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CN116621983A - 抗robo1人源化抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

抗robo1人源化抗体、其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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CN116621983A
CN116621983A CN202310641528.6A CN202310641528A CN116621983A CN 116621983 A CN116621983 A CN 116621983A CN 202310641528 A CN202310641528 A CN 202310641528A CN 116621983 A CN116621983 A CN 116621983A
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CN
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amino acid
antibody
humanized
robo
acid sequence
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Application number
CN202310641528.6A
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李华顺
韦治明
张骏
陶家豪
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Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd
Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Inte Pharmaceutical Research And Development Co ltd
Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗ROBO1人源化抗体、其抗原结合片段及其应用。本发明以CDR嫁接结合回复突变的方法对鼠源性抗人ROBO1抗体进行人源化改造，筛选获得4条人源化轻链可变区和4条人源化重链可变区。将4条重链可变区(VH1、VH2、VH3、VH4)和4条轻链可变区(VL1、VL2、VL3、VL4)分别进行两两配对进行亲和力测定和排序分析。采用表面等离子共振(SPR)方法测定人源化改造的ROBO1抗体对抗原蛋白的亲和力，根据亲和力排序试验结果，最终纯化出3种与亲本鼠源抗体具有相似亲和力的人源化抗体，分别是VL1‑VH2scFv、VL2‑VH2scFv和VL1‑VH4scFv。

Description

抗ROBO1人源化抗体、其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗ROBO1人源化抗体、其抗原结合片段及其应用。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的最重要疾病之一，肿瘤的发病率目前一直呈持续增长趋势，现已成为严重的社会负担。2020年，全球范围内，有将近1930万新发癌症病例和近100万癌症死亡病例。其中女性乳腺癌已经超过肺癌成为最常见的癌症，预估每年将有230万新发病例(11.7％)，其次是肺癌(11.4％)、结直肠癌(10％)、前列腺癌(7.3％)和胃癌(5.6％)；肺癌仍然是癌症死亡率最高的癌症病例。这已成为严重的社会负担，是全球亟待解决的重大公共卫生问题之一。
ROBO1是一个单次跨膜蛋白受体，其胞外的IgG domain可以和其配体Slit结合，从物种进化的角度看，ROBO1/2/3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列组成，ROBOs有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分4个更小的区域，分别命名为：CC0、CC1、CC2、CC3。ROBO4的结构与其他三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。ROBO1较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，在刺激信号的条件下，完成由胞外到胞内骨架的传递，胞内则主要由Slit/ROBO下游的信号进行转导。
目前已有研究表明，ROBO1在包括复发或转移性晚期乳腺癌在内的多种肿瘤组织中过表达，且ROBO1的表达与癌细胞的迁移和血管的发生发展密切相关。与大量文献报道相一致，我们前期的病例组织化学研究结果显示：ROBO1在乳腺癌(95例)的阳性率为77.9％，结肠癌(76例)为77.7％，胃癌(67例)为84.1％，肺癌(118例)为85.5％。ROBO1在80％以上的恶性肿瘤中高表达，在正常组织中低表达或不表达。因此，ROBO1可作为实体瘤的理想靶点。
单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)是来自单个B淋巴细胞或一个杂交瘤细胞克隆的只识别某一种特定抗原表位(抗原决定簇)的抗体。单克隆抗体具有高度的特异性和均一性，且能够大量制备，从而为抗体的研究和应用带来了突破，在疾病的预防、诊断及治疗方面显示出重要作用。然而目前制备的McAb多为鼠源性，具有免疫原性，被人免疫系统识别后可产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)，从而造成免疫损伤，且异源蛋白在人体内很快被清除，即半衰期短。其次鼠源性抗体虽然对靶抗原是特异的，但它不能有效激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)等。因此，如何通过基因工程技术来构建降低鼠源抗体的免疫原性的抗体，有效地减少HAMA反应的发生率是急需解决的问题。
人源化抗体是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起来的新型基因工程抗体。对鼠源性McAb的人源化研究主要经历了三个发展阶段：1.将鼠源性McAb的可变区(variable region,VR)和人抗体的恒定区(constant region,CR)组装合成抗体；2.仅保留鼠源性McAb VR中与抗原结合的互补决定区(complementarity determining region，CDR)制备CDR移植抗体或改型抗体；3.利用噬菌体抗体库合成全人源性抗体。通常情况下，人源化改造的抗体与亲本鼠源性抗体相比亲和力会有所下降，因此，需要经过专门的人源化改造设计以及大量的筛选过程，才能得到符合要求的人源化抗体。
综上所述，如何将高活性的鼠源单抗，在不丧失其抗体活性的前提下，并利用其CDR进一步得到人源化抗体是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于，结合CDR嫁接和回复突变的方法，将鼠源性抗人ROBO1抗体进行人源化改造，得到与亲本鼠源抗体亲和力相当的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，降低其在后续应用过程中的HAMA反应。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，所述轻链可变区包括互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，所述互补决定区的氨基酸序列为：
VH-CDR1：GYTFTDYYMN；
VH-CDR2：DIVPNNGDTTYNQNFRG；
VH-CDR3：FSNYVYPFDY；
VL-CDR1：RASQDISNFLN；
VL-CDR2：ATSRLHS；
VL-CDR3：QQGNTLPLT；
每条重链可变区和轻链可变区还包括选自下述氨基酸序列的至少一个框架FR，或与下述氨基酸序列的框架FR具有至少80％的序列同一性，并且，与所述互补决定区组合后与人ROBO1具有KD≤10-7mol/L的结合力的框架FR；
框架VH-FR1为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS；
框架VH-FR2为W-V-X1-Q-A-P-G-Q-X2-L-E-W-X3-G，其中，
X1是R或K，X2为G或S，X3为M或I；
框架VH-FR3为X4-X5-T-M-T-X6-D-X7-S-T-S-T-V-Y-M-E-L-S-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-R，其中，
X4是R或K，X5为V或A，X6为R或V，X7为T或K；
框架VH-FR4为WGQGTTVTVSS；
框架VL-FR1为I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-X8-C，其中，X8为T或S；
框架VL-FR2为W-Y-Q-Q-K-P-G-K-X9-X10-K-L-L-I-Y，其中，X9为A或T，X10为P或V；
框架VL-FR3为G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-S-L-T-I-S-K-L-E-Q-E-D-I-A-T-Y-X11-C，其中，X11为Y或F；
框架VL-FR4为FGQGTKLELK。
在可选的实施方式中，所述重链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS的VH-FR1、氨基酸序列为WVRQAPGQGLEWIG的VH-FR2、氨基酸序列为RVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS的VH-FR4；
或者氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS的VH-FR1、氨基酸序列为WVKQAPGQSLEWIG的VH-FR2、氨基酸序列为KATMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS的VH-FR4。
在可选的实施方式中，所述轻链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYYC的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK的VL-FR4；
或者氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTISC的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYFC的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK的VL-FR4。
在可选的实施方式中，抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括(a)～(c)中任一项：
(a)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(b)氨基酸如SEQ ID No:28所示的VL2和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(c)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:34所示的VH4。
在可选的实施方式中，所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段选自与人源ROBO1抗原特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、dsFv分子或完整抗体分子。
第一方面，本发明提供生物材料，包括(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：
(ⅰ)核酸分子，包括编码权利要求5所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；
(ⅱ)载体，所述载体携带所述(ⅰ)核酸分子；优选地，所述载体为将所述(ⅰ)核酸分子连接于质粒载体得到的重组载体；进一步优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.4；
(ⅲ)细胞，所述细胞携带所述(ⅰ)核酸分子，或含有所述(ⅱ)载体，或表达权利要求1～5任一项权利要求所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述细胞包括将(ⅲ)所述的载体转化进真核宿主细胞得到的转化体，所述真核宿主细胞优选包括Expi-CHO。
在可选的实施方式中，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体NK细胞。
第三方面，本发明提供所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段用于制备细胞药物、抗体药物或诊断试剂盒的用途。
第四方面，本发明提供上述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或上述生物材料在制备治疗癌症的药物中的应用；所述癌症包括存在ROBO1高表达的癌细胞的癌症；
优选地，所述癌症包括乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
第五方面，本发明提供用于体外检测人源ROBO1的制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒包括上述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或，上述的生物材料。
本发明的有益效果包括：
本发明以CDR嫁接结合回复突变的方法对鼠源性抗人ROBO1抗体进行人源化改造，筛选获得亲本抗体的4条人源化轻链可变区和4条人源化重链可变区。将4条重链可变区(VH1、VH2、VH3、VH4)和4条轻链可变区(VL1、VL2、VL3、VL4)分别进行两两配对进行亲和力测定和排序分析。采用表面等离子共振(SPR)方法对抗ROBO1人源化抗体进行对抗原蛋白的亲和力测定，根据亲和力排序分析结果，筛选出与亲本抗体具有相似亲和力的人源化抗体的可变区。体外ELISA验证抗ROBO1人源化抗体与抗原蛋白的特异性结合实验的结果显示本发明提供的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段对人ROBO1抗原蛋白存在特异性结合，结合能力与Original scFv较一致。并且使用人源化改造的ROBO1抗体制备的ROBO1 CAR-NK细胞表现出对肿瘤细胞良好的杀伤效果，同时人源化改造的设计也降低了其对机内的免疫原性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的非还原与还原纯化条件下鼠源性ROBO1抗体的SDS-PAGE蛋白电泳结果图；
图2a为本发明实施例2中Fc端为mouseIgG的鼠源性ROBO1抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图；
图2b为本发明实施例2中Fc端为hIgG1的鼠源性ROBO1抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图；
图3a为本发明实施例3提供的非还原与还原纯化条件下筛选出的人源化抗体的部分SDS-PAGE蛋白电泳图；
图3b为本发明实施例3提供的非还原与还原纯化条件下筛选出的人源化抗体的部分SDS-PAGE蛋白电泳图；
图4a为本发明实施例5提供的筛选出的VL1-VH2人源化抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图；
图4b为本发明实施例5提供的筛选出的VL2-VH2人源化抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图；
图4c为本发明实施例5提供的筛选出的VL1-VH4人源化抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图；
图5a为本发明实施例6提供的Fc端为hIgG1的鼠源性ROBO1抗体分别与不同种属中ROBO1抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图5b为本发明实施例6提供的筛选出的VL1-VH2人源化抗体分别与不同种属中ROBO1抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图5c为本发明实施例6提供的筛选出的VL2-VH2人源化抗体分别与不同种属中ROBO1抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图5d为本发明实施例6提供的筛选出的VL1-VH4人源化抗体分别与不同种属中ROBO1抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图6为本发明实施例6提供的筛选出的人源化抗体分别与人源ROBO1抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图7a为本发明实施例7提供的Fc端为hIgG1的鼠源性ROBO1抗体分别与人ROBO家族4个成员抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图7b为本发明实施例7提供的筛选出的VL1-VH2人源化抗体分别与人ROBO家族4个成员抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图7c为本发明实施例7提供的筛选出的VL2-VH2人源化抗体分别与人ROBO家族4个成员抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图7d为本发明实施例7提供的筛选出的VL1-VH4人源化抗体分别与人ROBO家族4个成员抗原蛋白的特异性结合的ELISA结果；
图8为本发明实施例7提供的用于构建CAR-NK细胞的嵌合抗原受体示意图；
图9a为本发明实施例10提供的对照组流式监测CAR细胞阳性率的结果图；
图9b为本发明实施例10提供的含有Fc端为hIgG1的鼠源性ROBO1抗体的NK92细胞株流式监测CAR细胞阳性率的结果图；
图9c为本发明实施例10提供的含有筛选出的VL1-VH2人源化抗体的NK92细胞株流式监测CAR细胞阳性率的结果图；
图9d为本发明实施例10提供的含有筛选出的VL2-VH2人源化抗体的NK92细胞株流式监测CAR细胞阳性率的结果图；
图9e为本发明实施例10提供的含有筛选出的VL1-VH4人源化抗体的NK92细胞株流式监测CAR细胞阳性率的结果图；
图10a为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对乳腺癌细胞MDA-MB231-ROBO1-Ox的2小时的杀伤率；
图10b为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对乳腺癌细胞T47D的2小时的杀伤率；
图10c为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对乳腺癌细胞MDA-MB453的2小时的杀伤率；
图10d为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对乳腺癌细胞HCC1187的2小时的杀伤率；
图11a为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对肺癌细胞H1299的2小时的杀伤率；
图11b为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对肺癌细胞A549的2小时的杀伤率；
图12a为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对肝癌细胞HepG2的2小时的杀伤率；
图12b为本发明实施例11提供的鼠源性和人源化ROBO1 CAR-NK细胞株对肝癌细胞Huh7的2小时的杀伤率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
定义：
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血NK细胞、脐带血NK细胞、NK92细胞或其他来源的NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞系，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的加强型CAR-NK细胞”，其具体制备过程参照申请号为“CN201811394153.3”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”的专利。
除非特别指明，本文中“Original scFv”是指“鼠源性抗人ROBO1的单链可变区片段scFv”，其具体来源请参照申请号为“CN201811394153.3”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”的专利。
除非特别指明，本文中的“MDA-MB231-ROBO1-Ox”指通过慢病毒转染方式获得人ROBO1基因过量表达的MDA-MB231肿瘤细胞。
在本文中“抗体或其抗原结合片段”是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。此外，“抗体或其抗原结合片段”也包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体。在本文中“抗原结合片段”是包含抗体CDR的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。本发明中抗原结合片段具有特异性识别并结合ROBO1的作用。
抗体或其抗原结合片段的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变区可以被称为“VH”。轻链可变区可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自由通过4个框架(framework region，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determiningregion，CDR)(也被称作高变区)组成。框架和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等)和Chothia中，本领域众所周知的任何CDR确定方法，包括方法的组合，可以鉴别可变结构域的CDR。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。抗体或其抗原结合片段对抗原表位的结合能力通常以抗原-抗体相互作用的平衡解离常数KD衡量，KD等于kd/ka且被表达为摩尔浓度(M)，KD越小结合亲和力越强。通常，抗体或其抗原结合片段以大约小于10-7M，例如大约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD值结合。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的KD值。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。
本文中术语“核酸分子”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸分子编码上述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，编码可选地为编码正义链或反义链。核酸分子可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。
术语“载体(vector)”是指，可将核酸分子插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的核酸分子编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。
所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，例如在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物。
根据本发明的第一方面，本发明提供抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，轻链可变区包括互补决定区VL-CDR2、VL-CDR2和VL-CDR3，互补决定区按照Kabat编码方式。所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区氨基酸序列为：
VH-CDR1：GYTFTDYYMN(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIVPNNGDTTYNQNFRG(SEQ ID NO:2)；
VH-CDR3：FSNYVYPFDY(SEQ ID NO:3)；
轻链互补决定区氨基酸序列为：
VL-CDR1：RASQDISNFLN(SEQ ID NO:4)；
VL-CDR2：ATSRLHS(SEQ ID NO:5)；
VL-CDR3：QQGNTLPLT(SEQ ID NO:6)；
所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区还包括选自下述氨基酸序列的至少一个框架FR，或与下述氨基酸序列的框架FR具有至少80％的序列同一性，并且，与上述互补决定区组合后与人ROBO1具有KD≤10-7mol/L的结合力的框架FR；
重链可变区包括选自下述氨基酸序列的至少一个框架FR：
框架VH-FR1为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:7)；
框架VH-FR2为W-V-X1-Q-A-P-G-Q-X2-L-E-W-X3-G(SEQ ID NO:8)，其中，
X1是R或K，X2为G或S，X3为M或I；
框架VH-FR3为X4-X5-T-M-T-X6-D-X7-S-T-S-T-V-Y-M-E-L-S-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-R(SEQ ID NO:9)，其中，
X4是R或K，X5为V或A，X6为R或V，X7为T或K；
框架VH-FR4为WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:10)；
轻链可变区包括选自下述氨基酸序列的至少一个框架FR：
框架VL-FR1为I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-X8-C(SEQ ID NO:11)，其中，X8为T或S；
框架VL-FR2为W-Y-Q-Q-K-P-G-K-X9-X10-K-L-L-I-Y(SEQ ID NO:12)，其中，X9为A或T，X10为P或V；
框架VL-FR3为G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-S-L-T-I-S-K-L-E-Q-E-D-I-A-T-Y-X11-C(SEQ ID NO:13)，其中，X11为Y或F；
框架VL-FR4为FGQGTKLELK(SEQ ID NO:14)。
在可选的实施方式中，所述重链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:7)的VH-FR1、氨基酸序列为WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:16)的VH-FR2、氨基酸序列为RVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:17)的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:10)的VH-FR4；
或者，氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:7)的VH-FR1、氨基酸序列为WVKQAPGQSLEWIG(SEQ ID NO:19)的VH-FR2、氨基酸序列为KATMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:20)的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:10)的VH-FR4。
在可选的实施方式中，所述轻链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:21)的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:22)的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYYC(SEQ ID NO:23)的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK(SEQ ID NO:14)的VL-FR4；
或者，氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTISC(SEQ ID NO:25)的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:22)的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYFC(SEQ ID NO:26)的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK(SEQ ID NO:14)的VL-FR4。
在可选的实施方式中，所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段包括(a)～(c)中任一项：
(a)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(b)氨基酸如SEQ ID No:28所示的VL2和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(c)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:34所示的VH4。
在可选的实施方式中，所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段选自与人源ROBO1抗原特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2、dsFv分子或完整抗体分子。
本发明以CDR嫁接结合回复突变的方法对鼠源性抗人ROBO1抗体进行人源化改造，筛选获得亲本抗体的4条人源化轻链和4条人源化重链。将4条重链可变区(VH1、VH2、VH3、VH4，SEQ ID NO:31～34)和4条轻链可变区(VL1、VL2、VL3、VL4,SEQ ID NO:27～30)分别进行两两配对进行亲和力测定和排序分析。采用表面等离子共振(SPR)方法对抗ROBO1人源化抗体进行对抗原蛋白的亲和力测定，根据亲和力排序分析结果，在可选的实施方式中，最终纯化出3种与亲本抗体具有相似亲和力的人源化抗体，分别是VL1-VH2 scFv、VL2-VH2 scFv和VL1-VH4 scFv。
经体外ELISA验证抗ROBO1人源化抗体与抗原蛋白的特异性结合实验中，结果显示：1)对人ROBO1抗原蛋白的结合力由大到小排序为：Original-Fc(hIgG1)>VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)>VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)>VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)；2)对人ROBO家族4个成员抗原蛋白的亲和力：Original-Fc(hIgG1)和VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)仅对人ROBO1抗原蛋白存在特异性结合，对ROBO2/3/4抗原蛋白不存在非特异性结合。3)对不同种属(Human、Mouse、Dog、Rat、Rabbit、Monkey)的ROBO1抗原的结合力：上述4个抗体对Rat ROBO1抗原蛋白均有较强的非特异性结合，对Monkey ROBO1抗原蛋白也存在不同程度的非特异性结合。Original-Fc(hIgG1)和VL1-VH2scFv-Fc(hIgG1)抗体对Mouse、Dog以及Rabbit ROBO1抗原蛋白几乎不存在非特异性结合，而VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)和VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)抗体对Mouse、Dog以及Rabbit ROBO1抗原蛋白存在一定的非特异性结合。
综上所述，在一些可选的实施方式中筛选出的3种人源化抗体VL1-VH2 scFv、VL2-VH2 scFv和VL1-VH4 scFv，其中VL1-VH2 scFv尽管在与目标抗原蛋白的亲和力上有所下降，但在与不同种属动物中ROBO1抗原蛋白以及与人ROBO家族其他成员之间的非特异性结合的表现来看，VL1-VH2scFv与Original scFv相一致。
根据本发明的第二方面，本发明提供生物材料，包括(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：
(ⅰ)核酸分子，包括编码前述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；
(ⅱ)载体，所述载体携带前述(ⅰ)核酸分子；优选地，所述载体为将所述(ⅰ)核酸分子连接于质粒载体得到的重组载体；进一步优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.4；
(ⅲ)细胞，所述细胞携带所述(ⅰ)核酸分子，或含有所述(ⅱ)载体，或表达前述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段。
在可选的实施方式中，所述细胞包括将(ⅲ)所述的载体转化进真核宿主细胞得到的转化体，所述真核宿主细胞优选包括Expi-CHO。
在可选的实施方式中，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体NK细胞。
根据本发明的第三方面，本发明提供前述实施方式所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段用于制备细胞药物、抗体药物或诊断试剂盒的用途。
根据本发明的第四方面，本发明提供前述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或前述生物材料在制备治疗癌症的药物中的应用；所述癌症包括存在ROBO1高表达的癌细胞的癌症；
优选地，所述癌症包括乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
在可选的实施方式中，将前述生物材料中的括嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体NK细胞应用于制备治疗癌症的细胞药物。
根据本发明的第五方面，本发明提用于体外检测人源ROBO1的制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒包括前述实施方式所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或，前述实施方式所述的生物材料。
在某次具体实施方式中，提供以下人源化的整体技术方案：
1.鼠源性抗人ROBO1抗体的人源化改造
1)抗体的构建与制备
合成抗体重链和轻链的DNA序列，插入pcDNA3.4载体，构建scFv形式的表达质粒。在Expi293F细胞培养中表达抗体，用蛋白A亲和柱纯化上清。用PD-10脱盐柱将纯化的抗体缓冲交换到PBS中。以OD280和SDS-PAGE测定纯化蛋白的浓度和纯度。
2)鼠源性抗人ROBO1抗体与抗原结合证明
采用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K测定抗体对抗原蛋白的亲和力。采用Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上。用抗原蛋白作为分析物对象。采用Biacore T200/8K评价软件计算解离(kd)和缔合(ka)速率常数。平衡解离常数(KD)由kd/ka计算。
3)采用CDR嫁接结合回复突变的方法将鼠源性抗人ROBO1抗体人源化
亲本抗体的结构采用计算机辅助同源建模程序进行建模。采用CDR嫁接结合回复突变方式设计人源化抗体。简单地说，将亲本抗体的CDR区嫁接到人源抗体框架FR区，并将人源抗体框架FR区的某些重要残基回复突变成鼠源残基，用来恢复抗体的活性，筛选获得亲本抗体的4条人源化轻链和4条人源化重链。将4条重链(VH1、VH2、VH3、VH4)和4条轻链(VL1、VL2、VL3、VL4)分别进行两两配对进行亲和力测定和排序分析。
4)抗ROBO1人源化抗体的制备及亲和力排序
将设计的人源化重链和人源化轻链进行DNA序列合成，两两进行配对，插入pcDNA3.4载体，构建scFv形式的表达质粒。在Expi293F细胞培养中表达抗体，用蛋白A亲和柱纯化上清。用PD-10脱盐柱将纯化的抗体缓冲交换到PBS中。以OD280和SDS-PAGE测定纯化蛋白的浓度和纯度。
采用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K测定抗体对抗原蛋白的亲和力。采用Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上。目标抗原蛋白(人ROBO1蛋白)作为分析物对象。
在注射另一种抗体之前，表面进行再生。重复过程，直到所有抗体被分析出来。利用Biacore T200/8K评价软件将实验数据局部拟合为1:1相互作用模型，得到抗体的脱分率。根据抗体的分离速率常数(off-rates,kd)对其进行排序，筛选出排名靠前的克隆进一步纯化。根据排序结果，筛选出排名前三的克隆，进一步纯化。
5)纯化后的人源化ROBO1 IgGs抗体的亲和力验证
将步骤4)筛选出的抗体，使用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K(GE Healthcare)单独测定纯化抗体与目标抗原结合的亲和力。采用Fc捕获法在传感器芯片上捕获抗体。人ROBO1蛋白抗原用作分析物。采用T200/8K评价软件计算解离(kd)和缔合(ka)速率常数。平衡解离常数(KD)由kd/ka计算。
2.体外ELISA验证抗ROBO1人源化抗体与抗原蛋白的特异性结合
1)以scFv-Fc(hIgG1)-Ori即鼠源性亲本scFv-Fc(hIgG1)抗体为对照，ELISA验证筛选出的人源化ROBO1 IgGs抗体，与不同种属(Human、Mouse、Dog、Rat、Rabbit、Monkey)中ROBO1抗原蛋白的特异性结合。
2)以scFv-Fc(hIgG1)-Ori即鼠源性亲本scFv-Fc(hIgG1)抗体为对照，ELISA验证筛选出的抗ROBO1人源化抗体)与人ROBO家族4个不同成员ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4抗原蛋白的特异性结合。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1鼠源性亲本抗体的制备
合成抗体重链和轻链的DNA序列Original-VL-VH-scFv-Fc(mouseIgG)(SEQ IDNO:35)和Original-VL-VH-scFv-Fc(hIgG1)(SEQ ID NO:36)，插入pcDNA3.4载体，构建scFv形式的表达质粒。在Expi293F细胞培养中表达抗体，Original-VL-VH-scFv-Fc(mouseIgG)氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，Original-VL-VH-scFv-Fc(hIgG1)氨基酸序列如SEQ IDNO:38所示，用蛋白A亲和柱纯化上清。用PD-10脱盐柱将纯化的抗体缓冲交换到PBS中。SDS-PAGE测定纯化蛋白的纯度如图1所示，可以看出制备的Original-VL-VH-scFv-Fc(mouseIgG)和Original-VL-VH-scFv-Fc(hIgG1)纯度都很高，能够满足后续实验的要求。
实施例2鼠源性亲本抗体与ROBO1抗原蛋白结合证明
采用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K测定抗体对抗原蛋白的亲和力。采用Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上。用抗原蛋白作为分析物对象。亲和实验具体设置参数如下表所示。采用Biacore T200/8K评价软件计算解离(kd)和缔合(ka)速率常数，平衡解离常数(KD)由kd/ka计算。
鼠源性抗体与ROBO1抗原蛋白的结合动力学结果如下表所示：
Ligand Analyte ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Rmax(RU) Chi2(RU2)
scFv-Fc(mIgG)-Ori his-ROBO1 1.02E+05 5.33E-03 5.24E-08 169.2 4.35
scFv-Fc(HuIgG1)-Ori his-ROBO1 5.48E+05 9.99E-03 1.82E-08 194.6 9.04
不同Fc端鼠源性ROBO1抗体对ROBO1抗原蛋白的传感图分别如图2a和图2b所示。
实施例3采用CDR嫁接结合回复突变的方法将鼠源性亲本抗体人源化改造
亲本抗体的结构采用计算机辅助同源建模程序进行建模。采用CDR嫁接结合回复突变方式设计人源化抗体。简单地说，将亲本抗体的CDR区嫁接到人源抗体框架FR区，并将人源抗体框架FR区的某些重要残疾回复突变成鼠源残疾，用来恢复抗体的活性，筛选获得亲本抗体的4条人源化轻链和4条人源化重链。将编码4条重链的核酸片段(VH1、VH2、VH3、VH4，核苷酸序列如SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:34所示)和编码4条轻链的核酸片段(VL1、VL2、VL3、VL4，核苷酸序列如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:30所示)分别进行两两配对进行人源化抗体载体构建，而后进行抗体纯化，方法如实施例1中所述。
实施例4抗ROBO1人源化抗体的亲和力排序
采用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K测定抗体对抗原蛋白的亲和力。采用Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上。目标抗原蛋白(人ROBO1蛋白)作为分析物对象。在注射另一种抗体之前，表面进行再生。重复过程，直到所有抗体被分析出来。利用Biacore T200/8K评价软件将实验数据局部拟合为1:1相互作用模型，得到抗体的脱分率。根据抗体的分离速率常数(off-rates,kd)对其进行排序。根据排序结果(如下表所示)，筛选出排名前三的克隆即VL1-VH2scFv-Fc(hIgG1)(核苷酸序列SEQ ID NO:39，氨基酸序列SEQ ID NO:40)、VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)(核苷酸序列SEQ ID NO:41，氨基酸序列SEQ IDNO:42)、VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)(核苷酸序列SEQ ID NO:43，氨基酸序列SEQ ID NO:44)进一步纯化，纯化结果如图3a和图3b所示。
Ligand Analyte ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Rmax(RU) Chi2(RU2)
VH+VL-Original his-ROBO1 1.18E+05 1.67E-03 1.42E-08 186.3 13.5
VL1-VH2 his-ROBO1 9.82E+04 1.98E-03 2.01E-08 71.8 6.1
VL2-VH2 his-ROBO1 1.06E+05 4.36E-03 4.09E-08 74.9 7.97
VL1-VH4 his-ROBO1 7.13E+04 1.87E-03 2.63E-08 98.9 14.1
实施例5纯化后的人源化ROBO1 hIgG1抗体(VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)、VL2-VH2scFv-Fc(hIgG1)、VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1))亲和力验证
使用表明等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200/8K(GE Healthcare)单独测定纯化抗体与目标抗原结合的亲和力。采用Fc补获法在传感器芯片上捕获抗体。人ROBO1蛋白抗原用作分析物。亲和实验具体设置参数如下表所示。采用T200/8K评价软件计算解离(kd)和缔合(ka)速率常数。平衡解离常数(KD)由kd/ka计算(如实施例4中表格所示)。抗原对抗体的传感图结果如图4a～4c所示。从图中可以看出，不同抗体对人ROBO1抗原蛋白的结合力由大到小排序为：Original-Fc(hIgG1)>VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)>VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)>VL1-VH4scFv-Fc(hIgG1)。可以看出，VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)、VH2 scFv-Fc(hIgG1)和VL1-VH4scFv-Fc(hIgG1)的KD值略大于Original-Fc(hIgG1)，但是均和Original-Fc(hIgG1)在同一数量级，均小于10-7M，说明人源化ROBO1 hIgG1抗体能够特异性结合ROBO1，且具有较好的结合能力。
实施例6ELISA验证不同ROBO1抗体与不同种属(Human、Mouse、Dog、Rat、Rabbit、Monkey)中ROBO1抗原蛋白的特异性结合。
将不同种属的ROBO1蛋白(Human、Mouse、Dog、Rat、Rabbit、Monkey)用抗原稀释液稀释后进行包被；第二天用5％BSA封闭液进行封闭；将VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)、VL2-VH2scFv-Fc(hIgG1)、VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)人源化抗体以1μg/ml为起始浓度进行梯度稀释加入至去除封闭液的酶标板中，37℃孵育一段时间后，用PBST洗涤液洗板；拍干后加入二抗进行孵育，之后用PBST洗涤液洗板；拍干后加入TMB显色液，室温反应20min后加入终止液，测定OD450并进行数据处理和结果分析，具体结果如图5a～5d及图6所示。从图中可以看出，上述4个抗体对Rat ROBO1抗原蛋白均有较强的非特异性结合，对Monkey ROBO1抗原蛋白也存在不同程度的非特异性结合。Original-Fc(hIgG1)和VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)抗体对Mouse、Dog以及Rabbit ROBO1抗原蛋白几乎不存在非特异性结合，而VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)和VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)抗体对Mouse、Dog以及Rabbit ROBO1抗原蛋白存在一定的非特异性结合。对于制备表达嵌合抗原受体免疫细胞的实施领域来说，可以理解的是，嵌合抗原受体免疫细胞的受试者机体中的ROBO1种属来源单一，因此非特异性结合不影响其在制备表达嵌合抗原受体免疫细胞中的应用。
实施例7ELISA验证不同抗ROBO1人源化抗体与人ROBO家族4个不同成员ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4抗原蛋白的特异性结合。
将人的ROBO家族成员蛋白(ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4，其中ROBO1、ROBO2、ROBO4购自Abcam，ROBO3购自武汉艾美捷科技有限公司)用抗原稀释液稀释后进行包被；第二天用5％BSA封闭液进行封闭；将VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)、VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)、VL1-VH4scFv-Fc(hIgG1)人源化抗体以1μg/ml为起始浓度进行梯度稀释加入至去除封闭液的酶标板中，37℃孵育一段时间后，用PBST洗涤液洗板；拍干后加入二抗进行孵育，之后用PBST洗涤液洗板；拍干后加入TMB显色液，室温反应20min后加入终止液，测定OD450并进行数据处理和结果分析，具体结果如图7a～7d所示。从图中可以看出，对人ROBO家族4个成员抗原蛋白的特异性结合其情况：Original-Fc(hIgG1)和VL1-VH2 scFv-Fc(hIgG1)仅对人ROBO1抗原蛋白存在特异性结合，对ROBO2/3/4抗原蛋白不存在非特异性结合。而VL2-VH2 scFv-Fc(hIgG1)和VL1-VH4 scFv-Fc(hIgG1)抗体不仅对人ROBO1抗原蛋白存在特异性结合，对人ROBO3抗原蛋白存在非特异性的结合，然而其对ROBO3的结合是在抗体达到较高的浓度下发生的，在体内条件下，ROBO1 CAR-NK表面ROBO1 CAR的表达量不会达到与ROBO3大量结合的水平。
实施例8慢病毒载体制备
构建嵌合抗原受体CAR-NK工程改造细胞，CAR结构设计如图8所示。分别合成scFv(Original VL-VH scFv、VL1-VH2 scFv、VL2-VH2 scFv、VL1-VH4 scFv)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(分别为SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:18)，通过酶切酶连方式将合成序列转化连接到PRRSLIN载体中，基因上游为EF-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PRRLSIN-scFv(anti-ROBO1)慢病毒转染质粒载体。
实施例9慢病毒制备
转染前12小时，以每皿约8×106将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
准备溶液A和溶液B。溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液。溶液B：分别加入以下质粒的混合物：112.5μg PRRLSIN-ScFv(anti ROBO1)(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液B总体积：6.25ml。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置5～15分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16～18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28 centrifugetubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)。以PBS平衡离心管，2500rpm，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl PBS，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例10人源化ROBO1 CAR-NK细胞制备
将NK-92细胞密度调整至2～3×105/ml，按体积比(V/V)病毒载体：细胞培养基＝1:5比例添加病毒载体，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1～2天进行补液，使维持细胞密度在2～3×105/ml。72h后进行标记CAR的抗体染色，同时流式分选Humanized ROBO1 CAR NK92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的pH值、细胞密度、细胞活率并作相应记录。利用流式检测CAR NK92细胞阳性率(如图9a～9e)。
以此同样的方法制备VL1-VH2 scFv、VL2-VH2 scFv、VL1-VH4 scFv以及鼠源性Original VL-VH scFv CAR-NK92细胞。(VL1-VH2 scFv CAR-NK92中CAR的氨基酸序列SEQID NO:48、VL2-VH2scFv CAR-NK92中CAR的氨基酸序列SEQ ID NO:15、VL1-VH4 scFv CAR-NK92中CAR的氨基酸序列SEQ ID NO:24、Original VL-VH scFv CAR-NK92中CAR的氨基酸序列SEQ ID NO:46)。
实施例11人源化ROBO1 CAR-NK细胞制备
将制备的不同scFv ROBO1 CAR-NK92细胞(阳性率95％以上)稳定培养后，将其用于对乳腺癌(MDA-MB231-ROBO1-Ox、T47D、MDA-MB453、HCC1187)，肺癌细胞(A549、H1299)和肝癌细胞(HepG2、Huh7)等的杀伤实验。具体地，提前一天将不同那个的靶细胞以4.5万cells/孔均匀铺在96孔板中，待培养20～24小时，靶细胞贴壁完全后，按照1:1、0.5:1、0.25:1的效靶比，将效应细胞VL1-VH2 scFv、VL2-VH2 scFv、VL1-VH4 scFv以及鼠源性scFvCAR-NK92铺于靶细胞上，2小时后，用CCK8检测OD值，计算杀伤率，比较不同scFv ROBO1CAR-NK92对靶细胞的杀伤效果。对乳腺癌细胞(MDA-MB231-ROBO1-Ox、T47D、MDA-MB453、HCC1187)的杀伤结果如图10a～10d所示，对肺癌细胞(A549、H1299)的杀伤结果如图11a～11b所示，对肝癌细胞(HepG2、Huh7)的杀伤结果如图12a～12b所示。
人源化ROBO1 CAR-NK对不同肿瘤细胞进行杀伤实验的结果表明，VL1-VH2 scFvROBO1CAR-NK92杀伤活性>VL2-VH2 scFv ROBO1 CAR-NK92杀伤活性>VL1-VH4 scFvROBO1CAR-NK92杀伤活性，并且VL1-VH2 scFv ROBO1 CAR-NK92杀伤活性始终高于OriginalscFv ROBO1 CAR-NK92。
综上所述，鼠源性抗人ROBO1抗体人源化过程中，势必会牺牲部分抗体对抗原的亲和力，可能也会出现人源化抗体对抗原的非特异性结合。筛选出的3种人源化抗体VL1-VH2scFv、VL2-VH2scFv和VL1-VH4 scFv，其中VL1-VH2 scFv尽管在与目标抗原蛋白的亲和力上有所下降，但在与不同种属动物中ROBO1抗原蛋白以及与人ROBO家族其他成员之间的非特异性结合的表现来看，VL1-VH2 scFv与Original scFv相一致。并且从杀伤效果来看，VL1-VH2 scFv ROBO1 CAR-NK92杀伤活性始终高于Original scFv ROBO1 CAR-NK92，因此，采用人源化改造的VL1-VH2 scFv制备的VL1-VH2 scFv ROBO1 CAR-NK92相较其他人源化VL2-VH2 scFv和VL1-VH4 scFv制备的ROBO1 CAR-NK92具有更好的优势，然而这三种scFv在降低免疫原性和提高抗体半衰期方面均有良好的优势。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，所述轻链可变区包括互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，所述互补决定区的氨基酸序列为：
VH-CDR1：GYTFTDYYMN；
VH-CDR2：DIVPNNGDTTYNQNFRG；
VH-CDR3：FSNYVYPFDY；
VL-CDR1：RASQDISNFLN；
VL-CDR2：ATSRLHS；
VL-CDR3：QQGNTLPLT；
每条重链可变区和轻链可变区还包括选自下述氨基酸序列的至少一个框架FR，或与下述氨基酸序列的框架FR具有至少80％的序列同一性，并且，与所述互补决定区组合后与人ROBO1具有KD≤10-7mol/L的结合力的框架FR；
框架VH-FR1为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS；
框架VH-FR2为W-V-X1-Q-A-P-G-Q-X2-L-E-W-X3-G，其中，
X1是R或K，X2为G或S，X3为M或I；
框架VH-FR3为X4-X5-T-M-T-X6-D-X7-S-T-S-T-V-Y-M-E-L-S-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-A-R，其中，
X4是R或K，X5为V或A，X6为R或V，X7为T或K；
框架VH-FR4为WGQGTTVTVSS；
框架VL-FR1为I-Q-M-T-Q-S-P-S-S-L-S-A-S-V-G-D-R-V-T-I-X8-C，其中，X8为T或S；
框架VL-FR2为W-Y-Q-Q-K-P-G-K-X9-X10-K-L-L-I-Y，其中，X9为A或T，X10为P或V；
框架VL-FR3为G-V-P-S-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-S-L-T-I-S-K-L-E-Q-E-D-I-A-T-Y-X11-C，其中，X11为Y或F；
框架VL-FR4为FGQGTKLELK。
2.根据权利要求1所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS的VH-FR1、氨基酸序列为WVRQAPGQGLEWIG的VH-FR2、氨基酸序列为RVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS的VH-FR4；
或者氨基酸序列为LVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS的VH-FR1、氨基酸序列为WVKQAPGQSLEWIG的VH-FR2、氨基酸序列为KATMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR的VH-FR3和氨基酸序列为WGQGTTVTVSS的VH-FR4。
3.根据权利要求2所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区中的所述框架FR包括：
氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTITC的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYYC的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK的VL-FR4；
或者氨基酸序列为IQMTQSPSSLSASVGDRVTISC的VL-FR1、氨基酸序列为WYQQKPGKAPKLLIY的VL-FR2、氨基酸序列为GVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYFC的VL-FR3和氨基酸序列为FGQGTKLELK的VL-FR4。
4.根据权利要求3所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括(a)～(c)中任一项：
(a)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(b)氨基酸如SEQ ID No:28所示的VL2和氨基酸如SEQ ID No:32所示的VH2；
(c)氨基酸如SEQ ID No:27所示的VL1和氨基酸如SEQ ID No:34所示的VH4。
5.根据权利要求1～4任一项所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段选自与人源ROBO1抗原特异性结合的scFv分子、Fv分子、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、dsFv分子或完整抗体分子。
6.生物材料，其特征在于，包括(ⅰ)～(ⅲ)中任一项：
(ⅰ)核酸分子，包括编码权利要求1～5任一项所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列；
(ⅱ)载体，所述载体携带所述(ⅰ)核酸分子；优选地，所述载体为将所述(ⅰ)核酸分子连接于质粒载体得到的重组载体；进一步优选地，所述质粒载体包括pcDNA3.4；
(ⅲ)细胞，所述细胞携带所述(ⅰ)核酸分子，或含有所述(ⅱ)载体，或表达权利要求1～5任一项权利要求所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述细胞包括将(ⅲ)所述的载体转化进真核宿主细胞得到的转化体，所述真核宿主细胞优选包括Expi-CHO。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述细胞包括嵌合抗原受体T细胞或嵌合抗原受体NK细胞。
8.权利要求1～5任一项所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段用于制备细胞药物、抗体药物或诊断试剂盒的用途。
9.权利要求1～5任一项所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或权利要求6或7所述的生物材料在制备治疗癌症的细胞药物中的用途，所述癌症包括存在ROBO1高表达的癌细胞的癌症；
优选地，所述癌症包括乳腺癌、肺癌或肝癌；
优选地，所述癌症包括复发性癌症或转移性晚期癌症。
10.用于体外检测人源ROBO1的制剂或试剂盒，其特征在于，所述制剂或试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的抗ROBO1人源化抗体或其抗原结合片段，或，权利要求6或7所述的生物材料。
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