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CN116549619A - 激肽原酶及其衍生物在治疗vci、psci或csvd中的应用 - Google Patents

激肽原酶及其衍生物在治疗vci、psci或csvd中的应用 Download PDF

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CN116549619A
CN116549619A CN202210106039.6A CN202210106039A CN116549619A CN 116549619 A CN116549619 A CN 116549619A CN 202210106039 A CN202210106039 A CN 202210106039A CN 116549619 A CN116549619 A CN 116549619A
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江辰阳
王俊
倪雯婷
王和
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ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
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Abstract

本发明涉及激肽原酶及其衍生物在治疗血管性认知功能障碍(VCI)、卒中后认知功能障碍(PSCI)或脑小血管病(CSVD)中的应用。VCI、PSCI通常会出现认知功能损害和精神行为症状，针对VCI、PSCI认知功能损害的药物有胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N‑甲基‑D‑天冬酰胺受体拮抗剂，精神行为症状针对性治疗药物，如抗抑郁药物等。慢性CSVD患者可出现认知障碍、运动障碍、情感障碍和二便障碍等症状，认知障碍可选择胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N‑甲基‑D‑天冬酰胺受体拮抗剂，抑郁一般选用抗抑郁药物。本申请研究发现激肽原酶及其衍生物可以用于治疗VCI、PSCI、CSVD等，提供了一种治疗VCI、PSCI、CSVD的新方法。

Description

激肽原酶及其衍生物在治疗VCI、PSCI或CSVD中的应用
技术领域
本发明涉及激肽原酶及其衍生物在治疗血管性认知功能障碍(VCI)、卒中后认知功能障碍(PSCI)或脑小血管病(CSVD)中的应用。
背景技术
随着社会发展和人口老龄化，脑血管病的发病率逐年升高，严重影响了患者和家属的生活质量。1993年Hachinski和Bowler首次提出了血管性认知功能障碍(vascularcognitive impairment，VCI)的概念，它是指由脑血管病危险因素(如高血压、糖尿病、高血脂等)、明显(如脑梗死和脑出血等)或不明显的脑血管病(如白质疏松、慢性脑缺血)引起的从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征。根据临床表现，VCI分为三个亚型：无痴呆型血管认知障碍(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)、血管性痴呆(VaD)和混合型痴呆(mixed dementia，MD)。
血管性认知功能障患者会出现认知功能损害和精神行为症状。部分患者的认知功能损害以抽象思维、概念的形成和转换、思维灵活性、信息处理速度等功能损害突出，而记忆力相对保留；部分患者表现为多领域障碍，记忆力亦可明显受损。针对VCI认知功能损害的药物有胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N-甲基-D-天冬酰胺受体拮抗剂。精神行为症状包括知、思维、心境、行为异常等，常见淡漠、抑郁、烦躁、激越/攻击，针对性治疗药物，如抗抑郁药物5-羟色胺再摄取抑制剂等(《中国血管性认知损害诊疗指导规范》)。
卒中后认知功能障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)、脑小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)导致的认知功能障碍、伴有血管病变的阿尔兹海默病等均是VCI的重要亚型。其中卒中后认知功能障碍强调卒中触发认知功能障碍，同样涉及认知功能损害和精神行为症状。考虑到PSCI、VCI和AD在神经病理和神经生化机制方面存在一定重叠性，中国的治疗指南建议参考VCI、VaD、AD等相关的研究和证据，即针对认知障碍的药物治疗一般采用乙酰胆碱酯酶抑制剂、美金刚；针对卒中后抑郁的药物治疗一般采用抗抑郁药。欧洲卒中组织最新发布的“2021ESO/EAN联合指南:卒中后认知障碍”指出：尚无药物治疗卒中后认知障碍。其关注试验中有几项胆碱酯酶抑制剂治疗血管性痴呆的试验，只有一项试验特别关注卒中后认知障碍，但并未有阳性结果。该指南同时指出针对PSCI的随机对照试验的高质量数据明显不足。
脑小血管病是由多种危险因素影响脑内小动脉、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所导致的一系列临床、影像学和病理综合征，分为急性CSVD、慢性CSVD。急性CSVD可导致缺血性卒中，目前建议参考急性缺血性卒中的防治方案，如采取降压、溶栓、抗血小板、降脂治疗。慢性CSVD患者可出现认知障碍、运动障碍、情感障碍和二便障碍等症状，一般建议在明确诊断后进行对症处理。如CSVD导致的认知障碍可选择胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N-甲基-D-天冬酰胺受体拮抗剂，抑郁一般选用抗抑郁药物如5-羟色胺再摄取抑制剂等(《中国脑小血管病诊治专家共识》)。
发明内容
本申请解决的第一个技术问题是提供一种新的治疗血管性认知功能障碍药物。具体而言提供了激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善血管性认知功能障碍的药物中的应用。
本发明还提供一种用于治疗或改善血管性认知功能障碍的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
本发明还提供一种治疗或改善血管性认知功能障碍的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
所述血管性认知功能障碍包括无痴呆型血管认知障碍、血管性痴呆和混合型痴呆。所述的血管性认知功能障碍包括但不限于卒中后认知功能障碍、脑小血管病导致的认知功能障碍、伴有血管病变的阿尔兹海默病等。
优选地，所述血管性认知功能障碍是卒中后认知功能障碍。
优选地，所述血管性认知功能障碍是脑小血管病导致的认知功能障碍。
优选地，所述血管性认知功能障碍是伴有血管病变的阿尔兹海默病。
本申请解决的第二个技术问题是提供一种新的治疗脑小血管病的药物。具体而言提供了激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善脑小血管病的药物中的应用。
本申请还提供一种用于治疗或改善脑小血管病的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
本申请还提供一种治疗或改善脑小血管病的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
所述激肽原酶及其衍生物为天然激肽原酶或重组激肽原酶。所述激肽原酶及其衍生物是激肽原酶的全长蛋白、部分蛋白、突变体、融合蛋白、各种形式修饰物。
优选地，所述激肽原酶及其衍生物是聚乙二醇修饰的激肽原酶。
所述激肽原酶及其衍生物可以单独给药，也可以联合其他药物给药，如胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N-甲基-D-天冬酰胺受体拮抗剂等。
给药方式包括但不限于注射给药、口服给药等。所述注射给药方式包括但不限于静脉注射、皮下注射等。
血管性认知障碍比较的公认动物模型有：针对大鼠的四血管闭塞法(4-vesselocclusion，4-VO)法、改良4-VO法、3期4-VO法、两血管闭塞法(2-vessel occlusion，2-VO)法、改良2-VO法、以及一侧颈总动脉闭塞一侧颈总动脉狭窄改良法(modified commoncarotid artery occlusion，mCCAO)等；针对小鼠的颈总动脉狭窄(bilateral CCAstenosis，BCAS)和不对称颈动脉手术(asymmetric CCA surgery，ACAS)等。
脑小血管病公认的动物模型主要包括双侧颈总动脉结扎模型、双侧颈总动脉狭窄模型(BCAS)、卒中易发性自发高血压大鼠模型等(《脑小血管病转化医学研究中国专家共识》)。
作为血管性认知障碍、脑小血管病研究中较为公认的实验动物模型，BCAS模型动物的脑血流量显著降低，引起慢性低灌注损伤，导致血脑屏障通透性增加、白质损伤，进而引起记忆功能障碍、运动功能损伤等。本申请研究结果显示激肽原酶及其衍生物给予BCAS模型小鼠后可显著改善受损的运动协调功能、前肢受损肌肉强度、工作记忆、空间学习记忆功能。因此本领域技术人员可以预期激肽原酶及其衍生物可以用于治疗血管性认知功能障碍、脑小血管病。
此外，血管性认知功能障碍包括无痴呆型血管认知障碍、血管性痴呆和混合型痴呆。卒中后认知功能障碍、脑小血管病导致的认知功能障碍、伴有血管病变的阿尔兹海默病等均为血管性认知功能障碍的重要亚型，在各自临床治疗上，它们会用到相同的对症治疗药物，如针对认知功能障碍，血管性认知功能障碍、卒中后认知功能障碍、脑小血管病的治疗指南或专家共识普遍推荐使用乙酰胆碱酯酶抑制剂、美金刚；针对卒中后抑郁的药物治疗普遍推荐使用抗抑郁药。因此本领域技术人员可以合理预期激肽原酶及其衍生物可以用于治疗其他血管性认知功能障碍类疾病，如卒中后认知功能障碍、伴有血管病变的阿尔兹海默病等。
激肽释放酶-激肽系统(KKS，Kinin-kallikrein system)，参与多种生理和病理过程，如心血管、肾脏和神经系统的功能调节。KKS系统包括激肽原酶、激肽原、激肽、激肽受体(B1、B2受体)及激肽酶。激肽原酶，又称激肽释放酶或血管舒缓素，是一种丝氨酸蛋白酶，分为两大类：血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)，均发挥十分重要的生理作用。目前认为人组织激肽原酶至少由15个成员(KLK1-KLK15)组成，其中对组织激肽原酶1(KLK1)的研究较多，KLK1通过将激肽原转化为激肽，作用于相应受体，发挥一系列生物作用。
国内已有两种注射用激肽原酶上市，适应症包括微循环障碍性疾病以及轻-中度急性缺血性脑卒中，美国Diamedica Therapeutics Inc目前正在开展重组人组织激肽原酶临床试验，适应症为急性缺血性脑卒中、糖尿病肾病。
血管性认知功能障碍、脑小血管病等与激肽原酶已获批适应症有较大不同。在病理机制方面，急性缺血性脑卒中是在各种原因引起的血管壁病变基础上，脑动脉主干或分支动脉管腔狭窄、闭塞或血栓形成，引起脑局部血流减少或供血中断，使脑组织缺血、缺氧性坏死，出现局灶性神经系统症状和体征。VCI是指由脑血管病危险因素(如高血压、糖尿病、高血脂等)、明显(如脑梗死和脑出血等)或不明显的脑血管病(如白质疏松、慢性脑缺血)引起的从轻度认知障碍到痴呆的一大类综合征。脑小血管病是VCI的亚型之一，神经血管单元(neurovascular unit，NVU)功能异常在发病过程中起重要作用。任何原因引起的NVU结构或功能改变均可导致CSVD，常见机制包括慢性脑缺血和低灌注、内皮功能障碍和血脑屏障破坏、组织间液回流障碍、炎症反应和遗传因素等，不同机制存在相互作用。(theneurovaseular unit coming of age：a journey through neurovaseular coupling inhealth and disease)
此外，两者的诊断、治疗方案均有较大差别。急性缺血性脑卒中最有效的治疗方法是时间窗内给予血管再通治疗，包括静脉溶栓、机械取栓、血管成形术等，救治成功率与发病时间密切相关。药物治疗包括抗血小板、抗凝、降纤、扩容、扩张血管、他汀类药物、神经保护药物等。VCI、PSCI通常会出现认知功能损害和精神行为症状，针对VCI和PSCI认知功能损害的药物有胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N-甲基-D-天冬酰胺受体拮抗剂，精神行为症状针对性治疗药物，如抗抑郁药物5-羟色胺再摄取抑制剂等。慢性脑小血管病患者可出现认知障碍、运动障碍、情感障碍和二便障碍等症状，一般建议在明确诊断后进行对症处理。如CSVD导致的认知障碍可选择胆碱酯酶抑制剂、非竞争性N-甲基-D-天冬酰胺受体拮抗剂，抑郁一般选用抗抑郁药物如5-羟色胺再摄取抑制剂等。
本申请研究发现激肽原酶及其衍生物可以用于治疗血管性认知功能障碍、卒中后认知功能障碍、脑小血管病等。与激肽原酶已获批适应症有较大不同，提供了一种治疗血管性认知功能障碍、卒中后认知功能障碍、脑小血管病的新方法。
附图说明
图1：KLK1及其突变体激活下游CREB蛋白的磷酸化。
图2：Lys-BK激活下游ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化。
图3：第13天药物对转棒跌落时间(Rotarod test)的影响。
图4：第26天药物对转棒跌落时间(Rotarod test)的影响。
图5：第20天药物对铁丝跌落时间(Wire hang)的影响。
图6：第28天药物对铁丝跌落时间(Wire hang)的影响。
图7：第29天药物对Y Maze轮流得分的影响。
图8：第44天药物对Y Maze轮流得分的影响。
图9：第48天药物对Morris maze登台潜伏期的影响。
具体实施方式
除非特别指明，否则本申请的技术术语或简称具有下列含义：
hKLK1：与天然人组织激肽原酶序列一致、未突变的人组织激肽原酶；涵盖人KLK1的各种同源物，包括但不限于Genbank登录号为AAA59455.1、NP002248.1、AAA36136.1、AAP35917、AAU12569等所示的KLK1。在具体的实施例中采用了AAA59455.1所示的序列。
rhKLK1：重组人激肽原酶，有三个糖基化修饰位点，分别为N78(NMS序列中N)，N84(NMS序列中N)与N141(NFS序列中的N)。
hKLK1高糖基化：未突变的人组织激肽原酶的高糖基化组分。三个糖基化修饰位点均有糖修饰。
hKLK1低糖基化：未突变的人组织激肽原酶的低糖基化组分。N78、N84均有糖基化修饰，N141基本未发生糖基化修饰，或仅有少量发生糖基化修饰。重组hKLK1高糖基化、hKLK1低糖基化可以通过常规的纯化方法分离，如疏水层析、阴离子交换、阳离子交换及其组合。
hKLK1X：人组织激肽原酶突变体。在一些具体的实施例中，在AAA59455.1基础上突变N141位点获得了仅含有两个糖基化修饰位点的KLK1，hKLK1X1、hKLK1X2、hKLK1X3、hKLK1X4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～4所示。
KLK1突变体的衍生物：包括本申请KLK1突变体的全长蛋白、部分蛋白或者在本申请KLK1突变体的基础上进一步突变获得的蛋白、融合蛋白(包括但不限于白蛋白融合、Fc融合等)、各种形式修饰物(包括但不限于聚乙二醇化修饰物等)。使用本领域公知的方法对重组蛋白进行基因设计、表达载体构建、选择合适的宿主细胞、培养宿主细胞、纯化(疏水层析、阴离子交换、阳离子交换及其组合)，获得的重组蛋白。
聚乙二醇：PEG，通常经环氧乙烷聚合而成，有分支型，直链型和多臂型。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
聚乙二醇修饰剂：PEG修饰剂，指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是经过活化的聚乙二醇，可用于蛋白质以及多肽药物修饰。本申请所用聚乙二醇修饰剂购自江苏众红生物工程创药研究院有限公司或北京键凯科技股份有限公司。特定分子量的PEG修饰剂实际分子量可以是标示值的90％～110％，如PEG5K分子量可以是4.5kDa～5.5kDa。
实施例所用的PEG5K具体指M-SPA-5K，是分子量约为5kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，结构如式(1)所示，n为105至110的整数，
实施例所用的PEG10K具体指M-SPA-10K，是分子量约为10kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，结构如式(1)所示，n为220至225的整数。
实施例所用的PEG30K具体指Y-PALD-30K，是分子量约为30kD的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为335至340的整数，
实施例所用的PEG40K具体指Y-PALD-40K，是分子量约为40kD的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为450至455的整数。
适合KLK1的聚乙二醇修饰剂不限于具体实施例使用的上述聚乙二醇修饰剂，还可以尝试其他公知的聚乙二醇修饰剂。
以下实施例所采用的KLK1的聚乙二醇化修饰物，为使用本领域公知的方法进行聚乙二醇修饰并纯化获得聚乙二醇修饰的蛋白。例如：可参考中国专利CN109498815A、中国专利CN107760661A或在先申请CN202111353294.2制备。
实施例1重组人激肽原酶(hKLK1)及其突变体(hKLK1X)的体外活性检测
激肽原酶在体内催化低分子激肽原LMWK水解释放赖氨酰缓激肽发挥生物学功能，水解反应涉及精氨酸(Arg)羧基端肽键的断裂。因此，重组人激肽原酶及其突变体的体外生物学活性评价是基于水解人工合成发色底物S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-PNA)中Arg与对硝基苯胺间酰胺键断裂生成对硝基苯胺(PNA)，在405nm下检测PNA的生成。活性单位IU定义为在37℃、pH8.0条件下，每分钟水解1μmol S-2266为PNA的酶量为1IU。反应体系为200μl20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，10μl供试品，20μl 20mM S-2266底物溶液，置于37℃水浴中准确反应10min，加入20μl 50％醋酸溶液终止反应，基于不同浓度的PNA标准品拟合的标准曲线定量反应体系中PNA的生成量。运用上述方法完成高低糖基化hKLK1、hKLK1突变体以及hKLK1-PEG修饰样品的体外生物学活性检测。
结果如下表所示，未突变蛋白的PEG修饰系列产物中，均较好地保留了原蛋白活性。。位点突变后，突变体(hKLK1X1、hKLK1X2、hKLK1X3、hKLK1X4)样品的活性均高于未突变的hKLK1-低糖基化样品。同时PEG修饰样品的活性稍低于修饰前hKLK1X1蛋白；PEG10K-hKLK1X1的活性高于PEG5K-hKLK1X1，PEG10K修饰后基本保留了原蛋白活性。
表1
样品名称 比活性IU/mg 相对活性
hKLK1低糖基化 5.1 100％
hKLK1X1 7.0 137.3％
hKLK1X2 7.1 139.2％
hKLK1X3 5.7 111.8％
hKLK1X4 5.7 111.8％
PEG5K-hKLK1X1 5.0 98.0％
PEG10K-hKLK1X1 6.7 131.4％
PEG5K-hKLK1低糖基化 5.1 100.6％
PEG10K-hKLK1低糖基化 5.6 110.5％
尤瑞克林 4.5 88.2％
实施例2 KLK1对B2受体下游信号的激活作用
收集处于对数生长期的CHO-K1细胞(含B2受体)，用血球计数板进行活细胞计数。用培养基将活细胞悬液调整至3×106cells/mL接种于6孔细胞培养板，最终细胞浓度为3×105个/孔。细胞于37.0℃，5.0％CO2的CO2培养箱培养24～48h。待每孔细胞密度长到90％以上时，用PBS洗涤2遍，提前用F12培养基配制好样品(KLK1和LMWK按质量比1：10混和，反应体系为F12培养基，反应15min)，反应结束后以每孔1ml的体系加入，KLK1终浓度为0.1μM，对照组则为F12培养基。加药完成后，将细胞培养板置于37.0℃、5.0％CO2培养箱中孵育0.5h。时间结束后，将6孔板从培养箱取出，用PBS洗涤2遍，最后1遍将PBS吸尽。将配制好的蛋白裂解液(RIPA、PMSF、磷酸酶抑制剂)按80μL/孔加入，用刮棒来回研磨孔底以加速细胞裂解，研磨时间1min。将细胞碎片与裂解液转移至离心管中，12000rpm，10min，4℃离心。小心吸取蛋白上清，将蛋白上清与5×Loading Buffer以4:1体积比混匀，后于100℃金属浴煮沸10min；样品于室温冷却后，短时间置于4℃保存，长时间-20℃保存。将等量的蛋白样品和预染marker上样到10％SDS-PAGE中进行跑胶、转膜、封闭、抗体孵育、发光鉴定等操作。
环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是B2R激活后下游直接作用的信号分子，CREB的激活可以防止缺血后的炎症反应与神经元损伤的发生，故其表达的高低可一定程度反应受试物激活B2R的能力，同时从侧面反应神经保护效应发挥的意义。
基于B2-NFAT-CHO-K1细胞株证明了KLK1可催化低分子激肽原LMWK生成活性分子与B2受体结合后激活下游信号CREB蛋白的活化，如图1所示，可以激活下游CREB蛋白的磷酸化，与该药物作用机制存在一致性，通过判断下游CREB蛋白的磷酸化水平来定性评价样品的体外生物学活性。结果显示，hKLK1X1、hKLK1X2、hKLK1X3、hKLK1X4、hKLK1X-低糖基化、hKLK1X-高糖基化与LMWK反应后均显示出激活下游通路的活性。
实施例3赖氨酰缓激肽Lys-BK对B2受体下游信号的激活作用
收集处于对数生长期的CHO-K1(含B2受体)细胞，用血球计数板进行活细胞计数。用培养基将活细胞悬液调整至3×106cells/mL接种于6孔细胞培养板，最终细胞浓度为3×105个/孔。细胞于37.0℃，5.0％CO2的CO2培养箱培养24～48h。待每孔细胞密度长到90％以上时，用PBS洗涤2遍，提前用F12培养基配制好样品(Lys-BK)，以每孔1ml的体系加入，Lys-BK终浓度为1μM，对照组则为F12培养基。加药完成后，将细胞培养板置于37.0℃、5.0％CO2培养箱中孵育0.5h。时间结束后，将6孔板从培养箱取出，用PBS洗涤2遍，最后1遍将PBS吸尽。将配制好的蛋白裂解液(RIPA、PMSF、磷酸酶抑制剂)按80μL/孔加入，用刮棒来回研磨孔底以加速细胞裂解，研磨时间1min。将细胞碎片与裂解液转移至离心管中，12000rpm，10min，4℃离心。小心吸取蛋白上清，将蛋白上清与5×Loading Buffer以4:1体积比混匀，后于100℃金属浴煮沸10min；样品于室温冷却后，短时间置于4℃保存，长时间-20℃保存。将等量的蛋白样品和预染marker上样到10％SDS-PAGE中进行跑胶、转膜、封闭、抗体孵育、发光鉴定等操作。
胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)都是B2R激活后下游直接作用的信号分子，CREB与ERK1/2的激活可以防止缺血后的炎症反应与神经元损伤的发生，故其表达的高低可一定程度反应受试物激活B2R的能力，同时从侧面反应神经保护效应发挥的意义。
基于B2-NFAT-CHO-K1细胞株证明了赖氨酰缓激肽Lys-BK与B2受体结合后激活下游信号CREB、p-ERK1/2蛋白的活化，如图2所示，Lys-BK可以激活下游CREB、p-ERK1/2蛋白的磷酸化。
实施例4 KLK1-PEG在小鼠BCAS模型上的药效作用
本发明中，以小鼠双侧颈总动脉狭窄(Bilateral common carotid arterystenosis,BCAS)脑小血管缺血损伤模型为基础，多次静脉注射给予KLK1-PEG(100IU/kg，所述KLK1是hKLK1X1，PEG是SPA10K)，观察重复给予KLK1-PEG后对脑小血管缺血损伤的保护作用并进行比较。
一、分组与实验设计
采用双侧颈总动脉弹簧缩束法制备小鼠双侧颈总动脉狭窄(Bilateral commoncarotid artery stenosis,BCAS)脑小血管缺血损伤模型。
BCAS小血管损伤模型的制备：采用BCAS小血管缺血损伤模型，实现小鼠持续性前脑慢性缺血。小鼠使用异氟烷麻醉，首先将小鼠放入麻醉机的诱导盒中诱导麻醉，然后将小鼠仰卧保定并连接呼吸面罩，备皮、消毒皮肤，颈部正中切开，分离双侧颈总动脉，用定制弹簧(弹簧材料：进口钢琴丝，尺寸：线径：0.08mm，内径：0.18mm，节距：约0.5mm，总长：2.5mm)缩束双侧颈总动脉，阻断大部分血流，造成脑部血供降低，全脑持续性慢性缺血。缝合颈部皮肤，消毒，放回笼中饲养。
试验共设3组，即假手术组(SHAM组)、模型对照组(BCAS组)、候选药物组(KLK1-PEG组)。
于BCAS术后第3天开始分组给药。KLK1-PEG组(100IU/kg)、BCAS组及SHAM组每周尾静脉注射等体积生理盐水1次，共给药7周。
采用转棒实验(Rotarod test)于术后第13天、26天检测小鼠运动协调功能；采用挂绳实验(Wire hang)于术后第20天、28天检测小鼠前肢肌肉强度受损情况；采用Y迷宫实验(Y Maze)于术后第29天、44天检测小鼠工作记忆受损情况；采用水迷宫实验(Morrismaze)于术后第48天检测小鼠空间学习记忆受损情况。
二、结果
BCAS组与SHAM组比较，在转棒实验、挂绳实验、Y迷宫实验、水迷宫实验、糖水偏爱实验的结果上均有显著性统计学差异，表明BCAS造模导致动物的运动协调、前肢肌肉强度、工作记忆和空间学习记忆障碍，诱发动物的抑郁行为。KLK1-PEG组与BCAS造模组比较，上述各项检测均有改善。说明KLK1及其衍生物可用于治疗脑小血管病、血管性认知障碍。
结果详见附图1-8、表2～表6。
表2静脉注射给药对Rotarod test转棒跌落时间的影响
表3静脉注射给药对Wire hang铁丝跌落时间的影响
***P<0.001，**P<0.01，与SHAM组相比。
表4静脉注射给药对Y Maze轮流得分的影响
***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，与SHAM组相比。
表5静脉注射给药对Morris maze登台潜伏期的影响
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 激肽原酶及其衍生物在治疗VCI、PSCI或CSVD中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
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1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
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35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
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Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
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Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 2
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
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Claims (16)

1.激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善血管性认知功能障碍的药物中的应用。
2.一种用于治疗或改善血管性认知功能障碍的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
3.一种治疗或改善血管性认知功能障碍的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
4.激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善卒中后认知功能障碍的药物中的应用。
5.一种用于治疗或改善卒中后认知功能障碍的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
6.一种治疗或改善卒中后认知功能障碍的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
7.激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善伴有血管病变的阿尔兹海默病的药物中的应用。
8.一种用于治疗或改善伴有血管病变的阿尔兹海默病的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
9.一种治疗或改善伴有血管病变的阿尔兹海默病的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
10.激肽原酶及其衍生物在制备治疗或改善脑小血管病的药物中的应用。
11.一种用于治疗或改善脑小血管病的药物组合物，包含激肽原酶及其衍生物。
12.一种治疗或改善脑小血管病的方法，即给予患者激肽原酶及其衍生物。
13.如权利要求1至12任一项所述的激肽原酶为天然人组织激肽原酶，突变或未突变的重组人组织激肽原酶。
14.如权利要求1至12任一项所述的激肽原酶衍生物为激肽原酶的全长蛋白、部分蛋白或者突变体、融合蛋白、各种形式修饰物。
15.如权利要求1至12任一项的激肽原酶衍生物为激肽原酶的聚乙二醇化修饰物。
16.如权利要求15所述的激肽原酶的聚乙二醇化修饰物为以M-SPA-5K、M-SPA-10K、Y-PALD-30K、Y-PALD-40K修饰的激肽原酶。
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