CN116507343A - 治疗肝衰竭的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝衰竭的治疗或预防。

Description

治疗肝衰竭的方法

技术领域

本发明涉及肝衰竭的治疗或预防。

背景技术

肝衰竭是肝脏不能执行其正常代谢功能的严重失能。肝衰竭的表现包括急性肝衰竭、肝硬化和慢加急性肝衰竭。

急性肝衰竭(ALF)

术语ALF描述了一种以在没有预先存在的慢性肝病的情况下肝功能的急性丧失为特征的障碍。ALF也被称为暴发性肝衰竭、急性肝坏死、爆发性肝坏死和爆发性肝炎。

ALF是肝细胞突然损伤的一种罕见且严重的后果，并且可以在数天或数周内演变成致命结果。对肝细胞的各种损伤导致转氨酶快速升高、精神状态改变和凝血扰乱的一致模式。现有肝病的缺失将ALF与由终末期慢性肝病引起的肝衰竭(失代偿性肝硬化和慢加急性肝衰竭，ACLF)区分开。在ALF中，导致肝细胞损伤的物质引起直接毒性坏死或作为较慢过程的细胞凋亡和免疫损伤。从症状出现到肝性脑病发作的时间区分了不同形式的急性肝衰竭：被称为超急性肝衰竭的直接、非常迅速的损伤(数小时内)；和被认为是急性或亚急性的较慢的基于免疫的损伤(数天至数周)。本文所使用的术语“肝性脑病”或HE是指作为肝衰竭的结果而出现意识模糊、意识水平改变和昏迷。在晚期阶段，它被称为肝性昏迷或肝昏迷。

在发达国家，ALF的5种最常见病因是醋氨酚(对乙酰氨基酚)毒性、局部缺血、药物诱导的肝损伤、乙型肝炎和自身免疫，它们占病例的近80％。在发展中国家，甲型、乙型和戊型肝炎是ALF的主要病因。ALF的其余病因占总数的不到15％，并包括中暑、妊娠相关损伤(例如妊娠期急性脂肪肝和HELLP[溶血、肝酶升高和低血小板]综合征)、Budd-Chiari综合征、非肝营养性病毒感染例如单纯性疱疹和弥漫性浸润性恶性肿瘤。

在不治疗的情况下预后不良，因此即时识别和管理急性肝衰竭患者是至关重要的。只要可能，急性肝衰竭患者应该在肝移植中心的重症监护室中管理。

肝硬化

本文所使用的术语“肝硬化”是指以肝组织被纤维化和再生性结节取代，导致肝功能丧失直至失代偿为特征的一种病症。腹水(体液在腹腔中潴留)是与肝硬化失代偿相关的最常见并发症。它与生活质量差、感染风险增加和长期结果不佳有关。其他潜在危及生命的并发症是肝性脑病(意识模糊和昏迷)和食管静脉曲张出血。肝硬化具有许多可能的表现。这些体征和症状可能是肝细胞衰竭的直接结果，也可能是继发于由此产生的门静脉高压。门静脉高压的影响包括脾肿大、胃食管静脉曲张和作为门静脉高压的结果的门静脉系统与脐周静脉之间的静脉侧支静脉的形成而导致的门体侧支循环。

肝硬化被分为两种临床类别：代偿性和失代偿性肝硬化。

本文所使用的术语“代偿性肝硬化”是指肝脏重度疤痕化，但仍能执行许多重要的身体功能。患有代偿性肝硬化的患者很少或没有症状，并且可以在没有严重临床并发症的情况下生存。代偿性肝硬化早期阶段的患者的特征在于门静脉高压水平低并且没有食管静脉曲张。代偿性肝硬化晚期阶段的患者的特征在于门静脉高压水平较高并存在食管静脉曲张，但没有腹水和出血。

本文所使用的术语“失代偿性肝硬化”是指肝脏广泛疤痕化且无法正常发挥作用。患有失代偿性肝硬化的患者发展出各种症状，例如如疲劳、食欲不振、黄疸、体重减轻、腹水和/或水肿、肝性脑病和/或出血。失代偿性肝硬化早期阶段的患者的特征在于在从未出血的患者中出现腹水，并伴有或不伴有食管静脉曲张。失代偿性肝硬化晚期阶段的患者的特征在于单独的或与出血、细菌感染和/或肝性脑病相伴的更严重的腹水。可能发展出与失代偿性肝硬化相关的并发症，例如腹水、水肿、出血问题、骨量和骨密度损失、肝肿大、女性月经不调和男性女型乳房、精神状态受损、瘙痒、肾衰竭和肌肉萎缩。

慢加急性肝衰竭(ACLF)

ACLF也是一种重要的肝脏病症，在患有已知慢性肝病且肝功能急性恶化的患者中观察到。

ACLF是晚期肝硬化或由慢性肝病引起的肝硬化患者中临床状况的突然且危及生命的恶化。表征这种综合征的三个主要特点是：它通常发生在严重全身性炎症的背景中，经常与促炎性诱发事件(例如感染或酒精性肝炎)有密切的时间关系，并与影响肝脏、肾脏、脑、凝血和/或心血管功能的单器官或多器官衰竭有关。器官衰竭使用改良的序贯器官衰竭评估评分(EASL-CLIF联盟器官衰竭评分系统)来鉴定，所述评分系统考虑了肝脏、肾脏和脑的功能以及凝血、循环和呼吸，允许将患者分层为具有不同死亡风险的亚组。根据诊断时器官衰竭的数量，将患者分层为四个预后等级(无慢加急性肝衰竭以及1、2和3级慢加急性肝衰竭)。ACLF的易发性与基础慢性肝病的严重程度(即纤维化进展直至肝硬化)和病因相关。无论慢性肝病的病因是什么，代偿性肝硬化都是与ACLF发展相关的主要病症。胆汁淤积性、代谢性肝病、慢性病毒性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)也属于基础慢性肝病。在西方国家，酒精性肝硬化占ACLF的所有基础肝病的50-70％，而与病毒性肝炎相关的肝硬化约占所有病例的约10-30％。

基础疾病的严重程度可以通过终末期肝病模型(MELD)评分来评估。

ACLF需要在肝硬化和/或慢性肝病的背景中发生的诱发事件，并迅速发展成具有高死亡率的多器官衰竭。诱发事件可能是乙型肝炎的再激活或叠加性病毒性肝炎、酒精、药物、局部缺血、手术、脓毒症或特发性的。

在疾病发作期间，细菌移位可能通过全身炎症反应综合征在从代偿性肝硬化向失代偿性肝硬化(以腹水、静脉曲张出血、脑病为标志)的发展中发挥关键作用。然而，约40％的ACLF患者没有诱发事件。

宿主反应决定了损伤的严重程度。炎症和中性粒细胞功能障碍在ACLF的发病机制中至关重要，并且显著的促炎性细胞因子分布情况导致从稳定的肝硬化向ACLF的转变。在这些患者中，炎症反应可能导致免疫失调，这可能容易导致感染，然后进一步加剧促炎性反应，从而导致恶性循环。细胞因子被认为在ACLF中发挥重要作用。已描述了ACLF患者中包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、sTNF-αR1、sTNF-αR2、白细胞介素(IL)-2、IL-2R、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和干扰素-α在内的几种细胞因子的血清水平升高。

高胆红素血症几乎总是存在，并且黄疸被认为是ACLF的基本判据。不同的作者使用不同的黄疸截止值水平，从6-20mg/dL的血清胆红素不等。除了黄疸之外，肝功能障碍的另一个标志是凝血障碍。肝硬化患者中的凝血测试通常是异常的，这是由于凝血因子的合成受损和消耗增加。持续的肝损伤以不可阻挡的螺旋式下降和死亡告终。

除了肝脏以外，最常见的衰竭器官是肾脏。肾衰竭可以分为四种类型：肝肾综合征、实质性疾病、低血容量诱导的肾衰竭和药物诱导的肾衰竭。细菌感染(例如自发性细菌性腹膜炎)是肝硬化中肾衰竭最常见的诱发因素，其次是低血容量(继发于胃肠道出血、过度利尿剂治疗)。

肝性脑病(HE)是ACLF的常见表现之一。HE可能是ACLF的诱发因素或后果。氨是HE发病机制的核心。事实上，多项研究强调，高氨血症在肝硬化和其他肝病患者的HE发展中发挥关键作用。由于肝衰竭，大量的血清氨逃离肝脏代谢并且可以到达大脑，在那里如此高的氨浓度与脑水肿和脑疝的高发病率密切相关。

此外，与ALF中的情况类似，脑肿胀是ACLF的一个重要特点。

ACLF的标志之一是与ALF患者中类似的心血管崩溃。这种心血管异常与死亡风险增加有关，特别是在出现肾功能障碍的患者中。

ACLF的呼吸道并发症可以分为急性呼吸衰竭(例如肺炎)和作为肝硬化的结果而引起的并发症(例如门肺动脉高压和肝肺综合征)。肝硬化患者患肺炎的风险增加。

在相同的MELD评分下，ACLF患者的死亡率在统计学上高于没有ACLF的患者。无论诱发事件如何，导致肝功能急性恶化和多器官衰竭的最终常见途径似乎是全身炎症的过度激活，随后是一段时间的免疫系统瘫痪。最初的细胞因子风暴造成宏观循环、微循环的深刻改变和正常器官功能的破坏，导致多器官衰竭。

减少或校正损伤的早期干预措施至关重要。ACLF的管理目前基于对器官衰竭的支持性治疗，主要是在重症监护环境中。

然而，在ACLF患者中，具有急性失代偿的既往发作史(发展为腹水、脑病、胃肠道出血、细菌感染)的病例比例非常高。事实上，肝硬化患者中肝衰竭的出现代表了医疗管理的决定性时间点，因为这种病症常常与快速演化的多器官功能障碍有关。肝脏解毒、代谢和调节功能的缺乏以及免疫应答的改变导致危及生命的并发症，例如肾衰竭、对感染的易感性增加、肝性昏迷和全身血液动力学功能障碍。此外，仅有20％的晚期肝硬化患者可以接受肝移植治疗。

需要对肝衰竭，特别是ACLF、ALF和肝硬化，更特别是失代偿性肝硬化进行充分的治疗或预防。

于1975年首次描述的NTZ(硝唑尼特)被证明对厌氧原生动物、蠕虫和包括厌氧和需氧细菌在内的广范围的微生物非常有效。NTZ还可以提供抗病毒活性，并且也被显示通过干扰关键的代谢和促死亡信号传导途径而具有广泛的抗癌特性。

针对服用NTZ和乳果糖的HE患者的一项初步研究提供了临床情况改善的结果。患者显示出精神状态改善，并且药物耐受性良好(Elrakaybi等，硝唑尼特在肝性脑病患者中的临床效果：初步研究(The clinical effects of nitazoxanide in hepaticencephalopathy patients:apilot study)，IJPSR,2015；Vol.6(11):4657-4667)。然而，这项研究的作者没有报告肝功能或任何其他器官功能的改善。此外，在NTZ给药后氨水平没有改善。

本文令人吃惊地显示，NTZ可用于治疗患有肝衰竭或具有肝衰竭风险的受试者。

发明内容

本发明源于下述令人吃惊的观察，即NTZ保护肝细胞免于氨诱导的毒性并改善肝功能。此外，本文令人吃惊地显示，NTZ在ACLF动物模型中预防失代偿。

因此，本发明涉及硝唑尼特(NTZ)、替唑尼特(TZ)、替唑尼特葡萄糖苷酸(TZG)或其药学上可接受的盐，其用于在有需要的受试者中治疗或预防肝衰竭的方法中。在特定实施方式中，所述肝衰竭是ACLF、ALF或肝硬化，特别是代偿性或失代偿性肝硬化，更特别是失代偿性肝硬化。在特定实施方式中，所述肝衰竭是ACLF或ALF。

在特定实施方式中，本发明涉及NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐，其用于治疗选自ACLF和ALF的肝衰竭的方法中。在特定实施方式中，本发明涉及NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐，其用于治疗ACLF的方法中。

本发明还涉及NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐，其用于在有需要的受试者中治疗或预防由ACLF、ALF、肝硬化或肝硬化失代偿造成的肝衰竭的方法中。在特定实施方式中，NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐用于治疗或预防由ACLF或ALF造成的肝衰竭的方法中。

在特定实施方式中，所述受试者具有ACLF、ALF或肝硬化、特别是失代偿性肝硬化的风险(在本文中也被称为“有风险的受试者”)。

在特定实施方式中，所述受试者患有ACLF。因此，NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐用于治疗ACLF的方法中。

在又一个实施方式中，所述受试者患有ALF。因此，NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐用于治疗ALF的方法中。。在特定实施方式中，所述方法用于治疗药物诱导的ALF，特别是对乙酰氨基酚诱导的ALF。

在又一个实施方式中，所述受试者患有肝硬化。在另一个特定实施方式中，所述受试者患有代偿性或失代偿性肝硬化。在另一个实施方式中，所述受试者患有失代偿性肝硬化。在另一个实施方式中，所述受试者患有代偿性肝硬化，并且所述方法用于预防从代偿性肝硬化进展到失代偿性肝硬化。

在又一个实施方式中，NTZ、TZ、TZG或其药学上可接受的盐用于预防失代偿性肝硬化或将失代偿性肝硬化逆转成代偿性肝硬化的方法中。

在另一个实施方式中，所述受试者患有ACLF和肝硬化。在另一个特定实施方式中，所述受试者患有ACLF和代偿性或失代偿性肝硬化。在另一个实施方式中，所述受试者患有ACLF和失代偿性肝硬化。在另一个实施方式中，所述受试者患有ACLF和代偿性肝硬化，并且所述方法用于预防从代偿性肝硬化进展到失代偿性肝硬化。

在又一个实施方式中，所述有ACLF风险的受试者患有肝硬化，特别是代偿性或失代偿性肝硬化，更特别是失代偿性肝硬化。

在又一个特定实施方式中，所述受试者患有入院后不到28天内死亡的风险高的ACLF。

在特定实施方式中，所述受试者患有根据EASL-CLIF联盟的CANONIC研究1、2或3级ACLF，特别是2或3级ACLF。

在特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝硬化的受试者中预防ACLF的方法中。在另一个实施方式中，所述受试者患有酒精性肝硬化。在另一个特定实施方式中，所述受试者患有代偿性酒精性肝硬化。在另一个实施方式中，所述受试者患有失代偿性酒精性肝硬化。

在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有慢性肝病的受试者中预防ACLF的方法中。在特定实施方式中，所述受试者患有伴或不伴肝硬化的慢性肝病。在特定实施方式中，所述受试者患有伴肝硬化的慢性肝病。在另一个实施方式中，所述肝硬化是代偿性或失代偿性肝硬化，更特别是失代偿性肝硬化。

在另一个特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的受试者中改善肝功能的方法中。在另一个特定实施方式中，所述方法在患有选自ACLF和ALF的肝衰竭的受试者中改善肝功能。

在另一个特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的受试者中改善肝脏解毒功能的方法中。在特定实施方式中，所述方法在患有选自ACLF和ALF的肝衰竭的受试者中改善肝脏解毒功能。

在另一个特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有ACLF的受试者中预防肝失代偿的方法中。

在特定实施方式中，所述受试者患有ACLF并合并至少一种诱发事件，例如感染(例如病毒、真菌或细菌感染)或酒精性肝炎、脓毒症、中毒、内脏出血和药物诱导的肝功能不全(DILI)。

在又一个特定实施方式中，所述受试者患有由肝诱发条件(例如酒精)、肝外诱发条件(例如病毒、真菌或细菌感染、脓毒症、病毒再激活)或两者引起的ACLF。

在另一个特定实施方式中，所述受试者具有ACLF风险并伴有诱发事件。例如，所述受试者可以患有慢性肝病并伴有诱发事件。在特定实施方式中，所述受试者患有慢性肝病并伴有诱发事件，伴有或不伴有肝硬化。在特定实施方式中，所述受试者患有慢性肝病并伴有诱发事件和肝硬化。在另一个实施方式中，所述肝硬化是代偿性或失代偿性肝硬化，更特别是失代偿性肝硬化。

在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝硬化的受试者、特别是患有代偿性或失代偿性肝硬化、特别是失代偿性肝硬化的受试者中预防肝外器官衰竭的方法中。在特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肾衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是脑衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是心力衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肺衰竭。

在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有慢性肝病伴肝硬化的受试者、特别是患有代偿性或失代偿性肝硬化、特别是失代偿性肝硬化的受试者中预防肝外器官衰竭的方法中。在特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肾衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是脑衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是心力衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肺衰竭。

在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有ACLF的受试者中治疗肝外器官衰竭的方法中。在特定实施方式中，所述治疗的肝外器官衰竭是肾衰竭。在另一个特定实施方式中，所述治疗的肝外器官衰竭是脑衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是心力衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肺衰竭。

在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有ACLF的受试者中预防肝外器官衰竭的方法中。在特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肾衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是脑衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是心力衰竭。在另一个特定实施方式中，所述预防的肝外器官衰竭是肺衰竭。

在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于保护受试者免于氨诱导的损伤的方法中，所述受试者患有选自ACLF、ALF和失代偿性肝硬化的肝衰竭或具有所述肝衰竭的风险。

在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于治疗或预防HE的方法中。在特定实施方式中，所述方法用于治疗或预防HE并进一步预防脑水肿。在特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝衰竭、例如选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的受试者中治疗或预防HE的方法中。在又一个特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在具有肝衰竭的风险、例如具有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的风险的受试者中治疗或预防HE的方法中。在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝衰竭、例如选自ACLF、ALF和肝硬化的肝衰竭、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的受试者中预防HE的方法中。在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭或具有所述肝衰竭的风险的受试者中，通过保护脑免于氨诱导的损伤来治疗或预防HE的方法中。

在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于治疗或预防脑水肿的方法中。在特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝衰竭、例如选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的受试者中治疗或预防脑水肿的方法中。在又一个特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在具有肝衰竭的风险、例如具有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的风险的受试者中治疗或预防脑水肿的方法中。在又一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有肝衰竭、例如选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的受试者中预防脑水肿的方法中。在另一个实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于在患有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭或具有所述肝衰竭的风险的受试者中，通过保护脑免于氨诱导的损伤来治疗或预防脑水肿的方法中。

附图说明

图1是示出了在用或不用NTZ处理后死细胞蛋白酶活性的图。在HepG2细胞中评估了NTZ对氯化铵(NH₄Cl)诱导的死亡的保护作用。在低(60mM)和高(120mM)浓度NH₄Cl时评估NTZ的剂量响应。细胞死亡率通过蛋白酶活性测量来估算。条形图表示平均值和标准偏差。§使用非参数Mann-Whitney检验，与不含NH₄Cl的对照相比p<0.05。¤，¤¤，¤¤¤使用非参数Kruskal-Wallis检验，与相同剂量的NH₄Cl并且不含NTZ(NTZ 0μM)相比p<0.05、p<0.01、p<0.001。

图2提供了大鼠中TAA诱导的肝硬化的肝脏切片的代表性图片。在TAA给药16周后大鼠肝脏的苏木精、曙红和番红染色的肝脏切片，其中最后4周用或不用NTZ处理。纤维性隔(黑色)围绕肝结节(灰色)，作为肝硬化的标志。门管区和血管用白色描绘。

图3是表示使用或不使用NTZ治疗的肝硬化大鼠中的血浆总胆红素水平的图。条形图表示平均值和标准偏差。§，§§，§§§：使用非参数Mann-Whitney检验，与TAA对照相比p<0.05、p<0.01、p<0.001。

图4是表示使用或不使用NTZ治疗的肝硬化大鼠中的血浆白蛋白水平的图。条形图表示平均值和标准偏差。*，**：使用Student t-检验，与TAA对照相比p<0.05、p<0.01。

图5是ACLF诱导和NTZ治疗方案的示意图。

图6是示出了用NTZ治疗或不用NTZ治疗(载体，veh)的肝硬化大鼠在LPS注射后的存活曲线的图。使用Mantel-Cox检验比较存活曲线，P＝0.058。

图7是示出了在ACLF诱导后用NTZ治疗或不用NTZ治疗(载体，veh)的肝硬化大鼠中的血浆总胆汁酸的图。*使用Student t-检验p<0.05。

图8是示出了在具有BDL+LPS诱导的ACLF的大鼠中NTZ减少脑水肿的图。条形图表示平均值和标准偏差。使用Student T检验，*p<0.05，**p<0.01。

图9是示出了在具有BDL+LPS诱导的ACLF的大鼠中NTZ改善肾功能的图。条形图表示平均值和标准偏差。使用Mann-Whitney检验，#p<0.05，##p<0.01。

图10是示出了在对乙酰氨基酚中毒后NTZ降低血浆AST的图。条形图表示平均值和标准偏差。使用ANOVA和Dunnett多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01。

图11是示出了NTZ治疗预防肾损伤的图。条形图表示血浆肌酸酐、尿素和胱抑素C浓度的平均值和标准偏差。使用Student T检验和Welsh校正，*p<0.05，**p<0.01。

图12是示出了在用CCl4+LPS治疗的动物中NTZ极大降低ALT和AST水平的图。实验结果被表示为平均值±标准偏差并绘制成条形图。使用Student T检验对遵循正态分布的所有变量进行组间比较的检验(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。在组间差异不同的情况下应用Welsh检验(¤：p<0.05；¤¤：p<0.01；¤¤¤：p<0.001)。对所有样品中的血浆ALT和AST应用对数变换以获得正态数据分布。

图13是示出了在用CCl4+LPS治疗的动物中NTZ极大降低GGT水平的图。实验结果被表示为平均值±标准偏差并绘制成条形图。应用非参数Mann-Whitney检验($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)。

图14是示出了NTZ预防LPS诱导的肝功能改变的图，正如通过它降低总胆红素和恢复白蛋白生产的作用所示。实验结果被表示为平均值±标准偏差并绘制成条形图。在组间差异不同的情况下应用Welsh检验(¤：p<0.05；¤¤：p<0.01；¤¤¤：p<0.001)。应用非参数Mann-Whitney检验($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)。

图15是示出了NTZ预防LPS诱导的肾损伤的图，正如通过血浆肌酸酐、尿素和胱抑素C的减少所证实的。实验结果被表示为平均值±标准偏差并绘制成条形图。应用非参数Mann-Whitney检验($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)。

图16是示出了NTZ在ACLF模型中具有炎症效应的图，正如通过它降低LPS诱导的血清IFNγ水平的能力所证实的。实验结果被表示为平均值±标准偏差并绘制成条形图。使用Student T检验对遵循正态分布的所有变量进行组间比较的检验(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。

具体实施方式

需要本文提供的治疗的受试者是患有肝衰竭的患者。在特定实施方式中，所述受试者是患有选自ACLF、ALF和肝硬化、例如代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的患者。

或者，需要本文提供的治疗的受试者是具有选自ACLF、ALF和肝硬化、特别是代偿性或失代偿性肝硬化、更特别是失代偿性肝硬化的肝衰竭的风险的患者。特别地，所述受试者可以是由于慢性肝病而具有肝硬化失代偿或ACLF的风险的患者。

本文所使用的术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物，优选为人。

ACLF是通常在患有肝硬化的受试者中发生的多器官综合征，伴有至少一个器官衰竭，并且短期死亡率高。ACLF在慢性肝病患者中对附加的诱发因素做出响应而发生。

在特定实施方式中，所述受试者患有伴有肝硬化的慢性肝病，并具有发生ACLF的风险。

术语“慢性肝病”在本文中用于指称与慢性肝损伤相关的肝病，不论基础病因如何。慢性肝病可能由例如酗酒(酒精性肝炎)、病毒感染(例如甲型、乙型、丙型、戊型病毒性肝炎)或自身免疫过程(自身免疫性肝炎)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、癌症或长期暴露于肝脏的机械或化学损伤或癌症引起。肝脏的化学损伤可以由多种物质引起，例如毒素、酒精、四氯化碳、三氯乙烯、铁或药物。

在特定实施方式中，所述受试者患有伴有肝硬化的慢性肝病。在特定实施方式中，所述受试者患有在下述情形后发生的肝硬化：

-酗酒，

-病毒性肝炎(例如由甲型、乙型、丙型、丁型、戊型或庚型肝炎病毒感染引起的病毒性肝炎)，

-药物的使用，

-代谢性疾病，

-胆道疾病，

-原发性胆汁性胆管炎，

-原发性硬化性胆管炎，或

-NASH。

本发明特别适合于预防ACLF的复发或管理ACLF。

在特定实施方式中，所述患有肝硬化失代偿或ACLF的受试者显示出高MELD评分。本文所使用的术语“MELD评分”或“终末期肝病模型”是指一种用于评估肝功能障碍严重程度的评分系统。MELD使用患者的血清胆红素、血清肌酸酐和凝血酶原时间的国际比率(INR)值来预测存活率。它根据下述公式计算：

MELD＝3.78[Ln血清胆红素(mg/dL)]+11.2[Ln INR]+9.57[Ln血清肌酸酐(mg/dL)]+6.43，其中Ln表示自然对数。

胆红素是正常血红素分解代谢的黄色分解产物。胆红素通过胆汁和尿液排泄。大多数胆红素(70-90％)源自于血红蛋白降解，并在较小程度上源自于其他血红素蛋白。在血清中，胆红素通常作为直接胆红素和总胆红素两者进行测量。直接胆红素与结合胆红素相关，它包括结合胆红素和与白蛋白共价结合的胆红素。间接胆红素与非结合胆红素相关。血清胆红素水平可以通过本领域已知的任何适合方法来测量。用于测定血清胆红素的方法的说明性非限制性实例包括使用重氮试剂的方法、使用DPD的方法、使用胆红素氧化酶的方法或利用胆红素的直接分光光度法测定。简而言之，使用重氮试剂测定血清中胆红素水平的方法是基于通过添加磺胺酸和亚硝酸钠的混合物而形成充当指示物的偶氮胆红素。使用DPD测定血清胆红素的方法是基于下述事实，即胆红素与2,5-二氯苯重氮盐(DPD)在0.1mol/HCl中反应，形成在540-560nm处具有最大吸光度的偶氮胆红素。染色强度与胆红素浓度成正比。在去污剂(例如Triton TX-100)存在下反应的非结合胆红素被确定为总胆红素，而只有结合胆红素在不存在去污剂的情况下反应。使用胆红素氧化酶测定血清胆红素水平的方法基于胆红素氧化酶催化的反应，该酶将胆红素氧化成在405-460nm处具有最大吸光度胆绿素。胆红素的浓度与测得的吸光度成正比。总胆红素的浓度通过添加十二烷基硫酸钠(SDS)或胆酸钠来测定，所述添加引起非结合胆红素与白蛋白的分离和沉淀反应。血清胆红素水平也可以通过454nm和540nm处的直接分光光度法测定。使用这两个波长下的测量来减少血红蛋白的干扰。

本文所使用的术语“凝血酶原时间的国际比率”或“INR”是指一种用于确定血液凝结趋势的参数。INR是患者的凝血酶原时间与正常(对照)样品的比率，提高到所使用的分析系统的ISI值的幂。凝血酶原时间(PT)测量因子I(纤维蛋白原)、II(凝血酶原)、V、VII和X，并与活化的部分促凝血酶原激酶时间联合使用。凝血酶原时间是在添加组织因子后血浆凝结所花费的时间。这测量了外源性凝血途径。INR将凝血酶原时间的结果标准化，并通过下述公式计算：INR＝(PT_试验/PT_正常)<ISI>。

所述公式的ISI值是任何组织因子的国际敏感指数，它指示了特定批次的组织因子与国际参比组织因子的比较情况。ISI通常在1.0至2.0之间。

MELD评分值与短期死亡率密切相关，MELD评分值越低，死亡率越低，并且MELD评分值越高，死亡率越高。因此，具有低MELD评分例如低于9的MELD的患者具有约1.9％的3个月死亡率，而具有高MELD评分例如40或更高的MELD评分的患者具有约71.3％的3个月死亡率。

本文所使用的术语“高MELD评分”是指MELD评分高于9，例如至少10、至少15、至少19、至少20、至少25、至少29、至少30、至少35、至少39、至少40、至少45或更高的患者。在特定实施方式中，本发明应用于MELD评分高于20的受试者。

在另一个特定实施方式中，所述待治疗的患者显示出肾脏功能受损。本文所使用的术语“肾脏功能受损”，也被称为“肾功能受损”、“肾损伤(障碍)”、“肾功能不全”、“肾损伤”和“肾衰竭”，是指肾脏无法充分过滤血液中的废物的医学状况。肾衰竭主要由肾小球滤过率下降决定，肾小球滤过率是血液在肾脏肾小球中的过滤速率。在肾衰竭中，可能会出现体内流体增加(导致肿胀)、酸水平升高、钾水平升高、钙水平降低、磷酸盐水平升高以及在较晚阶段贫血等问题。

凭借WO2019053578中公开的聚合物泡囊及其使用方法，可以鉴定出可从本发明获益的患有肝衰竭伴HE的受试者。

本文所使用的术语“治疗”涉及治疗措施和预防或预防性措施两者，其中目标是阻止或减缓(减轻)不想要的生理变化或障碍。有益或所需的临床结果包括但不限于减轻症状、稳定病理状态(特别是不恶化)、减缓或停止疾病进展、改善或减轻病理。具体来说，出于本发明的目的，治疗旨在减缓肝损伤的进展并降低进一步并发症的风险。它还可能涉及与未接受治疗情况下的预期生存期相比延长生存期。

在本发明的情形中，将NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以治疗有效量给药到受试者。在特定实施方式中，给药NTZ或TZ或其药学上可接受的盐。在另一个实施方式中，所述受试者用NTZ或其药学上可接受的盐、特别是用NTZ给药。

“治疗有效量”是指对实现所需治疗效果有效的药物的量。药物的治疗有效量可以根据多种因素而变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在所述个体中引发所需反应的能力。治疗有效量也是药剂的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。药物的有效剂量和给药方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术的医生可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以比为了实现所需治疗效果而需要的水平更低的水平开始在药物组合物中使用的药物的剂量，并逐渐增加所述剂量直至实现所需效果。通常，本发明的组合物的适合剂量将是根据特定给药方案有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量通常取决于上文描述的因素。

NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐可以配制在药物组合物中，所述药物组合物进一步包含一种或几种药学上可接受的赋形剂或载体(例如盐水溶液、生理溶液、等渗溶液等)，它们与药物用途相容并且为本领域普通技术人员公知。

这些组合物也可以进一步包含选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的一种或几种试剂或载体。可用于这些制剂(液体和/或注射剂/或固体)的试剂或载体具体来说是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露糖醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶、脂质体等。

这些组合物可以以注射用悬液、糖浆、凝胶、油、软膏、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、凝胶帽、胶囊、气雾剂等的形式配制，最终利用确保长期和/或缓慢释放的盖伦剂型或装置。对于这类制剂来说，可以有利地使用诸如纤维素、碳酸盐或淀粉的试剂。

NTZ或TZ(G)可以采取药学上可接受的盐的形式，特别是与药学用途相容的酸或碱盐。NTZ和TZ(G)的盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的碱加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。这些盐可以在化合物的最终纯化步骤中或通过将所述盐并入到以前纯化的化合物中来获得。

NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐可以通过不同途径并以不同形式给药。例如，所述化合物可以通过全身方式、口服、肠胃外、吸入、鼻喷雾、鼻滴注或注射例如静脉内、肌肉内途径、皮下途径、透皮途径、局部途径、动脉内途径等给药。当然，给药途径将根据本领域技术人员公知的程序调整以适应于药物的形式。

在特定实施方式中，所述化合物被配制成片剂。在另一个特定实施方式中，所述化合物口服给药。

给药的频率和/或剂量可以由本领域普通技术人员根据患者、病理学、给药形式等进行调整。通常，NTZ或TZ(G)可以以0.01mg/天至4000mg/天，例如50mg/天至2000mg/天，例如100mg/天至2000mg/天，特别是100mg/天至1000mg/天之间的剂量给药。在特定实施方式中，所述NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以约1000mg/天、特别是1000mg/天的剂量给药。在特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以约1000mg/天、特别是1000mg/天的剂量口服给药，特别是作为片剂。如有必要，给药可以每天一次或甚至每天几次进行。在一个实施方式中，所述化合物每天至少给药一次，例如每天一次、每天两次或每天三次。在特定实施方式中，所述化合物每天给药一次或两次。具体来说，口服给药可以每天一次，在用餐期间例如在早餐、午餐或晚餐期间，通过服用含有剂量为约1000mg、特别是剂量为1000mg的所述化合物的片剂来进行。在另一个实施方式中，片剂每天口服给药两次，例如通过在一餐期间给药含有剂量为约400mg、约500mg或约600mg、特别是剂量为500mg的所述化合物的第一片剂，并在同一天的另一餐期间给药含有剂量为约500mg、特别是剂量为500mg的所述化合物的第二片剂。

在本发明的上下文中，应用于数值的术语“约”是指所述值+/-10％。为清楚起见，这意味着“约100”是指90-110范围内的值。此外，在本发明的上下文中，术语“约X”(其中X是数值)也具体地公开了所述X值，但也公开了如此定义的范围的较低和较高的值，更具体来说公开了所述X值。

适合情况下，使用NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐的治疗过程持续至少1周，特别是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24周或更长时间。在特定实施方式中，所述治疗过程持续至少1个月、至少2个月或至少3个月。在特定实施方式中，取决于所治疗的受试者的状况，所述治疗过程持续至少1年或更长时间。

在特定实施方式中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐(“药物”)用作本文公开的治疗或预防的唯一活性成分。

在又一个实施方式中，所述药物用于联合疗法。

在特定实施方式中，所述药物与针对诱发事件的疗法联合使用。

在特定实施方式中，所述药物与针对肝诱发条件或肝外诱发条件的疗法联合使用。

在特定实施方式中，所述诱发事件是细菌、真菌或病毒感染。因此，所述药物可以与抗微生物剂或抗病毒剂联用。正如本领域中公知的，将根据负责的生物体或病毒为本发明选择最适合的药剂。在特定实施方式中，所述诱发事件是乙型肝炎病毒的再激活。在这种情况下，所述药物可以与核苷或核苷类似物联用。说明性的抗病毒药物包括但不限于替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺和恩替卡韦。

在另一个特定实施方式中，所述诱发事件是急性静脉曲张出血。因此，所述药物可以与血管收缩剂例如特利加压素、生长抑素或类似物如奥曲肽或伐普肽、特别是奥曲肽联用。这种治疗可以伴随内视镜治疗(优选为内视镜下静脉曲张结扎术，在入院后不到12小时的诊断性内视镜下进行)。也可以进行短期抗生素预防，例如使用头孢曲松。

在另一个特定实施方式中，所述诱发事件是酒精性肝炎。因此，所述药物可以与适用于严重酒精性肝炎患者的泼尼松龙联用。

在另一个特定实施方式中，所述药物与支持性疗法联合使用。

在特定实施方式中，所述支持性疗法是心血管支持。例如，所述药物可以与急性肾损伤的治疗例如停用利尿剂或容量扩大(使用静脉内白蛋白)联用。所述药物也可以与血管收缩剂例如特利加压素或去甲肾上腺素联用，特别是在对容量扩大没有反应的情况下。

在特定实施方式中，所述支持性疗法是对脑病的治疗。例如，所述药物可以与乳果糖联用。任选地，乳果糖治疗可以通过给药灌肠剂以清除肠道来进一步完成。在受试者患有乳果糖难治性严重肝性脑病的情况下，可以使用白蛋白透析。在又一个特定实施方式中，所述药物可以与利福昔明联用。在另一个实施方式中，所述药物可以与乳糖醇联用。

在另一个实施方式中，所述药物与基于脂质体的毒素清除剂例如氨清除剂联合使用。具体来说，所述基于脂质体的毒素清除剂可以是基于脂质体的腹膜内流体，其具体来说可用于增强氨、特别是在失代偿性肝硬化期间积累的氨的清除。

具有远程负载能力的囊泡(例如脂质体)(例如跨膜pH梯度脂质体)的腹膜内给药已被描述为治疗药物过量和内源性代谢物中毒(例如高氨血症)的一种令人感兴趣的方法(Forster等，Sci Transl Med 2014；6:258ra141)。如上所述，高氨血症与HE有关。因此，将NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐与基于脂质体的毒素清除剂的这种腹膜内给药联用，在本发明的情形中可能是有利的。

具体来说，WO 2014/023421描述了用于患有内源性或外源性中毒性疾病、特别是高氨血症的患者的腹膜透析的脂质体囊泡，其中脂质体内的pH与腹膜腔中的pH不同，并且其中脂质体内的pH产生脂质体包封的带电荷毒素。脂质体制剂可以包括各种性质、组成、大小和特性的囊泡，包封各种不同组成、pH和渗透压强度的水性介质。在优选实施方式中，脂质体样囊泡由聚合物制成，并且不包含脂质，因此它们不被正式认为是脂质体，并且被称为聚合物泡囊。这些聚合物泡囊可以以使脂质体或脂质体样囊泡例如聚合物泡囊或类脂囊泡(niosome)在腹膜腔中具有生物可利用性的任何形式或模式给药。在给药步骤之后和/或同时可以添加从腹腔提取脂质体的步骤。在特定实施方式中，脂质体囊泡内的pH为1至6.5，并产生脂质体包封的带电荷毒素，其中脂质体双层包含天然或合成磷脂作为主要成分，并且其中脂质体囊泡的直径尺寸大于700nm。在另一个特定实施方式中，所述天然或合成磷脂是长饱和磷脂。在另一个特定实施方式中，所述天然或合成磷脂是具有超过12个碳原子的烷基链的长饱和磷脂。在又一个实施方式中，所述天然或合成磷脂是具有超过14个碳原子的烷基链的长饱和磷脂。在另一个特定实施方式中，所述天然或合成磷脂是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰基-SA7-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PMPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SPPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)](DMPG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)](DPPG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)](DSPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)](DOPG)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸(DMPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸(DPPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](DPPS)或来自于鸡蛋(EPC)或大豆(SPC)的L-a-磷脂酰胆碱。在又一个实施方式中，所述天然或合成磷脂是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)。在另一个实施方式中，所述脂质体双层还包含空间稳定剂，其中脂质体组合物中所述可以是PEG化脂质的空间稳定剂的浓度可以在0至30mol％之间变化。在另一个实施方案中，脂质体双层包含0.5至20mol％之间的PEG化脂质。在另一个实施方式中，所述PEG化的脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙酰胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。在又一个实施方式中，所述脂质体囊泡的直径尺寸大于800nm。在另一个实施方式中，所述脂质体囊泡的直径尺寸为700nm至10μm。在另一个实施方式中，所述脂质体囊泡内的pH为1.5至5，更优选为1.5至4。

这些脂质体囊泡可以按照WO 2014/023421和WO 2016/177741中公开的方法来生产。

WO 2018/033856描述了跨膜pH梯度聚合物泡囊和它们在清除氨及其甲基化类似物(例如三甲胺(TMA))中的用途。制备此类聚合物泡囊的方法也公开在WO 2018/033856中。NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐可以与作为基于脂质体的毒素清除剂的此类聚合物泡囊联用。在特定实施方式中，所述聚合物泡囊包含：(a)膜，其包含聚(苯乙烯)(PS)和聚(环氧乙烷)(PEO)的嵌段共聚物，其中PS/PEO的分子量比高于1.0且低于4.0；和(b)包封酸的核心。在又一个实施方式中，所述嵌段共聚物是二嵌段共聚物。在另一个实施方式中，所述酸的浓度在聚合物泡囊被水合时产生1至6之间的pH。在一个实施方式中，所述酸在酸性水溶液中。在又一个实施方式中，所述酸性水溶液内的pH在1至6之间，特别是2至5之间，或优选为2至4之间。在另一个实施方式中，所述酸是羟基酸，最优选为柠檬酸。在另一个实施方式中，所述聚合物泡囊通过包括将含有所述共聚物的有机溶剂与含有所述酸的水性相进行混合的方法来制备。在又一个实施方式中，所述有机溶剂与水不混溶或与水部分混溶。在一个实施方式中，所述聚合物泡囊的核心还包封氨或其甲基化类似物，所述甲基化类似物优选为TMA。在又一个实施方式中，所述聚合物泡囊在包含至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物中。在另一个实施方式中，所述组合物采取液体、半固体或固体形式。

在特定实施方式中，所述支持性疗法是体外肝脏支持。例如，可以使用并入肝细胞的体外肝脏辅助装置。在另一个实施方式中，除了给药本文提供的药物之外，还可以进行血浆交换。在又一个实施方式中，所述体外肝脏支持是白蛋白交换或内毒素去除。

下面的实施例用于说明本发明，而不应被视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：NTZ诱导参与氨解毒的谷氨酰胺合成酶的表达

临床前模型

在5-6周龄雄性C57Bl/6小鼠(Janvier Labs,France)中，通过将它们用增补有胆固醇(1％)的缺乏胆碱的L-氨基酸限定饮食(CDAA/c)(Ssniff,Germany)喂养12周，诱导了肝损伤(n＝12)。一些动物从第1天起并在整个研究期间接受增补有NTZ(Interchim,France)(100mg/kg/天)的CDAA/c饮食(n＝8)。接受增补有胆碱的L-氨基酸限定(CSAA)饮食的小鼠充当额外的对照(n＝6)。

所有动物程序均按照标准方案并根据实验室动物适当护理和使用的标准建议进行。

转录组分析

使用96RNA试剂盒(ref 740709.4,Macherey Nagel,France)从小鼠肝脏分离总RNA(n＝5)。在通过MultiskanTM GO分光光度计(Thermo Scientific,France)测量RNA样品的浓度后，使用来自于Agilent(USA)的2100Bioanalyser来评估质量。使用Illumina TruSeq标准mRNA LT试剂盒(Ref RS-122-2101,Illumina,USA)制备文库，并使用带有高输出流动池(ref FC-404-2002-/>500/550高输出试剂盒v2(150个循环)，Illumina,USA)的NextSeq 500装置(配对末端序列，2x75bp)对mRNA进行测序。

使用Trimmomatic v.0.36和下述参数对读出序列进行清理：SLIDINGWINDOW:5:20LEADING:30TRAILING:30MINLEN:60(Bolger等，Bioinformatics,2014)。然后使用hisat2v.2.1.0作为比对器并使用默认参数，使用rnacocktail将读出序列在基因组参考(小鼠GRCm38.90–GenBank组装物登记号GCA_000001635.2)上进行比对(Sahraeian等，Nature communications 2017)。

使用featureCounts v1.5.3和默认参数产生计数表(Liao Y等，Bioinformatics2014)。

为了鉴定差异表达的基因(DE基因)，我们使用了R(3.4.3版)和DESEq2文库(v.1.18.1)。使用AnnotationDbi文库(v.1.40.0)检索基因注释。简单来说，将通过FeatureCounts产生的计数矩阵用DESeqDataSetFromMatrix()函数，然后用来自于DESeq2文库的DEseq()函数进行分析。对于每种条件来说(即比较NTZ+CDAA/c与CDAA/c)，使用来自于DESeq2的results()函数检索倍数变化和p-值。

结果

用NTZ治疗的小鼠与仅接受CDAA/c饮食的小鼠的肝脏转录组之间差异表达的基因的分析显示，Glul的mRNA被显著差异表达(表1)。

表1：受NTZ暴露影响最显著的前10个基因

排名：将所有差异表达的基因按照它们的调整后p值进行排序

倍数变化：NTZ+CDAA/c相比于CDAA/c，进行log2变换

调整后p值：为多重检验调整的倍数变化的p值

Glul编码谷氨酰胺合成酶，其参与氨的肝脏解毒(Zhou等，NeurochemistryInternational 2020)，已知氨这种分子诱导肝细胞损伤和肝纤维化。Glul在小鼠肝脏中的基础表达水平非常高(平均105162个计数，表1)，并且与CSAA对照相比，CDAA/c饮食使其表达降低40％(调整后p＝7x10^-10)。NTZ通过在CDAA/c喂养的小鼠中以1.6倍诱导Glul，有力地恢复了Glul基础表达(调整后p＝2.6x10^-13)。

因此，这些数据显示，NTZ通过谷氨酰胺的产生刺激氨解毒，在预防肝细胞损伤方面发挥重要作用。

实施例2：NTZ保护肝细胞免于氨诱导的毒性

急性或慢性肝病患者通常由于氨代谢和解毒的改变而表现出高氨血症。这种氨的积累反过来诱导肝细胞损伤、疤痕组织形成(纤维化)，并加速疾病的进展。

为了评估NTZ对经历氨诱导的细胞应激的人肝细胞的影响，将人肝母细胞瘤衍生的HepG2细胞系(#85011430，ECACC，UK)在增补有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、1％丙酮酸钠、1％ L-谷氨酰胺和1％ MEM非必需氨基酸(Gibco,France)的高葡萄糖DMEM培养基中，在37℃下在5％ CO₂培养箱中培养。

为了评估细胞对氯化铵(NH₄Cl)的耐受性，将1x10⁵个细胞铺于96孔板中，所述板含有在相同的细胞培养基中剂量范围为0-5μM的NTZ。在细胞黏附(10小时)后，将细胞用PBS清洗，并在0、60或120mM NH₄Cl(Fluka,France)存在下在不含L-谷氨酰胺和FBS的DMEM中温育14小时。

细胞毒性使用CytoTox-Glow^TM测定法(#G9291,Promega,USA)测量。简单来说，每个孔添加100μL试剂，并将板在室温下在暗处温育15min。CytoTox-Glow^TM测定法是一种发光细胞毒性测定法，测量细胞群体中死细胞的相对数量。使用Spark微孔板读板器(#30086376,Tecan,USA)测量发光。发光的量(RLU)与经历细胞毒性应激的细胞的百分率直接相关。

结果概述在图1中。

在HepG2中，NH₄Cl在低和高NH₄Cl浓度下均诱导高死亡率(60mM和120mM时分别为18倍和23倍)。此外，在所述两种NH₄Cl浓度条件下NTZ以剂量依赖性方式降低死亡率(图1)。这些结果显示NTZ对肝细胞具有直接的保护作用。

实施例3：NTZ在肝硬化大鼠中改善肝功能

肝硬化的临床前模型

雄性Sprague Dawley大鼠(250-275g)(Janvier,France)每周两次接受硫代乙酰胺(TAA)(ref 163678,Sigma)的腹膜内注射，第一周期间剂量为150mg/kg，随后的11周期间剂量为200mg/kg，以诱导肝硬化(总诱导期为12周)。根据从舌下血液取样获得的平均血浆α-2巨球蛋白(纤维化的标志物)和血浆总胆红素(肝功能的标志物)，将大鼠分层到治疗组。然后，大鼠接受标准饮食(n＝12)或增补有30mg/kg/天的NTZ的饮食(n＝10)，干预期为4周。在16周期间接受NaCl腹膜内注射的大鼠充当额外的健康对照(n＝10)。

动物被成对笼养在环境受控的动物设施中，采用12:12小时的光-暗循环，并随意取用食物和水。每周两次监测体重和食物摄入量。

在治疗的最后一天，从舌下血液取样获得血浆样品，并在6h禁食期后将大鼠处死。迅速切下肝脏，用于生物化学和组织学分析。

所有动物程序均按照标准方案并根据实验室动物适当护理和使用的标准建议进行。

组织包埋和切片

首先将肝切片在4％福尔马林溶液(Merck Sigma,France)中固定12-24小时。然后，将肝碎块在乙醇溶液中脱水(70％和100％乙醇的连续浴)。将肝碎块在异丙醇中温育，然后在液体石蜡(60℃)中浸泡两次。然后将肝碎块置于支架(ref 11670990,Fisherscientific,USA)中，并用(ref F/00403,Microm,France)填充以完全覆盖组织。将含有组织碎块的石蜡块从支架上取下并在室温下储存。将肝块切成3μm的切片。

天狼猩红染色

将肝脏切片脱石蜡，重新水合，并在0.04％固绿溶液(Sigma,cat#F7258-25G)中温育15分钟。然后将肝脏切片在0.5％乙酸溶液中漂洗，并在0.1％天狼猩红(直接红，AlfaAesar,Germany,cat#B21693-25G和苦味酸溶液，Sigma,cat#P6744)-0.04％固绿溶液中温育30分钟。将切片脱水，并使用CV封片介质(Leica,US,cat#14046430011)封片。胶原蛋白比例面积通过天狼猩红阳性面积相对于肝脏切片面积的形态计量量化来评估。

组织学检查

使用来自于3D Histech(Hungary)的Pannoramic 250扫描仪生成虚拟载片。对于每只动物来说，在天狼猩红和固绿染色的切片上，在根据胶原蛋白储集物的定位和肝脏结构的病理模式将纤维化分为不同阶段的基础上评估纤维化评分，提供了相对严重程度和疾病进展的指示。F0：无纤维化，F1：窦周或门周纤维化。F2：窦周和门/门周纤维化。F3：桥接纤维化。F4：肝硬化。

血浆分析

使用Abcam试剂盒(cat#ab157730,UK)，通过ELISA测定α-2巨球蛋白的血浆浓度。在450nm处测量到的颜色的强度与初始步骤中结合的a2M的量成正比。然后从标准曲线推导出样品值。结果以ng/mL为单位表示。

总胆红素浓度使用用于Daytona plus自动化分析仪的Randox试剂盒(Randox,cat#BR 8377)来测量。简单来说，将胆红素在约pH 2.9下用钒酸盐氧化以产生胆绿素。在去污剂和钒酸盐存在下，结合和非结合胆红素两者均被氧化。这个氧化反应导致胆红素特有的黄色的光密度降低。450/546nm处光密度的降低与样品中的总胆红素浓度成正比。

白蛋白浓度使用用于Daytona plus自动化分析仪的Randox试剂盒(Randox,cat#AB 8301)来测量。简单来说，白蛋白的测量是基于它与指示剂3,3',5,5'-四溴-间甲酚磺酞(溴甲酚绿)的定量结合。白蛋白-BCG复合物在578nm处吸收最大。

结果

16周的TAA给药在大鼠中诱导肝硬化，正如所有动物中F4的组织学评分所显示的(图2)。

胆红素是血红素分解代谢的结果(主要来源于红细胞中的血红蛋白)。肝脏负责清除血液中的胆红素。高的血浆总胆红素是肝功能异常的标志。正如预期，TAA给药16周后血浆总胆红素升高。NTZ治疗急剧降低血浆总胆红素(图3)。

白蛋白在肝脏中合成。患有任何肝病，血浆白蛋白的下降都反映了合成功能的降低。正如预期，TAA给药16周后血浆白蛋白下降，但通过NTZ治疗得以挽救(图4)。

有趣的是，这些对肝功能有益的效果与纤维化无关，因为这种使用NTZ的4周的干预治疗时间太短而无法观察到对肝纤维化的显著影响(使用NTZ时胶原蛋白比例面积为7.53±0.64％，相比于TAA对照组为7.74±0.38％，p＝0.77)。多变量分析证实了NTZ的独立作用，一方面是对肝功能(胆红素或白蛋白)，另一方面是对纤维化。

总而言之，这些结果显示在患有肝硬化的动物中NTZ对肝脏解毒和合成功能具有保护作用，而不依赖于它的抗纤维化作用。

实施例4：在慢加急性肝衰竭(ACLF)模型中NTZ预防失代偿

ACLF的临床前模型

雄性Sprague Dawley大鼠(175-200g)(Janvier Labs,France)每周3次接受硫代乙酰胺(TAA)的腹膜内注射，第一周期间剂量为150mg/kg，随后的14周期间剂量为200mg/kg，以诱导肝硬化。根据从舌下血液取样获得的纤维化标志物(α-2巨球蛋白和金属肽酶抑制剂1(TIMP1))和肝功能测试(血浆总胆汁酸和白蛋白)的平均血浆水平，将大鼠分层到治疗组(每组n＝5)。

动物被成对笼养在环境受控的动物设施中，采用12:12小时的光-暗循环，并随意取用食物和水。每周两次监测体重和食物摄入量。

在诱导肝硬化后，在停止TAA给药后一周，大鼠接受0.05mg/kg脂多糖(来自于大肠埃希氏杆菌O111:B4的LPS，Sigma-Aldrich)的单次腹膜内注射，以诱导ACLF。大鼠通过口饲管接受剂量为50mg/kg/天BID的NTZ或载体共3天，然后在诱导ACLF之前30分钟最后一次给药(图5)。血浆在即将处死之前从舌下血液取样获得。

所有动物程序均按照标准方案并根据实验室动物适当护理和使用的标准建议进行。

血浆分析

如实施例3中所述，α-2巨球蛋白的血浆浓度使用Abcam试剂盒(cat#ab157730)通过ELISA来测定，并且白蛋白的血浆浓度使用用于Daytona plus自动化分析仪的Randox试剂盒(Randox,cat#AB 8301)来测量。

总胆汁酸的浓度使用用于Daytona plus自动化分析仪的适合的Randox试剂盒(Randox,cat#BI 3863)来测量。在Thio-NAD存在下，3-α-羟基甾醇脱氢酶(3-a HSD)将胆汁酸转变成3-酮基甾醇和Thio-NADH。所述反应是可逆的，并且3-a HSD可以将3-酮基甾醇和Thio-NADH转变成胆汁酸和Thio-NAD。在过量NADH存在下，酶循环高效进行，并且通过测量405nm处吸光度的特定变化来确定Thio-NADH的形成速率。

血浆TIMP-1水平使用来自于R&D Systems(cat#RTM100)的定量夹心ELISA测定法来测量。然后从标准曲线计算样品值。

结果

在肝硬化大鼠中LPS的给药在24小时内诱导肝衰竭和死亡。在这个实验中，NTZ治疗将死亡时间延迟1小时，并允许5只大鼠中的1只存活，而载体组中的所有动物均在8小时内死亡(图6)。此外，NTZ降低循环胆汁酸水平，表明肝功能得以改善(图7)。因此，这些结果显示，在肝衰竭模型中NTZ的短期治疗改善肝功能并提供保护以免于失代偿。

实施例5：在胆管结扎和LPS注射诱导的ACLF啮齿动物模型中NTZ改善脑水肿

慢加急性肝衰竭的特征除了肝脏急性失代偿之外，还在于器官退化。本研究调查了在通过胆管结扎(BDL)(在3周内诱导肝损伤和晚期纤维化)和脂多糖(LPS)给药诱导的ACLF大鼠模型中NTZ对脑水肿的影响。

正如Kountouras等人(British journal of Experimental Pathology1984)所述，经历BDL的大鼠在手术后22天具有严重肝损伤并伴有晚期纤维化和胆管增生。

在Charles River实验室(France)，对37只体重约为270g的Sprague Dawley大鼠进行BDL手术。在用异氟烷(Vetflurane,Alcyon,France)麻醉并皮肤施用2％利多卡因(Alcyon)后，进行中线剖腹手术，以暴露出肝脏和十二指肠。鉴定主胆管并进行解剖。然后，在两个部位对胆管进行结扎：第一个结扎在胆管中部，第二个结扎位于胰管入口上方。然后从中间切开胆管，以避免再通。

动物在手术前用0.05mg/kg丁丙诺啡(Buprecore，Alcyon)和5mg/kg卡洛芬(Carprofelican，Alcyon)进行预处理，并在手术后4小时接受剂量为0.05mg/kg的丁丙诺芬，然后在手术后24和48小时接受剂量为5mg/kg的卡洛芬。

在手术后至少恢复5天，然后将动物转移到Genfit的动物设施(France)。手术后15天，在轻度异氟烷(Isoflurin,Axience,France)麻醉下从舌下静脉采集血样，测量肝损伤的标志物(血清天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP))，以将动物分层为治疗组。在此阶段两只BDL大鼠由于血液参数异常而被排除在外，4只大鼠死亡或因伦理原因被杀死(预计BDL手术的早期死亡率为10-20％)。未手术动物作为健康对照纳入本研究。

BDL手术后22天，通过腹膜内给药1μg/kg LPS(大肠埃希氏杆菌O111:B4，Sigma-Aldrich,Germany)诱导急性失代偿。4只具有BDL的大鼠接受磷酸盐缓冲盐水(PBS，FisherScientific,USA)代替LPS，以用作BDL对照。在LPS注射后持续观察每只动物，以便评估炎症反应和疼痛的严重程度。在这些大鼠中注射LPS诱导了高度炎症反应，可以通过耳朵颜色变为红色清楚地看到。

在即将LPS注射之前，通过管饲给予NTZ 100mg/kg(Interchim,France)或载体(1％羧甲基纤维素(C4888,Sigma-Aldrich)、0.1％吐温80(P8074,Sigma-Aldrich))治疗。

在LPS注射后3小时，如前所述在轻度麻醉下从舌下静脉进行血液取样，并通过颈椎脱位对动物实施安乐死。采集肝脏、脾脏、肾脏和大脑。

动物操作小心地进行，以将应激降至最低。所有实验均遵照法国农业部关于实验动物实验的指导方针(第87-848号法律)进行。本研究遵照《动物健康条例》(Animal HealthRegulation)(2010年9月22日第2010/63/UE号理事会指令和2013年2月1日关于动物保护的第2013-118号法国法令)进行。

为了评估脑水肿，将新鲜的脑称重，通过加热脱水4小时并再次称重，以计算水的百分率。

结果

肝损伤与脑水肿的显著增加有关，正如通过脑中含有的水的％所评估的(图8)。伴随着LPS注射的NTZ给药显著减少脑水。因此，这个实验证实了NTZ可用于治疗或预防脑水肿。

实施例6：在胆管结扎和LPS注射诱导的ACLF啮齿动物模型中NTZ改善肾功能

本研究调查了在通过胆管结扎(BDL)(在3周内诱导肝损伤和晚期纤维化)和脂多糖(LPS)给药诱导的ACLF大鼠模型中NTZ对肾功能标志物的影响。

材料和方法

大鼠的BDL手术和急性失代偿如前一个实施例中所述来进行。

肾损伤通过经ELISA(小鼠/大鼠胱抑素C免疫沉淀ELISA，MSCTC0,R&D Systems)测定的血清胱抑素C浓度来评估。

结果

LPS注射诱导肾脏改变，正如通过血清胱抑素C水平提高所显示的(图9)。NTZ治疗急剧降低胱抑素C，几乎达到健康对照的水平。总而言之，这些结果证实了NTZ在ACLF中改善外周器官(特别是脑和肾脏)损伤的效力。

实施例7：在对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭中NTZ减轻肝损伤

在小鼠中通过给药有毒剂量的对乙酰氨基酚(APAP)诱导急性肝衰竭。在5天的适应期后，将8周龄的C57BL/6J雄性小鼠(Janvier,France)根据体重分为3组，每组10只小鼠。将所有小鼠禁食过夜，然后通过腹膜内注射给药300mg/kg APAP。在APAP中毒前30分钟，小鼠通过胃内饲管接受载体(1％羧甲基纤维素(C4888,Sigma-Aldrich)、0.1％吐温80(P8074,Sigma-Aldrich))、50mg/kg NTZ(Interchim,France)或1200mg/kg N-乙酰半胱氨酸(NAC)(作为APAP中毒的参考治疗)。在APAP注射后，小鼠可以随意取用食物和水。

在APAP注射后6小时，在麻醉下通过眶后窦穿刺法采集所有小鼠的血液在肝素上。肝损伤通过使用Horiba Pentra 400机器和相关的Pentra测定试剂盒(Horiba FranceSAS，France)测定的血浆天冬氨酸转氨酶(AST)进行评估。在APAP给药后24小时通过颈椎脱位处死动物，用生理盐水放血，收集肝脏样品并称重。

动物操作小心地进行，以将应激降至最低。所有实验均遵照法国农业部关于实验动物实验的指导方针(第87-848号法律)进行。本研究遵照《动物健康条例》(Animal HealthRegulation)(2010年9月22日第2010/63/UE号理事会指令和2013年2月1日关于动物保护的第2013-118号法国法令)进行。

结果

结果显示，APAP中毒引起血浆AST急剧提高(>6000U/l，相比于健康小鼠中<100U/l)。令人吃惊的是，NTZ治疗极大降低AST，达到与使用NAC这种APAP中毒的参考治疗相近的水平(图10)。这些结果显示了NTZ治疗药物诱导的急性肝衰竭(ALF)患者的能力。

实施例8：NTZ改善肾功能标志物

肝硬化失代偿通常与肾功能的改变相关。本研究调查了NTZ在慢加急性肝衰竭(ACLF)模型中预防肾损伤的效果。简而言之，在具有通过反复给药四氯化碳(CCl₄)15周诱导的晚期肝纤维化/肝硬化的大鼠中，通过脂多糖(LPS)注射诱导ACLF。

方案研究包括4个阶段：

1)预敏化阶段：向32只4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(～200gr，Janvier Lab)的饮用水添加苯巴比妥(P5178，Sigma Aldrich)(35g/dl)，持续2周，以便激活代谢CCl₄的细胞色素酶。

2)肝纤维化的诱导：通过反复(每周两次)口服CCl₄(ref：289116，Sigma Aldrich；在橄榄油中稀释)给药(剂量从0.10ml/kg开始增加，每次给药时增加0.05-0.10ml/kg，以在7周时或之后达到0.85ml/kg)至多15周来诱导慢性肝损伤，最终剂量如下：

第1周 0.10ml/kg

0.20ml/Kg

第2周 0.25ml/Kg

0.30ml/Kg

第3周 0.35ml/Kg

0.40ml/Kg

第4周 0.45ml/Kg

0.50ml/Kg

第5周 0.60ml/Kg

0.70ml/Kg

第6周 0.80ml/Kg

0.85ml/Kg

第7周和之后0.85ml/kg

3)治疗阶段：在CCl₄给药15周后，在LPS给药前一周停止CCl₄管饲。在LPS激惹前3天期间口服给药载体(1％羧甲基纤维素(C4888,Sigma-Aldrich)、0.1％吐温80(P8074,Sigma-Aldrich))或NTZ(50mg/kg BID)。最后一剂(50mg/kg)载体或NTZ在即将LPS激惹前30分钟给药。

4)LPS激惹：将来自于大肠埃希氏杆菌O111:B4的LPS(L2630，Sigma Aldrich)以0.03mg/kg的剂量腹膜内注射。

在LPS给药后的最初几个小时内持续观察每只动物，以评估炎症反应和疼痛的严重程度。监测动物的外观(皮毛、皮肤颜色的变化)、活动程度和警惕性(对刺激的反应、眼睑张开、活动……)、步态和姿势。显示出明显痛苦迹象和濒临死亡的任何动物均被实施安乐死。在NTZ和载体两个组中，10只动物中有6只在LPS注射后存活。在LPS激惹后24小时对所有存活的动物实施安乐死，以进行血浆和组织分析。所有动物程序均按照标准方案并根据实验室动物适当护理和使用的标准建议进行。

肾损伤通过血浆肌酸酐、尿素和胱抑素C浓度进行评估。使用用于Daytona plus自动化分析仪(Randox，cat#BR 8377)的适合的Randox试剂盒(分别为CR 8316、UR 8334)，按照制造商的说明测量血浆肌酸酐和尿素浓度。血浆胱抑素C浓度通过ELISA(小鼠/大鼠胱抑素C免疫测定ELISA，MSCTC0，R&D Systems)测定。

结果显示，在CCl₄给药15周后注射LPS使肾功能恶化，正如血浆肌酸酐、尿素和胱抑素C浓度提高所显示的(图11)。通过将肌酸酐、尿素和胱抑素C水平恢复到橄榄油对照的水平，NTZ治疗显著预防肾损伤。

实施例9：在大鼠中NTZ对CCl₄+LPS诱导的慢加急性肝衰竭的功效的评估

本研究的目的是在具有CCl₄诱导的严重纤维化的大鼠中评估NTZ预防LPS诱导的肝和肾损伤的功效。

本研究包括4个阶段：

1)预敏化阶段：在CCl₄给药之前，向4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(～200g)的饮用水添加苯巴比妥(35g/dL)(ref P5178-25G，Sigma-Aldrich)，持续2周。

2)诱导阶段：使用与实施例8中描述的方案相同的方案，通过反复口服四氯化碳(CCl₄)给药(每周两次，剂量从0.10提高到0.85ml/kg，每周两次)共10或15周，来诱导严重肝纤维化。

3)治疗阶段：在15周CCl₄给药后，在LPS给药前一周停止管饲。在ACLF诱导之前的3天内口服给药载体或NTZ(50mg/kg，每天两次(BID))。最后一剂(50mg/kg)在即将ACLF诱导之前30分钟给药。

4)ACLF诱导：LPS以0.03mg/kg的剂量i.p.给药。

对于经口管饲来说，将NTZ粉剂(ref RQ550，Interchim)以10mg/mL的浓度溶解在琥珀色玻璃瓶中的1％ CMC(羧甲基纤维素钠，ref C48 88-500G，Sigma Aldrich)、0.1％吐温80的水溶液中，使用polytron均化，并以10％的功率超声处理10秒。在以10mL/kg向大鼠给药之前将NTZ保持在磁力搅拌下并避光。

LPS溶液(大肠埃希氏杆菌O111:B4，Sigma-Aldrich,Germany)在微生物安全柜下制备，并以15μg/mL的浓度溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，等分并冷冻直至实验当天。LPS以2mL/kg的剂量向大鼠给药。

38只雄性Sprague-Dawley大鼠(Janvier Labs,France)被分派到本研究中。在整个研究过程中，动物可随意取用水和饲料(ref E15000-04,Ssniff,Germany)。在CCl₄给药9周后，根据氨和白蛋白的血浆水平将动物随机分派到2个组(以便在两个组中具有相近的平均值)。

在LPS注射后24小时对所有存活的动物实施安乐死，以进行血浆和组织分析(在载体和NTZ两个组中存活60％)。在研究结束时，通过肝和肾损伤或功能生物标志物的生物化学分析来评估ACLF。

所有动物程序均按照标准方案并根据欧洲指令2010/63UE按照实验室动物适当护理和使用的标准建议进行。

在整个研究过程中，每周两次监测体重和食物摄入量。

在纤维化诱导阶段，每只动物每天观察一次以监测临床体征。观察包括皮肤、皮毛、眼睛、分泌物和排泄物的出现以及自主神经活动(流泪、竖毛、异常呼吸模式)的变化。也监测步态、姿势、刻板印象(例如过度梳理、重复绕圈)或怪异行为(自残、倒着走……)的变化。在连续3天以上体重下降超过25％、不进食、总体状况恶化或发声的情况下，对动物实施安乐死。

在LPS给药后，在7小时内连续观察每只动物，以评估炎症反应和疼痛的严重程度。对评分表进行评估，所述评分表考虑了动物的外表(皮毛、皮肤颜色的变化)、活动程度和警惕性(对刺激的反应、眼睑张开、活动……)、步态和姿势。在动物的总体状况恶化(摸起来冷、无法站立、发声、呼吸困难)的情况下，对动物实施安乐死。

在研究结束时，在轻度异氟醚麻醉下通过舌下静脉穿刺采集血液，并将其转移到乙二胺四乙酸(EDTA)、血清凝胶和肝素锂的管中。将含有血液的EDTA和肝素锂管快速离心，并收集血浆级分。将肝素锂的血浆等分试样在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下，将EDTA血浆等分试样储存在-20℃下，将血清凝胶管在室温下保持30分钟，离心并储存在-20℃下。

然后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死，并将其斩首进行脑部切除和称重。收集肝脏、脾脏和右肾并称重。将肝脏切片固定并包埋在石蜡中，用于组织学分析。将剩余的肝脏在液氮中快速冷冻并保持在-80℃下，用于生物化学分析。

组织学样品加工和分析：

首先将肝切片在4％福尔马林溶液(Merck Sigma)中固定10小时或24小时(周末方案)。然后，将肝碎块在乙醇溶液中脱水(70％和100％乙醇浴)。将肝碎块在两个异丙醇浴、然后是两个液体石蜡浴中温育(60℃)。这些步骤在LOGOS One(Milestone,MicromMicrotech)上进行。然后将肝碎块放入支架(Fisher scientific,ref 11670990)中，用(Microm,ref F/00403)轻柔填充以完全覆盖组织。将含有组织碎块的石蜡块从支架上取下并在室温下储存。在电子旋转显微切片机HM340E(ThermoScientific,MicromMicrotech)上将肝块切成3μm的切片。

在Autostainer ST5030(Leica)上进行天狼猩红-固绿染色。将肝脏切片脱石蜡，重新水化，并在0.04％固绿溶液(Sigma,cat#F7258-25G)中温育15分钟。然后将肝脏切片在0.5％乙酸溶液中漂洗，并在0.1％天狼猩红(直接红，Alfa Aesar，cat#B21693-25G和苦味酸溶液，Sigma,cat#P6744)-0.04％固绿溶液中温育30分钟。将切片脱水，并使用CV封片剂(Leica,cat#14046430011)在自动盖片机CV5030(Leica)上封片。在不知情情况下对治疗组进行组织学检查和评分。图像使用Pannoramic 250Flash II数字载片扫描仪(3DHistech)采集，并在QuantCenter软件中进行分析。

值得注意的是，只有在LPS后存活24h的动物(60％)可以进行分析。

实验结果被表示成平均值±标准偏差，并绘制成条形图。对于所有遵循正态分布的变量来说，组间比较使用Student T检验进行检验(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。在组间差异不同的情况下应用Welsh检验(¤：p<0.05；¤¤：p<0.01；¤¤¤：p<0.001)。对所有样品中的血浆ALT和AST应用对数变换以获得正态数据分布。对于其他非正态分布的变量来说，应用非参数Mann-Whitney检验($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)。如果未另行规定，则显示的是与第10周(W10)对照组的差异。

结果

在大多数动物中，重复的CCl₄给药诱导了以F3评分为特征的严重肝纤维化。

在载体和NTZ治疗组两者中LPS诱导的ACLF导致40％的显著的24小时内死亡率(两个组均为4/10大鼠)。在LPS后24小时存活的动物中评估了肝和肾损伤和功能标志物。血浆ALT和AST水平(肝细胞损伤的标志物)被CCl₄显著提高，而NTZ治疗使ALT大大降低80％(p＝0.007)并使AST大大降低87％(p＝0.005)(图14)。肝损伤的另一个标志物血浆GGT不被CCl₄给药改变(未检测到)，而LPS注射将血浆GGT水平提高到11.2U/l(图15)。NTZ治疗减弱了这种LPS诱导的GGT升高(<6.15U/l)。

CCl₄和LPS给药也改变肝功能的标志物血浆总胆红素和白蛋白(图16)。NTZ治疗预防LPS诱导的肝功能改变，正如总胆红素减少80％(p＝0.02)和白蛋白生产恢复95％(p＝0.04)所显示的。

LPS注射液改变肾功能，正如升高的血浆肌酸酐、尿素和胱抑素C浓度所显示的(图17)，证实了在这种ACLF模型中肝脏之外的器官受到影响。NTZ治疗还通过降低血浆肌酸酐(-102％，p＝0.009)、尿素(-92％，p＝0.002)和胱抑素C(-166％，p＝0.02)来预防LPS诱导的肾损伤。

在接受CCl₄ 15周和LPS的动物中测量了血清IFNγ，而其他细胞因子(IL6、TNFα、IL1β)不能被检测到(未示出)。NTZ治疗使血清IFNγ显著降低56％(p＝0.04)，这证实了它在ACLF模型中的抗炎作用(图18)。

结论

在具有严重纤维化(F3/F4)的大鼠中，用100mg/kg/天的NTZ预先治疗3天减轻肝损伤(ALT、AST、GGT)，并预防LPS诱导的肝(总胆红素、白蛋白)和肾(肌酸酐、尿素、胱抑素C)功能的改变。

Claims (28)

1.一种化合物，其选自硝唑尼特(NTZ)、替唑尼特(TZ)、替唑尼特葡萄糖苷酸(TZG)及其药学上可接受的盐，用于在有需要的受试者中治疗或预防选自慢加急性肝衰竭(ACLF)和急性肝衰竭(ALF)的肝衰竭的方法中。

2.根据权利要求1所述的用途的化合物，其用于治疗或预防ACLF的方法中。

3.根据权利要求1或2所述的用途的化合物，其用于治疗ACLF的方法中。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的用途的化合物，其用于在患有ACLF的受试者中预防从代偿性肝硬化进展为失代偿性肝硬化的方法中。

5.根据权利要求1所述的用途的化合物，其中所述受试者患有ACLF和代偿性肝硬化。

6.根据权利要求1所述的用途的化合物，其中所述受试者患有ACLF和失代偿性肝硬化。

7.根据权利要求1所述的用途的化合物，其用于在患有ACLF的受试者中将失代偿性肝硬化逆转为代偿性肝硬化的方法中。

8.根据权利要求1至7中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者患有2或3级ACLF。

9.根据权利要求1至8中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者具有至少一种ACLF诱发事件。

10.根据权利要求9所述的用途的化合物，其中所述诱发事件选自酒精性肝炎，细菌、真菌或病毒感染，脓毒症，中毒，内脏出血和药物诱导的肝功能不全。

11.根据权利要求1至8中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者患有由肝诱发条件或肝外诱发条件引起的ACLF。

12.根据权利要求1至11中的任一项所述的用途的化合物，其用于在患有ACLF的受试者中预防肝失代偿的方法中。

13.根据权利要求1所述的用途的化合物，其用于治疗或预防ALF的方法中。

14.根据权利要求13所述的用途的化合物，其用于治疗或预防药物诱导的ALF的方法中。

15.根据权利要求14所述的用途的化合物，其用于治疗或预防对乙酰氨基酚诱导的ALF的方法中。

16.一种化合物，其选自硝唑尼特(NTZ)、TZ(G)及其药学上可接受的盐，用于在患有肝硬化的受试者中预防肝外器官衰竭的方法中。

17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述受试者患有代偿性或失代偿性肝硬化。

18.根据权利要求16或17所述的化合物，其中所述受试者患有失代偿性肝硬化。

19.根据权利要求16至18中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者患有酒精性肝硬化。

20.根据权利要求16至19中的任一项所述的用途的化合物，其中所述方法用于预防肾衰竭。

21.根据权利要求16至20中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者患有无肾衰竭的ACLF。

22.根据权利要求16至20中的任一项所述的用途的化合物，其中所述受试者患有伴有非肾器官衰竭和肾功能障碍的ACLF。

23.根据权利要求1至22中的任一项所述的用途的化合物，其用于进一步预防肝性脑病。

24.根据权利要求1至23中的任一项所述的用途的化合物，其用于进一步治疗或预防脑水肿。

25.根据权利要求1至24中的任一项所述的用途的化合物，其用于进一步预防脑水肿。

26.根据权利要求1至25中的任一项所述的用途的化合物，其与基于脂质体的毒素清除剂联合使用。

27.根据权利要求26所述的用途的化合物，其中所述基于脂质体的毒素清除剂是铵清除剂。

28.根据权利要求26或27所述的用途的化合物，其中所述基于脂质体的毒素清除剂用于递送到腹膜中。