本:沉淀剂=1:2。
表6 抗心律失常药物不同沉淀剂和比例下的响应
稀释剂类型和用量优化
在沉淀蛋白后，由于四种药物的治疗浓度较高，尤其是普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺，高浓度点色谱峰容易出现饱和现象，需要选取合适的稀释剂对上清液进行稀释处理，再上机检测，对稀释剂类型和用量进行了考察。分别考察了纯水和0.1%甲酸水溶液作为稀释剂，加入稀释剂的体积为70µL、120µL 和170µL，如图2所示，由于普鲁卡因胺的保留时间比较短，稀释剂的类型选择不对或体积过小，会导致普鲁卡因胺有较强的溶剂效应，峰形分叉（如图2所示），加大稀释剂的用量，溶剂效应消除，峰分叉现象消失。因此最终选择0.1%甲酸水作为稀释剂，稀释剂的体积为170µL。
最佳色谱和质谱条件下的总离子流色谱图（TIC）和提取离子色谱图（EIC）
采用MRM模式监测4种抗心律失常药物的离子对，定量离子对用于结果定量，2对定性离子对辅助定性确证。获取的标曲最低点的TIC图和EIC图，如图3-图7所示。
外标法定量
采用外标定量法，以标准工作液(血浆基质)S1-S8 8个浓度为X轴，以标准工作液的峰面积为Y轴，建立外标标准曲线，奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺在各自浓度范围内线性拟合方程，线性良好，相关系数基本都在0.99以上，N-乙酰普鲁卡因胺采用Quantic拟合方式。具体线性回归方程及线性相关系数见表7。
表7 抗心律失常药物的线性回归方程及线性相关系数
标准工作曲线如图8-图11所示。
携带污染验证
在利用高效液相色谱串联质谱法进行样本中目标分析物的检测过程中，经常遇到携带污染的问题，影响检测结果的准确性和可靠性。本发明通过两种方式对携带污染进行了验证。
一种验证方式是重复进样标曲低浓度样本5针，然后交替进样标曲高浓度样本1针和低浓度样本连续2针，重复5次，比较高-低浓度值转换样本均值（H-L）和低-低浓度值转换样本均值（L-L）的偏差。第二种验证方式是交替进样标曲高浓度样本和空白样本5次，比较空白样本5次进样分析物峰面积的平均值和第一种验证方式标曲低浓度样本重复5次进样峰面积的平均值。
第一种验证方式结果显示，重复5次进样标曲低浓度样本的检测结果均值与H-L浓度交替进样的标曲低浓度样本的检测结果均值偏差低于20%；且H-L浓度值转换样本均值与L-L浓度值转换样本均值的差小于L-L浓度值转换样本的3SD。第二种验证方式结果显示，高浓度样本之后在空白样本中的分析物峰面积均值低于标曲低浓度样本中分析物峰面积均值的20%。详见表8。
表8 携带污染验证数据
准确度验证
采用加标回收率试验评估方法的准确性。按照2.4.6低、中、高三水平质控品的配制方法，配制低、中、高3个不同浓度的待测样本，每个浓度样本平行处理5份，结果显示，4种抗心律失常药物的平均回收率均在91.62%-111.73%之间，满足85%-115%的要求。5次重复实验的CV在1.97%-5.96%之间。具体见表9。
表9 四种抗心律失常药物低、中、高三水平的回收率
精密度验证
按照2.4.6 低、中、高三水平质控品的配制方法，配制低、中、高3个不同浓度的待测样本，一天内每个浓度样本平行处理5份，连续处理三天，结果显示，4种抗心律失常药物批内精密度以变异系数CV表示，为1.31％-8.59％，批间精密度CV值在2.82％-7.22％之间，具体见表10。
表10 四种抗心律失常药物低、中、高三水平的批内和批间精密度
基质效应验证
通过两种方式对基质效应进行了验证，一种验证方式是按照2.4.6 低、中、高三水平质控品的配制方法，配制低、中、高3个不同浓度，每个浓度样本平行处理5份，每份重复测定3次；按照同样的浓度设置，配制纯溶剂标准溶液，同基质样本一同上机检测，验证基质效应。结果显示，4种抗心律失常药物低、中、高3个浓度水平的基质效应因子（MF）的平均值在0.87-1.22之间，基质效应因子（MF）的CV值在3.9%-10.0%之间。具体见表11。
另一种验证方式是选取校准品稀释液加入目标分析物（分析物浓度为标曲中间点浓度）作为基质样本，生物基质样本以及二者的1：1混合液，分别进行前处理，然后上机检测。比较添加目标分析物的基质样本和生物基质样本峰面积的平均值，与1：1混合液峰面积的偏差，结果显示，偏差在7.26%-12.31之间。见表12。
表11 四种抗心律失常药物低、中、高三水平的基质效应因子
表12 混合实验基质效应结果
从上述两种验证方式的结果可以看出，该方法能够有效地避免基质效应对检测结果的影响。
总之，采用本实施例检测方法对4种抗心律失常药物进行检测，其具有良好的重现性、稳定性与准确性，总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确性高且前处理过程较简单，可快速完成抗心律失常药物的检测，为临床上心律失常病人服药后的血药浓度监测提供一种可靠的检测方法。
液相色谱串联质谱法检测血浆中抗心律失常药物的试剂盒组成
试剂盒组成、配方、规格及装量见表13。
表13：抗心律失常药物的试剂盒组成
校准品的配制
按照2.4.4标准混合储备溶液的配制方法，配制标准混合储备溶液，然后移取5mL标准混合储备溶液，加入至100mL校准品稀释液（空白血浆）基质中，充分混匀。按照200μL/瓶分装于3mL棕色冻干瓶内，将分装好的校准品溶液置于冷冻干燥机内冻成干粉，保存于-18℃或以下。使用时取出，加入200μL水复溶。
低、中、高三水平质控品的配制
用校准品溶液（2.4.9.1）配制质控品，具体如下：
高水平质控品溶液：将校准品溶液与校准品稀释液（空白血浆）按照2:1的比例混合，以150mL为单位，移取校准品溶液100mL，加入校准品稀释液（空白血浆）50mL，涡旋振荡混匀。
中水平质控品溶液：将高水平质控品溶液与校准品稀释液（空白血浆）按照1:1的比例混合，以150mL为单位，移取高水平质控品溶液75mL，加入校准品稀释液（空白血浆）75mL，涡旋振荡混匀。
低水平质控品溶液：将校准品溶液与校准品稀释液（空白血浆）按照1:4的比例混合，以150mL为单位，移取中水平质控品溶液30mL，加入校准品稀释液（空白血浆）120mL，涡旋振荡混匀。
将上述低、中、高三水平质控品溶液按照200μL/瓶分装于3mL棕色冻干瓶内，将分装好的溶液置于冷冻干燥机内冻成干粉，保存于-18℃或以下。使用时取出，加入200μL水复溶。
校准品稀释液的配制
取空白血浆，按照1.5mL /瓶分装于3mL棕色冻干瓶内，置于冷冻干燥机内冻成干粉，保存于-18℃或以下。使用时取出，加入1.5mL水复溶。
稀释剂的配制
以1000mL为单位，移取1mL甲酸，加入超纯水至1000mL，超声溶解混匀。按照 25mL/瓶进行分装，室温保存。
流动相A添加剂的配制
以100mL为单位，精密称取15.765g甲酸铵，加入超纯水至100mL，超声溶解混匀。按照 2mL/瓶进行分装，室温保存。
冻干条件
在-30℃～-50℃下冷冻3-6h，并在-30℃～0℃下升华12-18h，然后在0℃～20℃下解析干燥6-10h。
具体地，将需要冻干的校准品、校准品稀释液和质控品溶液分装至3mL棕色冻干瓶中，加半塞，置于真空冷冻干燥机内，在-40℃下冷冻5h，将样品冻实。然后在-20℃下升华5h，0℃下升华10h，升华可以直接将90％左右的水分从冷冻后的固体半成品中去除，同时保留了原有的固体骨架结构，呈海绵状，且所得制品的复溶性极好。最后在20℃下解析干燥8h，去除结合水，可以改善冻干品的贮存稳定性，延长其保护期。 冻干曲线见图12。
校准品、校准品稀释液、低、中、高三水平质控品冻干品水分含量及状态验证
随机抽取同一批次校准品、校准品稀释液和低、中、高三水平质控品冻干品各3支，在室温下避光保存，使用卡尔-费休水分测定仪采用容量滴定法在分别测定冻干品水分，并对冻干品外观及复溶后的状态进行考察，具体结果如表14所示。
表14 校准品、校准品稀释液和低、中、高三水平质控品的水分含量、外观及复溶状态
由表14可知，校准品、校准品稀释液和低、中、高三水平质控品冻干品水分含量均未超过3％，而且冻干品均为淡黄色干粉、复溶后为淡黄色澄清液体，因此该试剂盒中校准品、校准品稀释液和低、中、高三水平质控品冻干品的水分和外观良好。
校准品准确度验证
随机取3支校准品，复溶后作为待测样品，按照2.4.7.1所述的前处理方法进行样本处理，用选定的更高级别标准品对系统进行校准后，按照2.4.7.2所述的检测方法检测待测样品，每支测试1次， 计算测定值，与靶值进行比较，计算相对偏差。结果如表15所示。
表15 校准品准确度验证
由表15可知，校准品用更高级别别校准，测定值与靶值的相对偏差均未超过10％，因此，校准品的准确度非常可靠。
校准品和低、中、高三水平质控品的开瓶/复溶稳定性验证
将校准品和低、中、高三水平质控品冻干品开瓶/复溶后盖好，置于预计储存的条件下存放，自0h起放置0d、3d、6d、9d、12d、14d，每次取出后放置在-70℃以下，最后按照检测方法上机检测，每个时间点测定三个平行样，利用均值计算检测获得的抗心律失常药物不同时间段的浓度，并与0h的浓度进行比对，计算相对偏差。结果如表16所示。
表16 校准品和低、中、高三水平质控品开瓶/复溶稳定性
由表16可知，校准品和低、中、高三水平质控品冻干品开瓶复溶后，放置在-70℃下保存14天，4种抗心律失常药物的浓度与0h检测浓度的相对偏差均未超过10％，因此，校准品和低、中、高三水平质控品的开瓶/复溶后，在14天内有较好的稳定性。
校准品和低、中、高三水平质控品的效期稳定性验证
将校准品和低、中、高三水平质控品冻干品在-18℃或以下避光密封的条件下存储，并分别0月、1月、3月、6月、9月、12月不同时间对冻干品中进行检测，每个时间点测定3个平行样，利用均值计算检测获得的抗心律失常药物不同时间段的浓度，并与靶值浓度进行比对，计算相对偏差，结果如表17所示。
表17校准品和低、中、高三水平质控品效期稳定性
由表17可知，校准品和低、中、高三水平质控品冻干品开瓶复溶后，放置在-18℃下保存12个月，4种抗心律失常药物的浓度与靶值的相对偏差均未超过10％，因此，校准品和低、中、高三水平质控品有较好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法，其特征在于：包括如下步骤：
向血浆中加入甲醇，血浆与甲醇的体积比为1:1.5-3，震荡混匀，进行蛋白沉淀，离心后得到上清液；
将30μL上清液与170μL 0.1%的甲酸水溶液进行混合稀释，得稀释液；
将得到的稀释液采用液相色谱串联质谱法进行检测，同时检测血浆中的奎尼丁、利多卡因、普鲁卡因胺和N-乙酰普鲁卡因胺；
液相色谱条件为：色谱柱型号：YS LCC 104 MD，2.1mm×50mm，2.6μm；
流动相A：0.05%-1%甲酸，%为质量百分数，5-8mmol/L甲酸铵水溶液；
流动相B：甲醇；
流速：0.1-0.4mL/min；
柱温：为25-50℃；
进样体积：1-10μL；
梯度洗脱程序：0 min：5%B，3min：98%B，4min：98%B，4.1 min：5%B，5.5 min：5%B；
质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子喷雾电压：3500V；鞘气：5.58L/min；辅助气：8L/min；吹扫气：1.5L/min；
离子传输管温度：325℃；雾化温度：350℃；扫描模式：多反应监测；
四种待测物质的质谱检测离子对见下表：
。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法，其特征在于：所述流动相A为0.05%-0.5%甲酸，5-6mmol/L甲酸铵水溶液。
3.根据权利要求2所述的HPLC-MS检测血浆中抗心律失常药物的方法，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸，5mmol/L甲酸铵水溶液。
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JP7240704B2 (ja) * 2018-09-28 2023-03-16 株式会社日立ハイテクサイエンス 液体クロマトグラフ分析方法及び液体クロマトグラフ分析装置
CN110596272B (zh) * 2019-09-26 2022-05-10 广东省药品检验所（广东省药品质量研究所、广东省口岸药品检验所） 一种成人外用制品中16种局部麻醉成分的检测方法
CN115963200A (zh) * 2022-12-27 2023-04-14 合肥市开凡检测科技有限公司 一种同时测定人血浆中利多卡因及丁卡因浓度的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Development and validation of an analytical method using liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the therapeutic drug monitoring of seven cardiovascular drugs in clinical usage;Mariam M. Abady et al.;Journal of Chromatography B;第1214卷;第2.3-2.4节、表2、第3.1-3.2节 *
Mariam M. Abady et al..Development and validation of an analytical method using liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the therapeutic drug monitoring of seven cardiovascular drugs in clinical usage.Journal of Chromatography B.2022,第1214卷第2.3-2.4节、表2、第3.1-3.2节. *
Simultaneous determination of procaine and para-aminobenzoic acid by LC-MS/MS method;Mugunthu R. Dhananjeyan et al.;Journal of Chromatography B;第847卷;第2.3-2.4节 *

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