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CN116656656A - 腈水合酶突变体、菌株及在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用 - Google Patents

腈水合酶突变体、菌株及在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用 Download PDF

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CN116656656A
CN116656656A CN202310125922.4A CN202310125922A CN116656656A CN 116656656 A CN116656656 A CN 116656656A CN 202310125922 A CN202310125922 A CN 202310125922A CN 116656656 A CN116656656 A CN 116656656A
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CN
China
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pfnh
nitrile hydratase
mutant
nitrile
compounds
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Application number
CN202310125922.4A
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Inventor
王亚军
徐浩博
李树芳
徐成龙
郑裕国
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Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种腈水合酶突变体、菌株及在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用，所述腈水合酶PfNH突变体是将SEQ ID NO.9所示腈水合酶PfNH氨基酸序列的第86位进行单突变获得的。本发明腈水合酶PfNH突变体PfNH‑Q86W的底物偏好性发生明显改变，对分子量较大的芳香族腈类如4‑氰基吡啶、苯甲腈、2,6‑二氟苯甲腈的催化性能较野生型显著的提升，对比酶活分别提高2.56倍、9.35倍、2.29倍；而对分子量较小的脂肪族腈类如异丁腈、正戊腈的催化性能较野生型有所降低，比酶活分别是野生型的0.38倍、0.80倍。突变体对芳香族腈类化合物催化活性显著提高，展现出工业应用前景。

Description

腈水合酶突变体、菌株及在催化芳香族腈类化合物合成酰胺 类化合物中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种源自荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens腈水合酶PfNH的编码基因及其突变体在生物催化合成酰胺类化合物方面的应用。
(二)背景技术
酰胺是一类具有高工业附加值的化合物，能够作为橡胶、尼龙聚合物、化妆品和纺织品的重要合成前体。传统工业生产这类酰胺化合物主要是通过腈化学法水合制备，化学法通常反应条件苛刻，需要高温高压以及化学催化剂的参与，反应副产物多、收率低。而生物转化法具有反应条件温和、副产物少、污染少等优势，符合绿色化学发展方向。目前，生物催化已逐渐替代传统化学方法应用于工业生产酰胺类化合物。
腈水合酶(Nitrile hydratase，EC 4.2.1.84)能够催化腈类化合物水合反应生成相应的酰胺。自上世纪70年代以来，腈水合酶已成功应用于丙烯酰胺和烟酰胺等大宗化学品的大规模化工业制备中。丙烯酰胺的聚合物聚丙烯酰胺的用途非常广泛，常作为润滑剂、黏土稳定剂和增稠剂；烟酰胺广泛用于医药、食品、饲料添加剂以及医药中间体。随着研究的不断深入，腈水合酶在医药、农药中间体生产上的应用也越来越广泛，如在异丁酰胺、2,6-二氟苯甲酰胺、4-吡啶甲酰胺、苯甲酰胺等的合成中体现出巨大的应用价值和潜力。异丁酰胺是合成艾滋病治疗药物利托那韦的重要中间体；2,6-二氟苯甲酰胺是杀虫剂苯甲酰脲的重要中间体；4-吡啶甲酰胺是头孢类药物中间体；苯甲酰胺其衍生物邻氨基苯甲酰胺是抗癌药伏立诺他的重要中间体，等等。
腈水合酶作为一种金属酶。根据所含有的金属离子不同，腈水合酶主要分为铁型腈水合酶(Fe-NHase)和钴型腈水合酶(Co-NHase)。Fe-NHase和Co-NHase除结合的金属离子不同外，还表现出不同的酶学性质。两种腈水合酶的底物偏好性有所差异，通常Fe-NHase更偏好催化分子量较小的脂肪族腈化合物，Co-NHase则对分子量较大的芳香族腈化合物具有更高的底物亲和力。
(三)发明内容
本发明提供一种腈水合酶PfNH突变体、菌株及在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用，本发明通过富集培养，分离到一株具有腈水合酶活性的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJUT001，从P.fluorescens ZJUT001基因组克隆得到铁离子依赖型腈水合酶PfNH的编码基因，并通过基因突变技术构建对芳香族腈类化合物催化活性显著提升的腈水合酶PfNH突变体，用于催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物。本发明克服了现有铁离子依赖型腈水合酶对芳香族腈类化合物催化效率低的缺陷。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水合酶PfNH突变体，所述腈水合酶PfNH突变体是将SEQ IDNO.9所示腈水合酶PfNH氨基酸序列的第86位进行单突变获得的。所述腈水合酶PfNH包含α亚基和β亚基，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
进一步，所述腈水合酶PfNH突变体是将SEQ ID NO.9所示氨基酸序列第86位谷氨酰胺突变为色氨酸(Q86W，记为M1)。
本发明所述腈水合酶PfNH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PfNH由α亚基(SEQ ID NO.5，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和β亚基(SEQ ID NO.6，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和调控蛋白(SEQ ID NO.7，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)组成。其中，调控蛋白基因来源于P.fluorescensZJUT001基因组的腈水合酶基因簇中，能够表达调控蛋白(SEQ ID NO.7)。该调控蛋白在腈水合酶的表达和组装过程中发挥重要作用，能够确保腈水合酶的正确表达。
本发明还提供一种所述腈水合酶PfNH突变体编码基因，以及含所述编码基因的重组载体，由重组载体构建的重组基因工程菌。所述重组载体采用质粒pET-28a(+)、pET-28b(+)，所述重组基因工程菌以E.coliBL21(DE3)为宿主菌。
本发明还提供一种所述腈水合酶PfNH突变体在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用，具体所述应用的方法为：将含腈水合酶PfNH突变体编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或是湿菌体经超声破碎提取的纯化酶为催化剂，以芳香族腈类化合物为底物，以pH 7.0、50mM的磷酸钠缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得酰胺类化合物。
进一步，所述转化体系中，底物终浓度10～100g/L(优选100g/L)，催化剂用量以湿菌体总干重计为0.1～20g DCW/L(DCW为细胞干重，优选6g DCW/L)或以纯化酶蛋白含量计为0.01～1mg/L(优选0.05mg/L)。
进一步，芳香族腈类化合物包括苯甲腈、4-氰基吡啶、2,6-二氟苯甲腈。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含所述腈水合酶PfNH突变体编码基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％(v/v)接种量接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600值0.6～0.8，培养液中加入异丙基硫代半乳糖苷以及FeSO4至终浓度分别为0.2mM和0.5mM，18℃培养14h后，4℃、8000rpm离心10min，获得所述的含腈水合酶湿菌体。
进一步，所述纯化酶按如下方法制备：将湿菌体以100g/L的量重悬于pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率为200W，破碎1s、暂停3s，取破碎混合液8000rpm、4℃下离心10min，收集上清液，通过0.22μm微滤膜过滤后，采用镍亲和柱纯化蛋白，纯化操作如下：①用含300mM NaCl的pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液平衡镍亲和柱直至基线稳定；②以1.0mL/min的流速上样，之后用含300mMNaCl、20mM咪唑的pH7.0、50mM磷酸钠缓冲液以1.0mL/min的流速冲洗未结合的杂质，直至基线稳定；③然后用含300mM NaCl、500mM咪唑的pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液以1.0mL/min洗脱目的蛋白；当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时收集流出液，当紫外吸收检测值回到基线时停止收集，将收集的目的蛋白置于冰上保存，再用50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析(透析袋的截留分子量为10kDal)12h，收集截留液，即为纯化酶。
本发明还提供一种用于提取腈水合酶PfNH基因的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)ZJUT001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年12月5日，保藏编号为CCTCC No:M 20221873，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
本发明所述腈水合酶PfNH突变体的获取是采用定点饱和突变技术对腈水合酶PfNH基因(SEQ ID NO.4)进行突变，将获得的突变质粒以热激方式转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得突变体菌株。具体方法如下：第一步将重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-pfnh活化并提取质粒pET-28b(+)-pfnh，并保存于-20℃。第二步筛选位于底物通道入口处的氨基酸残基Q86，以pET-28b(+)-pfnh为模板质粒，进行定点饱和突变，获得突变质粒，并转化。对所有的突变体进行催化性能评价，筛选出优势突变体PfNH-Q86W(记为M1)。
本发明腈水合酶PfNH及其突变体的接种、转接、诱导所使用的培养基，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH为7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明通过富集培养，分离到一株具有腈水合酶活性的菌株P.fluorescensZJUT001；克隆得到新型铁离子依赖型腈水合酶PfNH的编码基因，构建重组表达载体pET-28b(+)-pfnh，并成功实现在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达。
(2)通过定点饱和突变获得底物催化活性显著提高的腈水合酶PfNH突变体，其中突变体PfNH-Q86W的底物偏好性发生明显改变，对分子量较大的芳香族腈类化合物如4-氰基吡啶、苯甲腈、2,6-二氟苯甲腈的催化性能较野生型显著的提升，对比酶活分别提高2.56倍、9.35倍、2.29倍；而对分子量较小的脂肪族腈类如异丁腈、正戊腈的催化性能较野生型有所降低，比酶活分别是野生型的0.38倍、0.80倍。本发明克服了野生型腈水合酶PfNH对芳香族腈类化合物如4-氰基吡啶、苯甲腈、2,6-二氟苯甲腈的催化活性较差的缺陷。
(3)本发明首次将来自P.fluorescens ZJUT001的腈水合酶PfNH突变体用于生物催化芳香族腈类化合物合成酰胺化合物，突变体PfNH-Q86W对芳香族腈类底物催化活性显著提高，解决了现有铁型腈水合酶对芳香族腈类化合物催化活性较差的缺陷。对于突变体PfNH-Q86W，底物苯甲腈投料量可达到100g/L时，10min内可反应完全，转化率大于99％以上，展现出良好的工业应用前景。
(四)附图说明
图1为HPLC法检测丙烯腈和丙烯酰胺浓度的标准曲线。
图2为P.fluorescens ZJUT001的菌落形态(A)和光学显微镜下照片(B)。
图3为P.fluorescens ZJUT001基因组琼脂糖凝胶电泳图，泳道M代表标准DNA分子，泳道1代表基因组DNA。
图4为P.fluorescensZJUT001的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道M代表标准DNA分子，泳道1代表PCR扩增产物。
图5为P.fluorescens ZJUT001系统发育树。
图6为腈水合酶PfNH基因片段琼脂糖凝胶电泳图，泳道M代表标准DNA分子，泳道1代表腈水合酶PfNH基因。
图7为腈水合酶PfNH及其突变体纯酶的SDS-PAGE电泳图；M：标准蛋白分子；泳道1：腈水合酶PfNH-WT纯化酶；泳道2：突变体PfNH-M1纯化酶。
图8为HPLC法检测苯甲腈和苯甲酰胺浓度的标准曲线。
图9为实施例5中腈水合酶PfNH突变体M1催化苯甲腈合成苯甲酰胺的转化液的高效液相色谱检测图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所用培养基组成：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH为7.0。
富集培养基：葡萄糖10g/L，MgSO4 0.2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，FeSO4·7H2O0.002g/L，CoCl2·6H2O 0.002g/L，CaCl2 0.015g/L，4-氰基吡啶(唯一氮源)2g/L，溶剂为蒸馏水。
分离平板培养基：葡萄糖10g/L，MgSO4 0.2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，FeSO4·7H2O 0.002g/L，CoCl2·6H2O 0.002g/L，CaCl2 0.015g/L，4-氰基吡啶(唯一氮源)2g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4 0.3g/L，KH2PO40.3g/L，MgSO4 0.2g/L，溶剂为蒸馏水。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，NaCl 1g/L，MgSO4 0.2g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.03g/L，CaCl20.05g/L，己内酰胺(诱导剂)1g/L，溶剂为蒸馏水。
无机盐培养基：葡萄糖10g/L，NH4NO3 1.3g/L，NaCl 1g/L，MgSO4 0.2g/L，K2HPO41g/L，KH2PO4 1g/L，CaCl2 0.05g/L，己内酰胺(诱导剂)1g/L，溶剂为蒸馏水。
实施例1：产腈水合酶微生物菌株筛选及种属鉴定
(1)富集培养
称取1g化工厂附近采集的土样均匀分散于10mL蒸馏水中，混匀后移取2mL土样悬液加入到100mL灭过菌的富集培养基中，置于28℃摇床中180rpm培养4～5天后；移取2mL菌液加入到100mL灭过菌的富集培养基中，于28℃摇床中培养4～5天后；再次富集培养直至培养液浑浊。
(2)种子培养
将经过3次富集的菌液进行稀释，涂布于分离平板，放于28℃培养箱培养直到长出单菌落，挑取生长形态不同的菌株于种子培养基，置于28℃摇床中180rpm培养1天。
(3)发酵培养
将种子液以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，置于28℃摇床中180rpm培养1天后，菌液12000rpm离心10min，收集菌体。
(4)菌株筛选
称取0.5g湿菌体于10mL pH7.0的磷酸钠缓冲液中混匀，添加丙烯腈使其终浓度达到1g/L，于28℃，800rpm条件下反应30min。反应完成后，反应液12000rpm离心2min后，取上清液过0.22μm微滤膜微过滤，透过液采用高效液相色谱(HPLC)检测产物丙烯酰胺的峰面积，根据丙烯酰胺浓度与峰面积的标准曲线(图1)计算转化液中丙烯酰胺含量。
通过多轮富集培养和分离筛选，获得50余种不同形态菌株。最终筛选获得一株在上述反应条件下生成115mg/L丙烯酰胺的菌株，记为菌株ZJUT001。
液相检测方法：C18反相色谱柱(4.6×250mm，Welchrom)。流动相组成为乙腈:水＝1:9(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为210nm，柱温为40℃，丙烯酰胺和丙烯腈保留时间分别为5.4min、10.5min。
(5)菌株的鉴定
将筛选得到的菌株ZJUT001进行菌株形态、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析。
菌株形态：在LB固体培养基上30℃培养24小时，菌落呈现白色圆形凸起，表面光滑湿润，边缘整齐(图2A)，且菌株的显微形态为杆状(图2B)。
生理生化鉴定：利用Biolog(GENIII)自动微生物鉴定系统对菌株ZJUT001进行生理生化鉴定，包括碳源利用情况检测以及化学敏感性评价。检测结果如表1和表2所示。
表1.菌株ZJUT001对71种碳源的利用能力
注:+,阳性；-,阴性
表2.菌株ZJUT001化学敏感性评价
注:+,阳性；-,阴性
16S rDNA序列的测定及系统发育树分析：
采用细菌基因组提取试剂盒(擎科生物)提取菌株ZJUT001的基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测，提取的基因组DNA为单一条带，其大小大于12000bp(如图3所示)。
表3.16S rDNA通用引物
引物名称 引物序列(5'→3')
27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT
以基因组DNA为模板，27F/1492R为引物(表3)扩增菌株ZJUT001的16S rDNA序列。PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(均为10mM)，1μL模板，1μL DNA聚合酶和20μL超纯水。
PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min)，72℃终延伸10min。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得了一条大小约为1500bp的片段(图4)，经测序确认菌株ZJUT001的16S rDNA序列全长为1434bp(SEQ ID NO.8)。
SEQ ID NO.8
gtggcgcgactaccatgcaagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagttacctaatacgtgattgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttagttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcaaaactgactgactagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggagccttgagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttctagagatagattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcggggggacggtaccacggtgatcagta。
将所得的序列与GenBank中的序列进行BLAST分析比对，搜索与菌株ZJUT001序列相近的菌株序列用于系统发育学分析。采用MEGA7构建系统发育树(图5)。经同源性分析，菌株ZJUT001与Pseudomonas fluorescens的同源性最高，结合生理生化特征和形态学特征，该菌株ZJUT001被鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ZJUT001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年12月5日，保藏编号为CCTCC No:M 20221873。
(6)P.fluorescensZJUT001腈水合酶的金属离子类型
为了确定P.fluorescensZJUT001腈水合酶的金属离子类型，设置对照组和三个实验组(实验组1，实验组2，实验组3)，对照组选用无任何铁离子或钴离子的无机盐培养基，三个实验组分别在无机盐培养基中加添加0.002g/L FeSO4·7H2O(实验组1)；0.002g/LCoCl2·6H2O(实验组2)；0.002g/L FeSO4·7H2O和0.002g/L CoCl2·6H2O(实验组3)。培养基配制采用去离子水以排除离子干扰。将P.fluorescensZJUT001接种至各组培养基中，在30℃培养24h后，采用步骤(4)所述HPLC方法检测丙烯酰胺含量。结果显示对照组和仅添加钴离子的实验组2几乎检测不到腈水合酶活性，而仅添加铁离子实验组1与同时添加铁和钴离子的实验组3均表现出明显腈水合酶活性，其中实验组2的发酵液酶活达到27U/mL，表明P.fluorescensZJUT001腈水合酶属于铁离子依赖型。测序结果显示，PfNH的α亚基包含铁型腈水合酶高度保守的氨基酸序列“-VCSLCSCT-”，进一步证明P.fluorescensZJUT001腈水合酶是铁离子依赖型腈水合酶。
实施例2：P.fluorescensZJUT001腈水合酶PfNH基因克隆与重组质粒构建
(1)腈水合酶PfNH和其调控蛋白基因的克隆
采用细菌基因组提取试剂盒(擎科生物)提取P.fluorescensZJUT001的基因组，依据NCBI中报道的荧光假单胞菌P.fluorescensL111(GenBank登录号：CP015638.1)中的同源腈水合酶序列，结合P.fluorescensL111基因组的分析设计PCR引物NH-F和NH-R，如表4所示。
表4.腈水合酶及其调控蛋白基因克隆引物设计
引物名称 引物序列(5'→3')
NH-F ATGAGTACATCGATTTCCACGAC
NH-R TCAAGTCGGTTGAACCGCCAT
以P.fluorescensZJUT001基因组DNA为模板，NH-F和NH-R为引物，PCR克隆腈水合酶PfNH编码基因，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(均为10mM)，1μL模板，1μL DNA聚合酶和20μL超纯水。
PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min)，72℃终延伸10min。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带，大小为2500bp左右(图6)。得到包含调控蛋白基因的腈水合酶PfNH基因片段，基因全长2564bp，该基因片段由α亚基编码基因(SEQ ID NO.1)和β亚基编码基因(SEQ ID NO.2)和调控蛋白编码基因(SEQ IDNO.3)依次连接而组成；其中，所述腈水合酶PfNH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。调控蛋白编码基因来源于荧光假单胞菌(P.fluorescens)基因组的腈水合酶基因簇，能够表达调控蛋白(SEQ ID NO.7)，并在腈水合酶的表达和组装过程中发挥重要作用，能够确保腈水合酶的正确表达，从而获得有活性的腈水合酶。用DNA纯化回收试剂盒(杭州Axygen生物技术有限公司)对目的片段进行纯化回收。
SEQ ID NO.4
atgagtacatcgatttccacgaccgcgacaccttcgacacccggcgagagggcatgggccttgtttcaagtgctcaagagcaaggaactcattccagagggctatgtcgagcagctcactcaattgatggcccatgactggagcccggagaacggcgctcgcgtggtcgccaaggcatgggtcgatccgcagttccgggcgctgctgctcaaggacggaacagccgcttgcgcgcagttcggctacaccggcccacaaggcgaatacatcgtcgccctggaagatacaccgggggtgaagaacgtcattgtctgcagcctgtgctcctgcaccaactggccggtcctcggcctgccgcccgagtggtacaagggctttgagtttcgtgcgcgcctggtccgggaggggcgcaccgtactgcgcgagctggggacggagttgccgagcgacacggtcatcaaagtctgggataccagcgccgaaagccgttacctggtgttgccgcaaaggcctgaaggctctgagcacatgagtgaagaacagcttcaacagctggtgaccaaagacgtgctgattggcgtcgccctgccacgcgttggctgagaaaaaacaactcatcatcgttcaacttgcggagttttcattatggatggctttcacgatctcggcggtttccaaggctttggcaaagtaccgcacaccatcaacagcctcagctacaaacaggttttcaagcaggactgggaacacctggcctatagcttgatgtttgtcggcgttgaccagttgaaaaagttcagcgtggacgaagtgcgtcacgccgtcgaacgcctggacgttcgccagcatgtcggcacccagtactacgaacgctacatcatcgcgaccgccacgctgctggtggaaacgggcgttatcacccaggcggagctcgatcaggcattgggttcccacttcaagctggcgaaccccgcccatgcgacaggtcgcccggcgatcaccggcaggccgcccttcgaagtgggcgatcgggttgtggttcgagacgaatatgtggcggggcatatccgcatgccggcctacgtgcgcggtaaggaaggcgtggtcctgcaccgcacctcagagcagtggcccttccccgacgccattggccacggcgacttgagcgcagcccatcagcctacctaccacgtcgagtttcgcgtgaaagatctatggggtgacgcggcagatgacggttacgtcgtggtcgatcttttcgaaagctacttggataaggcccccggtgcccaagcggtgaacgcatgattgaaggcgcccaggcgggccgactgccggtgacggtcctttccggcttcctcggcgccggcaaaaccaccctgctcaacgctatcctgcgcaatcgccaaggactgcgggtcgcggtcatcgtcaacgacatgagcgaagtcaacctcgatgccgaatcggtgcagcgcgacgtctcgctgcaccgtggccgcgatgagttgatcgagatgagcaatggctgcatttgctgcaccctgcgcgccgacctgctggaacagatcagtgacctggcacgtcagcagcgcttcgattacctgcttatcgaatccacggggatctccgaaccgatgccggtcgcggagaccttcgccttcctcgacaccgaaggcttcagcctcagcgagctggcacgccttgatacactggtgacggtggtcgatggcagccaatttcaggcgctgctggaatcgacggataccgttgcccgcgccgacaccgaggcgcacacgtccacgcgtcacctggcggatcttctgatcgaacaggtggagtacgccaacgtcattctggtcaacaagcgggacctgatcgacgagcccggctaccaggcagtgcatgcgatcctcgctggcctcaacccgagcgcgcggatcatgccgatggctcacgggaacgtcgcgctgtccagcctcctcgacacccatctgtttgatttacccagcctcgcagcctcgccgggctggatgcgtaaaatggaagctaccgatacgccggcctcggagtcggatacctatggcgtgacatcctgggtctaccgggagcgcgcgccttttcacccccagcgcttgctcgagtttctacagaagccctggcacaacggtcgcttgttacgcagcaaaggttacttctggctcgccagccgccacctggaaatcggcctgctggcgcaaagcggcaagcagttccagtgggattatgtcgggcgctggtggaacttcatcgagccatcgcaatggccgcgggacgaatatcggttgcagggcatcatggccaagtgggacagcgttgtcggcgactgccgacaggagctggtcttcatcggccaggggctcgacacccgcgtcttgcagcgcgaactcgaccattgtttgctgagtgcccaggaaatagccgccggcccactggcctggcaggccctgccggcggcgacggcctttggcaccgaggccttatcggcacgccccacgccccccatggcggttcaaccgacttga。
SEQ ID NO.9
MSTSISTTATPSTPGERAWALFQVLKSKELIPEGYVEQLTQLMAHDWSPENGARVVAKAWVDPQFRALLLKDGTAACAQFGYTGPQGEYIVALEDTPGVKNVIVCSLCSCTNWPVLGLPPEWYKGFEFRARLVREGRTVLRELGTELPSDTVIKVWDTSAESRYLVLPQRPEGSEHMSEEQLQQLVTKDVLIGVALPRVGMDGFHDLGGFQGFGKVPHTINSLSYKQVFKQDWEHLAYSLMFVGVDQLKKFSVDEVRHAVERLDVRQHVGTQYYERYIIATATLLVETGVITQAELDQALGSHFKLANPAHATGRPAITGRPPFEVGDRVVVRDEYVAGHIRMPAYVRGKEGVVLHRTSEQWPFPDAIGHGDLSAAHQPTYHVEFRVKDLWGDAADDGYVVVDLFESYLDKAPGAQAVNA。
(2)重组载体pET-28b(+)-pfnh和重组工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-pfnh的构建
将载体和目的基因通过同源重组连接构建重组质粒。首先对腈水合酶PfNH的基因序列进行分析，选择表达载体pET-28b(+)合适的克隆位点(Nco I和Xho I)，设计引物如表5，以pET-28b(+)为模板扩增带有同源臂的线性化载体片段，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(均为10mM)，1μL模板，1μL DNA聚合酶和20μL超纯水。
PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min)，72℃终延伸10min。
表5.线性化载体引物设计
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，用DNA纯化回收试剂盒(杭州Axygen生物技术有限公司)对线性化载体片段进行纯化回收。
使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115(南京诺唯赞生物技术有限公司)将线性化载体片段和目的基因片段通过重组反应进行连接，按照表6的反应体系，将线性化载体片段和目的基因片段浓度稀释到50ng/μL，冰上配制，混匀，转移至50℃水浴锅进行重组反应，保温5min后置于冰上冷却，将重组产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞。
表6.一步克隆反应体系
经菌落PCR验证后，挑取阳性转化子，送杭州擎科生物技术有限公司测序，验证无误后的基因工程菌即为E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-pfnh，记为母本PfNH-WT，并保藏在-80℃冰箱。
实施例3：腈水合酶PfNH突变体文库的的构建
腈水合酶PfNH突变体文库的制备通过一轮定点饱和突变来实现，以实施例2构建的重组质粒pET-28b(+)-pfnh为模板，采用表7中设计的上下游引物，经饱和突变PCR，将SEQID NO.9所示腈水合酶PfNH氨基酸序列的第86位谷氨酰胺突变为其余19种氨基酸，筛选优势菌株。
PCR反应体系和反应条件如下：
PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(均为10mM)，1μL模板，1μL DNA聚合酶和20μL超纯水。
PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸5min)，72℃终延伸10min。
将Dpn I酶消化后的PCR产物转化进E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃、180rpm条件下培养10h。挑选单克隆，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下培养12h后，获得一系列的腈水合酶突变菌株。
表7.腈水合酶定点饱和突变引物设计
实施例4：腈水合酶的诱导表达
将实施例2构建的母本PfNH-WT及实施例3构建的突变菌株分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下培养10h，以1.0％(v/v)接种量接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm条件下培养2h至OD600值0.6～0.8，培养液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及FeSO4至终浓度分别为0.2mM和0.5mM，18℃、180rpm条件下诱导培养14h，收集发酵液，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体。以上获得的细胞可用于纯化酶的制备。
实施例5：突变文库筛选
将实施例4诱导表达的突变株湿菌体加入pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液中重悬，获得突变株菌悬液。同样条件下，用对照菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28b(+)-pfnh湿菌体制备对照株菌悬液。
分别将突变株菌悬液和对照株菌悬液作为催化剂，以底物苯甲腈和磷酸盐缓冲液配制0.5mL反应体系，反应体系湿菌体投入量以总干菌体量计为0.2gDCW/L，底物终浓度10g/L。在800rpm、30℃反应2min，然后加入0.5mL纯乙腈终止反应。离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤，滤液采用HPLC检测分析产物苯甲酰胺含量，根据苯甲酰胺分析标准曲线(图8)，计算产物苯甲酰胺的浓度。根据实施例7中酶活的定义，计算PfNH-WT及突变体的单位菌体酶活，并将野生型PfNH-WT单位菌体酶活定义为100％，计算突变体的相对酶活，实验结果示于表8。结果表明，突变体PfNH-Q86W(PfNH-M1)活性最高。
单位菌体酶活：每克干菌体所具有的活力单位，记作U/g。
液相检测方法：C18反相色谱柱(4.6×250mm，Welchrom)。流动相组成为乙腈:水＝1:1(v/v)，流速为1mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，苯甲酰胺和苯甲腈保留时间分别为3.0min、6.7min。突变体PfNH-Q86W转化苯甲腈合成苯甲酰胺的反应液高效液相色谱检测图谱示于图9。
表8.PfNH-WT及其突变体的催化性能
实施例6：腈水合酶PfNH及其突变体的蛋白纯化
将按照实施例4方法制备的含腈水合酶PfNH-WT的湿菌体，含腈水合酶突变体PfNH-M1的湿菌体，分别以100g/L的量重悬于pH 7.0、50mM的磷酸钠缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率为200W，破碎1s、暂停3s，取破碎混合液8000rpm、4℃下离心10min，收集上清液，通过0.22μm微滤膜过滤后，滤液采用镍亲和柱纯化蛋白，纯化操作如下：①用含300mM NaCl的pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液平衡镍亲和柱直至基线稳定；②以1.0mL/min的流速上样，之后用含300mMNaCl、20mM咪唑的pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至基线稳定；③然后用含300mM NaCl、500mM咪唑的pH 7.0、50mM以1.0mL/min磷酸钠缓冲液洗脱目的蛋白；当紫外吸收检测值相对于基线向上扬起时收集流出液，当紫外吸收检测值回到基线时停止收集，将收集的目的蛋白置于冰上保存，用50mM、pH 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析(透析袋的截留分子量为10kDal)12h，取截留液，即为纯化酶，分别获得母本腈水合酶PfNH-WT纯化酶、突变体PfNH-M1纯化酶。
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质亚基分子量。母本腈水合酶PfNH-WT纯酶采用上述纯化条件制备，电泳结果示于图7。突变体的表达量较母本腈水合酶PfNH-WT表达量没有显著变化，因此，突变体的酶活提高不是由于酶的表达量增加引起的，而是与酶自身催化活性增强有关。
实施例7：腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对苯甲腈的比酶活测定
腈水合酶的酶活义为：30℃，pH 7.0下，每分钟催化腈类底物生成1μmol对应酰胺所需要的酶量。
腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。
酶活检测标准条件：用50mM、pH 7.0的磷酸钠缓冲液将实施例6方法制备的纯化酶的蛋白浓度稀释至0.05mg/mL，移取250μL稀释过的纯化酶液至2mL EP管中，置于30℃金属浴。向EP管中加入250μL苯甲腈(20g/L)，800rpm、30℃反应2min，然后加入500μL纯乙腈终止反应，离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤。滤液采用实施例5所述HPLC检测苯甲酰胺含量。计算腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对苯甲腈的比酶活分别为22.28±0.95U/mg和230.54±3.05U/mg。
实施例8：腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对4-氰基吡啶的比酶活测定
用50mM、pH 7.0的磷酸钠缓冲液分别将实施例6方法制备的纯化酶的蛋白浓度稀释至0.05mg/mL，移取250μL稀释过的纯化酶液至2mL EP管中，置于30℃金属浴上。向EP管中加入250μL4-氰基吡啶(20g/L)，800rpm、30℃反应2min，然后加入500μL纯乙腈终止反应，反应液离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤。滤液采用HPLC检测4-吡啶甲酰胺的峰面积，根据4-吡啶甲酰胺的峰面积与浓度(mg/L)的标准曲线方程y＝0.213x-0.02，R2＝0.999，获得4-吡啶甲酰胺含量。根据实施例7酶活定义，计算腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对4-氰基吡啶比酶活分别为78.28±1.75U/mg和278.40±15.78U/mg。
液相检测方法：C18反相色谱柱(4.6×250mm，Welchrom)。流动相组成为乙腈:水＝1:9(v/v)，流速为1mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，4-吡啶甲酰胺和4-氰基吡啶保留时间分别为3.7min、10.6min。
实施例9：腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对2,6-二氟苯甲腈的比酶活测定
用50mM、pH 7.0的磷酸钠缓冲液分别将实施例6方法制备的纯化酶的蛋白浓度稀释至0.05mg/mL，移取250μL稀释过的纯化酶液至2mLEP管中，置于30℃金属浴上。向EP管中加入250μL2,6-二氟苯甲腈(20g/L)，800rpm、30℃反应2min，然后加入500μL纯乙腈终止反应，反应液离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤。滤液采用HPLC检测2,6-二氟苯甲酰胺的峰面积，根据2,6-二氟苯甲酰胺的峰面积与浓度(mg/L)的标准曲线方程y＝0.126x-0.2，R2＝0.999，获得2,6-二氟苯甲酰胺含量。根据实施例7酶活定义，计算腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对2,6-二氟苯甲腈的比酶活分别为12.13±0.44U/mg和39.94±0.93U/mg。
液相检测方法：C18反相色谱柱(4.6×250mm，Welchrom)。流动相组成为乙腈:水＝1:1(v/v)，流速为1mL/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，2,6-二氟苯甲酰胺和2,6-二氟苯甲腈保留时间分别为2.4min、7.1min。
实施例10：腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对异丁腈的比酶活测定
用50mM、pH 7.0的磷酸钠缓冲液分别将实施例6方法制备的纯化酶的蛋白浓度稀释至0.05mg/mL，移取250μL稀释过的纯化酶液至2mL EP管中，置于30℃金属浴上。向EP管中加入250μL异丁腈(20g/L)，800rpm、30℃反应2min，然后加入500μL纯乙腈终止反应，反应液离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤。滤液采用气相色谱检测异丁酰胺的峰面积，根据异丁酰胺的峰面积与浓度(g/L)的标准曲线方程y＝343.5x+75，R2＝0.994，获得异丁酰胺含量。根据实施例7酶活定义，计算腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对异丁腈的比酶活分别为157.22±15.57U/mg和59.04±3.26U/mg。
气相色谱方法：BGB-174毛细管手性色谱柱(30×0.25mm ID,0.25μm film,ea)，注射器和检测器温度设定为260℃，升温程序：40℃ 5min；30℃/min；160℃ 10min。异丁腈和异丁酰胺保留时间分别为5.4min、10.5min。
实施例11：腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对正戊腈的比酶活测定
用50mM、pH 7.0的磷酸钠缓冲液分别将实施例6方法制备的纯化酶的蛋白浓度稀释至0.05mg/mL，移取250μL稀释过的纯化酶液至2mL EP管中，置于30℃金属浴上。向EP管中加入250μL4-氰基吡啶(20g/L)，800rpm、30℃反应2min，然后加入500μL纯乙腈终止反应，反应液离心去除菌体，上清液采用0.22μm微滤膜过滤。滤液采用气相色谱检测正戊酰胺的峰面积，根据正戊酰胺的峰面积与浓度(g/L)的标准曲线方程y＝293x-44.5，R2＝0.993，得正戊酰胺含量。根据实施例7酶活定义，计算腈水合酶PfNH-WT及突变体PfNH-Q86W对正戊腈的比酶活分别为34.85±0.16U/mg和27.84±1.38U/mg。
气相色谱方法：BGB-174毛细管手性色谱柱(30×0.25mm ID,0.25μm film,ea)，注射器和检测器温度设定为260℃，升温程序：100℃ 5min；20℃/min；260℃ 10min。正戊腈和正戊酰胺保留时间分别为4.7min、9.2min。
实施例12：腈水合酶PfNH及其突变体热稳定性的测定
1、半衰期
半衰期(t1/2)是指在特定温度下酶活降低50％时所需的时间，是表征酶热稳定性的重要参数。实施例6方法制备的腈水合酶PfNH及其突变体的纯化酶用pH 7.0、50mM磷酸钠缓冲液稀释至蛋白浓度1.0mg/mL，分别置于30℃下保温，每隔一定时间，取出25.0μL保温后的酶液，按实施例7酶活检测标准条件下测定残余酶活，半衰期根据热失活方程(At＝A0e-kd t)计算，在热失活方程中，kd为失活动力学常数，A0和At分别代表初始酶活和t时刻的酶活。以ln(At/A0)为纵坐标，孵育时间t为横坐标绘图，实验数据拟合出kd，使用公式ln2/kd计算获得半衰期t1/2。结果如表9所示，与野生型相比，突变体PfNH-Q86W的半衰期略有下降。
表9.腈水合酶PfNH及其突变体在30℃半衰期
2、Tm
Tm表示蛋白质的熔解温度，指在蛋白质解折叠50％时对应的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。利用Chirascan圆二色(CD)光谱仪对腈水合酶及其突变体的熔解温度进行分析。首先，用pH7.0、50mM磷酸缓冲液将实施例6方法制备的腈水合酶PfNH及其突变体的纯化酶稀释至蛋白浓度为0.1mg/mL，然后取200μL上样到10mm石英比色皿中利用CD圆二色谱仪对腈水合酶PfNH及其突变体的Tm进行测定。在180-260nm波长下，20-65℃的温度下连续收集腈水合酶PfNH及其突变体的熔解曲线，圆二色谱分析仪自带软件Global 3可进行计算Tm，结果如表10所示，突变体PfNH-Q86W的Tm值略有下降，但下降幅度不显著。结合表9的半衰期测定结果，表明突变位点Q86W对腈水合酶PfNH热稳定性影响不大。
表10.腈水合酶PfNH及其突变体的熔融温度
实施例13：腈水合酶突变体PfNH-Q86W催化苯甲腈生成苯甲酰胺
在10mL反应体系中，先将实施例4方法制备的腈水合酶突变体PfNH-Q86W湿菌体用pH 7.0、50mM的磷酸钠缓冲液重悬，湿菌体加入总干重量为6g DCW/L，底物苯甲腈的投料量为100g/L，以pH 7.0、50mM的磷酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、800rpm条件下反应。取样后采用实施例5所述HPLC方法检测苯甲腈和苯甲酰胺浓度，PfNH-Q86W能在10min完全转化苯甲腈生成产物苯甲酰胺。

Claims (10)

1.一种腈水合酶PfNH突变体，其特征在于，所述腈水合酶PfNH突变体是将SEQ ID NO.9所示腈水合酶PfNH氨基酸序列的第86位进行单突变获得的。
2.如权利要求1所述腈水合酶PfNH突变体，其特征在于，所述腈水合酶PfNH突变体是将SEQ ID NO.9所示氨基酸序列第86位谷氨酰胺突变为色氨酸。
3.一种权利要求1所述腈水合酶PfNH突变体的编码基因。
4.一种含权利要求3所述编码基因的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述腈水合酶PfNH突变体在催化芳香族腈类化合物合成酰胺类化合物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将含腈水合酶PfNH突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或是湿菌体经超声破碎提取的纯化酶为催化剂，以芳香族腈类化合物为底物，以pH 7.0、50mM的磷酸钠缓冲液为反应介质构成转化体系，在30℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得酰胺类化合物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物终浓度10～100g/L，催化剂用量以湿菌体总干重计为0.1～20g DCW/L或以纯化酶蛋白含量计为0.01～1mg/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芳香族腈类化合物包括苯甲腈、4-氰基吡啶、2,6-二氟苯甲腈。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含所述腈水合酶PfNH突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％接种量接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600值0.6～0.8，培养液中加入异丙基硫代半乳糖苷以及FeSO4至终浓度分别为0.2mM和0.5mM，18℃培养14h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含腈水合酶的湿菌体。
10.一种用于提取权利要求1所述腈水合酶PfNH基因的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)ZJUT001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年12月5日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221873，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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