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CN116490605A - 以低免疫性细胞治疗敏感性患者的方法以及相关方法和组合物 - Google Patents

以低免疫性细胞治疗敏感性患者的方法以及相关方法和组合物 Download PDF

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CN116490605A
CN116490605A CN202180067169.7A CN202180067169A CN116490605A CN 116490605 A CN116490605 A CN 116490605A CN 202180067169 A CN202180067169 A CN 202180067169A CN 116490605 A CN116490605 A CN 116490605A
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CN
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CN202180067169.7A
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Inventor
S·施雷普费尔
S·哈尔
C·E·玛丽
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Sana Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Sana Biotechnology Co ltd
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Abstract

本文公开为用于施用到敏感性患者的低免疫性细胞。在一些例子中，患者因先前怀孕或先前移植物而敏感。在一些实施方案中，细胞外源性表达CD47蛋白质并且呈现降低表达的MHC I类蛋白质、MHC II类蛋白质或二者。

Description

以低免疫性细胞治疗敏感性患者的方法以及相关方法和组 合物
相关申请的交叉引用
本申请要求35U.S.C.§119(e)下2020年8月13日申请的美国临时申请第63/065,342号；2021年1月11日申请的第63/136,137号；2021年2月19日申请的第63/151,628号；以及2021年4月14日申请的第63/175,030号的优先权，其公开整体以引用方式并入本文。
背景技术
对抗原(例如，供体同种异体抗原)过敏是临床移植疗法面临的问题。例如，移植物接受者的免疫系统排斥同种异体材料的倾向大大降低治疗的潜在功效，并减少围绕此类治疗可能的正面影响。幸运的是，动物模型和人患者都有实质证据表明低免疫性细胞或组织移植是治疗多种失调和病症的科学上可行且临床上有前景的方法。
因此，仍然需要用于产生避免被接受者的免疫系统检测的细胞为主的疗法的新途径、组合物和方法。
对抗原(例如，供体同种异体抗原)过敏是临床移植疗法面临的问题。例如，移植物接受者的免疫系统排斥同种异体材料的倾向大大降低治疗的潜在功效，并减少围绕此类治疗可能的正面影响。幸运的是，动物模型和人患者都有实质证据表明低免疫性细胞或组织移植是治疗多种失调和病症的科学上可行且临床上有前景的方法。
因此，仍然需要用于产生避免被接受者的免疫系统检测的细胞为主的疗法的新途径、组合物和方法。
发明内容
在一些方面中，提供治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群低免疫性细胞，其中，低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：患者为敏感性患者，其中，患者：(i)对一种或多种同种异体抗原敏感；(ii)对一种或多种自体抗原敏感；(iii)因先前移植物而敏感；(iv)因先前怀孕而敏感；(v)因病症或疾病接受先前治疗；和/或(vi)为组织或器官移植患者，并且在施用组织或器官移植之前、同时和/或之后，施用低免疫性细胞。
在一些方面中，提供治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群胰脏胰岛细胞，其中，胰脏胰岛细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者，其中，患者：(i)对一种或多种同种异体抗原敏感；(ii)对一种或多种自体抗原敏感；(iii)因先前移植物而敏感；(iv)因先前怀孕而敏感；(v)因病症或疾病接受先前治疗；和/或(vi)为组织或器官患者，并且在施用组织或器官移植物之前，施用胰脏胰岛细胞。
在一些方面中，提供治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群心脏祖细胞，其中，心脏祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者，其中，患者：(i)对一种或多种同种异体抗原敏感；(ii)对一种或多种自体抗原敏感；(iii)因先前移植物而敏感；(iv)因先前怀孕而敏感；(v)因病症或疾病接受先前治疗；和/或(vi)为组织或器官患者，并且在施用组织或器官移植物之前，施用心脏肌肉细胞。
在一些方面中，提供治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群神经胶质祖细胞，其中，神经胶质祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHCI类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者，其中，患者：(i)对一种或多种同种异体抗原敏感；(ii)对一种或多种自体抗原敏感；(iii)因先前移植物而敏感；(iv)因先前怀孕而敏感；(v)因病症或疾病接受先前治疗；和/或(vi)为组织或器官患者，并且在施用组织或器官移植物之前，施用神经胶质祖细胞。
在一些实施方案中，患者为敏感性患者，并且其中，患者呈现对抗一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原的记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：(a)先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，先前移植物为同种异体移植物；或(b)先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，先前移植物为自体移植物。
在一些实施方案中，患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用(alloimmunizatio n)，视需要地，其中，在怀孕的同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
在一些实施方案中，患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者，其中，病症或疾病与正在按照本文所述治疗的患者的病症或疾病不同或相同。
在一些实施方案中，患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：(a)施用所述群细胞以治疗先前治疗的相同病症或疾病；(b)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；(c)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；(d)先前治疗为治疗有效；(e)先前治疗为治疗无效；(f)患者对先前治疗发展出免疫反应；和/或(g)施用所述群细胞以治疗与先前治疗不同的病症或疾病。
在一些实施方案中，先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应自杀基因或安全开关系统的活化，发生免疫反应。
在一些实施方案中，先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
在一些实施方案中，先前治疗包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法，其中，自体CAR-T细胞为主的疗法选自下列所组成的组：布卡巴吉奥仑赛(brexucabtagene autoleuc el)、西卡思罗(axicabtagene ciloleucel)、艾卡巴吉维赛(idecabtagene vicleucel)、利基迈仑赛马拉赛(lisocabtagene maraleucel)、替沙津鲁(tis agenlecleucel)、来自Cartesian Therapeutics的Descartes-08或Descart es-11、来自Novartis的CTL110、来自Poseida Therapeutics的P-BM CA-101、来自AutolusLimited的AUTO4、来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B或PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819和来自Clyad Oncology的CYAD-211。
在一些实施方案中，患者患有过敏症，视需要地，其中，过敏症为选自下列所组成的组的过敏症枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
在一些实施方案中，细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD142。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD46。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD59。
在一些实施方案中，细胞自干细胞分化。在一些实施方案中，干细胞为间质干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK细胞和CAR-NK细胞。在一些实施方案中，细胞源自原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞是原代T细胞、原代β细胞或原代视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。
在一些实施方案中，CAR为CD19-特异性CAR，使得细胞为CD19 CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR为CD22-特异性CAR，使得细胞为CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为相同。在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为不同。在一些实施方案中，细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第三基因组基因座相同于第一或第二基因组基因座。在一些实施方案中，第三基因组基因座不同于第一和/或第二基因组基因座。
在一些实施方案中，安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因、ROSA26基因基因座和CLYBL基因基因座。在一些实施方案中，目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
在一些实施方案中，至CCR5基因基因座的插入为在CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。在一些实施方案中，至PPP1R12C基因基因座的插入为PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。在一些实施方案中，至CLYBL基因基因座的插入为CLYBL基因的内含子2。在一些实施方案中，至ROSA26基因基因座的插入为ROSA26基因的内含子1。在一些实施方案中，至安全港基因座的插入为SHS231基因座。在一些实施方案中，至CD142基因基因座的插入为在CD142基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至MICA基因基因座的插入为在MICA基因的CDS。在一些实施方案中，至MICB基因基因座的插入为在MICB基因的CDS。在一些实施方案中，至B2M基因基因座的插入为在B2M基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至CIITA基因基因座的插入为在CIITA基因的外显子3或另一CDS。在一些实施方案中，至TRAC基因基因座的插入为在TRAC基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至TRB基因基因座的插入为在TRB基因的CDS。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的下述的一者或多者：内源性T细胞受体；细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；程序性细胞死亡(PD1)；以及程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的TRAC。
在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：内源性T细胞受体；细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；程序性细胞死亡(PD1)；以及程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG和/或EF1a启动子。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1天或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1天或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少一周或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少一周或更久。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1个月或更久，在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞后，患者呈现无免疫反应。在一些实施方案中，在施用所述群细胞后的无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
在一些实施方案中，患者呈现下述的一者或多者：(a)在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；(b)在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；(c)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；(d)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；以及(e)在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在一些实施方案中，方法包含给药方案，其包含：包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；恢复期间；以及包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。在一些实施方案中，恢复期间包含至少1个月或更久。在一些实施方案中，恢复期间包含至少2个月或更久。
在一些实施方案中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用，视需要地，其中，因为源自自杀基因或安全开关系统的除去，不再能检测到细胞。
在一些实施方案中，通过自杀基因或安全开关系统而除去低免疫性细胞，并且其中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。
在一些实施方案中，方法进一步包含施用给药方案至少二次。在一些实施方案中，施用所述群细胞用于治疗细胞缺陷或作为细胞疗法用于治疗选自下列所组成的组的组织或器官中的病症或疾病：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜、脑、脊髓和骨头。
在方法的一些实施方案中：(a)细胞缺陷与神经退化性疾病相关或细胞疗法用于治疗神经退化性疾病；(b)细胞缺陷与肝脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肝脏疾病；(c)细胞缺陷与角膜疾病相关或细胞疗法用于治疗角膜疾病；(d)细胞缺陷与心血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病；(e)细胞缺陷与糖尿病相关或细胞疗法用于治疗糖尿病；(f)细胞缺陷与血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗血管病症或疾病；(g)细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关或细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎；或(h)细胞缺陷与肾脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肾脏疾病。
在方法的一些实施方案中：(a)神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和佩梅病(PMD)；(b)肝脏疾病包含肝脏的硬化；(c)角膜疾病为富克斯氏营养不良(Fuchs dystrophy)或先天遗传性内皮营养不良；或(d)心血管疾病为心肌梗塞或充血性心力衰竭。
在一些实施方案中，所述群细胞包含：(a)选自下列所组成的组的细胞：神经胶质祖细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元，视需要地，其中，多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元；(b)肝细胞或肝祖细胞；(c)角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞；(d)心肌细胞或心脏祖细胞；(e)胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞，视需要地，其中，胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞；(f)内皮细胞；(g)甲状腺祖细胞；或(h)肾前驱细胞或肾细胞。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
在一些实施方案中，患者正接受组织或器官移植物，视需要地，其中，组织或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和部分角膜移植物。
在一些实施方案中，组织或器官移植物为同种异体移植移植物。在一些实施方案中，组织或器官移植物为自体移植移植物。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代相同的组织或器官。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代不同组织或器官。在一些实施方案中，器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。在一些实施方案中，患者患有糖尿病。在一些实施方案中，器官移植物为心脏移植物并且所述群细胞为一群起搏细胞。在一些实施方案中，器官移植物为胰脏移植物并且所述群细胞为一群β胰岛细胞。在一些实施方案中，器官移植物为部分肝脏移植物并且所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。
在一些方面中，本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者。
在一些方面中，本文提供一群胰脏胰岛细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，胰脏胰岛细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者。
在一些方面中，本文提供一群心脏肌肉细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，心脏肌肉细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者。
在一些方面中，本文提供一群神经胶质祖细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，神经胶质祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者。
在一些实施方案中，患者为敏感性患者，并且其中，患者呈现对抗一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原的记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，先前移植物为同种异体移植物；或先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，先前移植物为自体移植物。
在一些实施方案中，患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
在一些实施方案中，患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。在一些实施方案中，患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：(a)施用所述群细胞以治疗先前治疗的相同病症或疾病；(b)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；(c)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；(d)先前治疗为治疗有效；(e)先前治疗为治疗无效；(f)患者对先前治疗发展出免疫反应；和/或(g)施用所述群细胞以治疗与先前治疗不同的病症或疾病。
在一些实施方案中，先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应自杀基因或安全开关系统的活化，发生免疫反应。
在一些实施方案中，先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
在一些实施方案中，患者患有过敏症，视需要地，其中，过敏症为选自下列所组成的组的过敏症枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
在一些实施方案中，细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD142。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD46。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD59。
在一些实施方案中，细胞自干细胞分化。在一些实施方案中，干细胞为间质干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK细胞和CAR-NK细胞。在一些实施方案中，细胞是源自原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞是原代T细胞、原代β细胞或原代视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。在一些实施方案中，CAR为CD19-特异性CAR，使得细胞为CD19 CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR为CD22-特异性CAR，使得细胞为CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为相同。在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为不同。在一些实施方案中，细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第三基因组基因座相同于第一或第二基因组基因座。在一些实施方案中，第三基因组基因座不同于第一和/或第二基因组基因座。
在一些实施方案中，安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。
在一些实施方案中，目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
在一些实施方案中，至CCR5基因基因座的插入为在CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。在一些实施方案中，至PPP1R12C基因基因座的插入为PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。在一些实施方案中，至CLYBL基因基因座的插入为CLYBL基因的内含子2。在一些实施方案中，至ROSA26基因基因座的插入为ROSA26基因的内含子1。在一些实施方案中，至安全港基因座的插入为SHS231基因座。在一些实施方案中，至CD142基因基因座的插入为在CD142基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至MICA基因基因座的插入为在MICA基因的CDS。在一些实施方案中，至MICB基因基因座的插入为在MICB基因的CDS。在一些实施方案中，至B2M基因基因座的插入为在B2M基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至CIITA基因基因座的插入为在CIITA基因的外显子3或另一CDS。在一些实施方案中，至TRAC基因基因座的插入为在TRAC基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至TRB基因基因座的插入为在TRB基因的CDS。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的下述的一者或多者：(a)内源性T细胞受体；(b)细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；(c)程序性细胞死亡(PD1)；以及(d)程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的TRAC。
在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：(a)内源性T细胞受体；(b)细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；(c)程序性细胞死亡(PD1)；以及(d)程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG和/或EF1a启动子。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1天或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1天或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少一周或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少一周或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1个月或更久，在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞后，患者呈现无免疫反应。在一些实施方案中，在施用所述群细胞后的无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
在一些实施方案中，患者呈现下述的一者或多者：(a)在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；(b)在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；(c)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；(d)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；以及(e)在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在一些实施方案中，方法包含给药方案，其包含：(a)包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；(b)恢复期间；以及(c)包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。在一些实施方案中，恢复期间包含至少1个月或更久。在一些实施方案中，恢复期间包含至少2个月或更久。在一些实施方案中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。
在一些实施方案中，通过自杀基因或安全开关系统而除去低免疫性细胞，并且其中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。
在一些实施方案中，细胞的用途进一步包含施用给药方案至少二次。
在一些实施方案中，施用所述群细胞用于治疗细胞缺陷或作为细胞疗法以治疗选自下列所组成的组的组织或器官中的病症或疾病：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜、脑、脊髓和骨头。
在一些实施方案中，(a)细胞缺陷与神经退化性疾病相关或细胞疗法用于治疗神经退化性疾病；(b)细胞缺陷与肝脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肝脏疾病；(c)细胞缺陷与角膜疾病相关或细胞疗法用于治疗角膜疾病；(d)细胞缺陷与心血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病；(e)细胞缺陷与糖尿病相关或细胞疗法用于治疗糖尿病；(f)细胞缺陷与血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗血管病症或疾病；(g)细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关或细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎；或(h)细胞缺陷与肾脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肾脏疾病。
在一些实施方案中，(a)神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和佩梅病(PMD)；(b)肝脏疾病包含肝脏的硬化；(c)角膜疾病为富克斯氏营养不良或先天遗传性内皮营养不良；或(d)心血管疾病为心肌梗塞或充血性心力衰竭。
在一些实施方案中，所述群细胞包含：(a)选自下列所组成的组的细胞：神经胶质祖细胞、(b)少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元，视需要地，其中，多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元；(c)肝细胞或肝祖细胞；(d)角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞；(e)心肌细胞或心脏祖细胞；(f)胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞，视需要地，其中，胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞；(g)内皮细胞；(h)甲状腺祖细胞；或(i)肾前驱细胞或肾细胞。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
在一些实施方案中，患者正接受组织或器官移植物，视需要地，其中，组织或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和部分角膜移植物。
在一些实施方案中，组织或器官移植物为同种异体移植移植物。在一些实施方案中，组织或器官移植物为自体移植移植物。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代相同的组织或器官。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代不同组织或器官。在一些实施方案中，器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群肾前驱细胞或肾细胞。在一些实施方案中，患者患有糖尿病。在一些实施方案中，器官移植物为心脏移植物并且所述群细胞为一群心脏祖细胞或起搏细胞。在一些实施方案中，器官移植物为胰脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。在一些实施方案中，器官移植物为部分肝脏移植物并且所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。
在一些方面中，本文提供治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群低免疫性细胞，其中，低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸、编码CAR的第二外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：(a)患者不为敏感性患者；或(b)患者为敏感性患者，其中，患者：(i)对一种或多种同种异体抗原敏感；(ii)对一种或多种自体抗原敏感；(iii)因先前移植物而敏感；(iv)因先前怀孕而敏感；(v)因病症或疾病接受先前治疗；和/或(vi)为组织或器官患者，并且在施用组织或器官移植物之前，施用低免疫性细胞。
在一些实施方案中，患者为敏感性患者，并且其中，患者呈现对抗一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原的记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，先前移植物为同种异体移植物；或先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，先前移植物为自体移植物。
在一些实施方案中，患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
在一些实施方案中，患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。在一些实施方案中，患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：(a)施用所述群细胞以治疗先前治疗的相同病症或疾病；(b)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；(c)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；(d)先前治疗为治疗有效；(e)先前治疗为治疗无效；(f)患者对先前治疗发展出免疫反应；和/或(g)施用所述群细胞以治疗与先前治疗不同的病症或疾病。
在一些实施方案中，先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应自杀基因或安全开关系统的活化，发生免疫反应。
在一些实施方案中，先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
在一些实施方案中，患者患有过敏症，视需要地，其中，过敏症为选自下列所组成的组的过敏症枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
在一些实施方案中，细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD142。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD46。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD59。
在一些实施方案中，细胞自干细胞分化。在一些实施方案中，干细胞为间质干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，细胞是CAR T细胞或CAR-NK细胞。在一些实施方案中，细胞源自原代T细胞。在一些实施方案中，细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。在一些实施方案中，CAR为CD19-特异性CAR，使得细胞为CD19 CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR为CD22-特异性CAR，使得细胞为CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得细胞为CD19/CD22CAR T细胞。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为相同。在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为不同。
在一些实施方案中，细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第三基因组基因座相同于第一或第二基因组基因座。在一些实施方案中，第三基因组基因座不同于第一和/或第二基因组基因座。
在一些实施方案中，安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。在一些实施方案中，目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
在一些实施方案中，至CCR5基因基因座的插入为在CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。在一些实施方案中，至PPP1R12C基因基因座的插入为PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。在一些实施方案中，至CLYBL基因基因座的插入为CLYBL基因的内含子2。在一些实施方案中，至ROSA26基因基因座的插入为ROSA26基因的内含子1。在一些实施方案中，至安全港基因座的插入为SHS231基因座。在一些实施方案中，至CD142基因基因座的插入为在CD142基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至MICA基因基因座的插入为在MICA基因的CDS。在一些实施方案中，至MICB基因基因座的插入为在MICB基因的CDS。在一些实施方案中，至B2M基因基因座的插入为在B2M基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至CIITA基因基因座的插入为在CIITA基因的外显子3或另一CDS。在一些实施方案中，至TRAC基因基因座的插入为在TRAC基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至TRB基因基因座的插入为在TRB基因的CDS。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的下述的一者或多者：内源性T细胞受体；细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；程序性细胞死亡(PD1)；以及程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的TRAC。
在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：内源性T细胞受体；细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；程序性细胞死亡(PD1)；以及程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG和/或EF1a启动子。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1天或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1天或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少一周或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少一周或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1个月或更久，在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞后，患者呈现无免疫反应。在一些实施方案中，在施用所述群细胞后的无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
在一些实施方案中，患者呈现下述的一者或多者：(i)在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；(ii)在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；(iii)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；(iv)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；以及(v)在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在一些实施方案中，方法包含给药方案，其包含：包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；恢复期间；以及包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。在一些实施方案中，恢复期间包含至少1个月或更久。在一些实施方案中，恢复期间包含至少2个月或更久。
在一些实施方案中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。
在一些实施方案中，通过自杀基因或安全开关系统而除去低免疫性细胞，并且其中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。
在一些实施方案中，方法进一步包含施用给药方案至少二次。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
在一方面中，提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸、编码CAR的第二外源性多核苷酸以及(I)下述的一者或多者：(a)降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；(b)降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；(c)降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(transactivator)(CIITA)；和/或(d)降低表达的B2M和CIITA；其中降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞；(II)其中：患者不为敏感性患者；或患者为敏感性患者。
在一些实施方案中，患者为敏感性患者，并且其中，患者呈现对抗一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原的记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，先前移植物为同种异体移植物；或先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，先前移植物为自体移植物。
在一些实施方案中，患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
在一些实施方案中，患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。在一些实施方案中，患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：(a)施用所述群细胞以治疗先前治疗的相同病症或疾病；(b)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；(c)相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；(d)先前治疗为治疗有效；(e)先前治疗为治疗无效；(f)患者对先前治疗发展出免疫反应；和/或(g)施用所述群细胞以治疗与先前治疗不同的病症或疾病。在一些实施方案中，先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应自杀基因或安全开关系统的活化，发生免疫反应。在一些实施方案中，先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
在一些实施方案中，患者患有过敏症，视需要地，其中，过敏症为选自下列所组成的组的过敏症枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
在一些实施方案中，细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD142。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD46。在一些实施方案中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，细胞进一步包含降低表达量的CD59。
在一些实施方案中，细胞自干细胞分化。在一些实施方案中，干细胞为间质干细胞。在一些实施方案中，干细胞为胚胎干细胞。在一些实施方案中，干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，细胞是CAR T细胞或CAR-NK细胞。细胞自干细胞分化。在一些实施方案中，细胞源自原代T细胞。在一些实施方案中，细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。在一些实施方案中，CAR为CD19-特异性CAR，使得细胞为CD19 CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR为CD22-特异性CAR，使得细胞为CD22 CAR T细胞。在一些实施方案中，细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得细胞为CD19/CD22CAR T细胞。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。在一些实施方案中，CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为相同。在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为不同。在一些实施方案中，细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第三基因组基因座相同于第一或第二基因组基因座。在一些实施方案中，第三基因组基因座不同于第一和/或第二基因组基因座。
在一些实施方案中，安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。在一些实施方案中，目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，至CCR5基因基因座的插入为在CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。在一些实施方案中，至PPP1R12C基因基因座的插入为PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。在一些实施方案中，至CLYBL基因基因座的插入为CLYBL基因的内含子2。
在一些实施方案中，至ROSA26基因基因座的插入为ROSA26基因的内含子1。在一些实施方案中，至安全港基因座的插入为SHS231基因座。在一些实施方案中，至CD142基因基因座的插入为在CD142基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至MICA基因基因座的插入为在MICA基因的CDS。在一些实施方案中，至MICB基因基因座的插入为在MICB基因的CDS。在一些实施方案中，至B2M基因基因座的插入为在B2M基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至CIITA基因基因座的插入为在CIITA基因的外显子3或另一CDS。在一些实施方案中，至TRAC基因基因座的插入为在TRAC基因的外显子2或另一CDS。在一些实施方案中，至TRB基因基因座的插入为在TRB基因的CDS。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的下述的一者或多者：(a)内源性T细胞受体；(b)细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；(c)程序性细胞死亡(PD1)；以及(d)程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的TRAC。
在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：(a)内源性T细胞受体；(b)细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；(c)程序性细胞死亡(PD1)；以及(d)程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，降低表达是由于修饰并且降低表达是相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG和/或EF1a启动子。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1天或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1天或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少一周或更久，或在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少一周或更久。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用所述群细胞至少1个月或更久，在患者接受同种异体移植物之后，施用所述群细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞后，患者呈现无免疫反应。在一些实施方案中，在施用所述群细胞后的无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。在一些实施方案中，患者呈现下述的一者或多者：(a)在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；(b)在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；(c)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；(d)在施用所述群细胞后，对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；以及(e)在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在施用所述群细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在一些实施方案中，方法包含给药方案，其包含：(a)包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；(b)恢复期间；以及(c)包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。在一些实施方案中，恢复期间包含至少1个月或更久。在一些实施方案中，恢复期间包含至少2个月或更久。在一些实施方案中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。在一些实施方案中，通过自杀基因或安全开关系统而除去低免疫性细胞，并且其中，当来自第一施用的细胞不再能在患者中检测到时，开始第二施用。在一些实施方案中，本文提供的细胞的用途进一步包含施用给药方案至少二次。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
在所述的用途或方法的一些实施方案中，先前治疗包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法，其中，自体CAR-T细胞为主的疗法选自下列所组成的组：布卡巴吉奥仑赛、西卡思罗、艾卡巴吉维赛、利基迈仑赛马拉赛、替沙津鲁、来自Cartesian Therapeutics的Descartes-08或Descartes-11、来自Novartis的CTL110、来自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、来自Autolus Limited的AUTO4、来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B或PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819和来自Clyad Oncology的CYAD-211。
附图说明
图1A至1F是一组代表性ELISPOT定量，来自NHP交叉施用的野生型人类(图1A、1B、1D及1F)和HIP(图1A、1C、1D和1E)iPSC的血清。图1A至1C显示在第一次注射时接受野生型人iPSC(wtxeno)，在第二次注射时接受wtxeno，和在第三次注射时接受人HIP iPSC(HIPxeno)的研究组结果。图1D至1F显示在第一次注射时接受HIPxeno、在第二次注射时接受HIPxeno，和在第三次注射时接受wtxeno的研究组结果。在接受wtxeno注射和HIPxeno注射后所有检定运行分别显示为带有水平线的条和带有垂直线的条。在不同的时间点例如，在治疗前(“pre-Tx”)、第7天、第13天、第75天和之后的细胞施用抽血分析，包括在交叉注射(“pre-Tx”)和在第7天、第13天和其后的第75天。下括号中的天数符号表示相对于第一次注射(第一列)、第二次注射(第二列)和第三次注射(第三列)抽血的时间，如图1A至7C、8C及8E所示。
图2A和2B是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图2A)或HIP(图2A和2B)人iPSC的血清中供体特异性IgG抗体结合。图2A和2B显示在第一次注射时接受wtxeno，在第二次注射时接受wtxeno，和在第三次注射时接受HIPxeno的研究组结果。在图2A中，针对wtxeno和HIPxeno的所有检定运行分别显示为带有水平线的圆圈和带有垂直线的圆圈。图2B显示接受HIPxeno注射后的IgG DSA量。
图3A和3B是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图3A和3B)或HIP(图3A)人iPSC的血清中供体特异性IgG抗体结合。图3A和3B显示在第一次注射时接受HIPxeno，在第二次注射时接受HIPxeno，和在第三次注射时接受wtxeno的研究组结果。在图2A中，针对wtxeno和HIPxeno的所有检定运行分别显示为带有水平线的圆圈和带有垂直线的圆圈。图3B显示接受wtxeno注射后的IgG DSA量。
图4A至4C是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图4A和4B)或HIP(图4A和4C)人iPSC的血清中的总IgM抗体。图4A至4C显示了在第一次注射时接受人HIP iPSC(HIPxeno)，在第二次注射时接受HIPxeno，和在第三次注射时接受wtxeno的研究组结果。图4B显示接受wtxeno注射后的总IgM抗体量，及图4C显示在第二次注射接受HIPxeno后的总IgM抗体量。
图5A至5C是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图5A和5B)或HIP(图5A和5C)人iPSC的血清中的总IgM抗体。图5A至5C显示在第一次注射时接受wtxeno，在第二次注射时接受wtxeno，和在第三次注射时接受HIPxeno的研究组结果。图5B显示在第二次注射时接受wtxeno后的总IgM抗体量，及图5C显示在第三次注射时接受HIPxeno后的总IgM抗体量。
图6A至6C是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图6A和6B)或HIP(图6A和6C)人iPSC的血清中的总IgG抗体。图6A至6C显示在第一次注射时接受HIPxeno，在第二次注射时接受HIPxeno，和在第三次注射时接受wtxeno的研究组结果。图6B显示在第三次注射时接受wtxeno后的总IgG抗体量，及图6C显示在第二次注射时接受HIPxeno后的总IgG抗体量。
图7A至7C是一组代表性图，显示NHP交叉施用野生型(图7A和7B)或HIP(图7A和7C)人iPSC的血清中的总IgG抗体。图7A至7C显示在第一次注射时接受HIPxeno，在第二次注射时接受wtxeno和在第三次注射时接受HIPxeno的研究组结果。图7B显示在第二次注射时接受wtxeno后的总IgG抗体量，及图7C显示在第三次注射时接受HIPxeno后的总IgG抗体量。
图8A至8E是一组代表性图表，显示不存在分化成野生型NHP的HIP人iPSC的自然杀手(NK)细胞介导的杀伤。图8A至8C显示在第一次注射时接受HIPxeno，在第二次注射时接受HIPxeno，和在第三次注射时接受wtxeno的研究组中NK细胞介导的杀伤。在第一次注射阶段(图8A)和第二次注射阶段(图8B)没有人HIP iPSC的NK细胞-杀伤描绘于即时细胞生物传感器数据图中。图8D和8E显示在第一次注射时接受wtxeno，在第二次注射时接受wtxeno，和在第三次注射时接受HIPxeno的研究组中NK细胞介导的杀伤。在第三注射阶段(图8D)没有人HIPiPSC的NK细胞-杀伤描绘在即时细胞生物传感器数据图。百分比目标细胞杀伤显示在左侧y-轴(平均值±s.d.)，杀伤速度在右侧y-轴(杀伤t1/2 -1，平均值±s.e.m.；显示为空心三角形)。在接受wtxeno和HIPxeno注射后的检定运行分别显示为带有水平线的圆圈和带有垂直线的圆圈。
图9A显示在同种异体NHP接受者左腿中，移植的HIP恒河猴iPSC的代表性BLI图像。相对于第0天或移植前的量，随时间的BLI信号以及随时间的BLI信号百分比显示在下方图9A、10、11、12A至12B和13C中的BLI图像。[图9B]为移植后6周来自注射部位的组织的免疫组织学图像。图像显示SMA阳性血管和荧光素酶阳性细胞，这表明移植的HIP恒河猴iPSC及其子代。
图10显示同种异体NHP接受者左腿的移植野生型恒河猴iPSC(顶列)和相同接受者右腿的移植HIP恒河猴iPSC(底列)的代表性BLI图像，其在野生型恒河猴iPSC移植物后5周已敏感。
图11显示另一个同种异体NHP接受者左腿的移植野生型恒河猴iPSC(顶列)和相同接受者右腿的移植HIP恒河猴iPSC(底列)的代表性BLI图像，其在野生型恒河猴iPSC移植物后5周已敏感。
图12A和12B显示来自HIP恒河猴iPSC到野生型恒河猴iPSC的交叉研究的同种异体NHP接受者的代表性BLI图像。顶列显示同种异体NHP接受者左腿的移植HIP恒河猴iPSC及其子代的图像，而底列显示相同接受者右腿的移植野生型恒河猴iPSC。右下角还描绘在初始HIP iPSC移植后8周和9周，同种异体NHP接受者左腿中移植HIP恒河猴iPSC及其子代的图像。
图13A显示在注射之后，最初在同种异体NHP接受者的左腿中移植野生型恒河猴iPSC和相同接受者右腿中移植HIP恒河猴iPSC的代表性同种异体NHP接受者随着时间的代表性BLI信号。[图13B]显示在交叉注射后，最初在同种异体NHP接受者的左腿中移植HIP恒河猴iPSC和在相同接受者的右腿中移植野生型恒河猴iPSC的代表性同种异体NHP接受者随着时间的代表性BLI信号。[图13C]显示从第0天到第9周第一次注射到左腿中的所施用的HIP恒河猴iPSC的同种异体NHP接受者的代表性BLI图像。
图14A至14G显示在异种移植到NHP接受者之前，人wt和HIP iPSC的特征化。图14A和14B显示wtxeno(图14A)和HIPxeno(图14B)培养物的形态。在wtxeno(图14C)和HIPxeno(图14D)上的HLA I类和II类和CD47的表面表达通过流式细胞术评估并描绘为直方图。图14E显示移植之前wtxeno和HIPxeno的细胞制剂的生存力。NHP接受者的生存力高于90％(平均值±s.d.)。图14F显示皮下注射wtxeno iPSC的NSG小鼠的随时间的代表性BLI图像和BLI信号。图14G显示皮下注射HIPxeno iPSC的NSG小鼠的随时间的代表性BLI图像和BLI信号。
图15A至15J显示恒河猴wt和HIP iPSC在同种异体移植到NHP接受者之前的特征化。图15A至15C显示wtallo(图15A)和HIPallo(图15B与15C)培养物的形态。在wtallo(图15D)和HIPallo(图15E与15F)上的HLA I类和II类以及CD47的表面表达通过流式细胞术评估并描绘为直方图。图15G显示移植之前wtallo及HIPallo的细胞制剂的生存力。进入NHP接受者的生存力高于90％(平均值±s.d.)。图15H显示皮下注射wtallo iPSC的NSG小鼠的随时间的代表性BLI图像和BLI信号。图15I和15J显示皮下注射HIPallo iPSC的NSG小鼠的随时间的代表性BLI图像和BLI信号。
图16为评估B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC中CD47表达的代表性图。在这些iPSC中，CD47转基因插入到安全港位点(AAVS1、CYBL或CCR5)，并且使用CAG或EF1α启动子以控制CD47多核苷酸的表达。如图所示，B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC比基线高约～30至200倍表达CD47。
图17为评估B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC中CD47表达的代表性图。在这些iPSC中，CD47转基因插入到CYBL安全港位点，并且使用EF1α启动子以控制CD47多核苷酸的表达。如所示，在P23与P27，B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC过表达CD47。
图18为在多个时间点(P20、P21、P23和P27)评估在B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC中CD47表达的代表性图。在这些iPSC中，CD47转基因插入到CCR5或CLYBL安全港位点，并且使用CAG或EF1α启动子以控制CD47多核苷酸的表达。如所示，在不同时间点，B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC过表达CD47。
图19A至19C是评估通过先天性免疫细胞(NK细胞和巨噬细胞)对B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC的杀伤的研究的代表性图表。B2Mindel/indel和CIITAindel/indeliPSC的CD47tg插入到安全港位点(AAVS1、CYBL或CCR5)。如所示，所有细胞克隆株都受到保护，免于NK和巨噬细胞细胞杀伤。
本技术的其他目的、优点和实施方案将从以下详细描述中显而易见。
具体实施方式
I.引言
本公开涉及用于减轻和/或避免免疫系统反应对细胞疗法的影响的方法和组合物。为了克服对细胞衍生和/或组织移植物的受试者免疫排斥问题，本发明人在此开发并公开了免疫逃脱(evasive)细胞(例如，低免疫性细胞或低免疫性多能细胞)，其代表任何可移植细胞类型的可行来源。有利地，无论受试者中对一种或多种先前同种异体或自体细胞衍生和/或组织移植物的受试者基因组成(genetic make-up)或任何存在反应，本文所公开的细胞不会被受者受试者的免疫系统排斥。
本文公开的技术利用基因修饰来调变(例如，降低或消除)MHC I和/或MHC II表达。在一些实施方案中，利用稀有切割(rare-cutting)核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶(meganuclease)和归巢(homing)核酸内切酶系统)的基因组编辑技术也用于降低或消除人细胞中涉及免疫反应的基因表达(例如，通过删除涉及免疫反应的基因的基因组DNA，或通过将基因组DNA插入此类基因中，使得基因表达受到影响)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调变技术用于在人细胞中插入耐受诱导(耐受原(tolerogenic))因子，使其和由此细胞所制备的分化的细胞在植入到接受者受试者中时可逃脱免疫辨识。因此，本文所述的细胞呈现影响MHC I和/或MHC II表达的一种或多种基因和/或因子的调变表达。
本文所述的基因组编辑技术能够在所需基因座位点发生双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进在特异性基因座位点的同源重组。此过程着重于以辨识并结合到序列并且诱导核酸分子中的双链断裂的核酸内切酶靶向核酸分子(诸如，染色体)的特异性序列。双链断裂通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复。
本文所述的某些基因组编辑技术能够在所需基因座位点发生单链DNA断裂，其中碱基编辑或初级编辑可用于依序将单一核酸碱基改变为替代碱基，以改变基因组序列。在一些实施方案中，碱基编辑用于调变MHC I和/或MHC II抗原、耐受原因子和/或CAR表达。碱基编辑的描述可以在例如Rothgangl等人，Nat Biotechnol,2021,39,949-957；Porto等人，Nat Rev Drug Discov,2020,19,839-859；及Rees and Lui,Nat Rev Genet,2018,19(12),770-788中找到。在一些实施方案中，初级编辑用于调变MHC I/或MHC II抗原耐受原因子和/或CAR表达。初级编辑的描述可以在例如，Anzalone等人，Nature,2019,576,149-157；Kantor等人，Int J Mole Sci,2020,21(17),6240；Schene等人，Nat Commun,2020,11,5232；及Scholef ield与Harrison,Gene Therapy,2021,doi.org/10.1038/s41434-021-00263-9中找到。
除非特别指明反义，否则特定实施方案的实行将采用在本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，为了说明的目的，下面描述许多。这些技术在文献中有充分的解释。见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008)；Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for theAnalysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription andTranslation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及在期刊上的专题著作，诸如，Advances inImmunology。
II.定义
术语“自身免疫疾病”是指受试者对自身组织和/或细胞发动破坏性免疫反应的任何疾病或失调。自身免疫失调可影响受试者(例如，人类)几乎每个器官系统，包括，但不限于，神经、胃肠道和内分泌系统、以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫疾病的例子包括但不限于桥本氏甲状腺炎、全身性红斑性狼疮、舍格伦综合征、格雷氏病、硬皮症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力和糖尿病。
在本文中所用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其独特的特征(例如，失去正常控制)导致不受调节的生长、缺乏分化、局部组织侵袭且转移。关于本发明方法，癌症可以是任何癌症，包括任何急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓白血病、齿槽横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌症、肛管癌症或肛门直肠(anorectum)癌症、眼癌症、肝内胆管癌症、关节癌症、颈部癌症、胆囊癌症或胸膜癌症、鼻癌症、鼻腔癌症或中耳癌症、口腔癌症、阴门癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌症、结肠癌、食管癌、子宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、何杰金氏淋巴瘤、咽下部癌、肾脏癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥胖细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰脏癌症、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌症、软组织癌症、实体肿瘤、胃癌、睪丸癌、甲状腺癌症、输尿管癌和/或泌尿膀胱癌。如本文所用，除非另有明确指出，术语“肿瘤”是指恶性类型细胞或组织的异常生长，并且不包括良性类型组织。
术语“慢性传染性疾病”是指由传染性病原体引起的疾病，其中传染一直持续。此类疾病可包括肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒例子可包括慢性真菌疾病，例如曲菌病、念珠菌病、球霉菌症和与隐球菌相关的疾病和组织胞浆菌病。慢性细菌性传染病原体的非限制性例子可为肺炎披衣菌、单增李斯特菌和结核分枝杆菌。在一些实施方案中，失调为人免疫缺乏病毒(HIV)传染。在一些实施方案中，失调为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰(包括，例如，基因改变或修饰)导致降低表达的目标或选定的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致降低表达的目标或选定的多肽序列。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致增加表达的目标或选定的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致增加表达的目标或选定多肽序列。术语“减少”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”及“减少”在本文中均用于一般来说意为统计学上显著量的减少。然而，为免生疑问，“减少”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”和“减少”表示与参考水平相比减少至少10％，例如，减少至少约20％，或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或最多并包括减少100％(即，与参考样品相比没有水平)或与参考水平相比，减少10至100％。在一些实施方案中，细胞经工程改造为相对于未改变或未修饰的野生型细胞具有降低表达的一种或多种目标。在细胞的背景中，“野生型”或“wt”是指在自然界中发现的任何细胞。然而，例如，在工程改造的细胞或低免疫性细胞的背景中，如本文所用，“野生型”也可指可包含导致降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体的核酸改变，但没有经过基因编辑程序以导致CD47蛋白质过表达，例如，细胞可以是CD47的“野生型”，但在关于MHC I和/或II和/或T细胞受体经改变。如本文所用，“野生型”也可指可含有导致CD47蛋白质过表达的核酸改变的工程改造的细胞或低免疫性细胞，但没有经过基因编辑程序以导致降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体，例如，对于MHC I和/或II和/或T-细胞受体，细胞可为“野生型”，但关于CD47经改变。在PSC或其子代的背景中，“野生型”也指可能包含导致多能性的核酸改变，但未经过本技术的基因编辑程序以达到降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体和/或CD47蛋白质的过表达的PSC或其子代。同样在PSC或其子代的背景中，“野生型”也指可能包含导致CD47蛋白质的过表达的核酸改变，但未经过基因编辑程序以导致降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体的PSC或其子代。在原代细胞或其子代的背景中，“野生型”也指可能包含降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体的核酸改变，但没有经过基因编辑程序以导致CD47蛋白质的过表达的原代细胞或其子代。同样在原代细胞或其子代的背景中，“野生型”也指可能包含导致CD47蛋白质的过表达的核酸改变，但未经过基因编辑程序以导致降低表达的MHC I和/或II和/或T-细胞受体的原代细胞或其子代。在一些具体的实施方案中，细胞经工程改造以相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞具有降低或增加表达的一种或多种目标。
术语“内源性”是指天然存在于细胞中的参考分子或多肽。同样地，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指天然包含在细胞内而非外源性引入的编码核酸的表达。
如本文所用，术语“外源性”旨在表示所指的分子或所指的多肽经引入感兴趣的细胞中。例如，可以通过将编码核酸引入细胞的基因材料，诸如通过整合到染色体或作为非染色体基因材料，诸如质粒或表达载体中，来引入多肽。因此，当用于提及编码核酸的表达时，术语是指将编码核酸以可表达的形式引入细胞。“外源性”分子为非正常存在于细胞中，但可以通过一种或多种基因、生物化学或其他方法引入细胞的分子、构建体、因子等。“细胞中的正常存在”是由关于细胞的特定发育阶段和环境条件所决定。因此，例如，仅在神经元胚胎发育期间存在的分子相对于成体神经元细胞为外源性分子。外源性分子可以包括，例如，功能异常的内源性分子的功能版本或正常功能的内源性分子的功能异常版本。
除了别的以外，外源性分子或因子可以是小分子，诸如通过组合化学过程产生者或大分子，诸如，蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白质、脂蛋白质、多糖，上述分子的任何修饰的衍生物，或包含上述分子的一种或多种的复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线性、分支或环状；以及可以是任何长度。核酸包括能够形成双链者，以及形成三链的核酸。见，例如，美国专利第5,176,996号和第5,422,251号。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白质、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白质、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、回旋酶和/或解旋酶。
就本公开目的而言，“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物生成的所有DNA区域，无论此调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不必要限于启动子序列、终止子、诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点的翻译调控序列、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和/或基因座控制区域。
“基因表达”是指将包含在基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核糖核酸酶、结构化RNA或RNA的任何其他类型)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、多腺核苷酸化、甲基化和编辑过程修饰的RNA和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻酰基化和/或糖基化修饰的蛋白质。
如本文所用，术语“基因修饰”及其文法均等物可以指核酸(例如有机体的基因组内的核酸)的一种或多种改变。例如，基因修饰可以指基因或基因部分或其他核酸序列的改变、添加和/或缺失。基因修饰的细胞还可以指具有添加、缺失和/或改变的基因或基因部分的细胞。基因修饰的细胞也可以指具有不为基因或基因部分的添加核酸序列的细胞。基因修饰包括，例如，短暂敲入(knock-in)或减弱(knock-down)两种机制，及导致目标基因或基因或核酸序列的部分永久性敲入、减弱或剔除(knock-out)的机制。基因修饰包括，例如，敲入和导致核酸序列永久敲入的机制。
如本文所用，术语“移植(grafting)”、“施用”、“引入”、“植入”和“移植(transplanting)”以及其文法均等物在细胞(例如，本文所述的细胞)置入受试者的背景中可交互使用，通过导致局部化或至少部分局部化所引入的细胞在所需位点或全身性引入(例如，进入循环)的方法或途径。细胞可以直接植入到所需位点，或者通过任何合适的途径施用，所述途径导致递送到受试者内的所需位置，其中至少一部分植入的细胞或细胞的组分保持存活。在施用到受试者后细胞的生存力期可以短至几个小时，例如，24小时，到几天，到长达数年。在一些实施方案中，细胞也可以被施用(例如，注射)在所需位点以外的位置，例如在脑中或皮下，例如，在胶囊中以将植入的细胞维持在植入位置并避免植入细胞的迁移。
“HLA”或“人白细胞抗原”复合物是指编码人的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质的基因复合物。这些构成HLA复合物的细胞表面蛋白质负责对抗原的免疫反应的调控。在人类中，有两类MHC，I类和II类，“HLA-I”和“HLA-II”。HLA-I包括三种蛋白质HLA-A、HLA-B和HLA-C，其呈现来自细胞内部的肽，而由HLA-I复合物所呈现的抗原吸引杀手T-细胞(也已知为CD8+T-细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I细胞与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五个蛋白质，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，其从细胞外呈现抗原到T淋巴细胞。这刺激CD4+细胞(也已知为T-辅助细胞)。应当理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着是限制性，因为这取决于基因是来自人(HLA)还是鼠类(MHC)。因此，当关于哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可以交互使用。
如本文中用于特征化细胞，术语“低免疫性”一般来说是指此类细胞不易免疫排斥，例如，此类细胞被移植到受试者的先天性或适应性免疫排斥，例如，细胞不易受到此细胞移植到受试者的同种异体排斥(allorejection)。例如，相对于未改变或未修饰的野生型或非低免疫细胞，此低免疫性细胞可能约为2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更多不易因此细胞移植到受试者而有免疫排斥。在一些实施方案中，基因组编辑技术用于调变MHC I和MHC II基因的表达，从而有助于低免疫性细胞的生成。在一些实施方案中，低免疫性细胞在MHC-不匹配的同种异体接受者中逃脱免疫排斥。在一些情况下，由本文概述的低免疫性干细胞产生的分化的细胞当对MHC不匹配的同种异体接受者施用(例如，移植(transplant)或移植(graft))时逃脱免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫性细胞受到保护免受T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。低免疫性细胞的详细描述、其生产方法及其使用方法可在2015年5月9日申请的WO2016183041；2018年1月14日申请的WO2018132783；2018年3月20日申请的WO2018176390；2019年7月17日申请的WO2020018615；2019年7月17日申请的WO2020018620；2020年7月31日申请的PCT/US2020/44635；2019年8月1日申请的US62/881,840；2019年8月23日申请的US62/891,180；2020年4月27日申请的US63/016,190；以及2020年7月15日申请的US63/052,360发现，包括实施方案、序列表和图式的公开内容整体以引用方式并入本文。
细胞的低免疫性可以通过评估细胞的免疫性来确定，例如细胞引起适应性和先天性免疫反应或避免引起这种适应性和先天性免疫反应的能力。可以使用发明所属技术领域中具有通常知识者认可的检定来测量此免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应检定测量低免疫性细胞对T细胞增殖、T细胞活化、T细胞杀伤，供体特异性抗体生成、NK细胞增殖、NK细胞活化和巨噬细胞活性的影响。在一些例子中，低免疫性细胞和其衍生物在施用到受试者后经历被T细胞和/或NK细胞减少的杀伤。在一些例子中，细胞和其衍生物与未经修饰或野生型细胞相比，显示出减少的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，低免疫性细胞是非免疫性或不能在接受者受试者中引起免疫反应。
术语百分比“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，是指在比较和比对最大一致性时，具有相同核苷酸或氨基酸残基的指定百分比的两个或更多个序列或子序列，使用下述序列比较算法之一(例如，BLASTP及BLASTN或通常知识者可获得的其他算法))或通过目视检查来测量。根据应用，百分比“同一性”可以存在于被比较序列的区域，例如，存在于功能性结构域上，或者存在于要比较的两个序列的全长上。对于序列比较，典型一个序列作为与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑，指定子序列坐标，并且必要时指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的寻找相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目视检查(见一般来说Ausubel等人，见下文)。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。
如本文所用的“免疫信号传递因子”在一些例子中是指活化免疫信号传递路径的分子、蛋白质、肽等。
如本文所用“免疫抑制因子”或“免疫调控性因子”或“耐受原因子”包括低免疫因子、补体抑制子、以及调变或影响在施用、移植或植入之后细胞被宿主或接受者受试者的免疫系统辨识的能力的其他因子。这些可能与额外的基因修饰结合。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”在本文中均用于一般来说指静态显著量的增加；为避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比至少约20％或至少约30％或至少约40％或至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或高至且包括100％增加或介于10至100％的任何增加或与参考水平相比至少约2倍或至少约3倍或至少约4倍或至少约5倍或至少约10倍增加或介于2倍至10倍的任何增加或更高。
在一些实施方案中，改变为indel。如本文所用，“indel”是指由于插入、缺失或其组合导致的突变。发明所属领域技术中具有通常知识者将理解，基因组序列编码区域中的indel将导致框移突变，除非indel的长度为三的倍数。在一些实施方案中，改变为点突变。如本文所用，“点突变”是指置换核苷酸之一的取代。本公开的CRISPR/Cas系统可用于在目标多核苷酸序列中诱导任何长度的indel或点突变，例如使用基因编辑、碱基编辑或初级编辑。术语“碱基编辑”是指在靶向基因基因座、将一个碱基对可编程转换为另一个的方法，和在一些例子中，不制造双链DNA断裂，在其他情况下，不制造单链DNA断裂。在一些实施方案中，碱基编辑利用催化性损害的Cas9来辨识目标DNA位点，并且具有一定范围的PAM序列辨识，在原间隔区(protospacer)序列内和/或外的基础编辑窗口。术语“初级编辑”是指利用可编程聚合酶(诸如，但不限于，如WO2020191242所述的napDNAbps)和特定引导RNA的基因编辑的方法。在一些实施方案中，引导RNA包括用于编码基因信息(或用于删除基因信息)的DNA合成模板，所述模板被并入目标DNA序列。正如发明所属技术领域中具有通常知识者所辨识到，碱基编辑和初级编辑有用于调变(例如，降低、消除、增加及增强)所描述的多核苷酸以及多肽的表达。
如本文所用，“剔除”及“减弱”分别是指导致无表达和降低表达的所编辑基因的基因修饰。如本文所用，“减弱”是指目标mRNA或相应目标蛋白质的表达降低。减弱通常报导为相对于不介导RNA(例如，非靶向对照shRNA、siRNA、引导RNA或miRNA)表达水平降低的对照分子施用或表达后所存在的水平。在一些实施方案中，减弱目标基因是通过shRNA、siRNA、miRNA或CRISPR干扰(CRISPRi)达成。在一些实施方案中，减弱目标基因是通过蛋白质为主的方法，诸如，降解决定子方法达成。在一些实施方案中，减弱目标基因是通过基因修饰，包括shRNA、siRNA、miRNA或使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)达成。
通常通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)扩增来测量mRNA水平或通过西方墨点法或酶联免疫吸附检定(ELISA)测量蛋白质水平来评估减弱。分析蛋白质水平提供了对mRNA切割和翻译抑制的评估。用于测量减弱的其他技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、北方杂交、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、放射免疫检定和荧光活化细胞分析。发明所属技术领域中具有通常知识者将轻易地理解如何基于本文描述的细节使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)剔除目标多核苷酸序列或其部分。
本文“敲入”是指因为将DNA序列插入宿主细胞的染色体基因座中而产生的基因修饰。这导致敲入的基因、基因的部分或核酸序列插入的产物增加的表达水平，例如，RNA转录水平和/或所编码的蛋白质水平的增加。正如发明所属技术领域中具有通常知识者所理解，这可以通过多种方式实现，包括将基因或其部分的一个或多个额外拷贝插入或添加到宿主细胞或改变内源性基因的调控组分，完成增加蛋白质表达或插入所需表达的特异性核酸序列。这可以通过修饰启动子、添加不同启动子、添加增强子、添加其他调控元件或修饰其他基因表达序列来实现。本公开的CRISPR/Cas系统可用于敲入序列，无论是通过使用具有同源臂的模板的同源DNA修复或是初级编辑或基因书写，其中，编辑特异性序列。在一些例子中，术语“敲入”是指是为宿主细胞添加基因功能的过程。这会导致敲入的基因产物(例如，RNA或所编码的蛋白质)水平增加。正如发明所属技术领域中具有通常知识者所理解，这可以通过多种方式实现，包括向宿主细胞添加一个或多个额外拷贝的基因或改变内源性基因的调控组分，完成增加蛋白质表达。这可以通过修饰改启动子、添加不同启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。
如本文所用，“剔除”包括以干扰目标多核苷酸序列的翻译或功能的方式删除目标多核苷酸序列的全部或部分。例如，剔除可以通过在目标多核苷酸序列，包括目标多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)诱导目标多核苷酸序列中的插入或缺失(“indel”)而改变目标多核苷酸序列来达成。发明所属技术领域中具有通常知识者将轻易地理解如何基于本文描述的细节使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来剔除目标多核苷酸序列或其部分。
在一些实施方案中，基因修饰或改变导致剔除或减弱目标多核苷酸序列或其部分。使用本技术的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)剔除目标多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，为了研究目的，可以在试管内执行剔除细胞中的目标多核苷酸序列。出于离体目的，剔除细胞中的目标多核苷酸序列可用于治疗或预防与目标多核苷酸序列表达相关的失调(例如，通过剔除离体细胞中的突变对偶基因并引入包含剔除的突变对偶基因的那些细胞到受试者)或用于改变细胞的基因型或表型。在一些例子中及如本文所用，“剔除”包括以干扰目标多核苷酸序列的功能的方法删除目标多核苷酸序列的全部或部分。例如，可以通过在目标多核苷酸的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中诱导目标多核苷酸序列中的indel，来改变目标多核苷酸序列而达成剔除。发明所属技术领域中具有通常知识者将轻易地理解如何基于本文描述的细节使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)剔除目标多核苷酸序列或其部分。在一些实施方案中，改变导致目标多核苷酸序列或其部分的剔除。使用本公开的CRISPR/Cas系统剔除目标多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，为了研究目的，可以在试管内执行剔除细胞中的目标多核苷酸序列。出于离体目的，剔除细胞中的目标多核苷酸序列可用于治疗或预防与目标多核苷酸序列表达相关的失调(例如，通过剔除离体细胞中的突变对偶基因并引入包含剔除的突变对偶基因的那些细胞到受试者)。
基因表达的“调变”是指基因的表达水平的变化。表达的调变可包括但不限于基因活化和基因抑制。调变也可以是完全，即，其中，基因表达被完全未活化或被活化到野生型水平或超过；或者它可以是部分，其中，基因表达被部分降低或部分被活化到野生型水平的一部分。
在额外的或替代的方面中，本技术考虑以具有通常知识者可获得的任何方式改变目标多核苷酸序列，例如，利用核酸酶系统，诸如TAL效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)系统。应当理解，尽管本文详细描述利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cpf1)与TALEN的方法的例子，但所述技术不限于使用这些方法/系统。发明所属技术领域中具有通常知识者已知的靶向降低或消除目标细胞中表达的其他方法可以在本文中利用。本文提供的方法可用于改变细胞中的目标多核苷酸序列。本技术考虑出于任何目的改变细胞中的目标多核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞中的目标多核苷酸序列被改变以产生突变细胞。如本文所用，“突变细胞”是指具有与其原始基因型不同的所得基因型的细胞。在一些例子中，“突变细胞”呈现突变表型，例如当使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)改变正常功能的基因时。在其他例子中，“突变细胞”呈现野生型表型，例如当本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)用于校正突变基因型时。在一些实施方案中，细胞中的目标多核苷酸序列被改变以校正或修复基因突变(例如，恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，细胞中的目标多核苷酸序列被改变以诱导基因突变(例如，破坏基因或基因组元件的功能)。
术语“可操作地连接”或“可实行地连接”可交互使用，指的是两个或更多个组件(例如序列元件)的并列，其中组件被配置成使得两个组件正常作用并允许组件中的至少一个可以介导施加在其他组件的至少一个上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列回应一种或多种转录调控性因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则转录调控序列(诸如启动子)与编码序列可操作地连接。转录调控序列一般来说与编码序列顺式可操作地连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是与编码序列可操作地连接的转录调控序列，即使它们不是连续。
如本文所用的“多能干细胞”具有分化为三个胚层中的任何一个的潜力：内胚层(例如，胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如，肌肉、骨头、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”也涵盖“诱导性多能干细胞”或“iPSC”或源自非多能细胞的多能干细胞类型。在一些实施方案中，多能干细胞是从不为多能细胞的细胞产生或生成。换句话说，多能干细胞可以是非多能细胞的直接或间接子代。母细胞的例子包括体细胞(通过各种手段已重新编程以诱导多能、未分化的表型)。此“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源性应用而创造。本领域已知诱导iPS细胞的方法且将在下文进一步描述。(见，例如，Zhou等人，StemCells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人，Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人，Nature 458(7239):766-770(2009)；及Zhou等人，Cell Stem Cell8:381-384(2009)；各者在此整体以引入方式并入本文)。生成诱导性多能干细胞(iPSCs)于下概述。如本文所用，“hiPSC”为人诱导性多能干细胞。
如本文所用的“安全港基因座”是指允许转基因或外源性基因以使新插入的基因元件能够可预测作用，并且也可不会以对宿主细胞构成风险的方式造成宿主基因组的改变的方式表达的基因基因座。例示性“安全港”基因座包括，但不限于，CCR5基因、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因、CLYBL基因和/或Rosa基因(例如，ROSA26)。如本文所用的“目标基因座”是指允许转基因或外源性基因表达的基因基因座。例示性“目标基因座”包括，但不限于，CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也已知为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也已知为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因和/或KDM5D基因(也已知为HY)。外源性基因可插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、CCR5、F3(即，CD142)、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、KDM5D(即，HY)、PDGFRa、OLIG2和/或GFAP的CDS区域。外源性基因可插入到PPP1R12C(即，AAVS1)或CCR5的内含子1或2。外源性基因可插入到CCR5的外显子1或2或3。外源性基因可插入到CLYBL的内含子2。外源性基因可插入到在Ch-4：58,976,613(即，SHS231)的500bp窗。外源性基因可以插入到上述安全港或目标基因座的允许表达外源性的任何适合区域，包括例如，安全港或目标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。
术语“受试者”和“个体”在本文中可交互使用，并且是指动物，例如，提供可以从其获得细胞和/或对其进行治疗，包括使用本文所述的细胞进行的预防性治疗的人类。对于感染、病症或疾病状态的治疗，这些状态对于特定动物(诸如，人受试者)是特异性，术语受试者是指特定动物。本文中可交互使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物，诸如，大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和/或非人灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬虫动物、两栖类和/或鱼。然而，有利地，受试者为哺乳动物，诸如人或其他哺乳动物，诸如，驯养的哺乳动物，例如，狗、猫、马等，或生产类哺乳动物，例如，牛、羊、猪等。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括向受试者施用有效量的本文所述的细胞，使得受试者具有疾病的至少一种症状降低或疾病的改善，例如，有益的或所需的临床结果。就此技术而言，有益或所需的临床结果包括，但不限于，减轻一种或多种症状、减少疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、疾病状态的改善或缓和及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测或是不可检测。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，发明所属技术领域中具有通常知识者了解治疗可以改善疾病状况，但可能不能完全治愈疾病。在一些实施方案中，疾病或失调的一种或多种症状在疾病治疗时缓解至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
就本技术而言，疾病治疗的有益或所需的临床结果包括但不限于缓解一种或多种症状、减少疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、疾病状态的改善或缓和及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测或是不可检测。
“载体”或“构建体”能够将基因序列转移到目标细胞。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导有兴趣基因的表达并且可以将基因序列转移到目标细胞的任何核酸构建体。因此，术语包括克隆，和表达载具(expression vehicle)、以及整合载体。发明所属技术领域中具有通常知识者已知用于将载体或构建体引入细胞的方法且包括，但不限于脂质介导的转移(即，微脂体，包括中性和阳离子性脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和/或病毒载体介导的转移。
应注意权利要求可以被起草以排除任何视需要元素。因此，本声明旨在作为与权利要求要素的叙述或“负面”限制的使用相关的诸如“唯一”、“仅”等专用术语的使用的先行基础。发明所属技术领域中具有通常知识者在阅读本公开内容后将明白，本文描述和说明的个别实施方案中的各者都具有在不脱离本技术范围和精神的情况下容易与其他几个实施方案中的任一个的特征分离或组合的分离组份和特征。任何记载的方法都可以按照引用事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。尽管在技术的实践或测试中也可以使用与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
在进一步描述技术之前，应当理解，此技术不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本技术的范围将仅由所附权利要求来限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与此技术所属的领域中具有通常知识者通常理解的相同含义。在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定到下限单位的十分之一，在所述范围的上限和下限之间的各居间值与所记载范围的任何其他记载或居间值均涵盖在此技术中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本技术内，受所记载范围内的任何明确排除的限制。当所记载范围包括一或两个限值时，排除所包括的限值之一或二者的范围也包括在技术中。本文呈现的某些范围的数值前面带有术语“约”。术语“约”在本文用于为它前面的确切数字以及接近或近似于术语前面的数字提供字面支持。在确定一个数字是否接近或近似于具体记载的数字时，接近或近似的未记载数字可以是数字，在所呈现的背景中，所述数字提供具体记载的数字的实质均等物。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度与各个别出版物、专利或专利申请被具体地且个别地指示通过引用并入一样。此外，每个引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与引用的出版物相关的主题。任何出版物的引用都是针对在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本文描述的技术无权凭借先前技术早于此出版物。再者，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。
在进一步描述技术之前，应当理解，此技术不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本技术的范围将仅由所附权利要求来限制。还应当理解，本文使用的标题不是限制性，并且仅仅旨在引导读者，但是主题一般来说适用于本文所公开的技术。
III.实施方案的详细描述
A.施用低免疫性细胞至患者
在一方面中，本文提供为通过施用一群本文所述的低免疫性细胞来治疗患者的方法。本文提供的主体低免疫性细胞(例如，从如本文所述的低免疫性干细胞分化的细胞)可施用到任何合适的患者，包括，例如，治疗疾病或失调的细胞疗法的候选人。细胞疗法的候选人包括可能受益于本文提供的主体低免疫性细胞的治疗效果的患有病症或疾病的任何患者。在一些实施方案中，患者具有细胞缺陷。可能受益于本文提供的主体低免疫性细胞的治疗效果的候选人呈现或病症的消除、降低或改善。如本文所用，“细胞缺陷”是指导致患者中一群细胞的功能异常或损失的任何病症或疾病，其中，患者无法自然地替换或再生所述群细胞。例示性细胞缺陷包括，但不限于，自身免疫疾病(例如，多发性硬化症、重症肌无力、类风湿性关节炎、糖尿病、全身性红斑性狼疮)、神经退化性疾病(例如，亨廷顿舞蹈症及帕金森氏症)、心血管病症及疾病、血管病症及疾病、角膜病症及疾病、肝脏病症及疾病、甲状腺病症及疾病和/或肾脏病症及疾病。在一些实施方案中，施用低免疫性细胞的患者患有癌症。可由本文提供的低免疫性细胞治疗的例示性癌症包括，但不限于，B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和/或膀胱癌。在某些实施方案中，癌症患者通过施用本文提供的低免疫性CAR-T-细胞而治疗。
在一些实施方案中，本文提供的低免疫性细胞有用于治疗因存在于先前移植物的一种或多种抗原(诸如，例如，细胞移植物、输血、组织移植物和/或器官移植物)而敏感的患者。在某些实施方案中，先前移植物为同种异体移植物并且患者对来自同种异体移植物的一种或多种同种异体抗原敏感。同种异体移植物包括，但不限于，同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和/或同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者是为怀孕或曾经怀孕的敏感性患者(例如，有或曾经有在怀孕的同种异体免疫作用)。在某些实施方案中，患者因包括在先前移植物中的一种或多种抗原而敏感，其中，先前移植物为修饰的人细胞、组织和/或器官。在一些实施方案中，修饰的人细胞、组织和/或器官为修饰的自体人细胞、组织和/或器官。在一些实施方案中，先前移植物为非人细胞、组织和/或器官。在例示性实施方案中，先前移植物为修饰的非人细胞、组织和/或器官。在某些实施方案中，先前移植物为包括人类组分的嵌合体。在某些实施方案中，先前移植物为和/或包含CAR-T-细胞。在某些实施方案中，先前移植物为自体移植物并且患者对来自自体移植物的一种或多种自体抗原敏感。在某些实施方案中，先前移植物为自体细胞、组织和/或器官。在一些实施方案中，敏感性患者先前已接受同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法。自体CAR-T细胞为主的疗法的非限制性例子包括布卡巴吉奥仑赛西卡思罗/>艾卡巴吉维赛/>利基迈仑赛马拉赛替沙津鲁/>来自Cartesian Therapeutics的Descartes-08与Descartes-11、来自Novartis的CTL110、来自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101和来自Autolus Limited的AUTO4。同种异体CAR-T细胞为主的疗法的非限制性例子包括来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B与PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819和来自Clyad Oncolo gy的CYAD-211。在一些实施方案中，在患者已先前接受包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法(不包括本技术的细胞)的第一疗法之后，敏感性患者被施用包含本技术的细胞的第二疗法。在一些实施方案中，在患者已先前接受包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法(不包括本技术的细胞)的第一和/或第二疗法之后，然后敏感性患者被施用包含本技术的细胞的第三疗法。在一些实施方案中，在患者已先前接受包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法(不包括本技术的细胞)的一系列疗法之后，然后敏感性患者被施用包含本技术的细胞的后续疗法。在一些实施方案中，(i)在失败的治疗诸如，但不限于，不包含本文提供的细胞的同种异体或自体CAR-T细胞为主的疗法之后，(ii)在治疗上无效的治疗诸如，但不限于，不包含本文提供的细胞的同种异体或自体CAR-T细胞为主的疗法之后，或(iii)在有效治疗诸如，但不限于，不包含本文提供的细胞的同种异体或自体CAR-T细胞为主的疗法(在某些例子中在一些实施方案中，包括后续的治疗第一线、第二线、第三线和额外线)之后，本文提供的方法用作为特定病症或疾病的在线治疗。
在某些实施方案中，敏感性患者患有过敏症且对一种或多种过敏原敏感。在例示的实施方案中，患者患有枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和/或异位性皮肤炎。
鉴于本公开，本领域已知的任何合适的方法都可用于确定患者是否为敏感性患者。确定患者是否为敏感性患者的方法的例子包括，但不限于，细胞为主的检定，包括补体依赖性细胞杀伤(CDC)和流式细胞术检定，及固相检定，包括ELISA和基于聚苯乙烯珠为主的阵列检定。用于确定患者是否为敏感性患者的方法的其他例子包括，但不限于，抗体筛选方法、百分比盘反应性抗体(PRA)测试、Luminex为主的检定，例如，使用单抗原珠(SAB)和Luminex IgG检定、评估HLA抗体的平均荧光强度(MFI)值、计算盘反应性抗体(cPRA)检定、IgG滴定测试、补体结合检定、IgG亚型检定和/或于Colvin等人，Circulation.2019Mar 19；139(12)：e553-e578中所述者。
在一些实施方案中，使用主体低免疫性细胞经历治疗的患者接受先前治疗。在一些实施方案中，使用低免疫性细胞治疗与先前治疗相同的病症。在一些实施方案中，使用低免疫性细胞治疗与先前治疗不同的病症。在一些实施方案中，施用到患者的低免疫性细胞呈现增强的治疗效果以治疗先前治疗所治疗的相同病症或疾病。在一些实施方案中，相较于先前治疗，所施用的低免疫性细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果。在例示性实施方案中，相较于先前治疗，所施用的细胞对癌症细胞呈现增强的潜力、效力和/或特异性。在特定实施方案中，低免疫性细胞为CAR-T-细胞，以治疗癌症。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以用作失败治疗后、治疗无效的治疗后或在有效治疗之后的针对特定病症或疾病的下一个在线治疗，包括在第一线、第二线、第三线和额外线治疗后的各情况中。在一些实施方案中，先前治疗(例如，第一线治疗)为治疗无效的治疗。如本文所用，“治疗无效”的治疗是指在患者中产生低于所需的临床结果的治疗。例如，对于细胞缺陷的治疗，治疗上无效的治疗可以指以下治疗：没有达到所需水平的功能性细胞和/或细胞活动来替代患者中的缺陷细胞，和/或缺乏治疗持久性。对于癌症治疗，治疗无效的治疗是指未达到所需水平的潜力、效力和/或特异性的治疗。可以使用本领域已知的任何合适的技术测量治疗效果。在一些实施方案中，患者对先前治疗产生免疫反应。在一些实施方案中，先前治疗为被患者排斥的细胞、组织和/或器官移植物。在一些实施方案中，先前治疗包括机械辅助的治疗。在一些实施方案中，机械辅助的治疗包括血液透析或心室辅助装置。在一些实施方案中，患者对机械辅助的治疗产生免疫反应。在一些实施方案中，先前治疗包括一群治疗细胞，其包括万一它们以非所需的方式生长和分裂，当安全性开关被活化时，导致治疗细胞死亡的安全性开关。在一些实施方案中，因为安全性开关诱导的治疗细胞死亡，患者产生免疫反应。在一些实施方案中，患者对之前的治疗敏感。在例示的实施方案中，患者没有因所施用的低免疫性细胞而敏感。
在一些实施方案中，提供组织、器官和/或部分器官移植物到有其需要的患者之前、同时和/或之后，施用主体低免疫性细胞。在一些实施方案中，患者未对低免疫性细胞呈现免疫反应。在一些实施方案中，施用低免疫性细胞到患者用于治疗特定组织和/或器官中的细胞缺陷并且患者后续为了相同特定组织或器官接受组织或器官移植物。在一些实施方案中，施用低免疫性细胞到患者用于移植的组织或器官中的原位。在一些实施方案中，组织或器官移植物之前或之后，施用低免疫性细胞到患者于组织或器官中的原位。在此实施方案中，低免疫性细胞治疗作用为到最终组织或器官替换的桥接疗法。例如，在一些实施方案中，患者患有肝脏失调且在接受肝脏移植物之前，接受本文提供的低免疫性肝细胞治疗。在一些实施方案中，患者患有肝脏失调且在接受肝脏移植物之后，接受如本文提供的低免疫性肝细胞治疗。在一些实施方案中，施用低免疫性细胞到患者以治疗特定组织和/或器官中的细胞缺陷并且患者后续为了不同组织或器官接受组织和/或器官移植物。例如，在一些实施方案中，在接受肾脏移植物之前，患者为以低免疫性胰脏β细胞治疗的糖尿病患者。在一些实施方案中，在接受肾脏移植物之后，患者为以低免疫性胰脏β细胞治疗的糖尿病患者。在一些实施方案中，在患者接受组织或器官移植物之前和/或之后，低免疫性细胞治疗被施用到供体组织和/或器官。在一些实施方案中，方法用于治疗细胞缺陷。在例示性实施方案中，组织或器官移植物为心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物和/或骨头移植物。
治疗患者的方法一般来说是通过施用细胞，特别是本文提供的低免疫性细胞。应当理解，对于本文描述的与细胞和/或治疗时机相关的所有多个实施方案，细胞的施用是通过导致所引入的细胞至少部分局部化在所需位点的方法或途径来完成。细胞可以直接植入到所需位点，或者通过任何合适的途径施用，所述途径导致递送到受试者的所需位置，其中至少部分所植入的细胞或细胞的组分保持存活。在一些实施方案中，细胞经原位植入于所需器官或器官的所需位置。在一些实施方案中，在患者接受组织或器官移植物之前和/或之后，细胞可以植入到供体组织和/或器官。在一些实施方案中，施用细胞以治疗疾病或失调，诸如可以通过细胞疗法缓解的任何疾病、失调、病症和/或其症状。
在一些实施方案中，在患者敏感之后，施用所述群细胞至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周或至少1个月或更久。在一些实施方案中，在患者敏感或呈现敏感的特性或特征之后，施用所述群细胞至少1周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更久)或更久。在一些实施方案中，在患者已接受移植物(例如，同种异体移植物)、已怀孕(例如，有或曾经有在怀孕的同种异体免疫作用)和/或敏感和/或呈现敏感的特性和/或特征之后，施用所述群细胞至少1个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月或更久)或更久。
在一些实施方案中，已接受移植物、已怀孕(例如，有或曾经有在怀孕的同种异体免疫作用)和/或对抗原(例如，同种异体抗原)敏感的患者被施用给药方案，其包含第一剂量施用的一群本文所述的细胞、第一剂量之后的恢复期间和第二剂量施用的一群所述的细胞。在一些实施方案中，存在于第一群细胞与第二群细胞的细胞类型的复合物不同。在某些实施方案中，存在于第一群细胞与第二群细胞的细胞类型的复合物相同或实质上均等。在许多实施方案中，第一群细胞与第二群细胞包含相同细胞类型。在一些实施方案中，第一群细胞与第二群细胞包含不同细胞类型。在一些实施方案中，第一群细胞与第二群细胞包含相同百分比的细胞类型。在其他实施方案中，第一群细胞与第二群细胞包含不同百分比的细胞类型。
在一些实施方案中，施用所述群细胞用于治疗细胞缺陷和/或作为治疗选自下列所组成的组的组织和/或器官中的病症或疾病的细胞疗法：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜、脑、脊髓和/或骨头。
在一些实施方案中，细胞缺陷与神经退化性疾病相关且细胞疗法用于治疗神经退化性疾病。在一些实施方案中，神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和/或佩梅病(PMD)。在一些实施方案中，细胞选自下列所组成的组：神经胶质祖细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元，视需要地，其中，多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元。在一些实施方案中，细胞缺陷与肝脏疾病相关且细胞疗法用于治疗肝脏疾病。在一些实施方案中，肝脏疾病包含肝脏的硬化。在一些实施方案中，细胞是肝细胞或肝祖细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与角膜疾病相关且细胞疗法用于治疗角膜疾病。在一些实施方案中，角膜疾病为富克斯氏营养不良或先天遗传性内皮营养不良。在一些实施方案中，细胞是角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与心血管病症或疾病相关且细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病。在一些实施方案中，心血管疾病为心肌梗塞和/或充血性心力衰竭。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞或心脏祖细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与糖尿病相关且细胞疗法用于治疗糖尿病。在一些实施方案中，细胞是胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞，视需要地，其中，胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与相关血管病症或疾病且细胞疗法用于治疗血管病症或疾病。在一些实施方案中，细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关且细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎。在一些实施方案中，细胞是甲状腺祖细胞。在一些实施方案中，细胞缺陷与肾脏疾病相关且细胞疗法用于治疗肾脏疾病。在一些实施方案中，细胞是肾前驱细胞或肾细胞。
在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗癌症且所述群细胞为一群CAR-T细胞。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
在一些实施方案中，患者正接受组织或器官移植物，视需要地，其中，组织或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和/或部分角膜移植物。
在一些实施方案中，组织或器官移植物为同种异体移植移植物。在一些实施方案中，组织或器官移植物为自体移植移植物。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代相同的组织或器官。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织和/或器官中的细胞缺陷并且组织和/或器官移植物是替代不同组织或器官。在一些实施方案中，器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群肾前驱细胞或肾细胞。在一些实施方案中，患者患有糖尿病且所述群细胞为一群β胰岛细胞。在一些实施方案中，器官移植物为心脏移植物并且所述群细胞为一群心脏祖细胞或起搏细胞。在一些实施方案中，器官移植物为胰脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。在一些实施方案中，器官移植物为部分肝脏移植物并且所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。
在一些实施方案中，恢复期间一群低免疫性细胞的第一施用之后开始且当此细胞不再存在于患者或无法在患者中检测到时结束。在一些实施方案中，恢复期间的持续时间为初始施用细胞之后至少1周(例如，1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周或更久)或更久。在一些实施方案中，恢复期间的持续时间为初始施用细胞之后至少1个月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月或更久)或更久。
在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞在患者中引起减少或降低水平的全身性TH1活化。在一些例子中，细胞所引起的全身性TH1活化的水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％更低于相较于通过施用免疫性细胞所产生的全身性TH1活化的水平。在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞未引起患者中全身性TH1活化。
在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞在患者中引起减少或降低水平的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化。在一些例子中，细胞所引起的PBMC的免疫活化的水平至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％更低于相较于通过施用免疫性细胞所产生的PBMC的免疫活化的水平。在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞未患者中的引起PBMC的免疫活化。
在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞在患者中引起减少或降低水平的供体特异性IgG抗体。在一些例子中，细胞所引起的供体特异性IgG抗体的水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％更低于相较于通过施用免疫性细胞所产生的供体特异性IgG抗体的水平。在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞未引起患者中的供体特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞在患者中引起减少或降低水平的IgM与IgG抗体生成。在一些例子中，细胞所引起的IgM与IgG抗体生成的水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％更低于相较于通过施用免疫性细胞所产生的IgM与IgG抗体生成的水平。在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞未引起患者中的IgM与IgG抗体生成。
在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞在患者中引起减少或降低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些例子中，细胞所引起的细胞毒性T细胞杀伤的水平为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％更低于相较于通过施用免疫性细胞所产生的细胞毒性T细胞杀伤的水平。在一些实施方案中，所施用的一群低免疫性细胞未引起患者中的细胞毒性T细胞杀伤。
如上所讨论，本文提供为在某些实施方案中，可施用到对同种异体抗原，诸如，人白细胞抗原敏感的患者的细胞。在一些实施方案中，患者正在或已怀孕，例如，在怀孕时有同种异体免疫作用(例如，胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT))。换句话说，患者患有或曾经患有与在怀孕的同种异体免疫作用相关的失调或病症，诸如，但不限于，胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)和胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。在一些实施方案中，患者已接受同种异体移植物，诸如，但不限于，同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物或同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者对同种异体抗原呈现记忆B细胞。在一些实施方案中，患者对同种异体抗原呈现记忆T细胞。此患者可对同种异体抗原呈现记忆B与记忆T细胞二者。
在施用所述的细胞时，相较于对无低免疫性的细胞的反应，患者呈现无全身性免疫反应或降低水平的全身性免疫反应。在一些实施方案中，相较于对无低免疫性的细胞的反应，患者呈现无适应性免疫反应或降低水平的适应性免疫反应。在一些实施方案中，患者相较于对无低免疫性的细胞的反应，呈现无先天性免疫反应或降低水平的先天性免疫反应。在一些实施方案中，相较于对无低免疫性的细胞的反应，患者呈现无T细胞反应或降低水平的T细胞反应。在一些实施方案中，相较于对无低免疫性的细胞的反应，患者呈现无B细胞反应或降低水平的B细胞反应。
如本文进一步详细描述，本文提供包括外源性CD47多肽及降低表达的MHC I类人白细胞抗原的一群低免疫性细胞、包括外源性CD47多肽及降低表达的MHC II类人白细胞抗原的一群低免疫性细胞和包括外源性CD47多肽及降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原的一群低免疫性细胞。
B.低免疫性细胞
本文提供为包含调变MHC I分子、MHC II分子或MHC I与MHC II分子的表达的一种或多种目标多核苷酸序列的修饰的细胞。在某些方面中，修饰包含CD47的增加表达。在一些实施方案中，细胞包括降低MHC I类分子的表达的一种或多种短暂修饰或基因组修饰及增加CD47的表达的修饰。换句话说，工程改造的细胞包含编码CD47蛋白质的外源性多核苷酸以及呈现降低或沉默的一种或多种MHC I类分子的表面表达。在一些实施方案中，细胞包括降低MHC II类分子的表达的一种或多种基因组修饰及增加CD47的表达的修饰。在一些例子中，工程改造的细胞包含外源性CD47核酸与蛋白质及呈现降低或沉默的一种或多种MHC I类分子的表面表达。在一些实施方案中，细胞包括降低或消除MHC II类分子的表达的一种或多种基因组修饰、降低或消除MHC II类分子的表达的一种或多种基因组修饰和增加CD47的表达的修饰。在一些实施方案中，工程改造的细胞包含外源性CD47蛋白质、呈现降低或沉默的一种或多种MHC I类分子的表面表达及呈现降低或缺乏一种或多种MHC II类分子的表面表达。在许多实施方案中，细胞是B2M indel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg细胞。
MHC I和/或MHC II表达的降低可以例如通过下述的一种或多种完成：(1)直接靶向多形态性HLA对偶基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和MHC-II基因；(2)移除B2M，其将降低所有MHC-I分子的表面运输；和/或(3)删除MHC强化体的一种或多种组分，诸如，对HLA表达重要的LRC5、RFX-5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。
在某些实施方案中，HLA表达受到干扰。在一些实施方案中，HLA表达受到通过靶向个别HLA(例如，HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的剔除表达)、靶向HLA表达的转录调控子(例如，NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的剔除表达)、阻断MHCI类分子的表面运输(例如，B2M和/或TAP1的剔除表达)和/或靶向HLA-Razor(见，例如，WO2016183041)的干扰。
在某些方面中，本文所公开的包括干细胞或分化的干细胞的细胞不表达对应MHC-I和/或MHC-II的一种或多种人白细胞抗原(例如，HLA-A、HLA-B和/或HLA-C)且因此特征化为低免疫性。例如，在某些方面中，本文所公开的包括干细胞或分化的干细胞的细胞已经修饰使得由此制备的干细胞或分化的干细胞不表达或呈现降低表达的一种或多种下述MHC-I分子：HLA-A、HLA-B及HLA-C。在一些实施方案中，一种或多种的HLA-A、HLA-B及HLA-C可经细胞的“剔除”。具有剔除的HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可呈现各剔除的基因降低或消除的表达。
在某些实施方案中，通过靶向HLA基因中的保留区域而允许同时缺失所有MHC I类对偶基因的引导RNA被鉴定为HLA Razor。在一些实施方案中，引导RNA是CRISPR系统的一部分，例如，CRISPR-Cas9系统。在替代方面中，gRNA是TALEN系统的一部分。在一方面中，WO2016183041中描述靶向HLA中经鉴定的保留区域的HLA Razor。在其他方面中，使用靶向经鉴定的保留区域的多个HLA Razor。一般来说了解任何靶向HLA中保留区域的引导可以作为HLA Razor。
在一些实施方案中，细胞包括修饰以增加CD47和选自下列所组成的组的一种或多种因子的表达：DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3和Serpinb9。
在一些实施方案中，细胞包含调控MHC I类分子、MHC II类分子或MHC I类和MHCII类分子的表达的一种或多种目标多核苷酸序列的基因组修饰。在一些实施方案中，使用基因编辑系统以修饰一种或多种目标多核苷酸序列。在一些实施方案中，经靶向的多核苷酸序列为选自群组的一者或多者：包括B2M、CIITA和NLRC5。在一些实施方案中，细胞包含对B2M基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对NLRC5基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和CIITA基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M及NLRC5基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA及NLRC5基因的基因编辑修饰。在特定实施方案中，细胞包含对B2M、CIITA及NLRC5基因的基因编辑修饰。在一些实施方案中，细胞的基因组已经改变以降低或删除HLA表达的重要组份。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞或CAR-T细胞)或其群，其包含其中基因已经编辑以删除基因组DNA的邻接伸展的基因组，从而降低或消除细胞或其群中MHC I类分子的表达，例如，细胞或其群中MHC I类分子的表面表达。在某些方面中，本公开提供细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞或CAR-T细胞)或其群，其包含其中基因已经编辑以删除基因组DNA的邻接伸展的基因组，从而降低或消除细胞或其群中MHC II类分子的表面表达。在特定方面中，本公开提供细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞或CAR-T细胞)或其群，其包含其中一种或多种基因已经编辑以删除基因组DNA的邻接伸展的基因组，从而降低或消除细胞或其群中MHC I类与II分子的表面表达。
在某些实施方案中，通过靶向和删除基因组DNA的邻接伸展而调变MHC I分子和/或MHC II分子的表达，从而降低或消除选自下列所组成的组的目标基因的表达：B2M、CIITA和NLRC5。在一些实施方案中，本文所述为经基因编辑的细胞(例如，修饰的人细胞)，其含外源性CD47蛋白质及未经活化的或修饰的CIITA基因序列和在一些例子中，未活化或修饰B2M基因序列的额外的基因修饰。在一些实施方案中，本文所述为经基因编辑的细胞，其包含外源性CD47蛋白质及未经活化或修饰的CIITA基因序列和在一些例子中，未活化或修饰NLRC5基因序列的额外的基因修饰。在一些实施方案中，本文所述为经基因编辑的细胞，其包含外源性CD47蛋白质及未经活化或修饰的B2M基因序列和在一些例子中，未活化或修饰NLRC5基因序列的额外的基因修饰。在一些实施方案中，本文所述为经基因编辑的细胞，其包含外源性CD47蛋白质及未经活化或修饰的B2M基因序列和在一些例子中，未活化或修饰CIITA基因序列及NLRC5基因序列的额外的基因修饰。
在一些实施方案中，细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞为原代T细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的T细胞。
在一些实施方案中，细胞是B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-和CD47tg细胞。在一些实施方案中，B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-和CD47tg细胞为原代T细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包括，但不限于，多能干细胞、诱导性多能干细胞、源自或自此干细胞产生的分化的细胞、造血干细胞、原代T细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞和其任何子代。
在一些实施方案中，原代T细胞选自包括下述的组：细胞毒性T-细胞、辅助型T-细胞、记忆T-细胞、调控T-细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和其组合。
在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括选自下列所组成的组的一种或多种基因组修饰：B2M、CIITA、TRAC和TRB基因。在一些实施方案中，低免疫T细胞和原代T细胞过表达CD47和CAR，并且包括B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，细胞是还表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-和CD47tg细胞。
在一些实施方案中，细胞是还表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-和CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是还表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-和CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是还表达CAR的B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel和CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是还表达CAR的B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRBindel/indel和CD47tg细胞。在许多实施方案中，细胞是还表达CAR的B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel、TRBindel/indel和CD47tg细胞。在一些实施方案中，所述的修饰的细胞为多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此多能干细胞与诱导性多能干细胞分化的细胞或原代T细胞。原代T细胞的非限制性例子包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T细胞、调控T(Treg)细胞、非调控T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T-滤泡辅助型(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应子T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应子记忆T(Tem)细胞、效应子记忆T细胞表达CD45RA(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天性记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括下述的组：细胞毒性T-细胞、辅助型T-细胞、记忆T-细胞、调控T-细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或其组合。
在一些实施方案中，原代T细胞是来自不同于接受者受试者(例如，施用细胞的患者)的一种或多种供体受试者的原代T细胞池。原代T细胞可得自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可得自1或多个、2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、7或更多、8或更多、9或更多、10或更多20或更多、50或更多或100或更多供体受试者并汇集在一起。在一些实施方案中，原代T细胞是从一个或多个受试者获取，并且在一些例子中，原代T细胞或原代T细胞池是试管内培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞池经工程改造以外源性表达CD47和在试管内培养。
在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞池经工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR可为任何发明所属技术领域中具有通常知识者已知者。有用的CAR包括结合选自包括下述的组的抗原者：CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA。在一些例子中，CAR相同或等同于FDA-批准的CAR-T细胞疗法中所用者，诸如，但不限于，布卡巴吉奥仑赛、西卡思罗、艾卡巴吉维赛、利基迈仑赛马拉赛、替沙津鲁或其他在临床试验中接受研究者中所用者。
在一些实施方案中，相较于未修饰的原代T细胞，原代T细胞或原代T细胞池经工程改造以呈现降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，相较于未修饰的原代T细胞，原代T细胞或原代T细胞池经工程改造以呈现降低表达的CTLA4、PD1或CTLA4与PD1二者。基因修饰包括T细胞的细胞的方法详细描述于例如，WO2020018620与WO2016183041，所述公开整体包括表、附件、序列表和图式以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，CAR-T细胞包含选自包括下列的群组的CAR：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在一些实施方案中，CAR-T细胞包含CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜和一种或多种信号传递结构域。在一些实施方案中，CAR也包含接头。在一些实施方案中，CAR包含CD19抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD28或CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CAR包含Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQID NO：14)。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域选自包括，但不限于下述的群组，(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特征；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自包括下述的组：抗体、抗原结合部分或其片段、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138或BCMA。在一些实施方案中，抗原结合结构域为抗-CD19 scFv，诸如，但不限于FMC63。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含选自包括下述的组之一：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B和其功能性变体的跨膜区域。
在一些实施方案中，CAR的信号传递结构域包含共刺激结构域。例如，信号传递结构域可包含一个共刺激结构域。或者，信号传递结构域可包含一个或多个共刺激结构域。在某些实施方案中，信号传递结构域包含一个共刺激结构域。在其他实施方案中，信号传递结构域包含多个共刺激结构域。在一些例子中，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域，两个共刺激结构域不为相同。在一些实施方案中，共刺激结构域包含不相同的两个共刺激结构域。在一些实施方案中，在T细胞活化期间，所述一个共刺激结构域增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。在一些实施方案中，在T细胞活化期间，所述多个共刺激结构域增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
如本文所述，第四代CAR可包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。在一些例子中，细胞因子基因为低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些例子中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性细胞因子选自包括下述的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因的表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3 zeta(CD3ζ)结构域或免疫受体(immunoreceptor)酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3 zeta结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在其他实施方案中，CAR包含(i)CD3 zeta结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3 zet a结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链和跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
发明所属技术领域中具有通常知识者已知用于引入CAR构建体或产生CAR-T细胞的方法。详细描述可见于，如，Vormittag等人，Curr Opin Biotechnol.,2018,53,162-181；以及Eyquem等人，Nature,2017,543,113-117。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体，例如通过破坏内源性T细胞受体基因(例如，T细胞受体α恒定区(称为“TRAC”)和/或T细胞受体β恒定区(称为“TRBC”或“TRB”)。在一些实施方案中，编码本文所公开的多肽(例如，本文所公开的嵌合抗原受体、CD47或另一耐受原因子)的外源性核酸插入到经破坏的T细胞受体基因中。在一些实施方案中，编码多肽的外源性核酸插入到TRAC或TRB基因基因座。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。降低或消除CTLA4、PD1和CTLA4与PD1二者的表达的方法可包括发明所属技术领域中具有通常知识者认知的任何方法，诸如，但不限于，利用稀有切割核酸内切酶与RNA沉默或RNA干扰技术的基因修饰技术。稀有切割核酸内切酶的非限制性例子包括任何Cas蛋白质、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和/或归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，编码本文所公开的多肽(例如，本文所公开的嵌合抗原受体、CD47或另一耐受原因子)的外源性核酸插入到CTLA4和/或PD1基因基因座。
在一些实施方案中，CD47转基因插入到细胞的预选的基因座。在一些实施方案中，转基因编码CAR插入到细胞的预选的基因座。在许多实施方案中，CD47转基因与编码CAR的转基因插入到细胞的预选的基因座。预选的基因座可为安全港基因座或目标基因座。安全港基因座的非限制性例子包括，但不限于，CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因基因座、CLYBL基因基因座和/或Rosa基因基因座(例如，ROSA26基因基因座)。目标基因座的非限制性例子包括，但不限于，CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也已知为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也已知为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D基因(也已知为HY)、B2M基因、CIITA基因、TRAC基因、TRBC基因、CCR5基因、F3(即，CD142)基因、MICA基因、MICB基因、LRP1基因、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D(即，HY)基因、PDGFRa基因、OLIG2基因和/或GFAP基因。在一些实施方案中，预选的基因座选自下列所组成的组：B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，预选的基因座为B2M基因座。在一些实施方案中，预选的基因座为CIITA基因座。在一些实施方案中，预选的基因座为TRAC基因座。在一些实施方案中，预选的基因座为TRB基因座。
在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到相同基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到不同基因座。在许多例子中，CD47转基因插入到安全港或目标基因座。在许多例子中，转基因编码CAR插入到安全港或目标基因座。在一些例子中，CD47转基因插入到B2M基因座。在一些例子中，转基因编码CAR插入到B2M基因座。在一些实施方案中，CD47转基因插入到CIITA基因座。在一些实施方案中，转基因编码CAR插入到CIITA基因座。在一些实施方案中，CD47转基因插入到TRAC基因座。在一些实施方案中，转基因编码CAR插入到TRAC基因座。在其他实施方案中，CD47转基因插入到TRB基因座。在其他实施方案中，转基因编码CAR插入到TRB基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港基因座(例如，CCR5基因基因座、PPP1R12C基因基因座、CLYBL基因基因座和/或Rosa基因基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到目标基因座(例如，CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也已知为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也已知为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D基因(也已知为HY)、B2M基因、CIITA基因、TRAC基因、TRBC基因、CCR5基因、F3(即，CD142)基因、MICA基因、MICB基因、LRP1基因、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、KDM5D(即，HY)基因、PDGFRa基因、OLIG2基因和/或GFAP基因。
在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或目标基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过单一启动子控制且插入到安全港或目标基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过其自身的启动子控制且插入到安全港或目标基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRAC基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过单一启动子控制且插入到TRAC基因座。在许多实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过其自身的启动子控制且插入到TRAC基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRB基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过单一启动子控制且插入到TRB基因座。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过其自身的启动子控制且插入到TRB基因座。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到B2M基因座。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过单一启动子控制且插入到B2M基因座。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过其自身的启动子控制且插入到B2M基因座。在各种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因插入到CIITA基因座。在各种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过单一启动子控制且插入到CIITA基因座。在各种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因通过其自身的启动子控制且插入到CIITA基因座。在一些例子中，控制所述任何转基因的表达的启动子为组成型启动子。在其他例子中，针对所述任何转基因的启动子为可诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子为EF1 alpha(EF1α)启动子。在一些实施方案中，启动子为CAG启动子。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因二者受到组成型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因二者受到可诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受到组成型启动子控制而编码CAR的转基因受到可诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受到可诱导型启动子控制而编码CAR的转基因受到组成型启动子控制。在各种实施方案中，CD47转基因受到EF1 alpha启动子控制而编码CAR的转基因受到EF1 alpha启动子控制。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因二者的表达受到单一EF1 alpha启动子控制。在各种实施方案中，CD47转基因受到CAG启动子控制而编码CAR的转基因。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因二者的表达受到单一CAG启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受到CAG启动子控制而编码CAR的转基因受到EF1 alpha启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受到EF1 alpha启动子控制而编码CAR的转基因受到CAG启动子控制。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含安全开关。本文使用的术语“安全开关”是指控制感兴趣的基因或蛋白质的表达的系统，当下调控或上调控时，导致细胞清除或死亡，例如，通过宿主免疫系统的辨识。安全开关可以设计为在发生不良临床事件时由外源性分子触发。可以通过调控在DNA、RNA和蛋白质水平的表达来工程改造安全开关。安全开关包括允许控制回应不良事件的细胞活性的蛋白质或分子。在一个实施方案中，安全开关为“切断开关(kill switch)”，其以不活跃状态表达并且在通过选择性、外部提供的剂活化开关时对表达安全开关的细胞是致命。在一个实施方案中，安全开关基因是与构建体中感兴趣的基因相关的顺式作用。安全开关的活化导致细胞通过细胞凋亡或坏死仅杀死自身或杀死自身和邻近细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化的细胞，包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、CART细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞，包含安全开关。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含“自杀基因”(或“自杀开关”)。如果低免疫性细胞以非所需的方式生长和分裂，自杀基因可导致低免疫性细胞死亡。自杀基因消融方法包括在编码蛋白质的基因转移载体中的自杀基因，其只有在特异性化合物活化时才会导致细胞杀伤。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化为高度毒性代谢物的酶。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化的细胞、包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、CART细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞，包含自杀基因。
在一些实施方案中，在施用到接受者受试者后，所述的一群工程改造的细胞引起降低量的免疫活化或无免疫活化。在一些实施方案中，降低的免疫反应是与被施用一群“野生型”细胞的患者或对照受试者的免疫反应比较。在一些实施方案中，细胞在接受者受试者中引起降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化。在一些实施方案中，细胞在接受者受试者中引起降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，在施用到接受者受试者后，细胞引起对细胞降低量的供体特异性IgG抗体或无供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，细胞在接受者受试者中引起对细胞降低量的IgM与IgG抗体生成或无IgM与IgG抗体生成。在一些实施方案中，在施用到接受者受试者后，细胞引起降低量的细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
1.源自T细胞和源自iPSC的治疗细胞
本文提供为低免疫性细胞，其包括，但不限于，逃脱免疫辨识的T细胞。在一些实施方案中，自多能干细胞，诸如，iPSC、MSC和/或ESC产生(例如，生成、培养或衍生)低免疫性细胞。在一些实施方案中，自T细胞，诸如，原代T细胞产生(例如，生成、培养或衍生)低免疫性细胞。在一些例子中，自受试者或个体获得(例如，获取、萃取、移出或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，原代T细胞自T细胞池产生使得T细胞是来自一位或多位受试者(例如，一种或多种人类包括一种或多种健康人类)。在一些实施方案中，T细胞池来自1至100、1至50、1至20、1至10、1或多、2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、10或更多、20或更多、30或更多、40或更多、50或更多或100或更多受试者。在一些实施方案中，供体受试者不同于患者(例如，施用治疗细胞的接受者)。在一些实施方案中，T细胞池不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，获得T细胞池的一个或多个供体受试者不同于患者。
在一些实施方案中，低免疫性细胞未活化患者(例如，在施用的接受者)的免疫反应。提供为治疗失调的方法，其包含重复给药一群低免疫性细胞到有其需要的受试者(例如，接受者)或患者。在一些实施方案中，施用一群低免疫性细胞(例如，低免疫性原代T细胞)至少二次(例如，2、3、4、5或更多)到人患者。
在一些实施方案中，低免疫性细胞未活化患者的免疫反应(例如，在施用的接受者)。提供为通过施用一群低免疫性细胞到有其需要的受试者(例如，接受者)或患者以治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞包含经工程改造(例如，经修饰)以表达嵌合抗原受体，包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体的T细胞。在一些例子中，T细胞来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造的或修饰的T细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。
在一些实施方案中，本技术是针对过表达CD47与CAR，并且具有降低表达或缺乏表达的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原及具有降低表达或缺乏表达的TCR复合物分子的低免疫性原代T细胞。本文所概述的细胞过表达CD47与CAR并逃脱免疫辨识。在一些实施方案中，原代T细胞展示降低水平或活性的MHC I类抗原、MHC II类抗原和/或TCR复合物分子。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47与CAR并在B2M基因拥有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47与CAR并在CIITA基因拥有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47与CAR并在TRAC基因拥有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47与CAR并在TRB基因拥有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47与CAR并在一个或多个下述基因拥有基因组修饰：B2M、CIITA、TRAC和TRB基因。
本公开的例示性T细胞选自下列所组成的组：细胞毒性T细胞、辅助型T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应子记忆T细胞、效应子记忆RA T细胞、调控T细胞、组织浸润淋巴细胞、其组合。在许多实施方案中，T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。在一些实施方案中，中央T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应子记忆T细胞表达PD1、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应子记忆RA T细胞表达PD1、CD57和CD45RA。
在一些实施方案中，T细胞为修饰的T细胞。在一些例子中，修饰的T细胞包含导致细胞表达至少一种嵌合抗原受体的修饰，其特异性结合到表达在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫性细胞、炎性细胞、恶性细胞、组织变形细胞、突变体细胞和其组合至少一者的表面的感兴趣的抗原或表位。在其他例子中，修饰的T细胞包含导致细胞表达至少一种蛋白质的修饰，其当细胞靠近相邻细胞、组织或器官时，调变相邻细胞、组织或器官中感兴趣的生物功效。对原代T细胞有用的修饰详细描述于US2016/0348073及WO2020/018620，其公开整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞包含经工程改造(例如，经修饰)以表达嵌合抗原受体，包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体的T细胞。在一些例子中，T细胞是来自一种或多种个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包括降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包括降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)。在其他实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包括降低表达的程序性细胞死亡(PD1)。在某些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包括降低表达的CTLA4与PD1。在某些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包括增强表达的PD-L1。
在一些实施方案中，低免疫性T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中，多核苷酸插入于基因组基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因。
2.嵌合抗原受体
本文提供为包含嵌合抗原受体(CAR)的低免疫性细胞。在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自本文提供的低免疫性多能细胞(HIP)(例如，多能干细胞)的原代T细胞或T细胞。在一些实施方案中，CAR选自下列所组成的组：第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)(包含抗原结合结构域)的多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞包含嵌合抗原受体(CAR)(包含抗原结合结构域)。在一些实施方案中，多核苷酸为或包含嵌合抗原受体(CAR)(包含抗原结合结构域)。在一些实施方案中，CAR为或包含第一代CAR(包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传递结构域(例如，一、二或三个信号传递结构域))。在一些实施方案中，CAR包含第二代CAR(包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域)。在一些实施方案中，CAR包含第三代CAR(包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域)。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR和在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域为或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞(例如，低免疫性原代T细胞或HIP-衍生的T细胞)包括编码CAR的多核苷酸，其中，多核苷酸插入于基因组基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP和/或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因。任何合适的方法可用于插入CAR到低免疫性细胞的基因组基因座，包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
a)抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤或癌症细胞的抗原特性
在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞的抗原特性。换句话说，抗原结合结构域靶向肿瘤或癌症细胞所表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关的抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞的抗原特性(例如，与肿瘤或癌症细胞相关的抗原)或肿瘤相关的抗原选自：细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白质偶合的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关的受体、类受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase)、组氨酸激酶相关的受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、纤维母细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体与Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2.EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白(Bestrophin)、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC运输蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇(sphingosin)-1-磷酸盐受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白质、多跨距跨膜蛋白质、T-细胞受体基序；T-细胞α链；T-细胞β链；T-细胞γ链；T-细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、颗粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG、CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、黏液素、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白质、神经节苷酯(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白(Tenascin)、PD-1L、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、斯莫森德(Smoothened)、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素(Mesothelin)、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、间白素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生的生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、EphrinB2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多涎酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPVE6、E7、ETV6-AML、精子蛋白质17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合体I类相关的基因蛋白质(MR1)、尿激酶-型胞浆素原活化子受体(uPAR)、Fos相关的抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白(prostein)、生存素(survivin)、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素(Galectin)8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄性素受体、周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC和/或其抗原片段或抗原部分。
b)ABD靶向T细胞的抗原特性
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞的抗原特性。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些例子中，此抗原是由T细胞表达或位于T细胞的表面。在一些实施方案中，T细胞的抗原特性或T细胞相关的抗原选自：T细胞的细胞表面受体、膜运输蛋白质(例如，主动或被动运输蛋白质诸如，例如，离子通道蛋白质、成孔蛋白质等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞黏着蛋白质特性。在一些实施方案中，T细胞的抗原特性可为G蛋白质偶合的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关的受体、类受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关的受体、AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD 3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK 3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JU N；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MA P2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MK K7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JN K3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SH P2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；和/或ZAP70。
c)ABD靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫或炎性失调相关的抗原。在一些例子中，抗原由与自身免疫或炎性失调相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫或炎性失调选自：慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古巴士德氏、眼色素层炎、肝炎、全身性硬化症或硬皮症、第I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素疾病、寻常型天疱疮、格雷氏疾病、自身免疫溶血性贫血、A型血友病、原代舍格伦综合征、血栓性血小板减少症紫斑症、视神经脊髓炎(neuromyelits optica)、Evan氏综合征、IgM介导的神经病变、冷凝球蛋白血症、皮肌炎、自发性血小板减少症、关节黏连性脊椎炎、大疱性类天疱疮、后天血管性水肿、慢性荨麻疹性、抗磷脂质脱髓鞘多发性神经病变和自身免疫血小板减少症或嗜中性白细胞减少症或纯红细胞再生不良，而同种异体免疫疾病的例示性非限制性例子包括同种异体敏感(allosensitization)(见，例如，Blazar等人，2015、Am.J.Transplant、15(4):931-41)和/或因造血或实体器官移植的异体敏感(xenosensitization)、输血、有胎儿同种异体敏感的怀孕、新生儿同种异体免疫血小板减少症、新生儿的溶血性疾病、对外来抗原的敏感，诸如，可与以酶或蛋白质替代疗法、血液产品和/或基因疗法治疗的遗传性或后天缺失失调的替代发生。同种异体敏感，在一些例子中，是指对接受者受试者或怀孕受试者的免疫系统视为是非自体抗原的人白细胞抗原的免疫反应(诸如，循环抗体)发展。在一些实施方案中，自身免疫或炎性失调的抗原特性选自：细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白质偶合的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关的受体、类受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶(receptor guanylyl cyclase)和/或组氨酸激酶相关的受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到在B细胞、浆细胞或浆母细胞上表达的配体。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合到CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。见，US 2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，其内容以引用方式并入本文。
d)ABD靶向衰老细胞的抗原特征
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞的抗原特征，例如，尿激酶-类型胞浆素原活化子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些例子中，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防由衰老细胞异常累积为特征的失调，例如，肝脏和肺脏纤维化、动脉硬化症、糖尿病和骨关节炎。
e)ABD靶向传染性疾病的抗原特征
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向传染性疾病的抗原特征。在一些实施方案中，ABD结合与传染性疾病相关的抗原。在一些例子中，抗原由受到传染性疾病影响的细胞表达。在一些实施方案中，其中，传染性疾病选自：HIV、肝炎B病毒、肝炎C病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8(HHV-8，卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV))、人T-亲淋巴性病毒-1(HTLV-1)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、猴病毒40(SV40)、Epstein-Barr二氏病毒、CMV、人乳突病毒。在一些实施方案中，传染性疾病的抗原特征选自：细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白质偶合的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关的受体、类受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关的受体、HIV Env、gpl20或在HIV-1Env的CD4-诱导的表位。
f)ABD结合到细胞的细胞表面抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到细胞的细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原为(例如，由下述表达)特定或特异性细胞类的特征。在一些实施方案中，细胞表面抗原为超过一种的细胞的特征。
在一些实施方案中，a CAR抗原结合结构域结合T细胞的细胞表面抗原特征，诸如，在T细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，T细胞的抗原特性可为细胞表面受体、膜运输蛋白质(例如，主动或被动运输蛋白质诸如，例如，离子通道蛋白质、成孔蛋白质等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞的细胞黏着蛋白质特征。在一些实施方案中，T细胞的抗原特性可为G蛋白质偶合的受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关的受体、类受体酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶和/或组氨酸激酶相关的受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体可为AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
g)跨膜结构域
在一些实施方案中，CAR-跨膜结构域包含至少T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能性变体的跨膜区域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含至少CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和/或FGFR2B和/或其功能性变体的跨膜区域。
h)信号传递结构域或多个信号传递结构域
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含一个或至少一个选自下述的一种或多种的信号传递结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD 27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNF RSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GIT R/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TN FSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4β1；整合素α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；Eph B6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；与抗原-1(LF A-1)相关的淋巴细胞功能；NKG2C、CD3ζ结构域、免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD 30、CD40、PD1、ICOS、与抗原-1(LFA-1)相关的淋巴细胞功能、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性与CD83结合的配体和/或其功能性片段。
在一些实施方案中，至少一个信号传递结构域包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少一个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，至少一个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少两个信号传递结构域包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少两个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在又其他实施方案中，至少一个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，至少两个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少三个信号传递结构域包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在其他实施方案中，至少三个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在又其他实施方案中，至少三个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，至少三个信号传递结构域包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少三个信号传递结构域包含CD8α或其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
i)在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域
在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR进一步包含在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对目标细胞为内源性或外源性，所述细胞包含CAR，其包含在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能性片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域为或包含转录因子或其功能性结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域为或包含转录因子或其功能性结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或功能性结构域或其片段为或包含经活化的T细胞(NFAT)的核因子、NF-kB或其功能性结构域或片段。见，例如，Zhang.C.等人，EngineeringCAR-T cells.Biomarker Research.5：22(2017)；WO 2016126608；Sha,H.等人，Chimaericantigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy.Bioscience ReportsJan 27,2017,37(1)。
在一些实施方案中，CAR进一步包含一种或多种间隔区或铰链，例如，其中，间隔区为介于抗原结合结构域及跨膜结构域之间的第一间隔区。在一些实施方案中，第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变异体或修饰的版本的至少一部份。在一些实施方案中，间隔区为介于跨膜结构域及信号传递结构域之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第二间隔区为寡肽，例如，其中，寡肽包含甘氨酸及丝氨酸残基，诸如，但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体(doublet)。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔区，例如，介于抗原结合结构域及跨膜结构域之间的间隔区与介于跨膜结构域及信号传递结构域之间的间隔区。在一些实施方案中，间隔区为CD28铰链、CD8a铰链或IgG4铰链。
在一些实施方案中，CAR进一步包含一种或多种接头。scFv的格式一般来说为由可挠性肽序列或“接头”呈定位VH-接头-VL或VL-接头-VH而连接的两个可变结构域。鉴于说明书发明所属技术领域中具有通常知识者已知的任何合适的接头可用于CAR。合适的接头的例子包括，但不限于，基于GS的接头序列和Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，接头为GS或gly-ser接头。例示性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n、以及(Gly4Ser)n和/或(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3，即，Ser(Gly4Ser)3。在一些实施方案中，n＝4，即，Ser(Gly4Ser)4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。在一些实施方案中，n＝7。在一些实施方案中，n＝8。在一些实施方案中，n＝9。在一些实施方案中，n＝10。另一例示性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一例示性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一例示性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一实施方案中，n＝6。另一例示性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一例示性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝l。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一实施方案中，n＝6。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中任一者包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域。在一些实施方案中，信号传递结构域在T细胞活化期间介导下游信号传递。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中任一者包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个信号传递结构域。在一些实施方案中，信号传递结构域在T细胞活化期间介导下游信号传递。在一些实施方案中，信号传递结构域为共刺激结构域。在一些实施方案中，在T细胞活化期间，共刺激结构域增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中任一者包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，信号传递结构域在T细胞活化期间介导下游信号传递。在一些实施方案中，信号传递结构域为共刺激结构域。在一些实施方案中，在T细胞活化期间，共刺激结构域增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和CAR-T细胞持续性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，至少两个共刺激结构域为不相同。
在一些实施方案中，本文所述的细胞中任一者包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少二、三或四个信号传递结构域。在一些实施方案中，信号传递结构域在T细胞活化期间介导下游信号传递。在一些实施方案中，信号传递结构域为共刺激结构域。在一些实施方案中，在T细胞活化期间，共刺激结构域增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和CAR-T细胞持续性。
j)包含抗体或其抗原结合部分的ABD
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域为或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域为或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含T-细胞α链抗体的scFv或Fab片段；T-细胞β链抗体；T-细胞γ链抗体；T-细胞δ链抗体；CCR7抗体；CD3抗体；CD4抗体；CD5抗体；CD7抗体；CD8抗体；CD11b抗体；CD11c抗体；CD16抗体；CD19抗体；CD20抗体；CD21抗体；CD22抗体；CD25抗体；CD28抗体；CD34抗体；CD35抗体；CD40抗体；CD45RA抗体；CD45RO抗体；CD52抗体；CD56抗体；CD62L抗体；CD68抗体；CD80抗体；CD95抗体；CD117抗体；CD127抗体；CD133抗体；CD137(4-1BB)抗体；CD163抗体；F4/80抗体；IL-4Ra抗体；Sca-1抗体；CTLA-4抗体；GITR抗体GARP抗体；LAP抗体；颗粒酶B抗体；LFA-1抗体；MR1抗体；uPAR抗体；或转铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中，CAR包含为共刺激结构域的信号传递结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含选自下列的一种或多种的共刺激结构域CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、与抗原-1(LFA-1)相关的淋巴细胞功能、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性与CD83结合的配体。在一些实施方案中，若CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域为不同。在一些实施方案中，若CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域为相同。
除了本文所述的CAR之外，各种CAR和编码的核苷酸序列是本领域已知并且将适用于如本文所述的体内和试管内目标细胞的融合体(fusosomal)递送与重编程(reprogramming)。见，例如，WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T,等人，Nature Nanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57，其公开内容以引用方式并入本文。
3.源自多能干细胞的治疗细胞
本文提供为低免疫性细胞，包括逃脱免疫辨识的源自多能干细胞的细胞。在一些实施方案中，细胞未活化患者或受试者(例如，在施用的接受者)的免疫反应。提供为治疗失调的方法，包括重复给药一群低免疫性细胞到有其需要的接受者受试者。
在一些实施方案中，多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞为经修饰以呈现降低表达的MHC I类人白细胞抗原。在其他实施方案中，多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞为经修饰以呈现降低表达的MHC II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞为经修饰以呈现降低表达的MHC I类与II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞为经修饰以呈现降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原且呈现增加的CD47表达。在一些例子中，细胞通过拥有编码耐受原因子的一种或多种转基因而过表达CD47。在一些实施方案中，多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞为经修饰以呈现降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原且呈现增加的耐受原因子表达。在一些例子中，细胞通过拥有一种或多种CD24转基因而过表达CD24。在一些例子中，细胞通过拥有一种或多种DUX4转基因而过表达DUX4。此多能干细胞为低免疫性多能细胞。此分化的细胞是低免疫性细胞。分化的细胞的例子包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞。
本文所述的多能干细胞任一可分化成有机体与组织的任何细胞。在一些实施方案中，细胞呈现降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。在一些例子中，与相同细胞类型的未经修饰或野生型细胞相比，MHC I和/或II类人白细胞抗原的表达为降低。在一些实施方案中，细胞呈现增加的CD47表达。在一些例子中，与相同细胞类型的未经修饰或野生型细胞相比，在本文所述的细胞中CD47的表达增加。降低MHC I和/或II类人白细胞抗原的量与增加CD47和一种或多种耐受原因子的表达的方法如本文所述。
在一些实施方案中，本文所述的方法中使用的细胞在施用到患者(例如，接受者受试者)时逃脱免疫辨识和反应。细胞可以在试管内与体内逃脱免疫细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞逃脱巨噬细胞和NK细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽视。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不被免疫系统的免疫细胞检测。在一些实施方案中，细胞是隐形的，因此可以避免免疫排斥。
测定多能干细胞和从此多能干细胞分化的任何细胞是否逃脱免疫辨识的方法包括，但不限于，IFN-γElispot检定、微胶细胞杀伤检定、细胞植入动物模型、细胞因子释放检定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放检定或Xcelligence分析的杀伤检定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。
本文所概述的治疗细胞有用于治疗失调，诸如，但不限于癌症、基因失调、慢性传染性疾病、自身免疫失调、神经失调等。
4.修饰的细胞的例示性实施方案
在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的MHC I类复合物的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的MHC II类复合物的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的MHC II类与MHC II类复合物的一种或多种分子。
在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的B2M。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的CIITA。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的NLRC5。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的B2M和CIITA的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的B2M与NLRC5的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的CIITA与NLRC5的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和降低表达的B2M、CIITA与NLRC5的一种或多种分子。本文所述的细胞中任一也可呈现增加表达的选自包括，但不限于下述所组成的组的一种或多种因子：DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8和Serpinb9。
在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的MHC I类复合物的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的MHC II类复合物的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的MHC II类与MHC II类复合物的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的B2M。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的CIITA。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的NLRC5。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的一种或多种分子B2M和CIITA。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的B2M与NLRC5的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的CIITA与NLRC5的一种或多种分子。在一些实施方案中，细胞和其群呈现增加表达的CD47和至少一种其他耐受原因子，以及降低表达的B2M、CIITA与NLRC5的一种或多种分子。在一些实施方案中，耐受原因子包括选自包括，但不限于下述群组中的任一者：DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8和Serpinb9。
发明所属技术领域中具有通常知识者将了解表达的量，诸如，增加或降低表达的基因、蛋白质或分子可经参考或经与可相比较的细胞相比。在一些实施方案中，具有增加表达的CD47的工程改造的干细胞是指相较于未修饰的干细胞，具有较高量的CD47蛋白质的修饰的干细胞。
在一个实施方案中，本文提供为表达外源性CD47多肽及具有降低表达的一种或多种MHC I类复合物蛋白质、一种或多种MHC II类复合物蛋白质或MHC I类与II类复合物蛋白质的任何组合的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞、CAR-T细胞和/或CAR-NK细胞)。在另一个实施方案中，细胞表达外源性CD47多肽且表达降低量的B2M和CIITA多肽。在一些实施方案中，细胞表达外源性CD47多肽且具有B2M和CIITA基因的基因修饰。在一些例子中，基因修饰使B2M和CIITA基因失去活性。
在一些实施方案中，细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞、CAR-T细胞和/或CAR-NK细胞)具有使B2M和CIITA基因失去活性并且表达选自包括下述的组的多个外源性多肽的基因修饰：CD47与DUX4、CD47与CD24、CD47与CD27、CD47与CD46、CD47与CD55、CD47与CD59、CD47与CD200、CD47与HLA-C、CD47与HLA-E、CD47与HLA-E重链、CD47与HLA-G、CD47与PD-L1、CD47与IDO1、CD47与CTLA4-Ig、CD47与C1-抑制子、CD47与IL-10、CD47与IL-35、CD47与IL-39、CD47与FasL、CD47与CCL21、CD47与CCL22、CD47与Mfge8和CD47与Serpinb9和其任何组合。在一些例子中，此细胞还具有使CD142基因失去活性的基因修饰。
C.CD47
在一些实施方案中，本公开提供已经修饰以表达耐受原因子(例如，免疫调节性多肽)CD47的细胞或其群。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达CD47的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源性CD47。在一些例子中，细胞表达包含编码人CD47多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些实施方案中，使用同源性定向修复，细胞经基因修饰以包含编码CD47的整合的外源性多核苷酸。
CD47为白细胞表面抗原并且在细胞黏着和整合素的调变起作用。其表达在细胞表面并且发信号到循环的巨噬细胞指示不要吃细胞。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其与在NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1与NP_942088.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其具有在NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1与NP_942088.1所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞包含CD47的核苷酸序列，其具有与在NCBI Ref.No.NM_001777.3与NM_198793.2所列的序列至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含CD47的核苷酸序列，如在NCBI Ref.Sequence No.NM_001777.3与NM_198793.2所列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列为密码子优化的序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列为人密码子优化的序列。
在一些实施方案中，细胞包含CD47多肽，其与在NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1与NP_942088.1中所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含CD47多肽，其具有在NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1与NP_942088.1.中所列的氨基酸序列。
表1中提供具有信号序列和不具有信号序列的人CD47的例示性氨基酸序列。
表1.人CD47的氨基酸序列
在一些实施方案中，细胞包含CD47多肽，其与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含CD47多肽，其具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞包含CD47多肽，其与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含CD47多肽，其具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含编码CD47多肽的核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列经密码子优化以在特定细胞中表达。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的基因编辑系统中任一者)协助插入编码CD47的多核苷酸到低免疫性细胞的基因组基因座。在一些例子中，编码CD47的多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，编码CD47的多核苷酸插入到B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。在一些实施方案中，编码CD47的多核苷酸插入到本文提供的表4中描述的基因基因座中任一者。在某些实施方案中，编码CD47的多核苷酸可操作连接到启动子。
在另一个实施方案中，CD47蛋白质表达使用以针对CD47蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，使用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)确认外源性CD47 mRNA的存在。
D.CD24
在一些实施方案中，本公开提供已经修饰以表达耐受原因子(例如，免疫调节性多肽)CD24的细胞或其群。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达CD24的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源性CD24。在一些例子中，细胞表达包含编码人CD24多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些实施方案中，使用同源性定向修复，细胞经基因修饰以包含编码CD24的整合的外源性多核苷酸。
也称为热稳定抗原或小细胞肺癌丛4抗原的CD24为糖化糖苷基磷脂肌醇-锚定的表面蛋白质(Pirruccello等人，J Immunol.,1986,136,3779-3784；Chen等人，Glycobiology,2017,57,800-806)。其结合到先天性免疫细胞上的Siglec-10。最近已显示通过Siglec-10的CD24作用为先天性免疫检查点(Barkal等人，Nature,2019,572,392-396)。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含编码CD24多肽的核苷酸序列，其与在NCBI Ref.No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含编码CD24多肽的核苷酸序列，其具有在NCBIRef.No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中所列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含核苷酸序列，其与在NCBI Ref.No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中所列的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，细胞包含在NCBI Ref.No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中所列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，CD24蛋白质表达使用以针对CD24蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源性CD24 mRNA的存在。
在一些实施方案中，合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的基因编辑系统中任一者)用于协助插入编码CD24的多核苷酸到低免疫性细胞的基因组基因座。在一些例子中，编码CD24的多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。在一些实施方案中，编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表4中描述的基因基因座的任一者。在一些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作连接到启动子。
E.DUX4
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞或CAR-T细胞)或其群，其包含经修饰以增加耐受原或免疫抑制因子诸如，DUX4的表达的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞的基因组以提供增加表达的DUX4的方法。在一方面中，揭示提供包含外源性表达的DUX4蛋白质的细胞或其群。在一些实施方案中，使用同源性定向修复，细胞经基因修饰以包含编码DUX4的整合的外源性多核苷酸。在一些实施方案中，增加表达的DUX4抑制、降低或消除下述MHC I分子-HLA-A、HLA-B和HLA-C的一者或多者的表达。
DUX4为在胚胎组织及诱导性多能干细胞中活化，并且在正常、健康体组织中沉默的转录因子(Feng等人，2015,ELife4；De Iaco等人，2017,Nat Genet.,49,941-945；Hendrickson等人，2017,Nat Genet.,49,925-934；Snider等人，2010,PLoS Genet.,e1001181；Whiddon等人，2017,Nat Genet.)。DUX4表达作用为阻断IFN-γ介导的主要组织相容性复合体(MHC)I类基因表达(例如，B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的表达)的诱导。DUX4表达与通过MHC I类的受抑制的抗原呈现有关联(Chew等人，Developmental Cell,2019,50,1-14)。DUX4作用为在切割阶段基因表达(转录)程序的转录因子。其目标基因包括，但不限于，编码基因、非编码基因和重复元件。
有至少两种DUX4的同功型，最长的同功型包含DUX4 C-端转录活化结构域。同功型是通过选择式剪接产生。见，例如，Geng等人，2012,Developmental Cell,22,38-51；Snider等人，2010,PLoS Genet.,e1001181。DUX4的活性同功型包括其N端DNA结合结构域和其C端活化结构域。见，例如，Choi等人，2016,Nucleic Acid Res.,44,5161-5173。
已经显示，降低DUX4的CpG基序数量会减少DUX4转基因的沉默(Jagannathan等人，Human Molecular Genetics,2016,25(20):4419-4431)。提供于上述Jagannathan等人中的核酸序列表示DUX4的密码子改变的序列，其包含一种或多种碱基取代，以降低CpG位点总数，同时保留DUX4蛋白质序列。核酸序列可从Addgene，目录编号99281商业上获得。
在某些方面中，至少一种或多种多核苷酸可用于协助细胞，例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代细胞或CAR-T细胞的DUX4的外源性表达。
在一些实施方案中，合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的基因编辑系统中任一者)用于协助插入编码DUX4的多核苷酸到低免疫性细胞的基因组基因座。在一些例子中，编码DUX4的多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸插入到B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸插入到本文提供的表4中描述的基因基因座的任一者。在某些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸可操作连接到启动子。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含多核苷酸序列，其包含DUX4的密码子改变的核苷酸序列，其包含一种或多种碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列(包含一种或多种碱基取代以降低CpG位点的总数)与2020年7月31日申请的PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1具有至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列为PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列为编码与选自包括下述的组的序列具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽序列的核苷酸序列：如在PCT/US2020/44635中所提供的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQID NO：29。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列为编码选自包括下述的组的多肽序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28，并且SEQ ID NO：29。SEQ ID NO：2至29中所示的氨基酸序列显示于PCT/US2020/44635的图1A至1G。
在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ACN62209.1所列的序列或GenBank登录号ACN62209.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与NCBI RefSeq No.NP_001280727.1所列的序列或NCBIRefSeq No.NP_001280727.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ACP30489.1所列的序列或GenBank登录号ACP30489.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与UniProt No.P0CJ85.1所列的序列或UniProt No.P0CJ85.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号AUA60622.1所列的序列或GenBank登录号AUA60622.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24683.1所列的序列或GenBank登录号ADK24683.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ACN62210.1所列的序列或GenBank登录号ACN62210.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24706.1所列的序列或GenBank登录号ADK24706.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24685.1所列的序列或GenBank登录号ADK24685.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ACP30488.1所列的序列或GenBank登录号ACP30488.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24687.1所列的序列或GenBank登录号ADK24687.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ACP30487.1所列的序列或GenBank登录号ACP30487.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24717.1所列的序列或GenBank登录号ADK24717.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24690.1所列的序列或GenBank登录号ADK24690.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24689.1所列的序列或所列的氨基酸序列GenBank登录号ADK24689.1具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24692.1所列的序列或GenBank登录号ADK24692.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24693.1所列的序列或GenBank登录号ADK24693.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24712.1所列的序列或GenBank登录号ADK24712.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24691.1所列的序列或GenBank登录号ADK24691.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与UniProtNo.P0CJ87.1所列的序列或UniProt No.P0CJ87.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24714.1所列的序列或GenBank登录号ADK24714.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24684.1所列的序列或GenBank登录号ADK24684.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24695.1所列的序列或GenBank登录号ADK24695.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与GenBank登录号ADK24699.1所列的序列或GenBank登录号ADK24699.1所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与NCBI RefSeqNo.NP_001768.1所列的序列或NCBI RefSeq No.NP_001768所列的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与NCBI RefSeqNo.NP_942088.1所列的序列或NCBI RefSeq No.NP_942088.1具所列的氨基酸序列有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与PCT/US2020/44635中所提供的SEQ ID NO：28或PCT/US2020/44635中所提供的SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。在一些例子中，DUX4多肽包含氨基酸序列，其与PCT/US2020/44635中所提供的SEQ ID NO：29或PCT/US2020/44635中所提供的SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。
在其他实施方案中，使用表达载体协助耐受原因子的表达。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列为密码子改变的序列，包含一种或多种碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些例子中，DUX4的密码子改变的序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在一些例子中，DUX4的密码子改变的序列为PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在其他实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，其包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，其与选自包括下述的组的序列具有至少95％序列同一性：PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，其选自包括下述的组：PCT/US2020/44635的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。
DUX4表达的增加可以使用已知技术来检定，诸如，西方墨点法、ELISA检定、FACS检定、免疫检定等。
F.CIITA
在某些方面中，本文所公开的技术通过靶向和调变(例如，降低或消除)II类转活化子(CIITA)表达而调变(例如，降低或消除)MHC II基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统而发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，CIITA表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少的mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
CIITA为蛋白质的LR或核苷酸结合结构域(NBD)亮氨酸-富集重复(LRR)家族的一员且通过与MHC强化体缔合而调控MHC II的转录。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CIITA的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CIITA的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CIITA的异种同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的表达CIITA降低或消除下述MHC II类的一种或多种的表达，为HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含靶向CIITA基因的基因修饰。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶靶向CIITA基因的基因修饰包含蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向CIITA基因的至少一个引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，特异性靶向CIITA基因的至少一个引导核糖核酸序列选自下列所组成的组：WO2016183041附件1或表12的SEQ ID NO：5184至36352，公开整体以引用方式并入。在一些实施方案中，如本文所公开的编码多肽的外源性核酸(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文所公开的另一耐受原因子)经插入在CIITA基因。
测试CIITA基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的CIITA基因的基因修饰和HLA-II表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，CIITA蛋白质表达使用以针对CIITA蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
G.B2M
在某些实施方案中，本文所公开的技术通过靶向和调变(例如，降低或消除)配件链B2M的表达调变(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，B2M表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少的mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
通过调变(例如，降低或删除)B2M的表达，MHC-I分子的表面运输受到阻断且当植入到接受者受试者时，此细胞呈现免疫耐受性。在一些实施方案中，在施用之后例如，在接受者受试者或患者中，细胞被认为是低免疫性。
在一些实施方案中，本文提供的目标多核苷酸序列为B2M的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为B2M的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为B2M的异种同源物。
在一些实施方案中，B2M的减少或消除表达降低或消除下述MHC I分子-HLA-A、HLA-B和HLA-C的一者或多者的表达。
在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含靶向B2M基因的基因修饰。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶靶向B2M基因的基因修饰包含Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向B2M基因的至少一个引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，特异性靶向B2M基因的至少一个引导核糖核酸序列选自下列所组成的组：WO2016/183041的附件2或表15的SEQ ID NO：81240至85644，公开整体以引用方式并入。在一些实施方案中，如本文所公开的编码多肽的外源性核酸(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文所公开的另一耐受原因子)经插入在B2M基因。
测试B2M基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的B2M基因的基因修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，B2M蛋白质表达使用以针对B2M蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
H.NLRC5
在某些方面中，本文所公开的技术通过靶向和调变(例如，降低或消除)NLR家族、包含5/NOD27/CLR16.1(NLRC5)的CARD结构域的表达而调变(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，NLRC5表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少的mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
NLRC5为MHC-I介导的免疫反应的调节子，并且与CIITA类似，NLRC5是由IFN-γ高度可诱导型，并且可以转位到细胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的启动子并诱导MHC-I以及涉及MHC-I抗原呈现的相关基因的转录。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为NLRC5的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为NLRC5的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为NLRC5的异种同源物。
在一些实施方案中，减少或消除的NLRC5的表达降低或消除下述MHC I分子-HLA-A、HLA-B和HLA-C的一者或多者的表达。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含靶向NLRC5基因的基因修饰。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶靶向NLRC5基因的基因修饰包含Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向NLRC5基因的至少一个引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，特异性靶向NLRC5基因的至少一个引导核糖核酸序列选自下列所组成的组：WO2016183041的附件3或表14的SEQ ID NO：36353至81239，公开整体以引用方式并入。
测试NLRC5基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的NLRC5基因的基因修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，NLRC5蛋白质表达使用以针对NLRC5蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
I.TRAC
在许多实施方案中，本文所公开的技术通过可调节地靶向和调变(例如，降低或消除)T细胞受体α链恒定区的表达而可调节地调变(例如，降低或消除)TCR基因(包括TRAC基因)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，发生调变使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，TRAC表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少的mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
通过调变(例如，降低或删除)TRAC的表达，TCR分子的表面运输受到阻断。在一些实施方案中，细胞还具有降低的诱导在接受者受试者中免疫反应的能力。
在一些实施方案中，本技术的目标多核苷酸序列为TRAC的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为TRAC的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为TRAC的异种同源物。
在一些实施方案中，TRAC的减少或消除的表达降低或消除TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞，诸如，但不限于，多能干细胞、诱导性多能干细胞、自诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和源自原代T细胞的细胞在编码TRAC蛋白质的基因基因座包含可调节的基因修饰。换句话说，细胞在TRAC基因座包含可调节的基因修饰。在一些例子中，编码TRAC蛋白质的核苷酸序列列于Genbank No.X02592.1。在一些例子中，TRAC基因基因座描述于RefSeq.No.NG_001332.3及NCBI Gene ID No.28755。在某些例子中，TRAC的氨基酸序列描述为Uniprot No.P01848。TRAC蛋白质及基因基因座额外的描述可在Uniprot No.P01848、HGNC Ref.No.12029和OMIM Ref.No.186880发现。
在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含靶向TRAC基因的可调节的基因修饰。在一些实施方案中，靶向TRAC基因的可调节的基因修饰通过可调节的稀有切割核酸内切酶，包含可调节的Cas蛋白质或可调节的编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向TRAC基因的至少一个引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，特异性靶向TRAC基因的至少一个引导核糖核酸序列选自下列所组成的组：US20160348073的SEQ ID NO：532至609及9102至9797，其以引用方式并入本文。
测试TRAC基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的TRAC基因的基因修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，TRAC蛋白质表达使用以针对TRAC蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含TRAC表达的可调节的剔除，使得细胞是可调节地TRAC-/-。在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞可调节地引入indel到TRAC基因基因座，使得细胞是可调节地TRACindel/indel。在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含TRAC表达的可调节的减弱，使得细胞是可调节地TRACknock down。
J.TRB
在许多实施方案中，本文所公开的技术通过可调节地靶向和调变(例如，降低或消除)T细胞受体β链恒定区的表达而可调节地调变(例如，降低或消除)TCR基因(包括编码T细胞抗原受体、β链的基因(例如，TRB、TRBC或TCRB基因))的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，发生调变使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，TRB表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少的mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
通过调变(例如，降低或删除)TRB的表达，TCR分子的表面运输受到阻断。在一些实施方案中，细胞还具有降低的诱导在接受者受试者中免疫反应的能力。
在一些实施方案中，本技术的目标多核苷酸序列为TRB的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为TRB的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为TRB的异种同源物。
在一些实施方案中，TRB的减少或消除的表达降低或消除TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞，诸如，但不限于，多能干细胞、诱导性多能干细胞、自诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和源自原代T细胞的细胞在编码TRB蛋白质的基因基因座包含可调节的基因修饰。换句话说，细胞在TRB基因基因座包含可调节的基因修饰。在一些例子中，编码TRB蛋白质的核苷酸序列列于UniProt No.P0DSE2。在一些例子中，TRB基因基因座描述于RefSeq.No.NG_001333.2及NCBI Gene ID No.6957。在某些例子中，TRB的氨基酸序列描述为Uniprot No.P01848。TRB蛋白质及基因基因座额外的描述可在GenBank No.L36092.2、Uniprot No.P0DSE2和HGNC Ref.No.12155发现。
在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含靶向TRB基因的可调节的基因修饰。在一些实施方案中，靶向TRB基因的可调节的基因修饰通过可调节的稀有切割核酸内切酶，包含可调节的Cas蛋白质或可调节的编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向TRB基因的至少一个引导核糖核酸序列。在一些实施方案中，特异性靶向TRB基因的至少一个引导核糖核酸序列选自下列所组成的组：US20160348073的SEQ ID NO：610至765及9798至10532，其以引用方式并入本文。
测试TRB基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的TRB基因的基因修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，TRB蛋白质表达使用以针对TRB蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含TRB表达的可调节的剔除，使得细胞是可调节地TRB-/-。在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞可调节地引入indel到TRB基因基因座，使得细胞是可调节地TRBindel/indel。在一些实施方案中，本文所概述的低免疫性细胞包含TRB表达的可调节的减弱，使得细胞是可调节地TRBknock down。
K.CD142
在某些方面中，本文所公开的技术调变(例如，降低或消除)CD142(也已知为组织因子、因子III和F3)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，发生调变使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，CD142表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CD142或CD142的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CD142的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CD142的异种同源物。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含靶向CD142基因的基因修饰。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶而靶向CD142基因的基因修饰包含Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向CD142基因的至少一个引导核糖核酸(gRNA)序列。辨识的有用方法针对目标CD142的gRNA序列于下面描述。
测试CD142基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的CD142基因的基因修饰和CD142表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，CD142蛋白质表达使用以针对CD142蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
关于人CD142的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC01M094530、HGNC No.3541、NCBI Gene ID 2152、NCBI RefSeq Nos.NM_001178096.1、NM_001993.4、NP_001171567.1和NP_001984.1、UniProt No.P13726等。
L.CTLA4
在某些方面中，本文所公开的技术调变(例如，降低或消除)CTLA4的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，发生调变使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，CTLA4表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CTLA4或CTLA4的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CTLA4的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为CTLA4的异种同源物。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含靶向CTLA4基因的基因修饰。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向CTLA4基因的基因修饰。基因修饰可降低在T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中CTLA4多核苷酸以及CTLA4多肽的表达。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶而靶向CTLA4基因的基因修饰包含Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向CTLA4基因的至少一个引导核糖核酸(gRNA)序列。辨识针对目标CTLA4的gRNA序列的有用方法于下面描述。
测试CTLA4基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的CTLA4基因的基因修饰和CTLA4表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，CTLA4蛋白质表达使用以针对CTLA4蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
关于人CTLA4的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC02P203867、HGNC No.2505、NCBI Gene ID 1493、NCBI RefSeq No.NM_005214.4、NM_001037631.2、NP_001032720.1及NP_005205.2、UniProt No.P16410等。
M.PD1
在某些方面中，本文所公开的技术调变(例如，降低或消除)PD1的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统发生调变。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，发生调变使用选自下列所组成的组的DNA-为主的方法：剔除或减弱，使用选自下列所组成的组的方法：CRISPR、TALEN、锌指核酸酶、归巢核酸内切酶和大范围核酸酶。在一些实施方案中，修饰为短暂(包括，例如，通过利用siRNA方法)。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的RNA-为主的方法：shRNA、siRNA、miRNA和CRISPR干扰(CRISPRi)发生调变。在一些实施方案中，PD1表达的调变包括，但不限于，降低的转录、减少mRNA稳定性(诸如，通过RNAi机制)和降低的蛋白质量。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为PD1或PD1的变体。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为PD1的同源物。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为PD1的异种同源物。
在一些实施方案中，本文所概述的细胞包含靶向编码程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)蛋白质的基因或PDCD1基因的基因修饰。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向PDCD1基因的基因修饰。基因修饰可降低在T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中PD1多核苷酸以及PD1多肽的表达。在一些实施方案中，通过稀有切割核酸内切酶而靶向PDCD1基因的基因修饰包含Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的多核苷酸以及特异性靶向PDCD1基因的至少一个引导核糖核酸(gRNA)序列。辨识针对目标PD1的gRNA序列的有用方法于下面描述。
测试PDCD1基因是否已经失去活性的检定是已知并且在本文中有描述。在一个实施方案中，通过PCR所得的PDCD1基因的基因修饰和PD1表达的降低可以通过FACS分析检定。在另一个实施方案中，PD1蛋白质表达使用以针对PD1蛋白质的抗体为探针的细胞溶解产物的西方墨点法检测。在另一个实施方案中，反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认失去活性的基因修饰的存在。
关于人PD1(包括PDCD1基因)的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCard Identifier GC02M241849、HGNC No.8760、NCBI Gene ID 5133、UniprotNo.Q15116，并且NCBI RefSeq No.NM_005018.2及NP_005009.2。
N.额外的耐受原因子
在某些实施方案中，一种或多种耐受原因子可经插入或再插入到经基因组编辑的细胞以创造免疫-特权通用供体细胞，诸如，通用供体干细胞、通用供体T细胞或通用供体细胞。在某些实施方案中，本文所公开的低免疫性细胞已经进一步修饰以表达一种或多种耐受原因子。
例示性耐受原因子包括，而无限制，CD47、DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpinb9、CD16 Fc受体、IL15-RF、CD16、CD52、H2-M3和CD35。在一些实施方案中，耐受原因子选自下列所组成的组：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21、CCL22和Mfge8。在一些实施方案中，耐受原因子选自下列所组成的组：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制子和IL-35。在一些实施方案中，耐受原因子选自下列所组成的组：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制子和IL-35。
在一些例子中，基因编辑系统诸如，CRISPR/Cas系统用于协助插入耐受原因子，诸如，耐受原因子到安全港或目标基因座，诸如，AAVS1基因座，以活性地抑制免疫排斥。在一些例子中，使用表达载体将耐受原因子插入到安全港或目标基因座。在一些实施方案中，安全港或目标基因座为AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达CD47的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达CD47的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入CD47到细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表29的SEQ ID NO：200784至231885，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达HLA-C的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达HLA-C的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入HLA-C到细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表10的SEQ ID NO：3278至5183，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达HLA-E的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达HLA-E的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入HLA-E到细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表19的SEQ ID NO：189859至193183，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达HLA-F的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达HLA-F的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入HLA-F到细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表45的SEQ ID NO：688808至399754，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达HLA-G的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达HLA-G的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入HLA-G到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表18的SEQ ID NO：188372至189858，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达PD-L1的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达PD-L1的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入PD-L1到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自下列所组成的组：WO2016183041的表21的SEQ ID NO：193184至200783，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达CTLA4-Ig的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达CTLA4-Ig的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入CTLA4-Ig到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自：WO2016183041，包括序列表中所公开的任一者。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达CI-抑制子的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达CI-抑制子的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入CI-抑制子到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自：WO2016183041，包括序列表中所公开的任一者。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达IL-35的基因组。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达IL-35的方法。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入IL-35到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自：WO2016183041，包括序列表中所公开的任一者。在一些实施方案中，原代细胞包括，但不限于，心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血液细胞、血浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，干细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、诱导的干细胞、间质干细胞和造血干细胞。
在一些实施方案中，使用表达载体将耐受原因子表达在细胞。例如，细胞中表达CD47的表达载体包含编码CD47的多核苷酸序列。表达载体可为可诱导表达载体。表达载体可为病毒载体，诸如，但不限于，慢病毒载体。
在一些实施方案中，本公开提供细胞(例如，原代细胞和/或低免疫性干细胞和其衍生物)或其群，包含其中细胞基因组已经修饰以表达选自下列所组成的组的多肽的任一者的基因组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在一些实施方案中，本公开提供改变细胞基因组以表达选自下列所组成的组的多肽的任一者的方法：HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFX-ANK、CIITA、NFY-A、NLRC5、B2M、RFX5、RFX-AP、HLA-G、HLA-E、NFY-B、PD-L1、NFY-C、IRF1、TAP1、GITR、4-1BB、CD28、B7-1、CD47、B7-2、OX40、CD27、HVEM、SLAM、CD226、ICOS、LAG3、TIGIT、TIM3、CD160、BTLA、CD244、LFA-1、ST2、HLA-F、CD30、B7-H3、VISTA、TLT、PD-L2、CD58、CD2、HELIOS和IDO1。在某些方面中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸可用于协助插入所选的多肽到干细胞株。在某些实施方案中，至少一个核糖核酸或至少一对的核糖核酸选自：WO2016183041的附件1至47及序列表中所公开的任一者，其公开以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的基因编辑系统中任一者)用于协助插入编码耐受原因子的多核苷酸到低免疫性细胞的基因组基因座。在一些例子中，编码耐受原因子的多核苷酸插入到安全港或目标基因座，诸如，但不限于，AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也已知为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也已知为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、PDGFRa、OLIG2、GFAP或KDM5D基因基因座。在一些实施方案中，编码耐受原因子的多核苷酸插入到B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。在一些实施方案中，编码耐受原因子的多核苷酸插入到本文提供的表4中描述的基因基因座的中任一者。在某些实施方案中，编码耐受原因子的多核苷酸可操作连接到启动子。
O.基因修饰的方法
在一些实施方案中，以编码稀有切割核酸内切酶的核酸形式，将稀有切割核酸内切酶引入到包含目标多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞的过程可以通过任何合适的技术来达成。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和转导或使用病毒载体感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，如本文所述，核酸包含修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含修饰的mRNA，如本文所述(例如，合成的、修饰的mRNA)。
可以使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)以具有通常知识者可获得的任何方式改变本文所述的目标多核苷酸序列。任何能够改变细胞中目标多核苷酸序列的CRISPR/Cas系统都可以使用。此CRISPR/Cas系统可以使用多种Cas蛋白质(Haft等人，PLoSComput Biol.2005；1(6)e60)。允许CRISPR/Cas系统改变细胞中目标多核苷酸序列的此Cas蛋白质的分子机制包括RNA结合蛋白质、核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统为CRISPR第I型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统为CRISPR第II型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统为CRISPR第V型系统。
本文所公开的基因编辑(例如，CRISPR/Cas)系统可以用于改变细胞中的任何目标多核苷酸序列。发明所属技术领域中具有通常知识者将轻易了解在任何特定细胞中欲改变的目标多核苷酸序列可对应于任何基因组序列(其中基因组序列的表达与失调相关或协助病原体进入到细胞)。例如，在细胞中改变的所需目标多核苷酸序列可为对应基因组序列(包含与单一多核苷酸多型性相关的疾病)的多核苷酸序列。在这样的例子中，本文所公开的CRISPR/Cas系统可用于通过用野生型对偶基因替换来修正细胞中与疾病相关的SNP。作为另一例子，负责病原体进入细胞或增殖的目标基因的多核苷酸序列可为删除或插入以破坏目标基因的功能的合适目标，避免病原体进入细胞或在细胞内增殖。
在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为基因组序列。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为人基因组序列。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，目标多核苷酸序列为脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中，本文提供的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白质及能够引导Cas蛋白质到以及杂交到目标多核苷酸序列的目标基序的至少一至两个核糖核酸。如本文所用，“蛋白质”及“多肽”可交互使用，指一系列由肽键连接的氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)与包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖化等)和氨基酸类似物。例示性多肽或蛋白质包括基因产物、天然发生蛋白质、同源物、同种同源物、片段及其他均等物、变体、与上述的类似物。
在一些实施方案中，Cas蛋白质包含一种或多种氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一种或多种氨基酸取代包含保守氨基酸取代。在一些例子中，取代和/或修饰可避免或降低细胞中蛋白质水解降解和/或延长多肽的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨甲酸酯、磺酰基脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含天然发生的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、升半胱氨酸、磷丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白质可包含修饰以包括部分(例如，聚乙二醇化、糖苷基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方案中，Cas蛋白质包含核心Cas蛋白质、其同功型或具有任何Cas蛋白质或其同功型的类似功能或活性的任何似Cas蛋白质。例示性Cas核心蛋白质包括，但不限于，Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含大肠杆菌亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS2)。大肠杆菌亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Ypest亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS3)。Ypest亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Nmeni亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS4)。Nmeni亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于，Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Dvulg亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS1)。Dvulg亚型的例示性Cas蛋白质包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Tneap亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS7)。Tneap亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于，Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Hmari亚型的Cas蛋白质。Hmari亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Apern亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS5)。Apern亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Mtube亚型的Cas蛋白质(也已知为CASS6)。Mtube亚型的例示性Cas蛋白质包括，但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含RAMP模组Cas蛋白质。例示性RAMP模组Cas蛋白质包括，但不限于，Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。见，例如，Klompe等人，Nature 571,219-225(2019)；Strecker等人，Science365,48-53(2019)。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含第I型亚型的Cas蛋白质。第I型CRISPR/Cas效应子蛋白质为第1类CRISPR/Cas效应子蛋白质的亚型。例子包括，但不限于：Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含第II型亚型的Cas蛋白质。第II型CRISPR/Cas效应子蛋白质为第2类CRISPR/Cas效应子蛋白质的亚型。例子包括，但不限于：Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含第III型亚型的Cas蛋白质。第III型CRISPR/Cas效应子蛋白质为第1类CRISPR/Cas效应子蛋白质的亚型。例子包括，但不限于：Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含第IV型亚型的Cas蛋白质。第IV型CRISPR/Cas效应子蛋白质为第1类CRISPR/Cas效应子蛋白质的亚型。例子包括，但不限于：Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含第V型亚型的Cas蛋白质。第V型CRISPR/Cas效应子蛋白质为第2类CRISPR/Cas效应子蛋白质的亚型。对于第V型CRISPR/Cas系统及其效应子蛋白质(例如，Cas12家族蛋白质诸如，Cas12a)的例子，见，例如，Shmakov等人，Nat Rev Microbiol.2017；15(3)：169-182："Diversity and evolutionof class 2CRISPR-Cas systems"。例子包括，但不限于：Cas12家族(Cas12a、Cas12b、Cas12c)、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10和C2c9；以及CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)。还见，例如，Koonin等人，Curr Opin Microbiol.2017；37：67-78："Diversity,classification andevolution of CRISPR-Cas systems"。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含Cas12蛋白质，诸如，Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d和/或Cas12e。
在一些实施方案中，Cas蛋白质包含本文所述的Cas蛋白质或其功能部分的任一者。如本文所用，“功能部分”是指肽的部分，其包留与至少一个核糖核酸(例如，引导RNA(gRNA))复合且切割目标多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含选自下列所组成的组的可操作性连接的Cas9蛋白质功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域。在一些实施方案中，功能部分包含选自下列所组成的组的可操作性连接的Cas12a(也已知为Cpf1)蛋白质功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域。在一些实施方案中，功能性结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白质的功能部分包含似RuvC结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白质的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质的功能部分包含似RuvC结构域的功能部分。
在一些实施方案中，外源性Cas蛋白质可呈多肽形式引入到细胞。在某些实施方案中，Cas蛋白质可共轭到或融合到细胞-穿透的多肽或细胞-穿透的肽。如本文所用，“细胞-穿透的多肽”及“细胞-穿透的肽”分别指多肽或肽，其协助分子摄入到细胞。细胞-穿透的多肽可包含可检测标志。
在某些实施方案中，Cas蛋白质可共轭到或融合到带电蛋白质(例如，带有正电荷、负电荷或整体中性电荷)。此键联可为共价。在一些实施方案中，Cas蛋白质可融合到带超正电荷的GFP，以显著增加Cas蛋白质穿透细胞的能力(Cronican等人，ACS Chem Biol.2010；5(8)：747-52)。在某些实施方案中，Cas蛋白质可融合到蛋白质转导结构域(PTD)以协助其进入细胞。例示性PTDs包括Tat、寡精氨酸和穿膜肽(penetratin)。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至细胞-穿透的肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至寡精氨酸结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至穿膜肽(penetratin)结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含稠合至带超正电荷的GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至细胞-穿透的肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至寡精氨酸结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至穿膜肽(penetratin)结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白质包含稠合至带超正电荷的GFP的Cas12a多肽。
在一些实施方案中，Cas蛋白质可呈编码Cas蛋白质的核酸的形式引入到包含目标多核苷酸序列的细胞。引入核酸进入细胞的过程可通过任何合适的技术达成。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和转导或使用病毒载体感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的、修饰的mRNA)。
在一些实施方案中，Cas蛋白质与1至2个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质与2个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质与1个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的、修饰的mRNA)所编码。
本文所公开的方法考量使用能够引导Cas蛋白质到以及杂交到目标多核苷酸序列的目标基序的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一个核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一个核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单一核糖核酸包含引导Cas蛋白质到以及杂交到细胞中目标多核苷酸序列的目标基序的引导RNA。在一些实施方案中，至少一个核糖核酸包含引导Cas蛋白质到以及杂交到细胞中目标多核苷酸序列的目标基序的引导RNA。在一些实施方案中，1至2个核糖核酸二者包含引导Cas蛋白质到以及杂交到细胞中目标多核苷酸序列的目标基序的引导RNA。如发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，可选择本文提供的核糖核酸以杂交各种不同目标基序，端赖所用的特定CRISPR/Cas系统和目标多核苷酸的序列。也可选择1至2个核糖核酸以最小化与目标多核苷酸序列以外的核酸序列杂交。在一些实施方案中，当与所有其他细胞中的基因组核苷酸序列比较时，1至2个核糖核酸杂交到包含至少两个错置的目标基序。在一些实施方案中，当与所有其他细胞中的基因组核苷酸序列比较时，1至2个核糖核酸杂交到包含至少一错置的目标基序。在一些实施方案中，设计1至2个核糖核酸以杂交到由Cas蛋白质所辨识的去氧核糖核酸基序紧邻的目标基序。在一些实施方案中，设计1至2个核糖核酸各者以杂交到由Cas蛋白质所辨识的去氧核糖核酸基序紧邻的目标基序，其夹于位在目标基序之间的突变体对偶基因二侧。
在一些实施方案中，1至2个核糖核酸各者包含引导Cas蛋白质到以及杂交到细胞中目标多核苷酸序列的目标基序的引导RNA。
在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)互补到和/或杂交到在目标多核苷酸序列相同链上的序列。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)互补到和/或杂交到目标多核苷酸序列相反链上的序列。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)未互补到和/或未杂交到目标多核苷酸序列相反链上的序列。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)互补到和/或杂交到目标多核苷酸序列的重叠目标基序。在一些实施方案中，一个或两个核糖核酸(例如，引导RNA)互补到和/或杂交到目标多核苷酸序列的补偿目标基序。
在一些实施方案中，编码Cas蛋白质的核酸及编码至少一至两个核糖核酸的核酸通过病毒转导(例如，慢病毒转导)经引入到细胞。在一些实施方案中，Cas蛋白质与1至2个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质与两个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质与一个核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白质由如本文所述的所修饰的核酸(例如，合成的、修饰的mRNA)编码。
表2提供用于本文所述的基因的CRISPR/Cas-为主的靶向的例示性gRNA序列。序列可在2016年5月9日申请的WO2016183041发现，包括表格、附件和序列表的公开整体以引用方式并入本文。
表2.用于靶向基因的例示性gRNA序列
用于本文所述的基因的CRISPR/Cas-为主的靶向的其他例示性gRNA序列在2021年5月19日申请的美国临时专利申请第63/190,685号和在2021年7月14日申请的美国临时专利申请第63/221,887号中提供，其公开，包括表格、附件和序列表，整体通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的细胞使用似转录活化子效应子核酸酶(TALEN)方法制造。“TALE-核酸酶”(TALEN)意指由典型源自似转录活化子效应子(TALE)的核酸-结合结构域及切割核酸目标序列的一个核酸酶催化结构域所构成的融合蛋白质。催化结构域较佳为核酸酶结构域且更佳为具有核酸内切酶活性的结构域，像例如，I-TevI、ColE7、NucA及Fok-I。在一特定实施方案中，TALE结构域可融合到大范围核酸酶，像例如I-CreI及I-OnuI或其功能性变体。在更佳实施方案中，所述核酸酶为单体TALE-核酸酶。单体TALE-核酸酶为不需要二聚合以特异性辨识及切割的TALE-核酸酶，诸如，WO2012138927所述的工程改造的TAL重复与I-TevI的催化结构域的融合体。似转录活化子效应子(TALE)为来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，包含多个重复序列，各重复包含在位置12及13的二残基(RVD)，其对核酸靶向的序列的各核苷酸碱基特异性。具有类似模组化碱基依碱基(base-per-base)核酸结合特性(MBBBD)的结合结构域也可源自在申请人最近发现的不同细菌物种的新模组化蛋白质。新模组化蛋白质具有比TAL重复展示更多序列变化性的优点。较佳地，与辨识不同核苷酸相关的RVD为用于辨识C的HD、用于辨识T的NG、用于辨识A的NI、用于辨识G或A的NN、用于辨识A、C、G或T的NS、用于辨识T的HG、用于辨识T的IG、用于辨识G的NK、用于辨识C的HA、用于辨识C的ND、用于辨识C的HI、用于辨识G的HN、用于辨识G的NA、用于辨识G或A的SN及用于辨识T的YG、用于辨识A的TL、用于辨识A或G的VT及用于辨识A的SW。在另一个实施方案中，氨基酸12及13可突变成其他氨基酸残基以调变其针对核苷酸A、T、C及G的特异性且特别是，以增加此特异性。TALEN试剂盒为商业上贩售。
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)操作细胞。由于通过锌离子的配位而稳定蛋白质结构，所以“锌指结合蛋白质”为结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽，较佳地以序列-特异性方式。术语锌指结合蛋白质通常缩写为锌指蛋白质或ZFP。个别DNA结合结构域典型称为“指”。ZFP具有至少一个指，典型2个指、3个指或6个指。各指结合2至4个DNA的碱基对，典型3或4个DNA的碱基对。ZFP结合到称为目标位点或目标区段的核酸序列。各指典型包含大约30个氨基酸、锌螯合、DNA结合次结构域。研究已证实此类的单一锌指由包含与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋连同单一β转折的两个半胱氨酸残基所构成(见，例如，Berg&Shi,Science271：1081-1085(1996))。
在一些实施方案中，本文所述的细胞使用归巢核酸内切酶制造。此归巢核酸内切酶为所属领域所知(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶辨识DNA目标序列并产生单或双链断裂。归巢核酸内切酶为高度特异性，辨识DNA目标位点，范围从长度12至45碱基对(bp)，通常范围从长度14至40bp。归巢核酸内切酶可例如对应到LAGLIDADG核酸内切酶、到HNH核酸内切酶或到GIY-YIG核酸内切酶。在一些实施方案中，归巢核酸内切酶可为I-CreI变体。
在一些实施方案中，本文所述的细胞使用大范围核酸酶制造。大范围核酸酶顾名思义就是辨识大序列的序列-特异性核酸内切酶(Chevalier,B.S.and B.L.Stoddard,Nucleic Acids Res.,2001,29,3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等人，Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040；Rouet等人，Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106；Choulika等人，Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973；Puchta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060；Sargent等人，Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77；Donoho等人，Mol.Cell.Biol.,1998,18,4070-4078；Elliott等人，Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101；Cohen-Tannoudji等人，Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。
在一些实施方案中，本文提供的细胞使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi，也称为siRNA)以减弱(例如，减少、消除或抑制)多肽，诸如，耐受原因子的表达而制造。有用的RNAi方法包括那些利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI-交互作用的NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)和发明所属技术领域中具有通常知识者辨识的短暂减弱方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的RNAi试剂都是商业上可获得。例如，可以通过引入CIITA siRNA或将CIITA shRNA表达的病毒转导到细胞中以在多能干细胞中减弱CIITA。在一些实施方案中，运用RNA干扰以降低或抑制选自下列所组成的组的至少一者的表达：CIITA、B2M和NLRC5。
1.基因编辑系统
在一些实施方案中，基因修饰细胞以剔除、减弱或修饰一种或多种基因的方法包含使用位点-导向核酸酶，包括，例如，发明所属技术领域中所知的锌指核酸酶(ZFN)、似转录活化子效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、转位酶和群聚且有规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统、以及切口酶(nickase)系统、碱基编辑系统、初级编辑系统和基因写入系统。
a)ZFN
ZFN是包含一系列位点特异性DNA结合结构域的融合蛋白质，其是由附着在细菌FokI限制酶的核酸内切酶结构域上的含锌指的转录因子改编而来。ZFN可具有一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的DNA结合结构域或锌指结构域。参见，例如，Carroll等人Genetics Society of America(2011)188:773-782；Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:1156-1160。各锌指结构域为由一种或多种锌离子稳定的小蛋白质结构化基序，并且通常辨识3至4-bp DNA序列。因此，串联结构域可以潜在地与细胞基因组中独特的延伸的核苷酸序列结合。
可以组合已知特异性的各种锌指以产生辨识约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。可获得各种选择和模组组装技术以产生辨识特异性序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母一杂交系统、细菌一杂交和二杂交系统和哺乳动物细胞。锌指可以被工程改造成结合预定核酸序列。工程改造锌指以结合预定核酸序列的标准在本领域中为已知。参见，例如，Sera等人，Biochemistry(2002)41：7074-7081；Liu等人，Bioinformatics(2008)24：1850-1857。
包含FokI核酸酶结构域或其他二聚合核酸酶结构域的ZFN作用为二聚体。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个个别ZFN必须结合DNA的相反链，与其核酸酶间隔适当。参见Bitinaite等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95：10570-10575。为了切割在基因组中特异性位点，设计了一对ZFN来辨识位于所述位点两侧的两个序列，一个在正向链上，另一个在反向链上。在位点任一侧的ZFN结合后，核酸酶结构域二聚合化并在位点切割DNA，产生具有5'突出端的DSB。之后HDR可用于引入特异性突变，在修复模板的帮助下，包含所需的突变，两侧是同源臂。修复模板通常是引入细胞的外源性双链DNA载体。参见SeeMiller等人，Nat.Biotechnol.(2011)29：143-148；Hockemeyer等人，Nat.Biotechnol.(2011)29：731-734。
b)TALEN
TALEN是可用于编辑目标基因的人工核酸酶的另一个例子。TALEN为源自称为TALE重复的DNA结合结构域，其通常包含具有10至30个重复的串联阵列，其结合和辨识延伸的DNA序列。各重复为33至35个氨基酸长度，具有两个相邻的氨基酸(称为重复可变二残基，或RVD)，赋予四个DNA碱基对之一的特异性。因此，目标DNA序列中的重复和碱基对之间存在一一对应关系。
TALEN是通过将一种或多种TALE DNA结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)与核酸酶结构域(例如，FokI核酸内切酶结构域)融合而人工产生。见Zhang,NatureBiotech.(2011)29：149-153。已经对FokI进行几个突变以用于TALEN；这些，例如，改良切割特异性或活性。见Cermak等人，Nucl.Acids Res.(2011)39：e82；Miller等人，NatureBiotech.(2011)29：143-148；Hockemeyer等人，Nature Biotech.(2011)29：731-734；Wood等人，Science(2011)333：307；Doyon等人，Nature Methods(2010)8：74-79；Szczepek等人，Nature Biotech(2007)25：786-793；Guo等人，J.Mol.Biol.(2010)200：96。FokI结构域作用为二聚体，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于目标基因组中具有适当定向和间距的位点。TALE DNA结合结构域和FokI核酸酶结构域之间的氨基酸残基数量以及两个个别TALEN结合位点之间的碱基数量似乎是达到高量活性的重要参数。Miller等人，NatureBiotech.(2011)29：143-148。
通过结合工程改造的TALE重复序列与核酸酶结构域，可特异性产生对任何所需DNA序列的位点特异性核酸酶。与ZFN类似，TALEN可引入到细胞以在基因组中的所需目标位点产生DSB，并且因此可用于以类似、HDR介导的途径剔除基因或敲入突变。见Boch,NatureBiotech.(2011)29：135-136；Boch等人，Science(2009)326：1509-1512；Moscou等人，Science(2009)326：3501。
c)大范围核酸酶
大范围核酸酶是属于核酸内切酶家族的酶，其特征在于其辨识和切割大DNA序列(14至40个碱基对)的能力。大范围核酸酶根据其影响核酸酶活性和/或DNA辨识的结构化基序分为多个家族。最广泛和最著名的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，它们的名称归功于保留的氨基酸序列。见Chevalier等人，Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。另一方面，GIY-YIG家族成员有GIY-YIG模组，其为70至100个残基长，并且包括四个或五个具有四个不变残基的保留序列基序，其中两个是活性所必需。见Van Roey等人，NatureStruct.Biol.(2002)9：806-811。His-Cys家族大范围核酸酶的特征是在涵盖数百个氨基酸残基的区域上高度保留的组氨酸和半胱氨酸系列。见Chevalier等人，Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。NHN家族的成员由基序定义，基序包含二对被天门冬酰胺酸残基包围的保留组氨酸。见Chevalier等人，Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。
由于因为高特异性要求，对特定目标DNA序列鉴定自然大范围核酸酶的机会较低，因此已经使用包括诱变和高通量筛选方法的各种方法来创造辨识独特序列的大范围核酸酶变体。用于工程改造的具有改变的DNA结合特异性，例如结合预定核酸序列，的大范围核酸酶的策略在发明所属技术领域中是已知。见，例如，Chevalier等人，Mol.Cell.(2002)10:895-905；Epinat等人，Nucleic Acids Res(2003)31:2952-2962；Silva等人，J Mol.Biol.(2006)361:744-754；Seligman等人，Nucleic Acids Res(2002)30:3870-3879；Sussman等人，J MolBiol(2004)342:31-41；Doyon等人，J Am Chem Soc(2006)128:2477-2484；Chen等人，Protein Eng Des Sel(2009)22:249-256；Arnoul d等人，J Mol Biol.(2006)355:443-458；Smith等人，Nucleic Acids Res.(2006)363(2):283-294。
与ZFN和TALEN一样，大范围核酸酶可以在基因组DNA中产生DSB，如果修复不当，可创造框移突变，例如，通过NHEJ，导致细胞中目标基因的表达减少。或者，可以将外来DNA与大范围核酸酶一起引入到细胞。根据外来DNA的序列和染色体序列，此过程可用于修饰目标基因。见Silva等人，Current Gene Therapy(2011)11:11-27。
d)转位酶
转位酶是结合转位子末端并通过剪切和黏贴机制或复制转位机制催化其移动到基因组另一部分的酶。通过将转位酶连接到其他系统，诸如CRISPER/Cas系统，可发展新基因编辑工具，以实现基因组DNA的位点特异性插入或操作。有二种已知的使用转位子的DNA整合方法，其使用催化无活性的Cas效应子蛋白质和似Tn7转位子。转位酶依赖性DNA整合不会引起基因组DSB，这可保证更安全及更多特异性DNA整合。
e)CRISPR/Cas系统
CRISPR系统最初是在原核有机体(例如，细菌和古细菌)中发现，作为涉及防御入侵的噬菌体和质粒的系统，其提供获得性免疫的形式。现在它已被改编并用作研究和临床应用中受欢迎的基因编辑工具。
CRISPR/Cas系统一般来说包含至少两个成分：一种或多种引导RNA(gRNA)和Cas蛋白质。Cas蛋白质为将DSB引入目标位点的核酸酶。CRISPR-Cas系统落入两大类：第1类系统使用多个Cas蛋白质的复合物来降解核酸；第2类系统使用单一大Cas蛋白质用于同一目的。第1类分为第I、III类和IV型；第2类分为第II、V和VI型。适用于基因编辑应用的不同Cas蛋白质包括，但不限于，Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3和Mad7。最广泛使用的Cas9为第II型Cas蛋白质，并在本文中作为说明描述。这些Cas蛋白质可能源自不同来源物种。例如，Cas9可以源自化脓性葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。
在原始的微生物基因组中，第II型CRISPR系统在宿主基因组内在编码为阵列的CRISPR重复序列之间并入来自侵入DNA的序列。来自CRISPR重复阵列的转录本被处理成CRISPR RNA(crRNA)，各拥有从侵入DNA转录来的可变序列，称为“原间隔区”序列、以及CRISPR重复的一部分。各crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原间隔区编码的部分引导Cas9复合物以切割互补的目标DNA序列，前提是它们与称为“原间隔区相邻基序”(PAM)的短序列相邻。
自发现以来，CRISPR系统已被改编在大范围的细胞和从细菌到真核细胞(包括人细胞)的有机体中用于诱导序列特异性DSB及目标基因组编辑。在基因编辑应用中的使用，人工设计、合成的gRNA已经替代原来的crRNA：tracrRNA复合物。例如，gRNA可以是单一引导RNA(sgRNA)，由crRNA、四环和tracrRNA组成。crRNA通常包含互补区域(也称为间隔区，通常约20个核苷酸长度)，其为使用者设计以辨识有兴趣的目标DNA。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列由四环连接，并且各具有短重复序列，用于相互杂交，从而产生嵌合sgRNA。可以通过简单地改变gRNA中存在的间隔区或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组目标。互补区域将通过标准的RNA-DNA互补碱基配对规则将Cas核酸酶引导至目标DNA位点。
为了使Cas核酸酶发挥作用，基因组DNA中目标序列的紧邻下游必须有PAM。通过Cas蛋白质的PAM辨识被认为会使相邻基因组序列不稳定，允许通过gRNA的序列询问并在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特异性序列随Cas基因的物种而异。例如，源自化脓性葡萄球菌的最常用的Cas9核酸酶辨识5'-NGG-3'的PAM序列，或者效率较低的5'-NAG-3'，其中“N”可以是任何核苷酸。其他具有替代PAM的Cas核酸酶变体也已被特征化并成功用于基因组编辑，总结在下表3中。
表3.例示性Cas核酸酶变体及其PAM序列
CRISPR核酸酶 来源有机体 PAM序列(5’→3’)
SpCas9 化脓性葡萄球菌 NGG或NAG
SaCas9 金黄色葡萄球菌 NGRRT或NGRRN
NmeCas9 脑膜炎双球菌 NNNNGATT
CjCas9 空肠弯曲杆菌 NNNNRYAC
StCas9 嗜热链球菌 NNAGAAW
TdCas9 齿垢密螺旋体 NAAAAC
LbCas12a(Cpf1) 毛螺菌科细菌 TTTV
AsCas12a(Cpf1) 氨基酸球菌属 TTTV
AacCas12b 嗜酸脂环酸芽孢杆菌 TTN
BhCas12b v4 好热芽孢杆菌 ATTN、TTTN或GTTN
R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T；V＝A或C或G；N＝任何碱基
在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一种或多种突变以改变其活性、特异性、辨识和/或其他特性。例如，Cas核酸酶可具有改变其保真度以缓和偏离目标效应的一种或多种突变(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高度保真度变体)。另举一例，Cas核酸酶可具有改变其PAM特异性的一种或多种突变。
在一些实施方案中，本文提供的细胞经基因修饰以降低一种或多种免疫因子(包括目标多肽)的表达以创造免疫特权或低免疫性细胞。在某些实施方案中，本文所公开的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代T细胞和CAR-T细胞)包含一种或多种基因修饰以降低一种或多种目标多核苷酸的表达。此目标多核苷酸以及多肽的非限制性例子包括CIITA、B2M、NLRC5、CTLA4、PD1、HLA-A、HLA-BM、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、NFY-B、NFY-C、IRF1和/或TAP1。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统发生基因修饰。通过调变(例如，降低或删除)一个或多个目标多核苷酸的表达，当植入到接受者受试者时，此细胞呈现减少的免疫活化。在一些实施方案中，细胞被视为是低免疫性，例如，在施用之后在接受者受试者或患者中。
f)切口酶(nickase)
Cas，特别是Cas9的核酸酶结构域，可以独立地突变以产生称为DNA“切口酶(nickase)”的酶。切口酶能够以与常规CRISPR/Cas核酸酶系统(包括例如CRISPR/Cas9)相同的特异性引入单链切割。可运用切口酶产生双链断裂，其可用于基因编辑系统(Mali等人，Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人，Nature Methods,10:957-963(2013)；Mali等人，Science,339(6121):823-826(2013))。在一些例子中，当使用两个Cas切口酶时，在切割端各者而不是钝端各者产生长突出端，这允许对精确基因整合和插入进行额外控制(Mali等人，Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人，Nature Methods,10:957-963(2013)；Mali等人，Science,339(6121):823-826(2013))。由于二种切开Cas酶都必须有效切开其目标DNA，与双链切割Cas为主的系统相比，成对的切口酶具有较低的偏离目标效应(Ran等人，Cell,155(2):479-480(2013)；Mali等人，Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人，Nature Methods,10:957-963(2013)；Mali等人，Science,339(6121):823-826(2013))。
P.重组表达耐受原因子和/或嵌合抗原受体的方法
对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生本文概述的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸编码耐受原因子或嵌合抗原受体可操作性连接到表达构建体中的一种或多种调节性核苷酸序列。调节性核苷酸序列一般来说适合待治疗的宿主细胞和接受者受试者。对于多种宿主细胞，许多类型的合适表达载体和合适的调节性序列在发明所属技术领域中是已知。典型地，一种或多种调节性核苷酸序列可包括，但不限于，启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录开始及终止序列、翻译开始及终止序列和增强子或活化子序列。还考虑发明所属技术领域中已知的组成型或可诱导型启动子。启动子可以是天然发生启动子，或组合超过一个启动子的元件的杂交启动子。表达构建体可存在于细胞在游离基因组上，诸如，质粒，或表达构建体可插入到染色体。在一个特定实施方案中，表达载体包括可选择标记基因，以允许选择转形的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，其包含与至少一个调节性序列可操作性连接的编码变体多肽的核苷酸序列。本文使用的调节性序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，设计表达载体用于选择欲转形的宿主细胞、要表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制所述拷贝数的能力和/或由载体编码的任何其他蛋白质的表达，例如抗生素标记。
合适的哺乳动物启动子的例子包括，例如，来自下述基因的启动子：延长因子1α(EF1α)启动子、仓鼠的泛蛋白/S27a启动子(WO 97/15664)、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的末端长重复区域、小鼠乳房瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼鼠白血病病毒末端长重复区域和人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的例子为肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在额外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可得自病毒的基因组，诸如，多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳突瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40(SV40)。在进一步实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。例子包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期及晚期启动子方便地获得为也包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段(Fiers等人，Nature 273：113-120(1978))。人巨细胞病毒的最早期启动子方便地获得为HindIII限制酶片段(Greenaway等人，Gene 18:355-360(1982)。上述文献整体以引用方式并入。
在一些实施方案中，表达载体为双顺反子或多顺反子表达载体。双顺反子或多顺反子表达载体可包括(1)融合到开读框的各者的多启动子；(2)基因之间插入剪接信号；(3)表达由单一启动子驱动的基因融合体；以及(4)基因之间插入蛋白质水解切割位点(自切割肽)或基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
可以通过任何合适的技术来达成将本文所述的多核苷酸引入细胞的过程。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、融合素(fusogen)和转导或使用病毒载体感染。在一些实施方案中，多核苷酸通过病毒转导(例如，慢病毒转导)或在病毒载体递送(例如，融合素介导的递送)而引入细胞。
本文提供的是在施用到接受者受试者后不会触发或活化免疫反应的细胞。如上所述，在一些实施方案中，细胞经修饰以增加影响接受者中免疫辨识和耐受性的基因和耐受原(例如，免疫)因子的表达。
在某些实施方案中，本文所公开的拥有调变本文所列的一种或多种目标蛋白质的表达的基因组修饰的细胞任一(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化的细胞、造血干细胞、原代T细胞CAR-T细胞和CAR-NK细胞)也被修饰以表达一种或多种耐受原因子。例示性耐受原因子包括，而无限制，一种或多种的CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8和Serpinb9。在一些实施方案中，耐受原因子选自包括下述的组：DUX4、CD47、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8和Serpinb9。
关于人CD27(也已知为CD27L受体、肿瘤坏死因子受体超家族成员7(TNFSF7)、T细胞活化抗原S152、Tp55，并且T14)的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCard Identifier GC12P008144、HGNC No.11922、NCBI Gene ID 939、UniprotNo.P26842和NCBI RefSeq Nos.NM_001242.4与NP_001233.1。
关于人CD46的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC01P207752、HGNC No.6953、NCBI Gene ID 4179、Uniprot No.P15529和NCBIRefSeq Nos.NM_002389.4、NM_153826.3、NM_172350.2、NM_172351.2、NM_172352.2NP_758860.1、NM_172353.2、NM_172359.2、NM_172361.2、NP_002380.3、NP_722548.1、NP_758860.1、NP_758861.1、NP_758862.1、NP_758863.1、NP_758869.1和NP_758871.1。
关于人CD55(也已知为补体衰变加速因子)的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCard Identifier GC01P207321、HGNC No.2665、NCBI Gene ID 1604、Uniprot No.P08174和NCBI RefSeq Nos.NM_000574.4、NM_001114752.2、NM_001300903.1、NM_001300904.1、NP_000565.1、NP_001108224.1、NP_001287832.1和NP_001287833.1。
关于人CD59的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC11M033704,HGNC No.1689,NCBI GENE ID 966、Uniprot No.P13987和NCBIRefSeq Nos.NP_000602.1、NM_000611.5、NP_001120695.1、NM_001127223.1、NP_001120697.1、NM_001127225.1、NP_001120698.1、NM_001127226.1、NP_001120699.1、NM_001127227.1、NP_976074.1、NM_203329.2、NP_976075.1、NM_203330.2、NP_976076.1和NM_203331.2。
关于人CD200的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC03P112332、HGNC No.7203、NCBI Gene ID 4345、Uniprot No.P41217和NCBIRefSeq Nos.NP_001004196.2、NM_001004196.3、NP_001305757.1、NM_001318828.1、NP_005935.4、NM_005944.6、XP_005247539.1和XM_005247482.2。
关于人HLA-C的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC06M031272、HGNC No.4933、NCBI Gene ID 3107、Uniprot No.P10321和NCBIRefSeq Nos.NP_002108.4及NM_002117.5。
关于人HLA-E的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC06P047281、HGNC No.4962、NCBI GENE ID 3133、Uniprot No.P13747和NCBIRefSeq Nos.NP_005507.3及NM_005516.5。
关于人HLA-G的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC06P047256、HGNC No.4964、NCBI Gene ID 3135、Uniprot No.P17693和NCBIRefSeq Nos.NP_002118.1及NM_002127.5。
关于人PD-L1或CD274的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCard Identifier GC09P005450、HGNC No.17635、NCBI Gene ID 29126、UniprotNo.Q9NZQ7和NCBI RefSe q Nos.NP_001254635.1、NM_001267706.1、NP_054862.1和NM_014143.3。
关于人IDO1的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC08P039891、HGNC No.6059、NCBI Gene ID 3620、Uniprot No.P14902和NCBIRefSeq Nos.NP_002155.1与NM_002164.5。
关于人IL-10的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC01M206767、HGNC No.5962、NCBIGene ID 3586、Uniprot No.P22301和NCBIRefSeq Nos.NP_000563.1与NM_000572.2。
关于人Fas配体(也已知为FasL、FASLG、CD178、TNFSF6等)的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCard Identifier GC01P172628、HGNC No.11936、NCBIGene ID 356、Uniprot No.P48023和NCBI RefSeq Nos.NP_000630.1、NM_000639.2、NP_001289675.1和NM_001302746.1。
关于人CCL21的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC09M034709、HGNC No.10620、NCB I Gene ID 6366、Uniprot No.O00585和NCBI RefSeq Nos.NP_002980.1与NM_002989.3。
关于人CCL22的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC16P057359、HGNC No.10621、NCBI Gene ID 6367、Uniprot No.O00626和NCBI RefSeq Nos.NP_002981.2、NM_002990.4、XP_016879020.1和XM_017023531.1。
关于人Mfge8的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC15M088898、HGNC No.7036、NCBIGene ID 4240、Uniprot No.Q08431和NCBIRefSeq Nos.NP_001108086.1、NM_001114614.2、NP_001297248.1、NM_001310319.1、NP_001297249.1、NM_001310320.1、NP_001297250.1、NM_001310321.1、NP_005919.2和NM_005928.3。
关于人SerpinB9的有用的基因组、多核苷酸以及多肽信息提供于，例如，GeneCardIdentifier GC06M002887、HGNC No.8955、NCBI Gene ID 5272、Uniprot No.P50453和NCBIRefSeq Nos.NP_004146.1、NM_004155.5、XP_005249241.1和XM_005249184.4。
用于调变基因和因子(蛋白质)的表达的方法包括基因组编辑技术、以及RNA或蛋白质表达技术等。对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生本文概述的重组核酸。
在一些实施方案中，目标基因的表达(例如，DUX4、CD47或另一耐受原因子)通过融合蛋白质或蛋白质复合物(包含(1)对内源性DUX4、CD47或其他基因特异性的位点特异性结合结构域及(2)转录活化子)的表达而增加。
在一些实施方案中，通过基因修饰方法而达成方法，包括同源性定向修复/重组。
在一些实施方案中，调控性因子包含位点特异性DNA-结合核酸分子，诸如，引导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，通过位点特异性DNA结合靶向蛋白质而达成方法，诸如，锌指蛋白质(ZFP)或包含ZFP的融合蛋白质，也已知为锌指核酸酶(ZFN)。
在一些实施方案中，调控性因子包含位点特异性结合结构域，诸如，使用DNA结合蛋白质或DNA结合核酸，其特异性结合到或杂交到目标区域的基因。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸或多肽与位点特异性核酸酶，诸如，修饰的核酸酶偶合或或复合。例如，在一些实施方案中，使用包含下述的融合体使施用生效：修饰的核酸酶的DNA-靶向蛋白质，诸如，大范围核酸酶或RNA-引导的核酸酶，诸如，群聚且有规律间隔的短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，诸如，CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，核酸酶经经修饰以缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的核酸酶为催化性死亡的dCas9。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域可源自核酸酶。例如，归巢核酸内切酶及大范围核酸酶的辨识序列，诸如，I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII。还见美国专利第5,420,032号；美国专利第6,833,252号；Belfort等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人，(1989)Gene 82:115-118；Perler等人，(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人，(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast等人，(1998)J.Mol.Biol.280：345-353及新英格兰生物实验室目录。此外，归巢核酸内切酶及大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程改造以结合非天然目标位点。见，例如，Chevalier等人，(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人，(2003)NucleicAcids Res.31:2952-2962；Ashworth等人，(2006)Nature 441：656-659；Paques等人，(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开案第2007/0117128号。
锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以“经工程改造”的以结合到预定的核苷酸序列，例如通过工程改造(改变一种或多种氨基酸)天然发生锌指或TALE蛋白质的辨识螺旋区域。工程改造的DNA结合蛋白质(锌指或TALE)是非天然发生的蛋白质。设计的合理标准包括应用取代规则及对于处理储存存在的ZFP和/或TALE设计与结合数据的信息的数据库中的信息的电脑化算法。见，例如，美国专利第6,140,081；6,453,242；以及6,534,261号；还见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536与WO 03/016496及美国公开案第20110301073号。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含以序列-特异性方式结合到DNA的一种或多种锌指蛋白质(ZFPs)或其结构域。ZFP或其结构域为在较大蛋白质中的蛋白质或结构域，其通过一种或多种锌指、结合结构域内氨基酸序列的区域(结合结构域的结构通过锌离子的配位而稳定)以序列-特异性的方式与DNA结合。
在ZFP中，有靶向特异性DNA序列的人工ZFP结构域，典型为9至18个核苷酸长，通过单个别指的组装产生。ZFP包括下述者，其中单一指结构域为约30个氨基酸长度并包含含有两个不变组氨酸残基的α螺旋(通过锌与单一β转折的两个半胱氨酸配位)，并且具有两个、三个、四个、五个或六个指。一般而言，ZFP的序列特异性可以通过在锌指辨识螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)处产生氨基酸取代而改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或包含ZFP的分子是非天然发生的，例如，经工程改造以与选择的目标位点结合。见，例如，Beerli等人，(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人，(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人，(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人，(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人，(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；美国专利第6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273号；以及美国专利公开案第2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061号，所有整体以引用方式并入本文。
许多基因-特异性工程改造的锌指可商业上获得。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发锌指构建平台(CompoZr)，使研究人员可以一起绕过锌指构建和验证，并且为成千上万的蛋白质提供特异性靶向的锌指(Gaj等人，Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405)。在一些实施方案中，使用商业上可获得的锌指或客制化设计。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含天然发生或工程改造的(非天然发生)似转录活化子蛋白质(TAL)DNA结合结构域，诸如，在似转录活化子蛋白质效应子(TALE)蛋白质中，见，例如，美国专利公开案第20110301073号，其整体以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域是源自CRISPR/Cas系统。一般而言，“CRISPR系统”统称涉及表达或引导CRISPR相关(“Cas”)基因的活性的转录本和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tra cr(反式活化CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tra cr-mate序列(涵盖“引导重复”和在内源性CRISPR系统的背景中的tracrRNA-处理的部分直接重复)、引导序列(也称为在内源性CRISPR系统的背景中的“间隔区”或“靶向序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录本。
一般而言，引导序列包括靶向结构域，其包含多核苷酸序列(与目标多核苷酸序列具有足够互补性以与目标序列杂交及与目标序列的CRISPR复合物的直接序列-特异性结合)。在一些实施方案中，引导序列与其对应的目标序列之间的互补程度，当使用合适的对准算法优化对准时，为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些例子中，gRNA的靶向结构域是互补，例如，至少80、85、90、95、98或99％互补，例如，完全互补，到目标核酸的目标序列。
在一些实施方案中，目标位点为目标基因转录起始位点的上游。在一些实施方案中，目标位点与基因转录起始位点相邻。在一些实施方案中，目标位点基因转录起始位点的RNA聚合酶暂停位点下游相邻。
在一些实施方案中，靶向结构域经配置以靶向目标基因的启动子区域来促使转录起始、一种或多种转录增强子或活化子和/或RNA聚合酶的结合。一种或多种gRNA可用于靶向基因的启动子区域。在一些实施方案中，基因的一个或多个区域可经靶向。在某些方面中，目标位点位于基因转录开始位点(TSS)的任一边的600碱基对内。
设计或鉴定gRNA序列(为或包含靶向基因的序列)，包括外显子序列和调控性区域的序列，包括启动子和活化子，为发明所属技术领域中具有通常知识者的程度之内。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库已公开可获得，其中包含人基因组或小鼠基因组中基因的组成型外显子中的例示性单一引导RNA(sgRNA)目标序列(见，例如，genescript.com/gRNA-database.html；还见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4；www.e-crisp.org/E-CRISP/；crispr.mit.edu/)。在一些实施方案中，gRNA序列为或包含具有对非目标基因的最小偏离目标结合的序列。
在一些实施方案中，调控性因子进一步包含功能性结构域，例如，转录活化子。
在一些实施方案中，转录活化子为或包含一种或多种调节元件，例如，一种或多种目标基因的转录控制元件，由此上述提供的位点特异性结构域经辨识以驱动此基因的表达。在一些实施方案中，转录活化子驱动目标基因的表达。在一些例子中，转录活化子可以是或包含所有或部分异源反式活化结构域。例如，在一些实施方案中，转录活化子选自单纯疱疹衍生的反式活化结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。
在一些实施方案中，调控性因子为锌指转录因子(ZF-TF)。在一些实施方案中，调控性因子为VP64-p65-Rta(VPR)。
在某些实施方案中，调控性因子进一步包含转录调控性结构域。常见的结构域包括，例如转录因子结构域(活化子、抑制子、共活化子、共抑制子)、沉默子、致癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子与修饰物；DNA重排酶及其相关因子与修饰物；染色质相关的蛋白质及其修饰物(例如，激酶、乙酰化酶及去乙酰化酶)；以及DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如，DNMT家族的成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等、拓朴异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)和其相关因子与修饰物。见，例如，美国公开案第2013/0253040号，其整体以引用方式并入本文。
用于达成活化的合适的结构域包括HSV VP 16活化结构域(见，例如，Hagmann等人，J.Virol.71,5952-5962(1 97))核激素受体(见，例如，Torchia等人，Curr.Opin.Cell.Biol.10：373-383(1998))；核因子kappa B的p65次单位(Bitko&Bank,J.Virol.72：5610-5618(1998)和Doyle&Hunt,Neuroreport 8：2937-2942(1997))；Liu等人，Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))或人工嵌合功能性结构域，诸如，VP64(Beerli等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14623-33)和降解决定子(Molinari等人，(1999)EMBOJ.18,6439-6447)。额外的例示性活化结构域包括，Oct 1、Oct-2A、Spl、AP-2和CTF1(Seipel等人，EMBOJ.11、4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A与ERF-2。见，例如，Robyr等人，(2000)Mol.Endocrinol.14：329-347；Collingwood等人，(1999)J.Mol.Endocrinol 23：255-275；Leo等人，(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46：77-89；McKenna等人，(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69：3-12；Malik等人，(2000)Trends Biochem.Sci.25：277-283；以及Lemon等人，(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。额外的例示性活化结构域包括，但不限于，OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6,-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，见，例如，Ogawa等人，(2000)Gene 245:21-29；Okanami等人，(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等人，(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等人，(1999)Plant Mol Biol 40：419-429；Ulmason等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：5844-5849；Sprenger-Haussels等人，(2000)Plant J.22：1-8；Gong等人，(1999)Plant Mol.Biol.41：33-44；以及Hobo等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：15,348-15,353。
可用于制造基因抑制子的例示性抑制结构域包括，但不限于，KRAB A/B、KOX、TGF-β-可诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族的成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等)、Rb和MeCP2。见，例如，Bird等人，(1999)Cell 99:451-454；Tyler等人，(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人，(1999)Cell 99:447-450；以及Robertson等人，(2000)Nature Genet.25:338-342。额外的例示性抑制结构域包括，但不限于，ROM2及AtHD2A。见，例如，Chem等人，(1996)Plant Cell 8:305-321；以及Wu等人，(2000)Plant J.22：19-27。
在一些例子中，结构域涉及染色体的表观遗传调控。在一些实施方案中，结构域为组织蛋白乙酰基转移酶(HAT)，例如第A型、核定位诸如，MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300或Rttl09(Bemdsen and Denu(2008)Curr Opin Struct Biol 18(6)：682-689)。在其他例子中，结构域为组织蛋白去乙酰化酶(HD AC)，诸如，I类(HDAC-l、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7及9)、HD AC IIB(HDAC 6及10))、第IV类(HDAC-l 1)、第III类(也已知为sirtuins(SIRTs)；SIRT1-7)(见Mottamal等人，(2015)Molecules 20(3):3898-394l)。用在一些实施方案中的另一结构域为组织蛋白磷酸化酶或激酶，其中例子包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bubl、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域且选自下述群组：诸如，Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7及Suv4-20h。涉及苏素化(sumoylation)和生物素化(biotinylation)(Lys9、13、4、18与12)的结构域也可用在一些实施方案中，(回顾见，Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。
融合分子是通过发明所属技术领域中具有通常知识者熟知的克隆和生化共轭的方法构建。融合分子包含DNA-结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子也视需要地包含核定位信号(诸如，例如，来自SV40培养基T-抗原者)和表位标签(例如，FLAG和血球凝集素)。融合蛋白质(和编码的核酸)经设计使得融合体组份之间保留翻译阅读框架。
通过发明所属技术领域中具有通常知识者已知的生化共轭方法构建一方面，功能结构域(或其功能性片段)的多肽组分和另一方面，非蛋白质DNA-结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂(intercalator)、小沟结合物、核酸)之间的融合体。见，例如，Pierce ChemicalCompany(Rockford,IL)Catalogue。已经描述用于制造在小沟结合物和多肽之间融合体的方法和组合物。Mapp等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3930-3935。同样地，CRISPR/Cas TF和核酸酶(包含与多肽组份功能结构域相关联的sgRNA核酸组份)也是发明所属技术领域中具有通常知识者已知并且在本文中详述。
本文提供为相较于野生型T细胞，包含降低表达的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的非经活化的T细胞，其中，经活化的T细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一基因。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞尚未经抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、T细胞活化的细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达活化标记。在一些实施方案中，非经活化的T细胞表达CD3和CD28，并且其中，CD3和/或CD28为未活化。
在一些实施方案中，抗-CD3抗体为OKT3。在一些实施方案中，抗-CD28抗体为CD28.2。在一些实施方案中，T细胞活化的细胞因子选自下列的群组：由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21所构成的T细胞活化的细胞因子。在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自下列的群组：由抗-CD28抗体、抗-CD80抗体、抗-CD86抗体、抗-CD137L抗体和抗-ICOS-L抗体所构成的可溶性T细胞共刺激分子。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞为原代T细胞。在其他实施方案中，非经活化的T细胞为自本技术的低免疫性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞为CD8+T细胞。
在一些实施方案中，第一基因由包含CD8结合子的慢病毒载体所携带。在一些实施方案中，第一基因为CAR，选自下列所组成的组：CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR。在一些实施方案中，CAR为双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR为CD19/CD22双特异性CAR。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因由包含CD8结合子的慢病毒载体所携带。在一些实施方案中，使用选自下列所组成的组的融合素介导的递送或转位酶系统将第一和/或第二基因引入到细胞：条件性或可诱导性转位酶、条件性或可诱导性PiggyBac转位子、条件性或可诱导性睡美人(SB11)转位子、条件性或可诱导性Mos1转位子和条件性或可诱导性Tol2转位子。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞进一步包含第二基因CD47。在一些实施方案中，第一和/或第二基因插入到T细胞至少一对偶基因的特异性基因座。在一些实施方案中，特异性基因座选自下列所组成的组：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座及TRB基因座。在一些实施方案中，编码CAR的第一基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座及TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到不同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到相同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到B2M基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到CIITA基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到TRAC基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到安全港或目标基因座。在一些实施方案中，安全港或目标基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、CXCR4基因基因座、PPP1R12C基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因基因座、CLYBL基因基因座、Rosa基因基因座、F3(CD142)基因基因座、MICA基因、基因座MICB基因、基因座LRP1(CD91)基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因座、PDGFRa基因基因座、OLIG2基因基因座、GFAP基因基因座和KDM5D基因基因座)。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达B2M。在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达CIITA。在一些实施方案中，非经活化的T细胞未表达TCR-α及TCR-β。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel /indel细胞，包含插入到TRAC基因座的编码CD47的第二基因和/或编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到TRAC基因座的编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到TRB基因座的编码CD47的第二基因和/或编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到TRB基因座的编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到B2M基因座的编码CD47的第二基因和/或编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到B2M基因座的编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到CIITA基因座的编码CD47的第二基因和/或编码CAR的第一基因。在一些实施方案中，非经活化的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel/indel细胞，包含插入到CIITA基因座的编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因。
本文提供为工程改造的T细胞，相较于野生型T细胞，包含降低表达的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β，其中，工程改造的T细胞进一步包含由包含CD8结合子的慢病毒载体携带的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一基因。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞为原代T细胞。在其他实施方案中，工程改造的T细胞为自本技术的低免疫性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞为CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+T细胞。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞未表达活化标记。在一些实施方案中，工程改造的T细胞表达CD3和CD28，并且其中，CD3和/或CD28为未活化。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞尚未经抗-CD3抗体、抗-CD28抗体、T细胞活化的细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，抗-CD3抗体为OKT3，其中，抗-CD28抗体为CD28.2，其中，T细胞活化的细胞因子选自下列的群组：由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21所构成的T细胞活化的细胞因子，并且其中，可溶性T细胞共刺激分子选自下列的群组：由抗-CD28抗体、抗-CD80抗体、抗-CD86抗体、抗-CD137L抗体和抗-ICOS-L抗体所构成的可溶性T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，工程改造的T细胞尚未经一种或多种选自下列所组成的组的T细胞活化的细胞因子处理：IL-2、IL-7、IL-15和IL-21。在一些例子中，细胞因子为IL-2。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子为IL-2而另一选自下列所组成的组：IL-7、IL-15和IL-21。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞进一步包含第二基因CD47。在一些实施方案中，第一和/或第二基因插入到T细胞至少一对偶基因的特异性基因座。在一些实施方案中，特异性基因座选自下列所组成的组：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座及TRB基因座。在一些实施方案中，编码CAR的第一基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座及TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到不同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到相同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的第二基因及编码CAR的第一基因插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或目标基因座。在一些实施方案中，安全港或目标基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、CXCR4基因基因座、PPP1R12C基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因基因座、CLYBL基因基因座、Rosa基因基因座、F3(CD142)基因基因座、MICA基因、基因座MICB基因、基因座LRP1(CD91)基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因座、PDGFRa基因基因座、OLIG2基因基因座、GFAP基因基因座和KDM5D基因基因座)。
在一些实施方案中，CAR选自下列所组成的组：CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞未表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中，工程改造的T细胞未表达B2M，其中，工程改造的T细胞未表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中，工程改造的T细胞未表达CIITA和/或其中，工程改造的T细胞未表达TCR-α及TCR-β。
在一些实施方案中，工程改造的T细胞为B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、TRACindel /indel细胞包含插入到TRAC基因座、到TRB基因座、到B2M基因座或到CIITA基因座的编码CD47的第二基因和/或编码CAR的第一基因。
在一些实施方案中，本技术的非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞在受试者。在其他实施方案中，本技术的非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞在试管内。
在一些实施方案中，本技术的非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞表达CD8结合子。在一些实施方案中，CD8结合子为抗-CD8抗体。在一些实施方案中，抗-CD8抗体选自下列所组成的组：小鼠抗-CD8抗体、兔抗-CD8抗体、人抗-CD8抗体、人源化抗-CD8抗体、骆驼科动物(camelid)(例如，骆马、羊驼、骆驼)抗-CD8抗体和其片段。在一些实施方案中，其片段为scFV或VHH。在一些实施方案中，CD8结合子结合到CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，CD8结合子融合到并入到病毒套膜的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体以病毒融合蛋白质假型分型(pseudotyped)。在一些实施方案中，病毒融合蛋白质包含一种或多种修饰以降低结合其天然受体。
在一些实施方案中，病毒融合蛋白质融合到CD8结合子。在一些实施方案中，病毒融合蛋白质包含融合到CD8结合子的Nipah病毒F糖蛋白质及Nipah病毒G糖蛋白质。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，慢病毒载体编码第一基因和/或第二基因。
在一些实施方案中，转移到第一受试者之后，非经活化的T细胞或工程改造的T细胞呈现一种或多种选自下列所组成的组的反应：(a)T细胞反应、(b)NK细胞反应和(c)巨噬细胞反应，其相较于野生型细胞转移到第两受试者之后为降低。在一些实施方案中，第一受试者的第两受试者为不同受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞反应遭淹没。
在一些实施方案中，转移到受试者之后，相较于野生型细胞转移到受试者之后，非经活化的T细胞或工程改造的T细胞呈现一种或多种选自下列所组成的组：(a)受试者中降低的TH1活化、(b)受试者中降低的NK细胞杀伤和(c)受试者中降低的经全PBMC的杀伤。
在一些实施方案中，转移到受试者之后，相较于野生型细胞转移到受试者之后，非经活化的T细胞或工程改造的T细胞引起一种或多种选自下列所组成的组：(a)受试者中降低的供体特异性抗体、(b)受试者中降低的IgM或IgG抗体和(c)受试者中降低的补体依赖性细胞杀伤(CDC)。
在一些实施方案中，非经活化的T细胞或工程改造的T细胞在受试者中以包含CD8结合子的慢病毒载体转导。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
本文提供为药物组合物，包含本技术的一群非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞和医药上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供为包含施用到受试者包含本技术的一群非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞的组合物或一种或多种本技术的药物组合物的方法。
在一些实施方案中，在组合物施用之前、之后和/或同时，受试者未被施用T细胞活化的治疗。在一些实施方案中，T细胞活化的治疗包含淋巴细胞排空(lymphodepletion)。
本文提供为治疗患有癌症的受试者的方法，包括施用到受试者包含本技术的一群非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞的组合物或一种或多种本技术的药物组合物，其中，在组合物施用之前、之后和/或同时，受试者未被施用T细胞活化的治疗。在一些实施方案中，T细胞活化的治疗包含淋巴细胞排空(lymphodepletion)。
本文提供为在受试者中扩增能够辨识及杀伤有其需要的受试者中肿瘤细胞的T细胞的方法，包括施用到受试者包含本技术的一群非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞的组合物或一种或多种本技术的药物组合物，其中，在组合物施用之前、之后和/或同时，受试者未被施用T细胞活化的治疗。在一些实施方案中，T细胞活化的治疗包含淋巴细胞排空(lymphodepletion)。
本文提供为治疗受试者中疾病或失调的给药方案，包含施用包含本技术的一群非经活化的T细胞和/或工程改造的T细胞的药物组合物或一种或多种本技术的药物组合物和医药上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中，药物组合物以约1至3剂量施用。
一旦改变，本文所述的任何分子的表达的存在可以使用已知技术检定，诸如，西方墨点法、ELISA检定、FACS检定等。
Q.产生诱导性多能干细胞
在一方面中，本文提供的是产生低免疫性多能细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括产生多能干细胞。产生小鼠及人多能干细胞(一般来说是指为iPSC；小鼠细胞为miPSC或人细胞为hiPSC)一般来说为发明所属技术领域已知。发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，有多种不同产生iPCS的方法。最初的诱导是从小鼠胚胎或成体纤维母细胞使用的四个转录因子，Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入进行；见Takahashi及Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，整体以引用方式并入本文，并且特别是其中概述的技术。从那时起，已经开发许多方法；见，Seki et al.,World J.Stem Cells 7(1):116-125(2015)评论，及Lakshmipathy及Vermuri，编辑，Methods in Molecular Biology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013，在此整体以引用方式将其明确并入，并且特别是产生hiPSC的方法(见例如后面参考文献的第3章)。
一般而言，iPSC基因是由宿主细胞中一个或多个重编程(reprogramming)因子”的短暂表达产生，通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞经诱导成为iPSC(一般而言，这一步的效率很低，因为没有使用选择标记)。一旦细胞“重编程”，并且成为多能，它们就会失去附加型载体并使用内源性基因产生因子。
如发明所属技术领域中具有通常知识者所理解，可以使用或使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少重编程因子时，细胞转形成多能状态的效率下降，以及“多能性”，例如较少的重编程因子可能导致未完全多能但可能仅能够分化成较少细胞类型的细胞。
在一些实施方案中，使用单一重编程(reprogramming)因子，OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程(reprogramming)因子，OCT4及KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程(reprogramming)因子，OCT4、KLF4及SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程(reprogramming)因子，OCT4、KLF4、SOX2及c-Myc。在其他实施方案中，可使用选自下述的5、6或7个重编程(reprogramming)因子：SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原。一般而言，这些重编程(reprogramming)因子基因提供到附加型载体，诸如，发明所属技术领域中已知及商业上可获得。
一般而言，如本领域已知，通过短暂表达本文所述的重编程(reprogramming)因子，iPSC从非多能细胞制造，诸如，但不限于，血细胞、纤维母细胞等。
R.低免疫性表型和多能性的保留的检定
一旦已产生低免疫性细胞，其可经检定其低免疫性和/或多能性的保留，如描述于WO2016183041及WO2018132783。
在一些实施方案中，使用WO2018132783的图13和图15中举例的多种技术来检定低免疫性。这些技术包括移植到同种异体宿主中，以及监测逃脱宿主免疫系统的低免疫性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些例子中，低免疫性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，并且然后可以使用生物发光成像追踪。同样地，测试宿主动物的T细胞和/或B细胞对此类细胞的反应，以确认细胞不会在宿主动物中引起免疫反应。T细胞反应可以通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞仪(CYTOF)评估。B细胞反应或抗体反应使用FACS或Luminex评估。另外或或者，可以对细胞检定其避免先天性免疫反应的能力，例如，NK细胞杀伤，一般来说如WO2018132783的图14和15中所示。
在一些实施方案中，细胞的免疫性是通过发明所属技术领域中具有通常知识者认可的T细胞免疫检定诸如，T细胞增殖检定、T细胞活化检定和T细胞杀伤检定来评估。在一些例子中，T细胞增殖检定包括用干扰素-γ预处理细胞和用标记的T细胞共培养细胞，并在预先选择的时间量之后检定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些例子中，T细胞活化检定包括将T细胞与本文所概述的细胞共培养，并测定在T细胞中T细胞活化标记的表达量。
可以进行体内检定以评估本文所概述的细胞的免疫性。在一些实施方案中，低免疫性细胞的生存和免疫性是使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模式测定。在一些例子中，低免疫性多能干细胞被移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠，并检定细胞排斥、细胞存活和畸胎瘤形成。在一些例子中，移植的低免疫性多能干细胞或其分化的细胞在小鼠模式中展现长期存活。
测定包括细胞的低免疫性的免疫性的其他技术描述于，例如，Deuse等人，NatureBiotechnology,2019,37,252-258及Han等人，Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，所述公开包括图式、图式图例和方法的描述整体以引用方式并入本文。
同样地，以多种方式测试多能性的保留。在一个实施方案中，多能性是通过一般来说如本文中描述的和WO2018132783图29所示的某些多能性-特异性因子的表达来检定。此外或或者，多能细胞分化成一种或多种细胞类型，为多能性的指示。
如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，可以使用发明所属技术领域中已知和如下所述的技术测量多能细胞中MHC I功能(HLA I，当细胞源自人细胞时)的成功减少；例如，使用结合HLA复合物的标记抗体的FACS技术；例如，使用商业上可获得HLA-A、B、C抗体(结合到人主要组织相容性HLA I类抗原的α链)。
此外，可以测试细胞以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可以通过FACS分析，使用针对上述讨论的一种或多种HLA细胞表面成分的抗体检定。
可以使用发明所属技术领域中已知的技术来测量多能细胞或其衍生物中MHC II功能(HLA II，当细胞源自人细胞时)的成功降低，诸如，使用针对蛋白质的抗体的西方墨点法、FACS技术、RT-PCR技术等。
此外，可以测试细胞以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，如发明所属技术领域中已知的那样进行检定(例如，见WO2018132783的图21)，并且一般来说使用基于与人HLA II类HLA-DR、DP及大多数DQ抗原结合的商业抗体的西方墨点法或FACS分析完成。
除了HLA I和II(或MHC I和II)的降低，本文提供的低免疫性细胞对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤具有降低的感受性。由于一种或多种CD24转基因的表达，由此所得的低免疫性细胞“逃脱”免疫巨噬细胞和先天性途径。
S.多能干细胞的维持
一旦低免疫性多能干细胞产生，其可以保持未分化状态，正如已知维持iPSC一样。例如，使用培养基在Matrigel上培养细胞，避免分化并维持多能性。此外，其可在维持多能性的条件下的培养基中。
T.来自低免疫性诱导性多能(HIP)干细胞的分化的细胞
于一方面中，本文提供为HIP细胞，其分化为不同的细胞类型，用于后续移植到接受者受试者中。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估细胞-特异性标记的存在。正如发明所属技术领域中具有通常知识者所了解，可以使用发明所属技术领域中已知的技术移植分化的低免疫性多能细胞衍生物，所述技术取决于这些细胞的细胞类型和最终用途。
1.自低免疫性多能细胞分化的心脏细胞
本文提供为自HIP细胞分化的心脏细胞类型用于后续移植或植入到受试者(例如，接受者)。如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，分化的方法使用已知技术取决于所需细胞类型。例示性心脏细胞类型包括，但不限于，心肌细胞、结节心肌细胞、传导心肌细胞、工作心肌细胞、心肌细胞前驱细胞、心肌细胞祖细胞、心脏干细胞、心脏肌肉细胞、心房心脏干细胞、心室心脏干细胞、心外膜细胞、造血细胞、血管内皮细胞、心内膜内皮细胞、心脏瓣膜间质细胞、心脏起搏细胞等。
在一些实施方案中，施用本文所述的心脏细胞到接受者受试者以治疗选自下列所组成的组的心脏失调：小儿科心肌病变、与年龄有关的心肌病变、扩张性心肌病变、肥大性心肌病变、局限性心肌病变、慢性缺血性心肌病变、分娩前后心肌病变、炎性心肌病变、自发性心肌病变、其他心肌病变、心肌缺血性再灌流损伤、心室功能异常、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、末期心脏疾病、动脉硬化症、局部缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌局部缺血、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心脏局部缺血、心脏损伤、心肌局部缺血、血管疾病、后天心脏疾病、先天心脏疾病、动脉硬化症、冠状动脉疾病、功能异常传导系统、功能异常冠状动脉、肺高血压、心脏心律不整、肌肉营养不良、肌肉质量异常、肌肉退化、心肌炎、感染性心肌炎、药物-或毒素-诱导的肌肉异常、过敏性心肌炎和自身免疫心内膜炎。
因此，本文提供为治疗及预防有其需要的受试者中心脏损伤或心脏疾病或失调的方法。本文所述的方法可用于治疗、改善、预防或减缓许多心脏疾病或其症状的进展，诸如，造成心脑结构和/或功能病理性损害者。术语“心脏疾病”、“心脏失调”及“心脏损伤”在本文中可互换使用并指与心脏相关的病症和/或失调，包括心脏的瓣膜、内皮、梗塞区或其他组件或结构。此心脏疾病或心脏相关的疾病包括，但不限于，其中包括心肌梗塞、心力衰竭、心肌病变、先天心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能异常、心内膜炎、风湿性热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥大性心肌病变、扩张性心肌病变、心肌炎、心脏扩大和/或二尖瓣闭锁不全。
在一些实施方案中，心肌细胞前驱包括能够产生子代的细胞，包括成熟(末期)心肌细胞。心肌细胞前驱细胞通常可以使用选自GATA-4、Nkx2.5和转录因子的MEF-2家族的一种或多种标记来辨识。在一些例子中，心肌细胞是指不成熟心肌细胞或表达来自下述列表的一种或多种标记(有时至少2、3、4或5种标记)的成熟心肌细胞：心脏肌钙蛋白I(cTnl)、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、肌原纤维节(sarcomeric)肌凝蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-黏附蛋白、β2-肾上腺素受体、ANF、转录因子的MEF-2家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心房利尿钠因子(ANF)。在一些例子中，当在合适的组织培养环境中与适当的Ca2+浓度和电解质平衡培养心脏细胞时，可以观察到细胞在细胞的一个轴上以周期性方式收缩，然后从收缩中释放，而没有必须向培养基中添加额外的成分。在一些实施方案中，心脏细胞是低免疫性心脏细胞。
在一些实施方案中，通过试管内分化从一群低免疫性多能(HIP)细胞产生一群低免疫性心脏细胞的方法包括：(a)在包含GSK抑制子的培养基中培养一群HIP细胞；；(b)包含WNT拮抗剂的培养基中培养一群HIP细胞以产生一群前心脏细胞；以及(c)在包含胰岛素的培养基中培养一群前心脏细胞以产生一群低免疫心脏细胞。在一些实施方案中，GSK抑制子是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些例子中，GSK抑制子的浓度范围从约2mM至约10mM。在一些实施方案中，WNT拮抗剂为IWR1、其衍生物或其变体。在一些例子中，WNT拮抗剂的浓度范围从约2mM至约10mM。
在一些实施方案中，一群低免疫性心脏细胞自非心脏细胞单离。在一些实施方案中，单离的一群低免疫性心脏细胞在施用之前扩增。在某些实施方案中，单离的一群低免疫性心脏细胞在施用之前扩增及冷冻保存。
在一些实施方案中，多能细胞分化成心肌细胞以解决心血管疾病。用于将hiPSC分化为心肌细胞的技术是发明所属技术领域中已知并且在实施方案中讨论。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估是否存在与心肌细胞相关或特异性标记或通过功能测量；见，例如Loh等人，Cell,2016,166,451-467，在此整体以引用方式并入，特别对于分化干细胞，包括心肌细胞的方法。
用于分化诱导性多能干细胞或多能干细胞为心脏细胞的其他有用方法描述例如，于US2017/0152485；US2017/0058263；US2017/0002325；US2016/0362661；US2016/0068814；US9,062,289；US7,897,389；以及US7,452,718。从诱导性多能干细胞或多能干细胞产生心脏细胞的额外的方法描述于例如，Xu等人，Stem Cells and Development,2006,15(5):631-9、Burridge等人，Cell Stem Cell,2012,10:16-28和Chen等人，Stem Cell Res,2015,15(2):365-375。
在各种实施方案中，低免疫性心脏细胞可以在包括BMP途径抑制子、WNT信号传递活化子、WNT信号传递抑制子、WNT促效剂、WNT拮抗剂、Src抑制子、EGFR抑制子、PCK活化子、细胞因子、生长因子、亲心性剂、化合物等的培养基中培养。
WNT信号传递活化子包括但不限于CHIR99021。PCK活化子包括但不限于PMA。WNT信号传递抑制子包括但不限于选自KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)和SO3042(KY03-I)和XAV939的化合物。Src抑制子包括但不限于A419259。EGFR抑制子包括但不限于AG1478。
从iPSC产生心脏细胞的剂的非限制性例子包括包括活化素A、BMP4、Wnt3a、VEGF、可溶性卷曲蛋白质、环孢素A、血管收缩素II、脱羟肾上腺素、抗坏血酸、二甲亚砜、5-氮杂-2'-脱氧胞苷等。
本文提供的细胞可培养在表面，诸如，合成表面以支持和/或促使低免疫性多能细胞分化成心脏细胞。在一些实施方案中，表面包含聚合物材料，包括，但不限于，选自一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性例子包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、甘油二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、苯甲酸三羟甲基丙烷二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.02,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。合成的丙烯酸酯如发明所属技术领域中已知或从商业供应商处获得，诸如，Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.及Sartomer,Inc。
聚合物材料可以分散在撑体材料的表面上。适合培养细胞的有用的撑体材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些例子中，玻璃包括钠钙玻璃、硼玻璃、硅质玻璃、石英玻璃、硅或这些的衍生物等。
在一些例子中，塑料或包括树枝状聚合物的聚合物包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-顺丁烯二酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、碳氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚次乙亚胺或这些的衍生物等。在一些例子中，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共顺丁烯二酸酐)、聚(苯乙烯-共顺丁烯二酸酐)、聚(乙烯-共丙烯酸)或这些的衍生物等。
如本文所述制备的心脏细胞的功效可以在心脏冷冻损伤(导致55％的左心室壁组织在未经治疗的情况下成为sCAR-组织)的动物模型中评估(Li等人，Ann.Thorac.Surg.62：654,1996；Sakai等人，Ann.Thorac.Surg.8：2074,1999,Sakai等人，Thorac.Cardiovasc.Surg.118：715,1999)。成功的治疗可以降低疤痕面积、限制疤痕扩张、并且改善由收缩压、舒张压和发展压力所决定的心脏功能。还可以在左前降支动脉远端部分使用栓塞线圈来建立模式心脏损伤(Watanabe等人，Cell Transplant.7:239,1998)，并且可以通过组织学和心脏功能评估治疗功效。
在一些实施方案中、施用包括植入组织受试者的心脏组织、静脉注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输液。
在一些实施方案中，施用工程改造的心脏细胞的患者还施用心脏药物。适合用于组合疗法的心脏药物的说明性例子包括，但不限于，生长因子、编码生长因子的多核苷酸、血管生成剂、钙通道阻滞剂、抗高血压剂、抗有丝分裂剂、强心剂、抗致动脉粥样硬化剂、抗凝血剂、β-阻滞剂、抗心律失常剂、抗炎性剂、血管舒张剂、血栓溶解剂、心脏糖苷类、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抑制原生动物的剂、硝酸盐、血管收缩素转换酶(ACE)抑制子、血管收缩素Ⅱ受体拮抗剂、脑利尿钠肽(BNP)；抗肿瘤药、类固醇等。
根据本文提供的方法的疗法效果可以通过多种方式监测。例如，可以使用心电图(ECG)或holier监护仪来确定治疗功效。ECG为测量心脏节律和电脉冲，并且是非常有效和非侵入性的方法来确定疗法是否改善或维持、预防或减缓受试者心脏中电传导退化。使用holier监护仪、可长时间佩戴监控心脏异常、心律失常失调等的可携式ECG也是评估疗法有效性的可靠方法。ECG或核研究可用于确定心室功能的改善。
2.自低免疫性多能细胞分化的神经细胞
本文提供为自HIP细胞分化的不同神经细胞类型，其有用于后续移植或植入到接受者受试者。如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，分化的方法使用已知技术取决于所需细胞类型。例示性神经细胞类型包括，但不限于，脑内皮细胞、神经元(例如，多巴胺神经元)、神经胶质细胞等。
在一些实施方案中，通过将细胞暴露或接触细胞到已知产生特异性细胞谱系的特异性因子来进行诱导性多能干细胞的分化，从而靶向其分化为特定、所需的谱系和/或有兴趣的细胞类型。在一些实施方案中，最终分化的细胞展现专门的表型特性或特征。在某些实施方案中，本文所述的干细胞分化成神经外胚层、神经元、神经内分泌、多巴胺、胆碱性、血清基能(5-HT)、谷氨酸、GABAergic、肾上腺素性、去肾上腺素性、交感神经元、副交感神经元、交感外周神经元或神经胶质细胞群。在一些例子中、神经胶质细胞群包括微神经胶(例如、变形虫状、分歧、活化吞噬和活化非吞噬)细胞群或巨神经胶(中枢神经系统细胞：星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和放射状胶质细胞；以及外周神经系统细胞：施旺氏细胞和卫星细胞)细胞群或任何前述细胞的前驱和祖细胞。
PCT申请第WO2010144696号、美国专利第9,057,053；9,376,664；以及10,233,422号中描述的用于产生不同类型神经细胞的方案。分化低免疫性多能细胞的方法的额外描述，可于例如，在Deuse等人，Nature Biotechnology,2019,37,252-258以及Han等人，ProcNatl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446中发现。测定神经失调或病症的动物模型中神经细胞移植效果的方法描述于下述参考文献中：对于脊髓损伤-Curtis等人，CellStem Cell,2018,22,941-950；对于帕金森氏症-Kikuchi等人，Nature,2017,548：592-596；对于ALS-Izrael等人，Stem Cell Research,2018,9(1):152及Izrael等人，IntechOpen,DOI:10.5772/intechopen.72862；对于癫癎-Upadhya等人，PNAS,2019,116(1)：287-296。
a.脑内皮细胞
在一些实施方案中，施用神经细胞到受试者以治疗帕金森氏症、亨丁顿疾病、多发性硬化症、其他神经退化性疾病或病症、注意力缺陷过动症(ADHD)、妥瑞氏症(TS)、思觉失调症、精神病、抑郁症、其他神经精神科失调。在一些实施方案中，施用本文所述的神经细胞到受试者以治疗或改善中风。在一些实施方案中，施用神经元及神经胶质细胞到患有肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的受试者。在一些实施方案中，施用脑内皮细胞以缓和脑出血的症状或效应。在一些实施方案中，施用多巴胺神经元到患有帕金森氏症的患者。在一些实施方案中，施用去肾上腺素性神经元、GABAergic中间神经元到经历癫痫发作的患者。在一些实施方案中，施用运动神经元、中间神经元、施旺氏细胞、少突胶质细胞和微胶细胞到经历脊髓损伤的患者。
在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前驱物和先驱物是自在表面的多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞)分化，通过培养细胞在包含一种或多种促使产生脑EC或神经细胞的因子的培养基。在一些例子中，培养基包括下述的一种或多种：CHIR-99021、VEGF、碱性FGF(bFGF)和Y-27632。在一些实施方案中，培养基包括经设计促使神经细胞存活与功能性的补充品。
在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前驱和先驱物是通过培养细胞在未经调节或经调节的培养基中在表面自多能干细胞分化。在一些例子中，培养基包含促进或协助分化的因子或小分子。在一些实施方案中，培养基包含一种或多种选自下列所组成的组的因子或小分子：VEGR、FGF、SDF-1、CHIR-99021、Y-27632、SB 431542和其组合。在一些实施方案中，供分化的表面包含一种或多种细胞外基质蛋白质。表面可经涂布一种或多种细胞外基质蛋白质。细胞可在悬浮液中分化，然后放到凝胶基质形式，诸如，matrigel、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式以协助细胞存活。在一些例子中，如发明所属技术领域已知，一般来说通过评估细胞-特异性标记的存在来检定分化。
在一些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自下列所组成的组的因子：CD31、VE黏附蛋白和其组合。在某些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌一种或多种选自下列所组成的组的因子：CD31、CD34、CD45、CD117(c-kit)、CD146、CXCR4、VEGF、SDF-1、PDGF、GLUT-1、PECAM-1、eNOS、密连蛋白-5、紧连蛋白、ZO-1、p-糖蛋白质、冯威里氏(von Willebrand)因子、VE-黏附蛋白、低密度脂蛋白质受体LDLR、低密度脂蛋白质受体-相关的蛋白质1LRP1、胰岛素受体INSR、瘦素受体LEPR、基底细胞黏着分子BCAM、转铁蛋白受体TFRC、晚期糖基化终产物-特异性受体AGER、供视黄醇摄取STRA6的受体、大中性氨基酸转运子小次单位1SLC7A5、兴奋性氨基酸转运子3SLC1A1、钠偶合中性氨基酸转运子5SLC38A5、溶质载剂家族16成员1SLC16A1、ATP-依赖性移位酶ABCB1、ATP-ABCC2-结合匣转运子ABCG2、多药物抗性-相关性蛋白质1ABCC1、小管多特异性有机阴离子转运子1ABCC2、多药物抗性-相关性蛋白质4ABCC4和多药物抗性-相关性蛋白质5ABCC5。
在一些实施方案中，脑EC由一种或多种选自下列所组成的组的特性特征化：紧密连接的高度表达、高电阻、低开窗、小血管周围空间、胰岛素和转铁蛋白受体的高度传播和线粒体数量多。
在一些实施方案中，使用阳性选择策略选择或纯化脑EC。在一些例子中，脑EC是针对内皮细胞标记分选，诸如，但不限于，CD31。换句话说，单离CD31阳性脑EC。在一些实施方案中，使用阴性选择策略选择或纯化脑EC。在一些实施方案中，未分化或多能干细胞通过选择表达多能性标记(包括，不限于，TRA-1-60和SSEA-1)的细胞来移出。
b.多巴胺神经元
在一些实施方案中，本文所述的HIP细胞分化成多巴胺神经元，包括神经元干细胞、神经元祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元。
在一些例子中，术语“多巴胺神经元”包括神经元细胞，其表达出酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺合成的限速酶。在一些实施方案中，多巴胺神经元分泌神经传导多巴胺，并且几乎没有或没有多巴胺羟化酶的表达。多巴胺(DA)神经元可以表达出一种或多种下述标记：神经元-特异性烯醇酶(NSE)、1-芳香族氨基酸脱羧酶、囊泡单胺转运子2、多巴胺转运子、Nurr-l和多巴胺-2受体(D2受体)。在某些例子中，术语“神经干细胞”包括沿着神经细胞途径已部分分化且表达一种或多种神经标记，包括，例如，巢蛋白(nestin)的一群多能细胞。神经干细胞可分化成神经元或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“神经祖细胞”包括表达FOXA2及低量的b-微管蛋白，但无酪氨酸羟化酶的经培养的细胞。此神经祖细胞具有分化成各种神经元亚型的能力；特别是培养适当的因子后，诸如，本文所述者，各种多巴胺神经元亚型。
在一些实施方案中，将源自HIP细胞的DA神经元施用到患者，例如，人患者以治疗神经退化性疾病或病症。在一些例子中，神经退化病症或疾病选自下列所组成的组：帕金森氏症、亨丁顿疾病和多发性硬化症。在其他实施方案中，DA神经元用于治疗或改善神经神经精神科失调，诸如，注意力缺陷过动症(ADHD)、妥瑞氏症(TS)、思觉失调症、精神病和抑郁症的一种或多种症状。在又其他实施方案中，DA神经元用于治疗有受损的DA神经元的患者。
在一些实施方案中，DA神经元、其前驱物和先驱物是通过培养干细胞在包含一种或多种因子或添加剂的培养基而自多能干细胞分化。促使DA神经元的分化、生长、扩增、维持和/或成熟的有用因子和添加剂包括，但不限于，Wntl、FGF2、FGF8、FGF8a、音猬因子(SHH)、脑衍生的神经营养性因子(BDNF)、转形生长因子a(TGF-a)、TGF-b、间白素1β、神经胶质细胞株衍生的神经营养性因子(GDNF)、GSK-3抑制子(例如，CHIR-99021)、TGF-b抑制子(例如，SB-431542)，B-27补充剂、多索吗啡(dorsomorphin)、嘌吗啡胺(purmorphamine)、头蛋白(noggin)、视黄酸、cAMP、抗坏血酸、神经秩蛋白(neurturin)、剔除血清替代物、N-乙酰基半胱氨酸、c-kit配体、其修饰的形式、模拟物、其类似物和其变体。在一些实施方案中，DA神经元在一种或多种活化或抑制WNT路径、NOTCH路径、SHH路径、BMP路径、FGF路径等的因子的存在下分化。分化程序及其详细描述提供于，例如，US9,968,637,US7,674,620,Kim等人，Nature,2002,418,50-56；Bjorklund等人，PNAS,2002,99(4),2344-2349；Grow等人，StemCells Transl Med.2016,5(9):1133-44和Cho等人，PNAS,2008,105：3392-3397，包括实施方案、方法、图式和结果的详细描述的整体公开以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，一群低免疫性多巴胺神经元自非神经元细胞单离。在一些实施方案中，在施用之前扩增单离的一群低免疫性多巴胺神经元。在某些实施方案中，在施用之前扩增及冷冻保存单离的一群低免疫性多巴胺神经元。
为了特征化和监测DA化并评估DA表型，可以评估任何数量的分子和基因标记的表达。例如，基因标记的存在可以通过发明所属技术领域中具有通常知识者已知的各种方法来测定。分子标记的表达可以通过量化方法，诸如，但不限于，qPCR为主的检定、免疫检定、免疫细胞化学检定、免疫墨点法检定等测定。DA神经元的例示性标记包括，但不限于，TH、b-微管蛋白、成对盒蛋白质(Pax6)、胰岛素基因增强子蛋白质(Isl1)、巢蛋白(nestin)、二氨基联苯胺(DAB)、G蛋白质活化的内向整流钾通道2(GIRK2)、微管-相关性蛋白质2(MAP-2)、NURR1、多巴胺转运子(DAT)、叉头盒蛋白质A2(FOXA2)、FOX3、双皮质素(doublecortin)和LIM同源异形匣转录因子l-β(LMX1B)等。在一些实施方案中，DA神经元表达一种或多种的选自下述的标记：corin、FOXA2、TuJ1、NURR1和其组合。
在一些实施方案中，DA神经元是根据细胞电生理学活性评估。可以通过使用发明所属技术领域中具有通常知识者已知的检定来评估细胞的电生理学。例如，全细胞和穿孔膜片钳、检测细胞电生理学活性的检定、测量细胞动作电位的幅度和持续时间的检定、以及检测DA细胞的多巴胺生成的功能性检定。
在一些实施方案中，DA神经元分化的特征在于自发节律性动作电位和在注入去极化电流时具有尖峰频率适应的高频动作电位。在其他实施方案中，DA分化的特征在于多巴胺生成。所生成的多巴胺量是通过测量动作电位在达到其最大振幅一半时点的宽度(峰值最大半宽度(spike half-maximal width))来计算。
在一些实施方案中，分化的DA神经元经静脉内或注射到患者的特定位置来移植。在一些实施方案中，分化的DA细胞移植到脑的黑质(特别是在致密区域内或相邻区域)、腹侧盖膜区(VTA)、尾状核、壳核、依核、视丘下核(subthalamic nucleus)或其任何组合，以取代退化导致帕金森氏症的DA神经元。可以将分化的DA细胞作为细胞悬浮物注射到目标区域。或者，当包含在此递送装置中时，分化的DA细胞可埋在支撑基质或支架中。在一些实施方案中，支架是可生物降解。在其他实施方案中，支架是不可生物降解。支架可以包含天然或合成(人工)材料。
DA神经元的递送可以通过使用合适的媒介物，诸如，但不限于，微脂体、微粒或微胶囊来达成。在其他实施方案中，在包含等张赋形剂的药物组合物中施用分化的DA神经元。在足够无菌供人施用的条件下制备药物组合物。在一些实施方案中，自HIP细胞分化的DA神经元以药物组合物的形式提供。细胞组合物的治疗调配物的一般原则可于Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy,G.Morstyn&W.Sheridan eds,Cambridge University Press,1996和Hematopoietic Stem CellTherapy,E.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000发现，其公开以引用方式并入本文。
源自干细胞的神经元及其制造方法的有用描述可于，例如，Kirkeby等人，CellRep,2012,1:703-714；Kriks等人，Nature,2011,480:547-551；Wang等人，Stem CellReports,2018,11(1):171-182；Lorenz Studer,"Chapter 8-Strategies for BringingStem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial"in Progressin Brain Research,2017,volume 230,pg.191-212；Liu等人，Nat Protoc,2013,8:1670-1679；Upadhya等人，Curr Protoc Stem Cell Biol,38,2D.7.1-2D.7.47；US专利公开案第20160115448号和US8,252,586；US8,273,570；US9,487,752与US10,093,897发现，其内容整体以引用方式并入本文。
除了DA神经元以外，通过培养细胞在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中，其他神经元细胞、其前驱物和先驱物可从本文所概述的HIP细胞分化。因子及添加剂的非限制性例子包括GDNF、BDNF、GM-CSF、B27、碱性FGF、碱性EGF、NGF、CNTF、SMAD抑制子、Wnt拮抗剂、SHH信号传递活化子和其组合。在一些实施方案中，SMAD抑制子选自下列所组成的组：SB431542、LDN-193189、头蛋白(Noggin)PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、BMP4、GW788388、GW6604、SB-505124、乐地单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制子)、SD-208、SMI6、NPC-30345、K 26894、SB-203580、SD-093、活化素-M108A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、多索吗啡二盐酸盐及其衍生物。在一些实施方案中，Wnt拮抗剂选自下列所组成的组：XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、DKK-4、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-059、LGK974、IWP-L6及其衍生物。在一些实施方案中，SHH信号传递活化子选自下列所组成的组：斯莫森德(Smoothened)促效剂(SAG)、SAG类似物、SHH、C25-SHH、C24-SHH、嘌吗啡胺(purmorphamine)、Hg-Ag和/或其衍生物。
在一些实施方案中，神经元表达一种或多种选自下列所组成的组的标记：谷氨酸离子型受体NMDA型次单位1GRIN1、谷氨酸脱羧酶1GAD1、γ-氨基丁酸GABA、酪氨酸羟化酶TH、LIM同源异形匣转录因子1-αLMX1A、叉头盒蛋白质O1 FOXO1、叉头盒蛋白质A2 FOXA2、叉头盒蛋白质O4 FOXO4、FOXG1、2',3'-环状-核苷酸3'-磷酸二酯酶CNP、髓鞘碱性蛋白质MBP、微管蛋白β链3TUB3、微管蛋白β链3NEUN、溶质载剂家族1成员6SLC1A6、SST、PV、钙结合蛋白(calbindin)、RAX、LHX6、LHX8、DLX1、DLX2、DLX5、DLX6、SOX6、MAFB、NPAS1、ASCL1、SIX6、OLIG2、NKX2.1、NKX2.2、NKX6.2、VGLUT1、MAP2、CTIP2、SATB2、TBR1、DLX2、ASCL1、ChAT、NGFI-B、c-fos、CRF、RAX、POMC、hypocretin、NADPH、NGF、Ach、VAChT、PAX6、EMX2p75、CORIN、TUJ1、NURR1和/或其任何组合。
c.神经胶质细胞
在一些实施方案中，所述的神经细胞包括神经胶质细胞，诸如，但不限于，微胶细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和施旺氏细胞、其神经胶前驱物和神经胶先驱物通过分化多能干细胞为治疗有效的神经胶质细胞等而产生。低免疫性多能干细胞的分化产生低免疫性神经细胞，诸如，低免疫性神经胶质细胞。
在一些实施方案中，通过培养多能干细胞在包含一种或多种选自下列所组成的组的剂的培养基产生神经胶质细胞、其前驱物和先驱物：视黄酸、IL-34、M-CSF、FLT3配体、GM-CSF、CCL2、TGFβ抑制子、a BMP信号传递抑制子、SHH信号传递活化子、FGF、血小板衍生的生长因子PDGF、PDGFR-α、HGF、IGF1、头蛋白(noggin)、SHH、多索吗啡、头蛋白(noggin)和其组合。在一些例子中，BMP信号传递抑制子为LDN193189、SB431542或其组合。在一些实施方案中，神经胶质细胞表达NKX2.2、PAX6、SOX10、脑衍生的神经营养性因子BDNF、神经滋养素(neutrotrophin)-3NT-3、NT-4、EGF、睫状神经营养性因子CNTF、神经生长因子NGF、FGF8、EGFR、OLIG1、OLIG2、髓鞘碱性蛋白质MBP、GAP-43、LNGFR、巢蛋白(nestin)、GFAP、CD11b、CD11c、CX3CR1、P2RY12、IBA-1、TMEM119、CD45和其组合。例示性分化培养基可包括发明所属技术领域中具有通常知识者认可的可协助或促进神经胶质细胞类型产生的任何特异性因子和/或小分子。
为了确定根据试管内分化程序产生的细胞是否展示神经胶质细胞特性和特征，可将细胞移植到动物模型中。在一些实施方案中，神经胶质细胞被注射到免疫功能不全的小鼠，例如，一只免疫功能不全的发抖小鼠。将神经胶质细胞施用到小鼠的脑，经过预选的时间量后，评估植入的细胞。在一些例子中，脑中的植入细胞是通过免疫染色和成像方法可视化。在一些实施方案中，确定神经胶质细胞表达已知的神经胶质细胞生物标志。
自干细胞产生神经胶质细胞、其前驱物和先驱物的有用方法在例如，US7,579,188；US7,595,194；US8,263,402；US8,206,699；US8,252,586；US9,193,951；US9,862,925；US8,227,247；US9,709,553；US2018/0187148；US2017/0198255；US2017/0183627；US2017/0182097；US2017/253856；US2018/0236004；WO2017/172976；以及WO2018/093681中发现。分化多能干细胞的方法描述于，例如，Kikuchi等人，Nature,2017,548,592-596；Kriks等人，Nature,2011,547-551；Doi等人，Stem Cell Reports,2014,2,337-50；Perrier等人，ProcNatl Acad Sci USA,2004,101,12543-12548；Chambers等人，Nat Biotechnol,2009,27,275-280；以及Kirkeby等人，Cell Report s,2012,1,703-714。
神经细胞移植物对脊髓损伤的功效可以在例如McDonald,等人，Nat.Med.,1999,5：1410)和Kim，等人，Nature,2002,418：50描述的急性受损脊髓大鼠模式中评估。例如，成功的移植物可能会在2至5周后显示移植物衍生的细胞存在于病灶处，例如分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并且从病灶端沿脊髓迁移，并且在步态、协调性和负重有改善。根据欲治疗的神经细胞类型和神经病症或疾病选择特异性动物模型。
神经细胞可以以允许它们植入到预期组织位点并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。例如，根据所需治疗的疾病，神经细胞可以直接移植到进入中枢神经系统的实质或鞘内腔位点。在一些实施方案中，任何本文所述的神经细胞，包括脑内皮细胞、神经元、多巴胺神经元、室管膜细胞、星形胶质细胞、微神经胶质细胞、少突胶质细胞和施旺氏细胞通过静脉内、脊髓内、脑室内、鞘内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、肌肉内、腹内、眼内、球后及其组合的方式注射到患者。在一些实施方案中，细胞以推注或连续输注的形式注射或沉积。在某些实施方案中，神经细胞通过注射到脑、恰当的脑和其组合而施用。注射可以，例如，通过在受试者头骨上的钻孔进行。神经细胞施用到脑的合适位点包括，但不限于，脑室、侧脑室、大池、壳核、基底核、海马回皮层、纹状体、脑尾状区及其组合。
用于本技术中使用的包括多巴胺神经元的神经细胞的额外描述可于WO2020/018615发现，公开整体以引用方式并入本文。
3.自低免疫性多能细胞分化的内皮细胞
本文提供为低免疫性多能细胞，其分化成各种内皮细胞类型，用于随后移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，使用已知技术，分化的方法取决于所需细胞类型。
在一些实施方案中，将自受试者低免疫性多能细胞分化的内皮细胞施用到有其需要的患者，例如，人患者。内皮细胞可施用到患有病症或疾病诸如，但不限于，心血管疾病、血管疾病、周边血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周边血管阻塞疾病、中风、再灌流损伤、肢局部缺血、神经病变(例如，周边神经病变或糖尿病神经病变)、器官衰竭(例如，肝脏衰竭、肾脏衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、血管损伤、组织损伤、高血压、因为冠状动脉疾病导致的心绞痛及心肌梗塞、肾血管高血压、因肾动脉狭窄的肾衰竭、下肢跛行等的患者。在某些实施方案中，患者已患有或正患有短暂脑缺血或中风，其在一些例子中，可能是因为脑血管疾病。在一些实施方案中，施用工程改造的内皮细胞以治疗组织局部缺血，例如，如发生在动脉硬化症、心肌梗塞和肢局部缺血且修复损伤的血管。在一些例子中，细胞用于植入物的生物工程改造。
例如，内皮细胞可用于细胞疗法以修复缺血性组织、形成血管及心脏瓣膜、人工血管的工程改造、修复受损的血管和诱导工程改造的组织中形成血管(例如，移植之前)。此外，内皮细胞可进一步经修饰以递送剂到目标及治疗肿瘤。
在许多实施方案中，本文提供为对需要血管细胞或血管形成的组织修复或替换的方法。方法涉及施用到需要此治疗的人患者包含单离的内皮细胞的组合物，以促使此组织中血管形成。需要血管细胞或血管形成的组织可为心脏组织、肝脏组织、胰脏组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨头组织等，其可为细胞受损、且特征为过多细胞死亡、组织面临受损的风险或人工工程改造的组织。
在一些实施方案中，血管疾病，可能与心脏疾病或失调有关，可以通过施用内皮细胞，诸如，但不限于，如本文所述的最终血管内皮细胞和衍生的心内膜内皮细胞来治疗。此类血管疾病包括，但不限于，冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉狭窄、主动脉瘤、周边动脉疾病、动脉硬化症、静脉曲张、血管病变、缺乏冠状动脉灌注的心脏的梗塞区域、不愈合伤口、糖尿病或非-糖尿病性溃疡或任何其他需要诱导血管形成的疾病或失调。
在某些实施方案中，内皮细胞用于改善用在血管重建手术中的人工植入物(例如，由合成材料制成的血管，诸如，Dacron及Gortex.)。例如，人工动脉移植物常用于替换灌注重要器官或肢的有病动脉。在其他实施方案中，工程改造的内皮细胞用于覆盖人工心脏瓣膜的表面，通过使瓣膜表面不易形成血栓来降低形成栓塞的风险。
可以使用众所周知的手术技术将所概述的内皮细胞移植到患者中以移植组织和/或单离的细胞到血管中。在一些实施方案中，细胞通过注射(例如，心肌内注射、冠状动脉内注射、经心内膜注射、经心外膜注射、经皮注射)、输液、移植和植入来引入到患者的心脏组织。
内皮细胞的施用(递送)包括，但不限于，皮下或肠胃外，包括静脉内、动脉内(例如，冠状动脉内)、肌肉内、腹膜内、心肌内、经心内膜、经心外膜、鼻内施用以及鞘内、与输液技术。
如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解的，HIP衍生物是使用发明所属技术领域中已知的技术移植，所述技术取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。在一些实施方案中，通过静脉内或注射在患者的特定位置移植细胞。当移植在特定位置时，细胞可能会悬浮在凝胶基质中，以防止它们在固定时分散。
例示性内皮细胞类型包括，但不限于，微血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、肾内皮细胞、脑内皮细胞、肝脏内皮细胞等。
本文所概述的内皮细胞可表达一种或多种内皮细胞标记。此标记的非限制性例子包括VE-黏附蛋白(CD 144)、ACE(血管收缩素-转换酶)(CD143)、BNH9/BNF13、CD31、CD34、CD54(ICAM-l)、CD62E(E-选择素)、CD105(内皮因子(Endoglin))、CD146、内皮细胞特异分子(Endocan)(ESM-1)、Endoglyx-1、内皮黏蛋白(Endomucin)、伊红趋素-3、EPAS1(内皮PAS结构域蛋白质1)、因子VIII相关的抗原、FLI-l、Flk-l(KDR、VEGFR-2)、FLT-l(VEGFR-l)、GATA2、GBP-l(鸟苷酸-结合蛋白质-l)、GRO-α、HEX、ICAM-2(细胞间黏着分子2)、LM02、LYVE-l、MRB(神奇圆环)、核仁素、PAL-E(pathologische anatomie Leiden-内皮)、RTKs、sVCAM-l、TALI、TEM1(肿瘤内皮标记1)、TEM5(肿瘤内皮标记5)、TEM7(肿瘤内皮标记7)、凝血酶调节素(TM，CD141)、VCAM-1(血管细胞黏着分子-1)(CD106)、VEGF、vWF(冯威里氏(vonWillebrand)因子)、ZO-l、内皮细胞-选择性黏着分子(ESAM)、CD102、CD93、CD184、CD304和DLL4。
在一些实施方案中，内皮细胞经基因修饰以表达编码有兴趣蛋白质的外源性基因，诸如，但不限于有用于治疗失调/病症或改善失调/病症的症状的酶、激素、受体、配体或药物。基因修饰内皮细胞的标准方法描述，例如，于US 5,674,722。
此内皮细胞可用于提供有用于预防或治疗疾病的多肽或蛋白质的组成合成及递送。如此，多肽直接分泌到个体的血流或其他身体区域(例如，中枢神经系统)。在一些实施方案中，内皮细胞可经修饰以分泌胰岛素、血凝因子(例如，因子VIII或冯威里氏(vonWillebrand)因子)、α-l抗胰蛋白酶、腺苷酸去胺酶、组织胞浆素原活化子、间白素(例如，IL-1、IL-2、IL-3)等。
在一些实施方案中，内皮细胞可以改善其在植入移植物的背景下的性能的方式来修饰。非限制性说明性例子包括血栓溶解剂的分泌或表达以防止血管腔内血块形成、平滑肌增殖的抑制子分泌以防止由于平滑肌肥大引起的腔狭窄和内皮细胞促分裂原或自泌因子的表达和/或分泌以刺激内皮细胞增殖和改善移植管腔内皮细胞衬里的范围或持续时间。
在一些实施方案中，工程改造的内细胞皮用于将所分泌的产品的治疗量递送到特定器官或肢。例如，内衬有试管内工程改造的(转导的)内皮细胞的血管植入物可以移植到特定器官或肢。转导的内皮细胞的所分泌的产物将以高浓度递送至灌注的组织，从而在靶向解剖位置达到所需效果。
在其他实施方案中，内皮细胞经基因修饰以包括当在血管形成的肿瘤中由内皮细胞表达时中断或抑制血管生成的基因。在一些例子中，内皮细胞也可被基因修饰以表达本文所述的选择性自杀基因的任一者，其允许在肿瘤治疗完成后对植入的内皮细胞进行负选择。
在一些实施方案中，施用本文所述的内皮细胞到接受者受试者以治疗选自下列所组成的组的血管失调：血管损伤、心血管疾病、血管疾病、周边血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、周边血管阻塞疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌流损伤、肢局部缺血、中风、神经病变(例如，周边神经病变或糖尿病神经病变)、器官衰竭(例如，肝脏衰竭、肾脏衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松症、脑血管疾病、高血压、因冠状动脉疾病导致的心绞痛及心肌梗塞、肾血管高血压、因肾动脉狭窄的肾衰竭、下肢跛行和/或其他血管病症或疾病。
在一些实施方案中，低免疫性多能细胞分化成内皮聚落形成细胞(ECFC)以形成新的血管来解决周边动脉疾病。分化内皮细胞的技术已知。见，例如，Prasain等人，doi：10.1038/nbt.3048，整体以引用方式并入本文，并且特别是从人多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂，以及移植技术。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与内皮细胞相关或特异性标记的存在，或通过测量功能性。
在一些实施方案中，通过试管内分化从一群低免疫性多能细胞产生一群低免疫性内皮细胞的方法包含(a)在包含GSK抑制子的第一培养基培养一群HIP细胞；(b)在包含VEGF及bFGF的第二培养基中培养一群HIP细胞，以产生一群前内皮细胞；以及(c)在包含ROCK抑制子及ALK抑制子的第三培养基中培养一群前内皮细胞，以产生一群低免疫性内皮细胞。
在一些实施方案中，GSK抑制子是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些例子中，GSK抑制子的浓度范围从约1mM至约10mM。在一些实施方案中，ROCK抑制子是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些例子中，ROCK抑制子的浓度范围从约1pM至约20pM。在一些实施方案中，ALK抑制子是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些例子中，ALK抑制子的浓度范围从约0.5pM至约10pM。
在一些实施方案中，第一培养基包含从2pM至约10pM的CHIR-99021。在一些实施方案中，第二培养基包含50ng/ml VEGF及10ng/ml bFGF。在其他实施方案中，第二培养基进一步包含Y-27632及SB-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10pM Y-27632及1pM SB-431542。在某些实施方案中，第三培养基进一步包含VEGF及bFGF。在特定例子中，第一培养基和/或第二培养基无胰岛素。
本文提供的细胞可以在表面上进行培养，诸如，支持和/或促使低免疫性多能细胞分化成心脏细胞的合成表面。在一些实施方案中，表面包含聚合物材料，包括，但不限于，选定的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性例子包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、甘油二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、苯甲酸三羟甲基丙烷二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲酯、三环[5.2.1.02,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯如发明所属技术领域中已知的合成或从商业供应商处获得，诸如，Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.及Sartomer,Inc.。
在一些实施方案中，内皮细胞可以接种到聚合物基质上。在一些例子中，聚合物基质是可生物降解。合适的可生物降解基质为发明所属技术领域中广知，并且包括胶原-GAG、胶原、纤维蛋白、PLA、PGA和PLA/PGA共聚物。额外的可生物降解的材料包括聚(酸酐)、聚(羟基酸)、聚(原酸酯)、聚(反丁烯二酸丙酯)、聚(己内酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨甲酸酯及多糖。
也可使用不可生物降解的聚合物。其他不可生物降解但具有生物相容性的聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚苯乙烯、聚酯、不可生物降解的聚氨甲酸酯、聚脲、聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚(环氧乙烷)。聚合物基质可以任何形状形成，例如，作为粒子、海绵、管、球、线、盘绕线、毛细管网络、膜、纤维、筛或片。聚合物基质可经修饰以包括天然或合成的细胞外基质材料和因子。
聚合物材料可以分散在支撑材料的表面上。适合培养细胞的有用支撑材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些例子中，玻璃包括钠钙玻璃、硼玻璃、硅质玻璃、石英玻璃、硅或这些的衍生物等。
在一些例子中，塑料或聚合物包括树枝状聚合物，包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-顺丁烯二酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)、单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、碳氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺或这些的衍生物等。在一些例子中，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共-顺丁烯二酸酐)、聚(苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或这些的衍生物等。
在一些实施方案中，一群低免疫性内皮细胞自非内皮细胞单离。在一些实施方案中，在施用之前，扩增单离的一群低免疫性内皮细胞。在某些实施方案中，在施用之前，扩增及冷冻保存单离的一群低免疫性内皮细胞。
用于本文提供的方法的内皮细胞的额外的描述在WO2020/018615发现，公开整体以引用方式并入本文。
4.自低免疫性多能细胞分化的甲状腺细胞
在一些实施方案中，低免疫性多能细胞分化成甲状腺祖细胞和可分泌甲状腺激素的甲状腺滤泡胞器以解决自身免疫甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是发明所属技术领域已知。见，例如Kurmann等人，Cell Stem Cell,2015Nov 5；17(5):527-42，整体以引用方式并入本文，特别是从人多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂，及移植技术。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与甲状腺细胞相关或特异性标记的存在或通过测量功能性。
5.自低免疫性多能细胞分化的肝细胞
在一些具体的实施方案中，低免疫性多能细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能丧失或肝脏的硬化。有许多技术可用于分化HIP细胞为肝细胞；见例如，Pettinato等人，doi：10.1038/spre32888，Snykers等人，Methods Mol Biol,2011 698:305-314，Si-Tayeb等人，Hepatology,2010,51：297-305和Asgari等人，Stem Cell Rev,2013,9(4):493-504，其全部整体以引用方式并入本文，并且特别是分化的方法与试剂。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与肝细胞相关和/或特异性标记的存在，包括，但不限于，白蛋白、α胎蛋白和纤维蛋白原。分化还可以功能上测量，诸如，氨的代谢、LDL的储存和摄取、ICG的摄取和释放和肝糖储存。
6.自低免疫性多能细胞分化的胰脏胰岛细胞
在一些实施方案中，胰脏胰岛细胞(也称为胰脏β细胞)为源自本文所述的HIP细胞。在一些例子中，分化成各种胰脏胰岛细胞类型的低免疫性多能细胞经移植到或植入到受试者(例如，接受者)。如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，分化的方法使用已知技术取决于所需细胞类型。例示性胰脏胰岛细胞类型包括，但不限于，胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞、成熟胰脏胰岛细胞等。在一些实施方案中，施用本文所述的胰脏细胞到受试者以治疗糖尿病。
在一些实施方案中，胰脏胰岛细胞为源自本文所述的低免疫性多能细胞。分化多能干细胞为胰脏胰岛细胞的有用方法描述，例如，于US 9,683,215；US 9,157,062；以及US8,927,280。
在一些实施方案中，本文所公开的方法所产生的胰脏胰岛细胞分泌胰岛素。在一些实施方案中，胰脏胰岛细胞呈现内源性胰脏胰岛细胞的至少两个特性，例如，但不限于，回应葡萄糖而分泌胰岛素和β细胞标记的表达。
例示性β细胞标记或β细胞先驱物标记包括，但不限于，c-肽、Pdxl、葡萄糖转运子2(Glut2)、HNF6、VEGF、葡萄糖激酶(GCK)、前激素转化酶(PC 1/3)、Cdcpl、NeuroD、Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.1、Nkx6.2、Pax4、Pax6、Ptfla、Isll、Sox9、Soxl7和FoxA2。
在一些实施方案中，单离的胰脏胰岛细胞回应增加的葡萄糖而产生胰岛素。在各种实施方案中，单离的胰脏胰岛细胞回应增加的葡萄糖而分析胰岛素。在一些实施方案中，细胞具有明显的形态，诸如，卵石细胞形态和/或约17pm至约25pm的直径。
在一些实施方案中，低免疫性多能细胞分化成似β细胞或岛胞器，用于移植以解决第I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的一种很有前景的方法，见，例如，Ellis等人，Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2017年10月；14(10)：612-628，以引用方式并入本文。此外，Pagliuca等人，(Cell,2014,159(2):428-39)报导从hiPSC成功分化出β-细胞，其内容整体以引用方式并入本文，并且特别是所述处概述用于从人多能干细胞大规模生成功能性人β细胞的方法和试剂)。此外，Vegas等人，显示了人多能干细胞生成人β细胞，然后封装以避免宿主的免疫排斥；Vegas等人，Nat Med,2016,22(3)：306-11，整体以引用方式并入本文，并且特别是所述处概述从人多能干细胞大规模生成功能性人β细胞的方法和试剂。
在一些实施方案中，通过试管内分化从一群低免疫性多能细胞产生一群低免疫性胰脏胰岛细胞的方法包含：(a)在包含选自下列所组成的组的一种或多种因子的第一培养基中培养一群HIP细胞：似胰岛素生长因子、转形生长因子、FGF、EGF、HGF、SHH、VEGF、转形生长因子-b超家族、BMP2、BMP7、GSK抑制子、ALK抑制子、BMP第1型受体抑制子和视黄酸，以产生一群不成熟胰脏胰岛细胞；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养一群不成熟胰脏胰岛细胞，以产生一群低免疫胰脏胰岛细胞。在一些实施方案中，GSK抑制子为CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些例子中，GSK抑制子的浓度范围从约2mM至约10mM。在一些实施方案中，ALK抑制子是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些例子中，ALK抑制子的浓度范围从约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基都没有动物血清。
在一些实施方案中，自非胰脏胰岛细胞单离一群低免疫性胰脏胰岛细胞。在一些实施方案中，在施用之前，扩增单离的一群低免疫性胰脏胰岛细胞。在某些实施方案中，在施用之前，扩增及冷冻保存单离的一群低免疫性胰脏胰岛细胞。
分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与β细胞相关或特异性标记的存在，包括但不限于，胰岛素。分化也可功能性测量，诸如，测量葡萄糖代谢，见一般来说Muraro等人，Cell Syst.2016Oct 26；3(4):385-394.e3，在此整体以引用方式并入，并且特别是所述处概述的生物标记。一旦产生β细胞，其可经移植(呈细胞悬浮物或在本文所讨论的凝胶基质中)到门静脉/肝脏、网膜、胃肠黏膜、骨髓、肌肉或皮下囊。
用于本技术中包括多巴胺神经元的胰脏胰岛细胞的额外描述于WO2020/018615发现，公开整体以引用方式并入本文。
7.自低免疫性多能细胞分化的视网膜色素上皮(RPE)细胞
本文提供为源自上述的HIP细胞的视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞。例如，人RPE细胞可通过分化人HIP细胞而产生。在一些实施方案中，分化成各种RPE细胞类型的低免疫性多能细胞经移植到或植入到受试者(例如，接受者)。如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，分化的方法使用已知技术取决于所需细胞类型。
术语“RPE”细胞是指具有与天然RPE细胞相似或实质上相似的基因表达概况的色素视网膜上皮细胞。当在平面基质上生长至汇合时，源自多能干细胞的此RPE可具有天然RPE细胞的多边形、平面片状形态。
可以将RPE细胞植入到患有黄斑部退化的患者或具有受损RPE细胞的患者。在一些实施方案中，患者患有与年龄有关的黄斑部退化(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性与年龄有关的黄斑部退化、干性黄斑部退化(干性与年龄有关的黄斑部退化)、湿性黄斑部退化(湿性与年龄有关的黄斑部退化)、青少年黄斑部退化(JMD)(例如，Stargardt疾病、Best疾病和视网膜裂损症)、Leber氏先天黑内障或色素沉着性视网膜炎。在其他实施方案中，患者患有视网膜剥离。
例示性RPE细胞类型包括，但不限于，视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞、RPE祖细胞、不成熟RPE细胞、成熟RPE细胞、功能性RPE细胞等。
分化多能干细胞为RPE细胞的有用方法描述于，例如，US9,458,428及US9,850,463，公开整体，包括说明书，以引用方式并入本文。从人诱导性多能干细胞产生RPE细胞的额外方法可在例如，Lamba等人，PNAS,2006,103(34)：12769-12774；Mellough等人，StemCells,2012,30(4):673-686；Idelson等人，Cell Stem Cell,2009,5(4):396-408；Rowland等人，Journal of Cellular Physiology,2012,227(2):457-466、Buchholz等人，StemCells Trans Med,2013,2(5):384-393和da Cruz等人，Nat Biotech,2018,36：328-337发现。
已使用Kamao等人，Stem Cell Reports 2014:2:205-18中概述的技术将人多能干细胞分化成RPE细胞，特此整体以引用方式并入全文，并且特别是对于所述处概述对于分化技术和试剂的方法和试剂；另见Mandai等人，N Engl J Med,2017,376：1038-1046，对于产生RPE细胞片及移植到患者，整体以引用方式并入全文。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与RPE相关和/或特异性标记的存在或通过测量功能性。见例如Kamao等人，StemCell Reports,2014,2(2):205-18，内容整体以引用方式并入本文，并且特别针对结果章节第一段中概述的标记。
在一些实施方案中，通过试管内分化从一群低免疫性多能细胞产生一群低免疫性视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞的方法包含：(a)在包含选自下列所组成的组的因子的任一者的第一培养基中培养一群低免疫性多能细胞：活化素A、bFGF、BMP4/7、DKK1、IGF1、头蛋白(noggin)、BMP抑制子、ALK抑制子、ROCK抑制子和VEGFR抑制子，以产生一群前RPE细胞；以及(b)在不同于第一培养基的第二培养基中培养一群前RPE细胞，以产生一群低免疫性RPE细胞。在一些实施方案中，ALK抑制子为SB-431542、其衍生物或其变体。在一些例子中，ALK抑制子的浓度范围从约2mM至约10pM。在一些实施方案中，ROCK抑制子为Y-27632、其衍生物或其变体。在一些例子中，ROCK抑制子的浓度范围从约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基都没有动物血清。
分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与RPE相关或特异性标记的存在或通过测量功能性。见例如Kamao等人，Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容整体以引用方式并入本文，并且特别是结果章节。
用于本发明技术的RPE细胞的额外描述于WO2020/018615发现，公开整体以引用方式并入本文。
对于治疗应用，根据所揭示的方法制备的细胞可典型以包含等张赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对于人施用足够无菌的条件下制备。有关细胞组合物药用调配物中的一般原则，见Morstyn&Sheridan eds,Cambridge University Press,1996的“CellTherapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy”；以及E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000的“Hematopoietic StemCell Therapy”。细胞可以被包装在适合于分配或临床使用的装置或容器中。
8.源自低免疫性多能细胞的T淋巴细胞
本文提供T淋巴细胞(T细胞，包括原代T细胞)为源自本文所述的HIP细胞(例如，低免疫性iPSC)。从多能干细胞(例如，iPSC)产生T细胞，包括CAR-T-细胞的方法描述，例如，于Iriguchi等人，Nature Communications 12,430(2021)；Themeli等人，16(4)：357-366(2015)；Themeli等人，Nature Biotechnology 31：928-933(2013)。T淋巴细胞衍生的低免疫性细胞包括，但不限于，逃脱免疫辨识的原代T细胞。在一些实施方案中，自T细胞，诸如，原代T细胞产生(例如，生成、培养或衍生)低免疫性细胞。在一些例子中，原代T细胞自受试者或个体获得(例如，获取、萃取、移出或取得)。在一些实施方案中，原代T细胞自T细胞池产生，使得T细胞来自一位或多位受试者(例如，一个或多个人类，包括一个或多个健康人类)。在一些实施方案中，原代T细胞池来自1至100、1至50、1至20、1至10、1或多者、2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、10或更多、20或更多、30或更多、40或更多、50或更多或100或更多受试者。在一些实施方案中，供体受试者不同于患者(例如，施用治疗细胞的接受者)。在一些实施方案中，T细胞池不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，获得T细胞池的一位或多位供体受试者不同于患者。
在一些实施方案中，低免疫性细胞未活化患者的免疫反应(例如，在施用后的接受者)。通过施用一群低免疫性细胞到有其需要的受试者(例如，接受者)或患者，提供为治疗失调的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫性细胞包含经工程改造(例如，经修饰)以表达嵌合抗原受体，包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体的T细胞。在一些例子中，T细胞来自一种或多种个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞，诸如，经工程改造或修饰的T细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。
在一些实施方案中，HIP-衍生的T细胞包括嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR可包含在HIP-衍生的T细胞，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，HIP-衍生的T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中，多核苷酸插入于基因组基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入到安全港或目标基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因。任何合适的方法可用于插入CAR到低免疫性细胞的基因组基因座，包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
本文提供的HIP-衍生的T细胞有用于治疗合适的癌症，包括，但不限于，B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
9.源自低免疫性多能细胞的NK细胞
本文提供，源自本文所述的HIP细胞(例如，低免疫性iPSC)的自然杀手(NK)细胞。
NK细胞(也定义为“大颗粒淋巴细胞”)代表从共同的淋巴先驱物(其还产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。与T细胞不同，NK细胞不会在细胞膜上自然包含CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR，并且典型也缺乏其他抗原-特异性细胞表面受体(以及TCR和CD3，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，而是典型表达CD16和CD56)。NK细胞细胞毒性活性不需要致敏化，但通过包括IL-2的各种细胞因子活化而增强。NK细胞一般来说被认为缺乏抗原受体介导的信号传递所需的适当或完整的信号传递路径，因此不被认为能抗原受体依赖性信号传递、活化和扩增。NK细胞为细胞毒性，并且平衡活化和抑制受体信号传递，以调变其细胞毒性活性。例如，表达CD16的NK细胞可与受感染细胞结合的抗体的Fc结构域结合，导致NK细胞活化。相比之下，对表达高量的MHC I类蛋白质的细胞活性降低。与目标细胞接触，NK细胞释放蛋白质，诸如，穿孔素和酶，诸如，蛋白酶(颗粒酶)。穿孔素可在目标细胞的细胞膜上形成孔，诱导细胞凋亡或细胞溶解。
有许多技术可从多能干细胞(例如，iPSC)用于产生NK细胞，包括CAR-NK-细胞；见，例如，Zhu等人，Methods Mol Biol.2019；2048:107-119；Knorr等人，Stem Cells TranslMed.2013 2(4):274-83.doi:10.5966/sctm.2012-0084；Zeng等人，Stem CellReports.2017Dec12；9(6):1796-1812；Ni等人，Methods Mol Biol.2013；1029:33-41；Bernareggi等人，Exp Hematol.2019 71:13-23；Shankar等人，Stem Cell Res Ther.2020；11(1):234，所有整体以引用方式并入本文，并且特别是用于分化的方法和试剂。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与NK细胞相关和/或特异性标记的存在，包括，但不限于，CD56、KIRs、CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、TRAIL、CD122、CD27、CD244、NK1.1、NKG2A/C、NCR1、Ly49、CD49b、CD11b、KLRG1、CD43、CD62L和/或CD226。
在一些实施方案中，低免疫性多能细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能丧失或肝脏硬化。有许多技术可用于将HIP细胞分化成肝细胞；见例如，Pettinato等人，doi：10.1038/spre32888、Snykers等人，Methods Mol Biol.,2011 698:305-314、Si-Tayeb等人，Hepatology,2010,51：297-305及Asgari等人，Stem Cell Rev.,2013,9(4):493-504，所有整体以引用方式并入本文，并且特别是对于分化的方法和试剂。分化可如本领域已知检定，一般来说通过评估与肝细胞相关和/或特异性标记的存在，包括，但不限于，白蛋白、α胎蛋白质和纤维蛋白原。也可功能性测量分化，诸如，氨的代谢、LDL储存和摄取、ICG摄取和释放和肝糖储存。
在一些实施方案中，NK细胞未活化患者的免疫反应(例如，在施用后的接受者)。提供为通过施用一群NK细胞到有其需要的受试者(例如，接受者)或患者而治疗失调的方法。在一些实施方案中，本文所述的NK细胞包含工程改造(例如，经修饰)以表达嵌合抗原受体，包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体的NK细胞。任何合适的CAR可包括在NK细胞，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，NK细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中，多核苷酸插入于基因组基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入到安全港或目标基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因。任何合适的方法可用于插入CAR到NK细胞的基因组基因座，包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
U.外源性多核苷酸
在一些实施方案中，本文提供的低免疫性细胞经基因修饰以包括插入到低免疫性细胞的一种或多种基因组基因座的一种或多种外源性多核苷酸。在一些实施方案中，外源性多核苷酸编码有兴趣的蛋白质，例如，嵌合抗原受体。任何合适的方法可用于将外源性多核苷酸插入到低免疫性细胞的基因组基因座，包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
外源性多核苷酸可插入到任何合适的低免疫性细胞的基因组基因座。在一些实施方案中，外源性多核苷酸插入到如本文所述的安全港或目标基因座。合适的安全港及目标基因座包括，但不限于，CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因、Rosa基因(例如，ROSA26)、F3基因(也已知为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也已知为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、PDGFRa基因、OLIG2基因、GFAP基因和KDM5D基因(也已知为HY)。在一些实施方案中，外源性多核苷酸插入到内含子、外显子或安全港或目标基因基因座的编码序列区域。在一些实施方案中，外源性多核苷酸插入到内源性基因，其中，插入导致沉默或降低表达的内源性基因。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因基因座。外源性多核苷酸插入的例示性基因组基因座描述于表4及5。
表4.外源性多核苷酸插入的例示性基因组基因座
表5.Cas9引导RNA的非限制性例子
对于Cas9引导，所有Cas9引导的间隔区序列在表6中提供，描述20nt引导序列对应于独特引导序列并且可以是本文描述者的中任一者，包括例如表6中列出者。
表6.Cas9引导RNA
在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞源自低免疫性多能细胞(HIP)，例如，如本文所述者。此低免疫性细胞包括，例如，心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺神经元、神经胶质细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、胰脏胰岛细胞(β细胞)、视网膜色素上皮细胞和T细胞。在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞为胰脏β细胞、T细胞(例如，原代T细胞)或神经胶质祖细胞。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸编码外源性CD47多肽(例如，人CD47多肽)且外源性多肽插入到安全港或目标基因基因座或本文所揭示的安全港或目标位点或导致沉默或降低表达的内源性基因的基因组基因座。在一些实施方案中，多核苷酸插入于B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因基因座。在一些实施方案中，编码CD47的基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座、PD1基因座和CTLA4基因座。在一些实施方案中，编码CAR的基因插入到选自下列所组成的组的特异性基因座：安全港基因座、目标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座及TRB基因座。在一些实施方案中，编码CD47的基因及编码CAR的基因插入到不同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的基因及编码CAR的基因插入到相同基因座。在一些实施方案中，编码CD47的基因及编码CAR的基因插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或目标基因座。在一些实施方案中，安全港或目标基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、CXCR4基因基因座、PPP1R12C基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因基因座、CLYBL基因基因座、Rosa基因基因座、F3(CD142)基因基因座、MICA基因、基因座MICB基因、基因座LRP1(CD91)基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因座、PDGFRa基因基因座、OLIG2基因基因座、GFAP基因基因座和KDM5D基因基因座)。
在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞为原代T细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的T细胞。在例示性实施方案中，外源性多核苷酸为嵌合抗原受体(例如，本文所述的CAR中任一者)。在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子以在低免疫性细胞中表达外源性多核苷酸。
在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞低免疫性细胞为原代T细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的T细胞且包括编码CAR多肽的第一外源性多核苷酸以及编码CD47多肽的第二外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第一外源性多核苷酸以的第二外源性多核苷酸插入到相同基因组基因座。在一些实施方案中，第一外源性多核苷酸以的第二外源性多核苷酸插入到不同基因组基因座。在例示性实施方案中，低免疫性细胞为原代T细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，iPSC)的T细胞。
在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞为原代NK细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的NK细胞。在例示性实施方案中，外源性多核苷酸为嵌合抗原受体(例如，本文所述的CAR中任一者)。在一些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子以在低免疫性细胞中表达外源性多核苷酸。在一些实施方案中，包括外源性多核苷酸的低免疫性细胞低免疫性细胞为原代NK细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，低免疫性iPSC)的NK细胞且包括编码CAR多肽的第一外源性多核苷酸以及编码CD47多肽的第二外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第一外源性多核苷酸以的第二外源性多核苷酸插入到相同基因组基因座。在一些实施方案中，第一外源性多核苷酸以的第二外源性多核苷酸插入到不同基因组基因座。在例示性实施方案中，低免疫性细胞为原代NK细胞或源自低免疫性多能细胞(例如，iPSC)的NK细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包括插入到一种或多种如本文所述的基因组基因座(例如，表4)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同外源性多核苷酸。在一些实施方案中，外源性多核苷酸插入到相同基因组基因座。在一些实施方案中，外源性多核苷酸插入到不同基因组基因座。
在一些实施方案中，外源性多核苷酸编码下述因子之一：DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制子、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpinb9和任何本文提供的耐受原因子。
V.细胞的移植
如发明所属技术领域中具有通常知识者将理解，细胞和其衍生物可以使用发明所属技术领域中已知的技术移植，取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。一般而言，本文所述的细胞可以通过静脉内或通过注射在患者的特定位置来移植。当在特定位置移植时，细胞可悬浮在凝胶基质中以防止其在固定时分散。
W.免疫抑制剂
在一些实施方案中，在一群低免疫性细胞的第一施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂未被施用到患者。在许多实施方案中，在一群低免疫性细胞的第一施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用到患者。在一些实施方案中，在细胞的第一施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在一些实施方案中，在细胞的第一施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更久。在特定实施方案中，免疫抑制和/或免疫调节性剂在细胞的第一施用之后，未被施用到患者或在细胞的第一施用之后，施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在一些实施方案中，免疫抑制和/或免疫调节性剂在细胞的第一施用之后，施用至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更久。免疫抑制和/或免疫调节性剂的非限制性例子包括环孢素、硫唑嘌呤、霉酚酸、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、皮质类固醇，诸如，强体松、氨甲蝶呤、氯金化钠(gold salt)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、治疟剂、布喹特林(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宝(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素(deoxyspergualine)、6-巯嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3,抗-胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽(thymopentin)、胸腺素-α及类似的剂。在一些实施方案中，免疫抑制和/或免疫调节性剂选自由下述所构成的免疫抑制抗体的群组：结合到IL-2受体的p75的抗体、结合下述的抗体，例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-.α.、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58和结合到其配体任一的抗体。在一些实施方案中，当在细胞的第一施用之前或之后，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用到患者，则施用为以有MHC I和/或MHC II表达而无外源性CD47的表达的细胞所需还要低的剂量。
在一个实施方案中，此免疫抑制和/或免疫调节性剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体和其片段)、ICOS和OX40、负向T细胞调控子的抑制子(诸如，对抗CTLA-4的抗体)和类似的剂。
在一些实施方案中，在一群低免疫性细胞的施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂未被施用到患者。在许多实施方案中，在一群低免疫性细胞的第一和/或第二施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用到患者。在一些实施方案中，在细胞的施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在一些实施方案中，在细胞的第一和/或第二施用之前，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更久。在特定实施方案中，在细胞的施用之后，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更久。在一些实施方案中，在细胞的第一和/或第二施用之后，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更久。在一些实施方案中，当在细胞的施用之前或之后，免疫抑制和/或免疫调节性剂被施用到患者，则施用为以有MHC I和/或MHC II表达而无外源性CD47的表达的细胞所需还要低的剂量。
IV.详细实施方案
在一方面中，本文提供为包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法，其包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。在一些实施方案中，方法用于治疗患者中的失调。
在一些实施方案中，患者因先前怀孕或先前同种异体移植物而敏感。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，同种异体移植物选自下列所组成的组：同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在一些例子中，患者对同种异体移植物呈现免疫反应及对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在一些实施方案中，降低或无免疫反应选自下列所组成的组：对一群低免疫性细胞降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用一群低免疫性细胞至少一周或更久。在某些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用一群低免疫性细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和/或CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和/或其组合。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含降低表达量的CD142。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的分化的细胞。在一些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含源自原代T细胞的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞源自包含来自一个或多个(例如，二或更多、三或更多、四或更多、五或更多、十或更多、二十或更多、五十或更多或一百或更多)不同于患者的受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在CAR的一些实施方案中，抗原结合结构域选自下述所组成的组：(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域；(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19或BCMA。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自下列所组成的组中的一者：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域和其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR的信号传递结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
对于第四代CAR，其包含在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域，在一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。
在第四代CAR的一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在源自原代T细胞的细胞的一些实施方案中，CAR包含CD3 zeta(CD3ζ)结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在某些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在特定实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在某些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在方法的一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的免疫活化或无免疫活化。在某些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化。在特定实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的供体特异性IgG抗体或无供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的IgM与IgG抗体产生或无IgM与IgG抗体产生。在其他实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起低免疫性细胞的降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无细胞毒性T细胞杀伤。在某些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中未触发全身性急性细胞性免疫反应。
在一些实施方案中，在施用一群低免疫性细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在另一方面中，本文提供包含施用到患者给药方案的方法，其包含：(a)包含治疗有效量的低免疫性细胞的第一施用；(b)恢复期间；以及(c)包含治疗有效量的低免疫性细胞的第二施用；其中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，并且其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。在一些实施方案中，方法有用于治疗患者中的失调。
在一些实施方案中，患者因先前怀孕或先前同种异体移植物而敏感。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，同种异体移植物选自下列所组成的组：同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和同种异体器官移植物。
在一些实施方案中，患者对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在一些例子中，降低或无免疫反应选自下列所组成的组：对一群低免疫性细胞降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后至少一周或更久，发生低免疫性细胞的第一施用。在一些实施方案中，在患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后至少1个月或更久，发生低免疫性细胞的第一施用。
在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，低免疫性细胞表达外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和/或CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞表达外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含降低表达量的CD142。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的分化的细胞。在某些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。在许多实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含源自原代T细胞的细胞。在某些实施方案中，源自原代T细胞的细胞源自包含来自一个或多个(例如，二或更多、三或更多、四或更多、五或更多、十或更多、二十或更多、五十或更多或一百或更多)不同于患者的受试者的原代T细胞的T细胞池。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下述所组成的组：(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域、(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在某些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19或BCMA。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含选自下列所组成的组中的一者：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域和其功能性变体。
在一些实施方案中，信号传递结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
在第四代CAR的一些实施方案中，CAR的成功信号传导诱导细胞因子基因的表达。在一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。在第四代CAR的一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3 zeta(CD3ζ)结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在一些实施方案中，恢复期间包含至少1个月或更久(例如，至少1个月、2个月、3个月、4个月或更久)。在一些实施方案中，恢复期间包含至少2个月或更久(例如，至少2个月、3个月、4个月或更久)。
在一些实施方案中，当来自第一施用的低免疫性细胞不再能在患者中检测到时，启动细胞的第二施用。
在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后(例如，在第一施用或第二施用之后或在第一和第二施用二者之后)，低免疫性细胞引起患者中降低量的免疫活化或无免疫活化。在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后，低免疫性细胞引起患者中降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化。在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后，低免疫性细胞引起患者中降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后，低免疫性细胞引起患者中对抗低免疫性细胞的降低量的供体特异性IgG抗体或无供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后，低免疫性细胞引起患者中对抗低免疫性细胞的降低量的IgM和IgG抗体生成或无IgM和IgG抗体生成。在一些实施方案中，在第一和/或第二施用之后，低免疫性细胞引起患者中低免疫性细胞的降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，在低免疫性细胞的第一施用之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。在一些实施方案中，在低免疫性细胞的第二施用之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。在某些实施方案中，在恢复期间，患者未被施用免疫抑制剂。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包含施用给药方案至少二次。在一些例子中，向对一种或多种同种异体抗原敏感的患者施用给药方案至少2次(例如，至少2、3、4或更多次)。
本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。
本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原，其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。
本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低量的B2M和CIITA多肽，其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。
本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽、B2M基因的基因组修饰和CIITA基因的基因组修饰，其中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。
在所述群细胞用途的一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
在所述的用途的一些实施方案中，患者因先前怀孕或先前同种异体移植物而敏感。在一些实施方案中，同种异体移植物选自下列所组成的组：同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和同种异体器官移植物。
在一些实施方案中，患者对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在某些实施方案中，降低或无免疫反应选自下列所组成的组：对一群低免疫性细胞降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。在某些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含CD142基因的基因组修饰。
在一些实施方案中，一群低免疫性细胞包含源自多能干细胞的分化的细胞。在一些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。
在一些实施方案中，一群低免疫性细胞包含源自原代T细胞的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞源自包含来自一个或多个(例如，二或更多、三或更多、四或更多、五或更多、十或更多、二十或更多、五十或更多或一百或更多)不同于患者的受试者的原代T细胞的T细胞池。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后的结构域诱导细胞因子基因的表达。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下述所组成的组：(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域、(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。
在CAR的一些实施方案中，抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19或BCMA。
在CAR的一些实施方案中，跨膜结构域包含选自下列所组成的组中的一者：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域和其功能性变体。
在CAR的一些实施方案中，信号传递结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
如第四代CAR所述，CAR的成功信号传导诱导细胞因子基因的表达。在一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL 18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。在第四代CAR的一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在一方面中，本文提供为包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者先前已接受同种异体移植物。
在一些实施方案中，同种异体移植物选自下列所组成的组：同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和同种异体器官移植物。在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在一些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在一些实施方案中，降低或无免疫反应选自下列所组成的组：对一群低免疫性细胞降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在一些实施方案中，在患者接受同种异体移植物之后，施用一群低免疫性细胞至少一周或更久。在特定实施方案中，在患者接受同种异体移植物之后，施用一群低免疫性细胞至少1个月或更久。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和/或CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。在一些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含降低表达量的CD142。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的分化的细胞。在一些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含源自原代T细胞的细胞。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞源自包含来自一个或多个(例如，二或更多、三或更多、四或更多、五或更多、十或更多、二十或更多、五十或更多或一百或更多)不同于患者的受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下述所组成的组：(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域；(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19或BCMA。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含选自下列所组成的组中的一者：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域和其功能性变体。
在一些实施方案中，信号传递结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
在诱导细胞因子基因表达的第四代CAR-T的一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL 18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。
在第四代CAR的一些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞的CAR包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的免疫活化或无免疫活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的供体特异性IgG抗体或无供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的IgM与IgG抗体产生或无IgM与IgG抗体产生。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起低免疫性细胞的降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无细胞毒性T细胞杀伤。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中未触发全身性急性细胞性免疫反应。
在一些实施方案中，在施用一群低免疫性细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在另一方面中，提供为包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用。在一些实施方案中，在怀孕的同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。在一些实施方案中，本文所述的方法有用于治疗患者中的失调。
在一些实施方案中，患者对一群低免疫性细胞呈现降低或无免疫反应。在一些实施方案中，降低或无免疫反应选自下列所组成的组：对一群低免疫性细胞降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在许多实施方案中，低免疫性细胞包含降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和/或CIITA。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含外源性CD47多肽及降低表达量的B2M和CIITA。在特定实施方案中，低免疫性细胞进一步包含选自下列所组成的组的一种或多种外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。在某些实施方案中，低免疫性细胞进一步包含降低表达量的CD142。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的分化的细胞。在某些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。
在许多实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含源自原代T细胞的细胞。在某些实施方案中，源自原代T细胞的细胞源自包含来自一个或多个(例如，二或更多、三或更多、四或更多、五或更多、十或更多、二十或更多、五十或更多或一百或更多)不同于患者的受试者的原代T细胞的T细胞池。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：(a)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；(b)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR；(c)包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及(d)包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下列所组成的组：(a)抗原结合结构域靶向肿瘤细胞的抗原特性；(b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域；(c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；(d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；(e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及(f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合到CD19或BCMA。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含选自下列所组成的组中的一者：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域和其功能性变体。
在一些实施方案中，信号传递结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。
对于诱导细胞因子基因表达的第四代CAR，在一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导之后诱导细胞因子基因的表达的CAR的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在一些实施方案中，源自原代T细胞的细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的免疫活化或无免疫活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起降低量之周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的供体特异性IgG抗体或无供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起针对低免疫性细胞的降低量的IgM与IgG抗体产生或无IgM与IgG抗体产生。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中引起低免疫性细胞的降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无细胞毒性T细胞杀伤。在一些实施方案中，一群低免疫性细胞在施用之后在患者中未触发全身性急性细胞性免疫反应。
在一些实施方案中，在施用一群低免疫性细胞之前或之后，患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
在一方面中，本文提供为治疗具有细胞缺陷的敏感性患者的方法，包括施用到患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞。
在另一方面中，本文提供为治疗为细胞疗法的候选人的敏感性患者的方法，包括施用到患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞。
在一方面中，本文提供为包含施用到为细胞疗法的候选人的患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞的方法，其中，患者因病症或疾病接受先前治疗。
在一方面中，本文提供为治疗为细胞疗法的候选人的敏感性患者的方法，包括施用到患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞，其中，在施用所述群细胞之前、期间或之后，患者未被施用免疫抑制剂。
在一方面中，本文提供为治疗具有至少部分器官衰竭的有其需要的患者的方法，包括在施用至少部分器官移植物到患者之前，施用到患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞。
在另一方面中，本文提供为施用组织或器官移植物到有其需要的患者的方法，包括在施用组织或器官移植物之前，施用到患者从包含一种或多种低免疫性修饰的干细胞分化的一群细胞。
在一些实施方案中，患者为敏感性患者。在某些实施方案中，患者因先前怀孕或先前移植物而敏感。在某些实施方案中，先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物。在一些实施方案中，先前移植物为同种异体移植物。
在一些实施方案中，先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官。在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感或一种或多种自体抗原。在某些实施方案中，患者呈现对抗一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原的记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
在一些实施方案中，患者患有过敏症。在某些实施方案中，过敏症为选自下列所组成的组的过敏症枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
在某些实施方案中，所述群细胞包含表达外源性CD47多肽及具有降低表达量的B2M和/或CIITA的细胞。在一些实施方案中，所述群细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
在一些实施方案中，患者对所述群细胞呈现降低或无免疫反应。在一些实施方案中，降低免疫反应与在患者或被施用一群“野生型”细胞的对照受试者中的免疫反应比较。在一些实施方案中，对所述群细胞的降低或无免疫反应反应呈现选自下列所组成的组：降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。在例示的实施方案中，患者呈现：a)在施用所述群细胞后，降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化；b)在施用所述群细胞后，降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化；c)在施用所述群细胞后，降低量的供体特异性IgG抗体或对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；d)在施用所述群细胞后，降低量的IgM与IgG抗体生成或对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；和/或e)在施用所述群细胞后，降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在某些实施方案中，在施用所述群细胞之前，患者未被施用免疫抑制剂。在一些实施方案中，在患者敏感之后，施用所述群细胞至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周或至少1个月或更久。
在一些实施方案中，干细胞为多能干细胞。在某些实施方案中，多能干细胞为诱导性多能干细胞。
在一些实施方案中，细胞缺陷与神经退化性疾病相关或细胞疗法用于治疗神经退化性疾病。在某些实施方案中，神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和佩梅病(PMD)。在一些实施方案中，所述群细胞包含选自下列所组成的组的细胞：神经胶质祖细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元。在某些实施方案中，多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元。
在一些实施方案中，细胞缺陷与糖尿病相关或细胞疗法用于治疗糖尿病。在某些实施方案中，所述群细胞为一群胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞。在一些实施方案中，胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞。
在某些实施方案中，细胞缺陷与心血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病。在一些实施方案中，所述群细胞为一群心肌细胞。
在一些实施方案中，细胞缺陷与血管病症或疾病相关或细胞疗法用于治疗血管病症或疾病。在一些实施方案中，所述群细胞为一群内皮细胞。
在一些实施方案中，细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关或细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎。在一些实施方案中，所述群细胞为一群甲状腺祖细胞。
在某些实施方案中，细胞缺陷与肝脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肝脏疾病。在一些实施方案中，肝脏疾病包含肝脏的硬化。
在一些实施方案中，所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。在某些实施方案中，细胞缺陷与角膜疾病相关或细胞疗法用于治疗角膜疾病。在一些实施方案中，角膜疾病为富克斯氏营养不良或先天遗传性内皮营养不良。在一些实施方案中，所述群细胞为一群角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞。
在一些实施方案中，细胞缺陷与肾脏疾病相关或细胞疗法用于治疗肾脏疾病。在一些实施方案中，所述群细胞为一群肾前驱细胞或肾细胞。
在某些实施方案中，细胞疗法用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。在一些实施方案中，所述群细胞为一群嵌合抗原受体(CAR)T-细胞。
在一些实施方案中，先前治疗不包含所述群细胞。在某些实施方案中，施用所述群细胞以治疗先前治疗的相同病症或疾病。在一些实施方案中，相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果。在某些实施方案中，相较于先前治疗，所述群细胞对患者中病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗与先前治疗不同的病症或疾病。在一些实施方案中，先前治疗为治疗上无效。在一些实施方案中，患者对先前治疗发展出免疫反应。
在一些实施方案中，先前治疗包含施用包含自杀基因安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应自杀基因安全开关系统的活化，发生免疫反应。
在一些实施方案中，先前治疗包含机械辅助的治疗。在例示性实施方案中，机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
在一些实施方案中，组织和/或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和/或部分角膜移植物。在一些实施方案中，施用所述群细胞用于治疗在选自下列所组成的组的组织或器官中的细胞缺陷：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜和/或骨头。
在一些实施方案中，组织或器官移植物为同种异体移植移植物。在某些实施方案中，组织或器官移植物为自体移植移植物。在一些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代相同的组织或器官。
在某些实施方案中，施用所述群细胞以治疗组织或器官中的细胞缺陷并且组织或器官移植物为替代不同组织或器官。在一些实施方案中，器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。在例示的实施方案中，患者患有糖尿病。
在另一方面中，本文提供为包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在一方面中，本文提供为包含施用到患者给药方案的方法。在此方法中，给药方案包含a)包含治疗有效量的低免疫性细胞的第一施用；b)恢复期间；以及c)包含治疗有效量的低免疫性细胞的第二施用；其中，低免疫性细胞各包含插入到包含B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸，及其中，低免疫性细胞各包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在一方面中，本文提供一群低免疫性细胞用于治疗患者疾病的用途，其中，低免疫性细胞各包含插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；以及其中，低免疫性细胞各包含外源性CD47多肽及降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在一方面中，本文提供为包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者先前已接受同种异体移植物。
在一方面中，本文提供为治疗为细胞疗法的候选人的患者的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在一方面中，本文提供为包含施用到为细胞疗法的候选人的患者一群低免疫性细胞的方法。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，患者因病症或疾病接受先前治疗。
在一方面中，本文提供为治疗为细胞疗法的候选人的患者的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞，其中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，在施用所述群细胞之前、期间或之后，患者未被施用免疫抑制剂。
在另一方面中，本文提供为治疗具有至少部分器官衰竭的有其需要的患者的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，在施用至少部分器官移植物到患者之前，施用一群低免疫性细胞。
在又另一方面中，本文提供为施用组织或器官移植物到有其需要的患者的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座的外源性多核苷酸；以及b)外源性CD47多肽，其中，在施用组织或器官移植物之前，施用一群低免疫性细胞。
在另一方面中，本文提供为施用到患者一群低免疫性细胞的方法。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)包含编码嵌合抗原受体(CAR)的外源性多核苷酸的基因修饰，其插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在另一方面中，本文提供为治疗有其需要的患者的癌症的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞。低免疫性细胞各包含：a)编码嵌合抗原受体(CAR)的外源性多核苷酸，其插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座；b)外源性CD47多肽；以及c)降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含编码外源性CD47多肽的额外外源性多核苷酸。在某些实施方案中，额外外源性多核苷酸是i)位于与(a)中的基因组基因座不同的基因组基因座；或ii)位于与(a)中的基因组基因座相同的基因组基因座。
在另一方面中，本文提供包含施用到患者一群低免疫性细胞的方法。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到第一基因组基因座的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸；以及b)插入到第二基因组基因座的编码CD47多肽的第二外源性多核苷酸，其中，低免疫性细胞呈现降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，第一和第二基因组基因座各为安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。
在一方面中，本文提供为治疗有其需要的患者的癌症的方法，包括施用到患者一群低免疫性细胞。在此方法中，低免疫性细胞各包含：a)插入到第一基因组基因座的编码嵌合抗原受体(CAR)的第一外源性多核苷酸；以及b)插入到第二基因组基因座的编码CD47多肽的第二外源性多核苷酸，其中，低免疫性细胞呈现降低表达的MHC I和/或II类人白细胞抗原，其中，第一和第二基因组基因座各为安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座。
在一些实施方案中，第一和第二基因组基因座为相同。在某些实施方案中，第一和第二基因组基因座为不同。在一些实施方案中，低免疫性细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。在一些实施方案中，第三基因组基因座相同于第一或第二基因组基因座。在一些实施方案中，第三基因组基因座不同于第一和/或第二基因组基因座。
在一些实施方案中，安全港或目标基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、CXCR4基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、CLYBL基因基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因座、PDGFRa基因基因座、OLIG2基因基因座、GFAP基因基因座和KDM5D基因基因座。在某些实施方案中，CCR5基因基因座为外显子1至3、内含子1至2或CCR5基因的编码序列(CDS)。在一些实施方案中，PPP1R12C基因基因座为PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。在一些实施方案中，CLYBL基因基因座为CLYBL基因的内含子2。在某些实施方案中，ROSA26基因基因座为ROSA26基因的内含子1。在一些实施方案中，目标港基因座为SHS231基因座。在一些实施方案中，CD142基因基因座为CD142基因的CDS。在某些实施方案中，MICA基因基因座为MICA基因的CDS。在一些实施方案中，MICB基因基因座为MICB基因的CDS。在一些实施方案中，B2M基因基因座为B2M基因的CDS。在例示性实施方案中，CIITA基因基因座为CIITA基因的CDS。在某些实施方案中，TRAC基因基因座为TRAC基因的CDS。在一些实施方案中，TRB基因基因座为TRB基因的CDS。
在某些实施方案中，外源性多核苷酸可操作连接到启动子。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的分化的细胞。在一些实施方案中，多能干细胞包含诱导性多能干细胞。
在某些实施方案中，分化的细胞选自下列所组成的组：胰脏β胰岛细胞、神经胶质祖细胞、心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、B细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞(例如，浆细胞或血小板)和上皮细胞。在一些实施方案中，分化的细胞是T细胞。
在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自原代T细胞。在某些实施方案中，低免疫性细胞为源自多能干细胞的T细胞。在一些实施方案中，低免疫性细胞为源自原代T细胞。在一些实施方案中，外源性多核苷酸编码嵌合抗原受体(CAR)。
在例示性实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)选自下列所组成的组：a)包含至少一抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传递结构域的第一代CAR；b)包含至少一抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传递结构域的第二代CAR、c)包含至少一抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传递结构域的第三代CAR；以及d)包含至少一抗原结合结构域、跨膜结构域、三或四个信号传递结构域的第四代CAR，并且在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因的表达的结构域。
在一些实施方案中，至少一抗原结合结构域选自下列所组成的组：a)靶向肿瘤细胞的抗原特性的抗原结合结构域；b)靶向T细胞的抗原特性的抗原结合结构域；c)抗原结合结构域靶向自身免疫或炎性失调的抗原特性；d)靶向衰老细胞的抗原特征的抗原结合结构域；e)靶向传染性疾病的抗原特征的抗原结合结构域；以及f)结合到细胞的细胞表面抗原的抗原结合结构域。
在某些实施方案中，至少一抗原结合结构域选自下列所组成的组：抗体、其抗原结合部分、scFv和Fab。在一些实施方案中，CAR为包含结合两个不同抗原的两个抗原结合结构域的双特异性CAR。在一些实施方案中，至少一抗原结合结构域结合到选自下列所组成的组的抗原：CD19、CD22和BCMA。在某些实施方案中，双特异性CAR结合到CD19和CD22。
在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含选自下列所组成的组的跨膜区域：来自TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B的跨膜区域及其功能性变体。
在某些实施方案中，CAR的信号传递结构域包含共刺激结构域。在某些实施方案中，共刺激结构域包含两个不相同的共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域在T细胞活化期间增强细胞因子生成、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持续性。在一些实施方案中，细胞因子基因为对低免疫性细胞的内源性或外源性细胞因子基因。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎性(pro-inflammatory)细胞因子。在一些实施方案中，促炎性(pro-inflammatory)细胞因子选自下列所组成的组：IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL 18、TNF、IFN-γ和其功能性片段。在某些实施方案中，在CAR的成功信号传递之后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能性结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3 zeta(CD3ζ)结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体。在某些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；以及(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；以及(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或免疫受体酪氨酸为主的活化基序(ITAM)或其功能性变体；(ii)CD28结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能性变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在某些实施方案中，CAR包含(i)抗-CD19 scFv；(ii)CD8α铰链及跨膜结构域或其功能性变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能性变体；以及(iv)CD3ζ信号传递结构域或其功能性变体。
在一些实施方案中，低免疫性细胞包含降低表达的内源性T细胞受体。在一些实施方案中，低免疫性细胞包含降低表达的细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)。在某些实施方案中，低免疫性细胞包含增加表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原敏感。在一些实施方案中，患者因先前怀孕或先前同种异体移植物而敏感。在某些实施方案中，一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
在一些实施方案中，患者对一种或多种同种异体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。在某些实施方案中，同种异体移植物选自下列所组成的组：同种异体细胞移植物、同种异体输血、同种异体组织移植物和同种异体器官移植物。
在一些实施方案中，患者对所述群细胞呈现降低或无免疫反应。在某些实施方案中，对所述群细胞反应呈现降低或无免疫反应选自下列所组成的组：降低或无全身性免疫反应、降低或无适应性免疫反应、降低或无先天性免疫反应、降低或无T细胞反应和降低或无B细胞反应。
在一些实施方案中，患者呈现：a)在施用所述群细胞后，降低量的全身性TH1活化或无全身性TH1活化；b)在施用所述群细胞后，降低量的周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化或无PBMC的免疫活化；c)在施用所述群细胞后，降低量的供体特异性IgG抗体或对所述群细胞无供体特异性IgG抗体；d)在施用所述群细胞后，降低量的IgM和IgG抗体生成或对所述群细胞无IgM和IgG抗体产生；和/或e)在施用所述群细胞后，降低量的细胞毒性T细胞杀伤或无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，失调为癌症或细胞疗法用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
V.实施例
实施例1：异种移植研究中人B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg诱导性多能干细胞
为了研究对细胞移植物减少MHC I和MHC II表达及增加CD47表达的影响，将人B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg诱导性多能干细胞(HIP细胞)移植到恒河猴(非人灵长类动物或NHP)接受者(异种移植)。
研究设计与施用。八名NHP(F/M，2-3kg，12-36个月大)被随机分为二组(n＝4)，用于野生型或HIP细胞的盲施用。根据IACUC批准的方案，各NHP在背部施用4次皮下注射～107个人野生型或HIP细胞。人野生型iPSC和人HIP iPSC的特性如图14所示。在注射前(“Tx前”或第0天)、在注射后第7、13、25天等抽血分析。野生型和HIP细胞也转基因表达的萤火虫荧光素酶用于生物发光成像(BLI)，并且细胞存活率由BLI监测。研究设计和结果如图1A-1F、2A、2B、3A、3B、4A至4C、5A至5C、6A至6C和7A至7C所示。
在初始注射后接受异种HIP细胞的NHP中观察到无全身性免疫反应，相较于注射野生型细胞的NHP，其显示T细胞活化、IgM与IgG量和供体特异性IgM与IgG增加。为了确定是否可以在类似缺乏免疫活化下重新施用HIP细胞，在初次注射后的第118天和第123天之间，将NHP以与第二次注射相同的细胞类型(野生型或HIP)再注射。和之前一样，在再注射之前(“Tx前”或第0天)和之后的第7天和第13天(分别是第一次注射后的125和131天)抽血分析，并且细胞存活率由BLI监测。值得注意的是，在再注射异种HIP细胞的动物中观察到无全身性免疫反应，而再注射野生型细胞的动物则显示全身性免疫活化。尽管在施用HIP细胞的动物中见到无全身性免疫活化，但在初始或第二次给药的13天期间(BLI<初始剂量的5％)，细胞未能存活，显然由于局部异种反应以及对媒介物(Matrigel)的反应。这些结果指出，HIP细胞可以逃脱多次剂量的免疫辨识和活化。
为了确定HIP细胞是否可以逃脱预先形成的免疫反应，最初施用二剂野生型细胞的四只NHP经HIP细胞移植，并且反之亦然(交叉施用)。在第二次注射后的第118天和第123天之间(初次注射后的第241天)，将HIP或野生型细胞皮下注射到动物中。和之前一样，在再注射前48天和此后第7天和第13天(分别在第一次注射后248天和254天)抽血分析，并且细胞存活率由BLI监测。
T细胞活化。通过Elispot检定测量野生型和HIP人iPSC施用的动物的T细胞活化。对于单向Elispot检定，在第三次注射(交叉施用)前48天及后7天和13天从恒河猕猴中单离接受者PBMC。通过CD3MACS-分选(Miltenyi)从PBMC中纯化T细胞并用作回应者细胞。供体细胞(野生型或HIP细胞)经过丝裂霉素处理(50μg/mL达30分钟，Sigma)并用作为刺激物细胞。1×105个刺激物细胞与5×105个接受者回应者T-细胞一起培养36小时，并使用Elispot盘读取器计算IFN-γ斑点频率。对于前两次注射HIP细胞后施用野生型细胞的动物，观察到的Elispot活性在交叉注射后第7天为最高(图1A至1F)。这些结果指出注射野生型细胞后，全身性TH1活化及急性细胞性免疫反应，之前注射HIP细胞无免疫抑制。相比之下，动物在前两次注射野生型细胞后注射HIP细胞(交叉注射)在第0天具有可与初始TH1细胞相比的Elispot活性，指示了对修饰的细胞无全身性TH1活化或细胞免疫反应，即使在对野生型异种有预先形成的免疫反应的动物中也是如此(图1A至1F)。
供体特异性抗体活性。还检定由以野生型和HIP细胞交叉注射的动物生成的供体特异性抗体。来自接受者猴的血清通过加热至56℃达30分钟而去补体。将等量的血清和野生型或HIP细胞悬液(5×106个细胞/mL)在4℃下培育45分钟。细胞用FITC-共轭的山羊抗-IgM(BD Bioscience)或抗-IgG标记，并通过流式细胞术(BD Bioscience)分析。
在先前施用HIP细胞的动物中交叉注射野生型细胞后第7天和第13天观察到供体特异性反应性高于注射前量，IgM从第7天到第13天下降，与同型切换一致(数据未显示)。相比之下，在先前已接受过两次野生型细胞注射的施用HIP细胞的动物中，观察到无供体特异性IgM结合(数据未显示)。在先前施用HIP细胞的动物中交叉注射野生型细胞后第13天观察到供体特异性反应性增加，IgG从第7天增加到第13天，并且然后从第13天到第75天减少，与同型切换一致(图3A至3B)。相比之下，在第7、13和75天，先前已接受过两次野生型细胞注射(图2A和2B)的施用HIP细胞的动物中，观察到无供体特异性IgG结合。
批量抗体生成。接受野生型或HIP细胞交叉注射的动物的总抗体生成使用IgM和IgG ELISA试剂盒(Abcam)检定。通过洗涤去除未结合的蛋白质后，加入与山葵过氧化酶(HRP)共轭的抗-IgM或抗-IgG抗体。这些酶标记的抗体与之前结合的IgM或IgG形成复合物。与免疫吸附剂结合的酶通过添加显色底物3,3',5,5'-四甲基-联苯胺(TMB)检定。在HIP细胞两次施用后，在以野生型细胞交叉施用的动物中，观察到总IgM和IgG急剧增加，在第7天观察到最大IgM生成，在第13天观察到最大的IgG生成，指示了同型转换(图4A至4C和6A至6C)。
引人注意的是，在二次注射野生型细胞后交叉施用HIP细胞的动物中，在任何时间点均观察到无总IgM或IgG的增加(图5A至5C和7A至7C)。
在HIP注射之前观察到一些IgG，可能是来自之前的野生型施用的残留生成(图7A至5C)。总之，这些结果指出对HIP细胞的体液性免疫反应几乎完全缺乏。
NK细胞杀伤。NK细胞的全身性先天性免疫也在动物交叉注射野生型或HIP细胞中检定。NK细胞杀伤检定是在XCELLIGENCE MP平台(ACEA BioSciences)上进行。96孔E盘(ACEA BioSciences)涂布胶原蛋白(Sigma-Aldrich)，并且4×105个野生型或HIP细胞种在100μl细胞特异性培养基中。在细胞指数值达到0.7后，以1：1的E：T比添加从处理的动物中单离的恒河猴NK细胞，有或无1ng/ml恒河猴IL-2(MyBiosource，San Diego，CA)。作为杀伤对照，细胞用2％TRITON X100处理。通过经刺激或未经刺激的NK细胞对野生型或HIP细胞观察到无杀伤，指示了在HLA I和HLA II不存在的情况下，HIP细胞上的CD47表达有效保护免受NK细胞和巨噬细胞。(参见Deuse等人，2019,Nat.Biotechnol.,37：252-258)。如图8A至8c所示，施用第一剂HIP细胞到野生型NHP后(图8C)，观察到无NK细胞杀伤，以HIP细胞再给药到野生型NHP后也无(图8c)。尽管HLA I/HLA II(例如MHC编辑))针对HIP细胞，在将HIP细胞交叉注射到具有预先存在的免疫性的野生型NHP后，也观察到缺乏NK细胞杀伤(图8D和8E)。
移植细胞的存活。尽管对交叉施用人HIP细胞的动物观察到无全身性免疫反应，但很可能是由于局部异种反应，细胞没有存活。对于先前的野生型和HIP注射，对从动物取出的细胞塞进行的组织病理学分析，显示嗜中性球浸润或纤维蛋白(作为嗜中性球已在所述区域的指标)以及异物反应和对媒介物的第IV型超敏性反应的迹象，分别指出对人细胞的异种反应和对媒介物的过敏反应。对媒介物的过敏反应和异物反应由额外的仅注射媒介物(无细胞)的对照猴子证实，其证实类似的组织病理学特征。
此实施例证实，可将HIP细胞施用到具有预先存在的全身性同种异体免疫反应的受试者，而不会引起新的全身性免疫反应。
实施例2：在同种异体移植交叉研究中的人B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg诱导性多能干细胞(iPSC)和野生型IPSC
这个实施例描述同种异体移植交叉研究，其比较移植人B2Mindel/indel、CIITAindel /indel、CD47tg诱导性多能干细胞(HIP iPSC)和野生型iPSC到恒河猴(非人灵长类动物或NHP)接受者的效果。在一组交叉研究中，野生型iPSC被皮下(s.c,)移植到接受者动物的背部，并且在大约6周后，HIP iPSC被s.c.移植在邻近位置。在第二组交叉研究中，HIP iPSC被s.c.移植到接受者动物的背部，并且在大约6周后，野生型iPSC被移植到邻近位置。监测植入细胞和其子代的存在。
数据显示HIP iPSC未被敏感的NHP接受者(最初用野生型iPSC移植的NHP接受者)的免疫系统检测，因此避免免疫排斥。即使接受者具有功能性免疫系统，植入的HIP iPSC也能逃脱接受者免疫反应。此外，最初移植HIP iPSC的NHP接受者对后续移植的野生型iPSC具有免疫反应。
A.方法
人iPSC过表达恒河猴CD47的基因编辑。人iPSC B2Mindel/indel、CIITAindel/恒河猴CD47 tg细胞(也称为HIP iPSC或HIP细胞)使用发明所属技术领域中具有通常知识者认可的标准人iPSC细胞培养方法培养。恒河猴野生型iPSC和恒河猴HIP iPSC的特性如图15所示。
恒河猴iPSC细胞培养。使用发明所属技术领域中具有通常知识者认可的标准恒河猴iPSC细胞培养方法培养恒河猴iPSC。
hiPSC的荧光素酶转导。hiPSC(即，HIP iPSC和野生型iPSC)通过在组成型活性启动子(即，CAG启动子)的表达控制下经表达荧光素酶II基因的慢病毒粒子感染。通过感染的细胞的荧光素酶表达使用标准商业上可获得的荧光素酶检定确认。
移植到非人灵长类动物的iPSC制备。iPSC在标准培养基中再悬浮，标准培养基包括促生存鸡尾酒(即，包括凋亡蛋白酶抑制子、BcL-xL、IGF-1、吡那地尔(pinacidil)和环孢素A的鸡尾酒)。将细胞装载到注射器进行注射。
在恒河猕猴中肌肉内iPSC注射。动物通过肌肉内(IM)注射速效麻醉剂(即替利他明(tiletamine)和唑拉西泮(zolazepan)的组合)镇静，较佳地不要在接受细胞植入物的腿中。一旦麻醉后，将动物的双腿在导管和细胞植入位点剃毛。通过经皮静脉穿刺从股静脉采集血液样本。将导管放入隐静脉(较佳地不在接受细胞植入物的腿中)。细胞植入区域，即，大腿或股四头肌的前表面，使用交替的葡萄糖酸洛赫西定/乙醇洗涤物而手术洗涤，最终用葡萄糖酸洛赫西定完成。
在动物股四头肌中间前侧的皮肤上做切口。通过捏单离股四头肌，而iPSC以星爆图案注射，使得经注射的细胞被注射到图案内的多个位置。用缝线缝合切口，并且标记注射区域以备将来参考。
通过预先放置的静脉内导管将荧光素注射到接受者动物中以用于荧光素输注。一旦动物的生命体征、诸如，心律恢复正常，通过生物发光成像(BLI)对注射区域成像。BLI监测细胞存活率。随着时间，定量生物发光成像数据表示为BLI图像和BLI信号。
B.HIP iPSC的移植
如图9A所示，同种异体HIP恒河猴iPSC被移植到恒河猴接受者的左腿中。此HIP细胞不会在接受者中引发免疫反应。移植后至少6周在注射位点检测植入细胞。图9B显示移植后6周以HIP iPSC植入的左腿的免疫组织化学染色。图9B显示代表血管的平滑肌肌动蛋白(SMA)的染色，并且显示移植的HIP iPSC的荧光素酶。
此外，图13C显示类似研究的BLI图像，用于监测同种异体恒河猴接受者左腿中移植的同种异体HIP恒河猴iPSC的存在。最初移植后至少9周内，在注射位点发现移植的细胞和其子代。HIP iPSC没有在恒河猴接受者中引起显著的免疫反应，因为细胞在移植后持续至少9周。
C.交叉研究：在相同NHP中施用野生型iPSC，接着施用HIP iPSC
在野生型iPSC到HIP iPSC的交叉研究中，同种异体恒河猴野生型iPSC被移植到恒河猴接受者的左腿。移植的恒河猴野生型iPSC群在移植后第7天实质上降低(100％至6.8％；图10)。移植后2周，仅检测到移植的群的10％，而移植后3周后，仅维持群的1.4％。移植后4周和5周，注射位点未发现移植的细胞。因此，恒河猴接受者似乎变得敏感。在研究的交叉臂中，在初始野生型iPSC移植物后5周(也称为第0天(d0)交叉)，将同种异体HIP恒河猴iPSC注射到敏感的恒河猴接受者的右腿。
在交叉移植的第0天，在注射位点检测到移植的同种异体HIP恒河猴iPSC(图10，底列)。在交叉移植的第7天(d7)，检测到69.2％的移植的HIP iPSC。此外，交叉移植后2周，48.1％的细胞仍然存在。因此，在研究的初始臂中，接受者动物引起对野生型iPSC的免疫反应，而在交叉臂中，在敏感的接受者动物中HIP iPSC持续。
图11显示野生型iPSC到HIP iPSC的另一交叉研究的结果。移植的恒河猴野生型iPSC在初始接受者中引起免疫反应。具体而言，在移植后第7天仅检测到移植的野生型iPSC的10.2％。在恒河猴野生型iPSC初始移植后的5周(也称为交叉移植的d0)，HIP恒河猴iPSC被移植到现已敏感的恒河猴接受者的右腿。在注射位点检测到移植的HIP iPSC(图11，底列)。交叉移植后第7天，移植的细胞和其子代的28.8％位于注射位点。交叉移植后3周，所检测到的群为移植的HIP iPSC的约32.9％。
D.交叉研究：在相同NHP中施用HIP iPSC，接着施用野生型iPSC
在HIP iPSC到野生型iPSC的交叉研究中，同种异体HIP iPSC被移植到恒河猴接受者的左腿中(图12)。移植的HIP iPSC及其子代在注射位点被检测到达在移植后至少9周。移植后5周，有约112％的HIP iPSC的初始移植群及其子代，而7周时，存在202.4％的HIP iPSC及其子代。在8周和9周，分别存在154.8％和178.6％的HIP iPSC及其子代。在接受者中发现HIP iPSC达最初移植物后至少9周。
在HIP iPSC的初始移植后的第6周(也称为交叉移植第0天)，同种异体恒河猴野生型iPSC被移植物到恒河猴接受者的右腿。在注射位点检测到移植的野生型iPSC(图12，底列)。交叉移植后第7天，移植的细胞和其子代无一位于注射位点。未检测到荧光素酶信号。相比之下，在HIP iPSC的初始移植后7周，在恒河猴接受者左腿中约有202.4％的初始移植的HIP iPSC群及其子代。
上述一系列交叉研究的结果显示HIP iPSC能够躲避敏感的NHP接受者(初始移植野生型iPSC的NHP接受者)的免疫系统，因此，HIP iPSC可以避免免疫排斥。此外，初始移植HIP iPSC的接受者对后续移植的野生型iPSC产生免疫反应。见，例如，图13A和13B。即使接受者具有功能性免疫系统，植入的HIP iPSC也能逃脱免疫反应。
实施例3：使用安全港位点在人B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg诱导性多能干细胞(iPSC)中外源性CD47的表达
此实施例描述特征化在人B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg诱导性多能干细胞(iPSC)中外源性CD47表达的表达的研究，其中，编码外源性CD47的多核苷酸插入到iPSC的安全港位点。
B2Mindel/indel、CIITAindel/indel诱导性多能干细胞(iPSC)使用标准CRISPR/Cas9基因编辑技术产生。编码人CD47的HDR供体质粒，在由CAG或EF1α启动子驱动且二侧有三个安全港位点(AAVS1、CLYBL或CCR5)的1kb同源臂的表达盒中，被引到B2Mindel/indel、CIITAindel/indeliPSC。
在安全港位点CD47的目标整合是使用标准CRISPR/Cas9基因编辑技术以介导同源定向修复来达成。产生以下批量编辑株：
·CAG-CD47 AAVS1
·CAG-CD47_CLYBL
·CAG-CD47_CCR5
·EF1α-CD47_AAVS1
·EF1α-CD47_CLYBL
·EF1α-CD47_CCR5。
进行来自批量编辑株的单细胞克隆株。评估克隆株的拷贝数和质粒插入，并且使用标准技术进行PCR基因分型以验证整合到安全港位点的正确位置。扩增通过基因组评估的克隆株，并进行克隆选择检定，以缩小到各安全港位点的2或3个克隆株。使用流式细胞术进行对B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg克隆株的CD47表达评估。
如图16所示，其中CD47转基因插入到三个港位点中各者的B2Mindel/indel、CIITAindel /indel、CD47tg以～30至200倍超过内源性量呈现增强的CD47表达。还观察到CD47被CAG启动子从iPSC中的几个安全港位点稳定表达(见图17和18)。使用上述方法进一步评估B2Mindel /indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC免受全身性先天免疫的保护。如图19所示，包括插入到安全港位点的CD47转基因的B2Mindel/indel、CIITAindel/indel、CD47tg iPSC以足够量稳定表达CD47来保护免受NK和巨噬细胞杀伤。
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<151> 2021-02-19
<150> 63/175,030
<151> 2012-04-14
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ABO的合成引导序列
<400> 1
ucucuccaug ugcaguagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FUT1的合成引导序列
<400> 2
cuggaugucg gaggaguacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RH的合成引导序列
<400> 3
gucuccggaa acucgaggug 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F3 (CD142)的合成引导序列
<400> 4
acaguguaga cuugauugac 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> B2M的合成引导序列
<400> 5
cgugaguaaa ccugaaucuu 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CIITA的合成引导序列
<400> 6
gauauuggca uaagccuccc 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TRAC的合成引导序列
<400> 7
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引导序列 20-mer
<220>
<221> misc_feature
<223> n 可以是任何核糖核苷酸碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 8
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 9
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成12 nt crRNA重复序列
<400> 9
guuuuagagc ua 12
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引导序列
<220>
<221> misc_feature
<223> n 可以是任何核糖核苷酸碱基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n是a、c、g或u
<400> 11
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuu 99
<210> 12
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成人CD47多肽
<400> 12
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu Ile Val
115 120 125
Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe Gly Ile
130 135 140
Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr Ile Ala
145 150 155 160
Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val Gly Ala
165 170 175
Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr Gly Leu
180 185 190
Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His Tyr Tyr
195 200 205
Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala Ile Leu
210 215 220
Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu Ser Leu
225 230 235 240
Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile Ser Gly
245 250 255
Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr Met Lys
260 265 270
Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys Ala Val
275 280 285
Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met Asn Asp
290 295 300
Glu
305
<210> 13
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 有信号序列的合成人CD47多肽
<400> 13
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成Whitlow接头
<400> 14
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (312)

1.一种治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群低免疫性细胞，其中，所述低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中，所述患者为敏感性患者，其中，所述患者：
i.对一种或多种同种异体抗原敏感；
ii.对一种或多种自体抗原敏感；
iii.因先前移植物而敏感；
iv.因先前怀孕而敏感；
v.因病症或疾病接受先前治疗；和/或
vi.为组织或器官移植患者，并且在施用所述组织或器官移植之前、同时和/或之后，施用所述低免疫性细胞。
2.一种治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群胰脏胰岛细胞，其中，所述胰脏胰岛细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者，其中，所述患者：
i.对一种或多种同种异体抗原敏感；
ii.对一种或多种自体抗原敏感；
iii.因先前移植物而敏感；
iv.因先前怀孕而敏感；
v.因病症或疾病接受先前治疗；和/或
vi.为组织或器官患者，并且在施用所述组织或器官移植之前，施用所述胰脏胰岛细胞。
3.一种治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群心脏祖细胞，其中，所述心脏祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者，其中，所述患者：
i.对一种或多种同种异体抗原敏感；
ii.对一种或多种自体抗原敏感；
iii.因先前移植物而敏感；
iv.因先前怀孕而敏感；
v.因病症或疾病接受先前治疗；和/或
vi.为组织或器官患者，并且在施用所述组织或器官移植之前，施用所述心脏肌肉细胞。
4.一种治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群神经胶质祖细胞，其中，所述神经胶质祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者，其中，所述患者：
i.对一种或多种同种异体抗原敏感；
ii.对一种或多种自体抗原敏感；
iii.因先前移植物而敏感；
iv.因先前怀孕而敏感；
v.因病症或疾病接受先前治疗；和/或
vi.为组织或器官患者，并且在施用所述组织或器官移植之前，施用所述神经胶质祖细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述患者为敏感性患者，并且其中，所述患者对所述一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：
a.所述先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，所述先前移植物为同种异体移植物；或
b.所述先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，所述先前移植物为自体移植物。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，所述患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的所述同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
9.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者，其中，所述病症或疾病不同于或相同于所述患者于权利要求1至6中任一项中接受治疗的所述病症或疾病。
10.如权利要求1至6中任一项或权利要求9所述的方法，其中，所述患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，所述先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：
a.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗相同的病症或疾病；
b.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；
c.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；
d.所述先前治疗为治疗有效
e.所述先前治疗为治疗无效；
f.所述患者对所述先前治疗发展出免疫反应；和/或
g.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗不同的病症或疾病。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应所述自杀基因或所述安全开关系统的活化，发生所述免疫反应。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，所述机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述先前治疗包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法，其中，所述自体CAR-T细胞为主的疗法选自下列所组成的组：布卡巴吉奥仑赛、西卡思罗、艾卡巴吉维赛、利基迈仑赛马拉赛、替沙津鲁、来自Cartesian Therapeutics的Descartes-08或Descartes-11、来自Novartis的CTL110、来自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、来自Autolus Limited的AUTO4、来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B或PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819和来自Clyad Oncology的CYAD-211。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述患者患有过敏症，视需要地，其中，所述过敏症为选自下列所组成的组的过敏症：枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述细胞进一步包含一种或多种选自下列所组成的组的外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
16.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD142。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD46。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD59。
19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述细胞自干细胞分化。
20.如权利要求18所述的方法，其中，所述干细胞为间质干细胞。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述干细胞为胚胎干细胞。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞。
23.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、心脏祖细胞、神经细胞、神经胶质祖细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK细胞和CAR-NK细胞。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述细胞源自原代细胞。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述原代细胞是原代T细胞、原代β细胞或原代视网膜色素上皮细胞。
26.如权利要求24所述的方法，其中，源自原代T细胞的所述细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
27.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。
29.如权利要求27所述的方法，其中，所述CAR为CD19-特异性CAR，使得所述细胞为CD19CAR T细胞。
30.如权利要求27所述的方法，其中，所述CAR为CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD22CAR T细胞。
31.如权利要求27所述的方法，其中，所述细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。
32.如权利要求30所述的方法，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
33.如权利要求30所述的方法，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
34.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述第一和第二基因组基因座相同。
36.如权利要求33所述的方法，其中，所述第一和第二基因组基因座为不同。
37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，所述细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。
38.如权利要求36所述的方法，其中，所述第三基因组基因座与所述第一或第二基因组基因座相同。
39.如权利要求36所述的方法，其中，所述第三基因组基因座不同于所述第一和/或第二基因组基因座。
40.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，所述安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因、ROSA26基因基因座和CLYBL基因基因座。
41.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，所述目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
42.如权利要求39所述的方法，其中，至所述CCR5基因基因座的插入为在所述CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。
43.如权利要求39所述的方法，其中，至所述PPP1R12C基因基因座的插入为所述PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。
44.如权利要求39所述的方法，其中，至所述CLYBL基因基因座的插入为所述CLYBL基因的内含子2。
45.如权利要求40所述的方法，其中，至所述ROSA26基因基因座的插入为所述ROSA26基因的内含子1。
46.如权利要求40所述的方法，其中，至所述安全港基因座的插入为SHS231基因座。
47.如权利要求40所述的方法，其中，至所述CD142基因基因座的插入为在所述CD142基因的外显子2或另一CDS。
48.如权利要求40所述的方法，其中，至所述MICA基因基因座的插入为在所述MICA基因的CDS。
49.如权利要求40所述的方法，其中，至所述MICB基因基因座的插入为在所述MICB基因的CDS。
50.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，至所述B2M基因基因座的插入为在所述B2M基因的外显子2或另一CDS。
51.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，至所述CIITA基因基因座的插入为在所述CIITA基因的外显子3或另一CDS。
52.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，至所述TRAC基因基因座的插入为在所述TRAC基因的外显子2或另一CDS。
53.如权利要求33至38中任一项所述的方法，其中，至所述TRB基因基因座的插入为在所述TRB基因的CDS。
54.如权利要求24至52中任一项所述的方法，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
55.如权利要求53所述的方法，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的TRAC。
56.如权利要求22至52中任一项所述的方法，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)。
57.如权利要求55所述的方法，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
58.如权利要求1至56中任一项所述的方法，其中，所述外源性多核苷酸可操作连接到启动子。
59.如权利要求57所述的方法，其中，所述启动子为CAG和/或EF1a启动子。
60.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1天或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1天或更久。
61.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少一周或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少一周或更久。
62.如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1个月或更久，在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1个月或更久。
63.如权利要求1至61中任一项所述的方法，其中，在施用所述群细胞后，所述患者呈现无免疫反应。
64.如权利要求62所述的方法，其中，在施用所述群细胞后的所述无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
65.如权利要求63所述的方法，其中，所述患者呈现下述的一者或多者：
a.在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；
b.在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；
c.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的供体特异性IgG抗体；
d.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的IgM和IgG抗体产生；以及
e.在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
66.如权利要求1至64中任一项所述的方法，其中，在施用所述群细胞之前或之后，所述患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
67.如权利要求1至65中任一项所述的方法，其中，所述方法包含给药方案，其包含：
a.包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；
b.恢复期间；以及
c.包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。
68.如权利要求66所述的方法，其中，所述恢复期间包含至少1个月或更久。
69.如权利要求66所述的方法，其中，所述恢复期间包含至少2个月或更久。
70.如权利要求66至68中任一项所述的方法，其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用，视需要地，其中，因为源自自杀基因或安全开关系统的除去，不再能检测到所述细胞。
71.如权利要求66至69中任一项所述的方法，其中，所述低免疫性细胞通过自杀基因或安全开关系统而除去，并且其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
72.如权利要求66至70中任一项的方法，进一步包括施用所述给药方案至少二次。
73.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中，所述群细胞被施用用于治疗细胞缺陷或作为细胞疗法用于治疗选自下列所组成的组的组织或器官中的病症或疾病：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜、脑、脊髓和骨头。
74.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中：
a.所述细胞缺陷与神经退化性疾病相关或所述细胞疗法用于治疗神经退化性疾病；
b.所述细胞缺陷与肝脏疾病相关或所述细胞疗法用于治疗肝脏疾病；
c.所述细胞缺陷与角膜疾病相关或所述细胞疗法用于治疗角膜疾病；
d.所述细胞缺陷与心血管病症或疾病相关或所述细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病；
e.所述细胞缺陷与糖尿病相关或所述细胞疗法用于治疗糖尿病；
f.所述细胞缺陷与血管病症或疾病相关或所述细胞疗法用于治疗血管病症或疾病；
g.所述细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关或所述细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎；或
h.所述细胞缺陷与肾脏疾病相关或所述细胞疗法用于治疗肾脏疾病。
75.如权利要求73所述的方法，其中：
a.所述神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和佩梅病(PMD)；
b.所述肝脏疾病包含肝脏的硬化；
c.所述角膜疾病为富克斯氏营养不良或先天遗传性内皮营养不良；或
d.所述心血管疾病为心肌梗塞或充血性心力衰竭。
76.如权利要求73或74所述的方法，其中，所述群细胞包含：
a.选自下列所组成的组的细胞：神经胶质祖细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元，视需要地，其中，所述多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元；
b.肝细胞或肝祖细胞；
c.角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞；
d.心肌细胞或心脏祖细胞；
e.胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞，视需要地，其中，所述胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞；
f.内皮细胞；
g.甲状腺祖细胞；或
h.肾前驱细胞或肾细胞。
77.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中，施用所述群细胞用于治疗癌症。
78.如权利要求76所述的方法，其中，所述癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
79.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中，所述患者正接受组织或器官移植物，视需要地，其中，所述组织或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和部分角膜移植物。
80.如权利要求78所述的方法，其中，所述组织或器官移植物为同种异体移植移植物。
81.如权利要求78所述的方法，其中，所述组织或器官移植物为自体移植移植物。
82.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中，施用所述群细胞用于治疗组织或器官中的细胞缺陷并且所述组织或器官移植物用于替代相同组织或器官。
83.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中，施用所述群细胞用于治疗组织或器官中的细胞缺陷并且所述组织或器官移植物用于替代不同组织或器官。
84.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中，所述器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。
85.如权利要求83所述的方法，其中，所述患者患有糖尿病。
86.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中，所述器官移植物为心脏移植物并且所述群细胞为一群起搏细胞。
87.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中，所述器官移植物为胰脏移植物并且所述群细胞为一群β胰岛细胞。
88.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中，所述器官移植物为部分肝脏移植物并且所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。
89.一种一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，所述低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达量的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者。
90.一种一群胰脏胰岛细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，所述胰脏胰岛细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者。
91.一种一群心脏肌肉细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，所述心脏肌肉细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者。
92.一种一群神经胶质祖细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，所述神经胶质祖细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者。
93.如权利要求88至91中任一项所述的用途，其中，所述患者为敏感性患者，并且其中，所述患者对所述一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
94.如权利要求92所述的用途，其中，所述一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
95.如权利要求88至93中任一项所述的用途，其中，所述患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：
a.所述先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，所述先前移植物为同种异体移植物；或
b.所述先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，所述先前移植物为自体移植物。
96.如权利要求88至93中任一项所述的用途，其中，所述患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，所述患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的所述同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
97.如权利要求88至93中任一项所述的用途，其中，所述患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。
98.如权利要求88至93中任一项或权利要求96所述的用途，其中，所述患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，所述先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：
a.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗相同的病症或疾病；
b.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；
c.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；
d.所述先前治疗为治疗有效；
e.所述先前治疗为治疗无效；
f.所述患者对所述先前治疗发展出免疫反应；和/或
g.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗不同的病症或疾病。
99.如权利要求97所述的用途，其中，所述先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应所述自杀基因或所述安全开关系统的活化，发生所述免疫反应。
100.如权利要求97所述的用途，其中，所述先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，所述机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
101.如权利要求88至99中任一项所述的用途，其中，所述患者患有过敏症，视需要地，其中，所述过敏症为选自下列所组成的组的过敏症：枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
102.如权利要求88至100中任一项所述的用途，其中，所述细胞进一步包含一种或多种选自下列所组成的组的外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
103.如权利要求88至101中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD142。
104.如权利要求88至102中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD46。
105.如权利要求88至103中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD59。
106.如权利要求88至104中任一项所述的用途，其中，所述细胞自干细胞分化。
107.如权利要求105所述的用途，其中，所述干细胞为间质干细胞。
108.如权利要求105所述的用途，其中，所述干细胞为胚胎干细胞。
109.如权利要求105所述的用途，其中，所述干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞。
110.如权利要求88至108中任一项所述的用途，其中，所述细胞选自下列所组成的组：心脏细胞、神经细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、胰脏胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、甲状腺细胞、皮肤细胞、血细胞、浆细胞、血小板、肾细胞、上皮细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、NK细胞和CAR-NK细胞。
111.如权利要求88至109中任一项所述的用途，其中，所述细胞源自原代细胞。
112.如权利要求110所述的用途，其中，所述原代细胞是原代T细胞、原代β细胞或原代视网膜色素上皮细胞。
113.如权利要求111所述的用途，其中，源自原代T细胞的所述细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
114.如权利要求88至112中任一项所述的用途，其中，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源性多核苷酸。
115.如权利要求113所述的用途，其中，所述CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。
116.如权利要求114所述的用途，其中，所述CAR为CD19-特异性CAR，使得所述细胞为CD19 CAR T细胞。
117.如权利要求114所述的用途，其中，所述CAR为CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD22 CAR T细胞。
118.如权利要求114所述的用途，其中，所述细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。
119.如权利要求117所述的用途，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
120.如权利要求117所述的用途，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
121.如权利要求88至119中任一项所述的用途，其中，所述第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
122.如权利要求120所述的用途，其中，所述第一和第二基因组基因座相同。
123.如权利要求120所述的用途，其中，所述第一和第二基因组基因座为不同。
124.如权利要求88至122中任一项所述的用途，其中，所述细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。
125.如权利要求123所述的用途，其中，所述第三基因组基因座与所述第一或第二基因组基因座相同。
126.如权利要求123所述的用途，其中，所述第三基因组基因座不同于所述第一和/或第二基因组基因座。
127.如权利要求120至125中任一项所述的用途，其中，所述安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。
128.如权利要求120至125中任一项所述的用途，其中，所述目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
129.如权利要求126所述的用途，其中，至所述CCR5基因基因座的插入为在所述CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。
130.如权利要求126所述的用途，其中，至所述PPP1R12C基因基因座的插入为所述PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。
131.如权利要求126所述的用途，其中，至所述CLYBL基因基因座的插入为所述CLYBL基因的内含子2。
132.如权利要求127所述的用途，其中，至所述ROSA26基因基因座的插入为所述ROSA26基因的内含子1。
133.如权利要求127所述的用途，其中，至所述安全港基因座的插入为SHS231基因座。
134.如权利要求127所述的用途，其中，至所述CD142基因基因座的插入为在所述CD142基因的外显子2或另一CDS。
135.如权利要求127所述的用途，其中，至所述MICA基因基因座的插入为在所述MICA基因的CDS。
136.如权利要求127所述的用途，其中，至所述MICB基因基因座的插入为在所述MICB基因的CDS。
137.如权利要求120至135中任一项所述的用途，其中，至所述B2M基因基因座的插入为在所述B2M基因的外显子2或另一CDS。
138.如权利要求120至135中任一项所述的用途，其中，至所述CIITA基因基因座的插入为在所述CIITA基因的外显子3或另一CDS。
139.如权利要求120至135中任一项所述的用途，其中，至所述TRAC基因基因座的插入为在所述TRAC基因的外显子2或另一CDS。
140.如权利要求120至135中任一项所述的用途，其中，至所述TRB基因基因座的插入为在所述TRB基因的CDS。
141.如权利要求111至139中任一项所述的用途，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
142.如权利要求140所述的用途，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的TRAC。
143.如权利要求109至139中任一项所述的用途，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
144.如权利要求142所述的用途，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
145.如权利要求88至143中任一项所述的用途，其中，所述外源性多核苷酸可操作连接到启动子。
146.如权利要求144所述的用途，其中，所述启动子为CAG和/或EF1a启动子。
147.如权利要求88至145中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1天或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1天或更久。
148.如权利要求88至145中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少一周或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少一周或更久。
149.如权利要求88至145中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1个月或更久，在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1个月或更久。
150.如权利要求88至148中任一项所述的用途，其中，在施用所述群细胞后，所述患者呈现无免疫反应。
151.如权利要求149所述的用途，其中，在施用所述群细胞后的所述无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
152.如权利要求150所述的用途，其中，所述患者呈现下述的一者或多者：
a.在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；
b.在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；
c.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的供体特异性IgG抗体；
d.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的IgM和IgG抗体产生；以及
e.在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
153.如权利要求88至151中任一项所述的用途，其中，在施用所述群细胞之前或之后，所述患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
154.如权利要求88至152中任一项所述的用途，其中，所述方法包含给药方案，其包含：
a.包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；
b.恢复期间；以及
c.包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。
155.如权利要求153所述的用途，其中，所述恢复期间包含至少1个月或更久。
156.如权利要求153所述的用途，其中，所述恢复期间包含至少2个月或更久。
157.如权利要求153至155中任一项所述的用途，其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
158.如权利要求153至156中任一项所述的用途，其中，所述低免疫性细胞通过自杀基因或安全开关系统而除去，并且其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
159.如权利要求155至157中任一项所述的用途，进一步包含施用所述给药方案至少二次。
160.如权利要求88至158中任一项所述的用途，其中，所述群细胞被施用用于治疗细胞缺陷或作为细胞疗法用于治疗选自下列所组成的组的组织或器官中的病症或疾病：心脏、肺脏、肾脏、肝脏、胰脏、肠道、胃、角膜、骨髓、血管、心脏瓣膜、脑、脊髓和骨头。
161.如权利要求88至159中任一项所述的用途，其中：
a.所述细胞缺陷与神经退化性疾病相关或所述细胞疗法用于治疗神经退化性疾病；
b.所述细胞缺陷与肝脏疾病相关或所述细胞疗法用于治疗肝脏疾病；
c.所述细胞缺陷与角膜疾病相关或所述细胞疗法用于治疗角膜疾病；
d.所述细胞缺陷与心血管病症或疾病相关或所述细胞疗法用于治疗心血管病症或疾病；
e.所述细胞缺陷与糖尿病相关或所述细胞疗法用于治疗糖尿病；
f.所述细胞缺陷与血管病症或疾病相关或所述细胞疗法用于治疗血管病症或疾病；
g.所述细胞缺陷与自身免疫甲状腺炎相关或所述细胞疗法用于治疗自身免疫甲状腺炎；或
h.所述细胞缺陷与肾脏疾病相关或所述细胞疗法用于治疗肾脏疾病。
162.如权利要求160所述的用途，其中：
a.所述神经退化性疾病选自下列所组成的组：脑白质营养性萎缩、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、多发性硬化症、横贯性脊髓炎和佩梅病(PMD)；
b.所述肝脏疾病包含肝脏的硬化；
c.所述角膜疾病为富克斯氏营养不良或先天遗传性内皮营养不良；或
d.所述心血管疾病为心肌梗塞或充血性心力衰竭。
163.如权利要求160或161所述的用途，其中，所述群细胞包含：
a.选自下列所组成的组的细胞：神经胶质祖细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和多巴胺神经元，视需要地，其中，所述多巴胺神经元选自下列所组成的组：神经干细胞、神经祖细胞、不成熟多巴胺神经元和成熟多巴胺神经元；
b.肝细胞或肝祖细胞；
c.角膜内皮祖细胞或角膜内皮细胞；
d.心肌细胞或心脏祖细胞；
e.胰脏胰岛细胞，包括胰脏β胰岛细胞，视需要地，其中，所述胰脏胰岛细胞选自下列所组成的组：胰脏胰岛祖细胞、不成熟胰脏胰岛细胞和成熟胰脏胰岛细胞；
f.内皮细胞；
g.甲状腺祖细胞；或
h.肾前驱细胞或肾细胞。
164.如权利要求88至162中任一项所述的用途，其中，施用所述群细胞用于治疗癌症。
165.如权利要求163所述的用途，其中，所述癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
166.如权利要求88至164中任一项所述的用途，其中，所述患者正接受组织或器官移植物，视需要地，其中，所述组织或器官移植物或部分器官移植物选自下列所组成的组：心脏移植物、肺脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、胰脏移植物、肠道移植物、胃移植物、角膜移植物、骨髓移植物、血管移植物、心脏瓣膜移植物、骨头移植物、部分肺脏移植物、部分肾脏移植物、部分肝脏移植物、部分胰脏移植物、部分肠道移植物和部分角膜移植物。
167.如权利要求165所述的用途，其中，所述组织或器官移植物为同种异体移植移植物。
168.如权利要求165所述的用途，其中，所述组织或器官移植物为自体移植移植物。
169.如权利要求165至167中任一项所述的用途，其中，施用所述群细胞用于治疗组织或器官中的细胞缺陷并且所述组织或器官移植物用于替代相同组织或器官。
170.如权利要求165至168中任一项所述的用途，其中，施用所述群细胞用于治疗组织或器官中的细胞缺陷并且所述组织或器官移植物用于替代不同组织或器官。
171.如权利要求165至169中任一项所述的用途，其中，所述器官移植物为肾脏移植物并且所述群细胞为一群肾前驱细胞或肾细胞。
172.如权利要求170所述的用途，其中，所述患者患有糖尿病。
173.如权利要求165至169中任一项所述的用途，其中，所述器官移植物为心脏移植物并且所述群细胞为一群心脏祖细胞或起搏细胞。
174.如权利要求165至169中任一项所述的用途，其中，所述器官移植物为胰脏移植物并且所述群细胞为一群胰脏β胰岛细胞。
175.如权利要求165至169中任一项所述的用途，其中，所述器官移植物为部分肝脏移植物并且所述群细胞为一群肝细胞或肝祖细胞。
176.一种治疗有其需要的患者的方法，包括施用一群低免疫性细胞，其中，所述低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸、编码CAR的第二外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者，其中，所述患者：
i.对一种或多种同种异体抗原敏感；
ii.对一种或多种自体抗原敏感；
iii.因先前移植物而敏感；
iv.因先前怀孕而敏感；
v.因病症或疾病接受先前治疗；和/或
vi.为组织或器官患者，并且在施用所述组织或器官移植之前，施用所述低免疫性细胞。
177.如权利要求175所述的方法，其中，所述患者为敏感性患者，并且其中，所述患者对所述一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
178.如权利要求176所述的方法，其中，所述一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
179.如权利要求175至177中任一项所述的方法，其中，所述患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：
a.所述先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，所述先前移植物为同种异体移植物；或
b.所述先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，所述先前移植物为自体移植物。
180.如权利要求175至178中任一项所述的方法，其中，所述患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，所述患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的所述同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
181.如权利要求175至178中任一项所述的方法，其中，所述患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。
182.如权利要求175至178中任一项所述的方法，其中，所述患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，所述先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：
a.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗相同的病症或疾病；
b.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；
c.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；
d.所述先前治疗为治疗有效；
e.所述先前治疗为治疗无效；
f.所述患者对所述先前治疗发展出免疫反应；和/或
g.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗不同的病症或疾病。
183.如权利要求181所述的方法，其中，所述先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应所述自杀基因或所述安全开关系统的活化，发生所述免疫反应。
184.如权利要求181所述的方法，其中，所述先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，所述机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
185.如权利要求1至183中任一项所述的方法，其中，所述患者患有过敏症，视需要地，其中，所述过敏症为选自下列所组成的组的过敏症：枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
186.如权利要求175至184中任一项所述的方法，其中，所述细胞进一步包含一种或多种选自下列所组成的组的外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
187.如权利要求175至185中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD142。
188.如权利要求175至186中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD46。
189.如权利要求175至187中任一项所述的方法，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD59。
190.如权利要求175至188中任一项所述的方法，其中，所述细胞自干细胞分化。
191.如权利要求189所述的方法，其中，所述干细胞为间质干细胞。
192.如权利要求189所述的方法，其中，所述干细胞为胚胎干细胞。
193.如权利要求189所述的方法，其中，所述干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞。
194.如权利要求175至192中任一项所述的方法，其中，所述细胞是CAR T细胞或CAR-NK细胞。
195.如权利要求175至193中任一项所述的方法，其中，所述细胞源自原代T细胞。
196.如权利要求194所述的方法，其中，所述细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
197.如权利要求175至195中任一项所述的方法，其中，所述CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。
198.如权利要求196所述的方法，其中，所述CAR为CD19-特异性CAR，使得所述细胞为CD19 CAR T细胞。
199.如权利要求196所述的方法，其中，所述CAR为CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD22 CAR T细胞。
200.如权利要求196所述的方法，其中，所述细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。
201.如权利要求199所述的方法，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
202.如权利要求199所述的方法，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
203.如权利要求175至201中任一项所述的方法，其中，所述第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
204.如权利要求202所述的方法，其中，所述第一和第二基因组基因座相同。
205.如权利要求202所述的方法，其中，所述第一和第二基因组基因座为不同。
206.如权利要求175至204中任一项所述的方法，其中，所述细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。
207.如权利要求206所述的方法，其中，所述第三基因组基因座与所述第一或第二基因组基因座相同。
208.如权利要求206所述的方法，其中，所述第三基因组基因座不同于所述第一和/或第二基因组基因座。
209.如权利要求202至207中任一项所述的方法，其中，所述安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。
210.如权利要求202至207中任一项所述的方法，其中，所述目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
211.如权利要求208所述的方法，其中，至所述CCR5基因基因座的插入为在所述CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。
212.如权利要求208所述的方法，其中，至所述PPP1R12C基因基因座的插入为所述PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。
213.如权利要求208所述的方法，其中，至所述CLYBL基因基因座的插入为所述CLYBL基因的内含子2。
214.如权利要求209所述的方法，其中，至所述ROSA26基因基因座的插入为所述ROSA26基因的内含子1。
215.如权利要求209所述的方法，其中，至所述安全港基因座的插入为SHS231基因座。
216.如权利要求209所述的方法，其中，至所述CD142基因基因座的插入为在所述CD142基因的外显子2或另一CDS。
217.如权利要求209所述的方法，其中，至所述MICA基因基因座的插入为在所述MICA基因的CDS。
218.如权利要求209所述的方法，其中，至所述MICB基因基因座的插入为在所述MICB基因的CDS。
219.如权利要求202至217中任一项所述的方法，其中，至所述B2M基因基因座的插入为在所述B2M基因的外显子2或另一CDS。
220.如权利要求202至217中任一项所述的方法，其中，至所述CIITA基因基因座的插入为在所述CIITA基因的外显子3或另一CDS。
221.如权利要求202至217中任一项所述的方法，其中，至所述TRAC基因基因座的插入为在所述TRAC基因的外显子2或另一CDS。
222.如权利要求202至217中任一项所述的方法，其中，至所述TRB基因基因座的插入为在所述TRB基因的CDS。
223.如权利要求194至221中任一项所述的方法，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
224.如权利要求222所述的方法，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的TRAC。
225.如权利要求193至221中任一项所述的方法，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
226.如权利要求224所述的方法，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
227.如权利要求175至225中任一项所述的方法，其中，所述外源性多核苷酸可操作连接到启动子。
228.如权利要求226所述的方法，其中，所述启动子为CAG和/或EF1a启动子。
229.如权利要求175至227中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1天或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1天或更久。
230.如权利要求175至227中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少一周或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少一周或更久。
231.如权利要求175至227中任一项所述的方法，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1个月或更久，在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1个月或更久。
232.如权利要求175至230中任一项所述的方法，其中，在施用所述群细胞后，所述患者呈现无免疫反应。
233.如权利要求231所述的方法，其中，在施用所述群细胞后的所述无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
234.如权利要求232所述的方法，其中，所述患者呈现下述的一者或多者：
a.在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；
b.在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；
c.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的供体特异性IgG抗体；
d.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的IgM和IgG抗体产生；以及
e.在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
235.如权利要求175至233中任一项所述的方法，其中，在施用所述群细胞之前或之后，所述患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
236.如权利要求175至234中任一项所述的方法，其中，所述方法包含给药方案，其包含：
a.包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；
b.恢复期间；以及
c.包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。
237.如权利要求235所述的方法，其中，所述恢复期间包含至少1个月或更久。
238.如权利要求235所述的方法，其中，所述恢复期间包含至少2个月或更久。
239.如权利要求235至237中任一项所述的方法，其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
240.如权利要求235至238中任一项所述的方法，其中，所述低免疫性细胞通过自杀基因或安全开关系统而除去，并且其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
241.如权利要求235至239中任一项的方法，进一步包括施用所述给药方案至少二次。
242.如权利要求175至240中任一项所述的方法，其中，施用所述群细胞用于治疗癌症。
243.如权利要求241所述的方法，其中，所述癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
244.一群低免疫性细胞用于治疗患者的失调的用途，其中，所述低免疫性细胞包含编码CD47的第一外源性多核苷酸、编码CAR的第二外源性多核苷酸以及
(I)下述的一者或多者：
a.降低表达的主要组织相容性复合体(MHC)I和/或II类人白细胞抗原；
b.降低表达的MHC I类和II类人白细胞抗原；
c.降低表达的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类转活化子(CIITA)；和/或
d.降低表达的B2M和CIITA；
其中所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞；
(II)其中：
a.所述患者不为敏感性患者；或
b.所述患者为敏感性患者。
245.如权利要求243所述的用途，其中，所述患者为敏感性患者，并且其中，所述患者对所述一种或多种同种异体抗原或一种或多种自体抗原呈现记忆B细胞和/或记忆T细胞反应。
246.如权利要求244所述的用途，其中，所述一种或多种同种异体抗原包含人白细胞抗原。
247.如权利要求243至245中任一项所述的用途，其中，所述患者为因先前移植物而敏感的敏感性患者，其中：
a.所述先前移植物选自下列所组成的组：细胞移植物、输血、组织移植物和器官移植物，视需要地，所述先前移植物为同种异体移植物；或
b.所述先前移植物为选自下列所组成的组的移植物：人来源的嵌合体、修饰的非人自体细胞、修饰的自体细胞、自体组织和自体器官，视需要地，所述先前移植物为自体移植物。
248.如权利要求243至245中任一项所述的用途，其中，所述患者为因先前怀孕而敏感的敏感性患者，并且其中，所述患者先前曾在怀孕呈现同种异体免疫作用，视需要地，其中，在怀孕的所述同种异体免疫作用为胎儿及新生儿的溶血性疾病(HDFN)、新生儿同种异体免疫嗜中性白细胞减少症(NAN)或胎儿及新生儿同种异体免疫血小板减少症(FNAIT)。
249.如权利要求243至245中任一项所述的用途，其中，所述患者为因病症或疾病的先前治疗而敏感的敏感性患者。
250.如权利要求243至245中任一项所述的用途，其中，所述患者因病症或疾病接受先前治疗，其中，所述先前治疗不包含所述群细胞，并且其中：
a.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗相同的病症或疾病；
b.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现增强的治疗效果；
c.相较于所述先前治疗，所述群细胞对所述患者中所述病症或疾病的治疗呈现较长的治疗效果；所述先前治疗为治疗有效；
d.所述先前治疗为治疗无效；
e.所述患者对所述先前治疗发展出免疫反应；和/或
f.施用所述群细胞用于治疗与所述先前治疗不同的病症或疾病。
251.如权利要求249所述的用途，其中，所述先前治疗包含施用包含自杀基因或安全开关系统的一群治疗细胞，并且回应所述自杀基因或所述安全开关系统的活化，发生所述免疫反应。
252.如权利要求249所述的用途，其中，所述先前治疗包含机械辅助的治疗，视需要地，其中，所述机械辅助的治疗包含血液透析或心室辅助装置。
253.如权利要求243至251中任一项所述的用途，其中，所述患者患有过敏症，视需要地，其中，所述过敏症为选自下列所组成的组的过敏症：枯草热、食物过敏症、昆虫过敏症、药物过敏症和异位性皮肤炎。
254.如权利要求243至252中任一项所述的用途，其中，所述细胞进一步包含一种或多种选自下列所组成的组的外源性多肽：DUX4、CD24、CD46、CD55、CD59、CD200、PD-L1、HLA-E、HLA-G、IDO1、FasL、IL-35、IL-39、CCL21、CCL22、Mfge8、Serpin B9和其组合。
255.如权利要求243至253中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD142。
256.如权利要求243至254中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD46。
257.如权利要求243至255中任一项所述的用途，其中，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，所述细胞进一步包含降低表达量的CD59。
258.如权利要求243至256中任一项所述的用途，其中，所述细胞自干细胞分化。
259.如权利要求257所述的用途，其中，所述干细胞为间质干细胞。
260.如权利要求257所述的用途，其中，所述干细胞为胚胎干细胞。
261.如权利要求257所述的用途，其中，所述干细胞为多能干细胞，视需要地，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞。
262.如权利要求243至260中任一项所述的用途，其中，所述细胞是CAR T细胞或CAR-NK细胞。
263.如权利要求243至261中任一项所述的用途，其中，所述细胞源自原代T细胞。
264.如权利要求262所述的用途，其中，所述细胞是源自包含来自不同于所述患者的一位或多位受试者的原代T细胞的T细胞池。
265.如权利要求243至263中任一项所述的用途，其中，所述CAR的抗原结合结构域结合到CD19、CD22或BCMA。
266.如权利要求264所述的用途，其中，所述CAR为CD19-特异性CAR，使得所述细胞为CD19 CAR T细胞。
267.如权利要求264所述的用途，其中，所述CAR为CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD22 CAR T细胞。
268.如权利要求264所述的用途，其中，所述细胞包含CD19-特异性CAR和CD22-特异性CAR，使得所述细胞为CD19/CD22 CAR T细胞。
269.如权利要求267所述的用途，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由单一双顺反子多核苷酸编码。
270.如权利要求267所述的用途，其中，所述CD19-特异性CAR和所述CD22-特异性CAR由两个单独多核苷酸编码。
271.如权利要求243至269中任一项所述的用途，其中，所述第一和/或第二外源性多核苷酸插入到包含安全港基因座、目标基因座、B2M基因基因座、CIITA基因基因座、TRAC基因基因座或TRB基因基因座的基因组基因座。
272.如权利要求270所述的用途，其中，所述第一和第二基因组基因座相同。
273.如权利要求270所述的用途，其中，所述第一和第二基因组基因座为不同。
274.如权利要求243至272中任一项所述的用途，其中，所述细胞各进一步包含插入到第三基因组基因座的第三外源性多核苷酸。
275.如权利要求273所述的用途，其中，所述第三基因组基因座与所述第一或第二基因组基因座相同。
276.如权利要求273所述的用途，其中，所述第三基因组基因座不同于所述第一和/或第二基因组基因座。
277.如权利要求270至275中任一项所述的用途，其中，所述安全港基因座选自下列所组成的组：CCR5基因基因座、PPP1R12C(也已知为AAVS1)基因和CLYBL基因基因座。
278.如权利要求270至275中任一项所述的用途，其中，所述目标基因座选自下列所组成的组：CXCR4基因基因座、白蛋白基因基因座、SHS231基因座、ROSA26基因基因座、CD142基因基因座、MICA基因基因座、MICB基因基因座、LRP1基因基因座、HMGB1基因基因座、ABO基因基因座、RHD基因基因座、FUT1基因基因座和KDM5D基因基因座。
279.如权利要求276所述的用途，其中，至所述CCR5基因基因座的插入为在所述CCR5基因的外显子1至3、内含子1至2或另一编码序列(CDS)。
280.如权利要求276所述的用途，其中，至所述PPP1R12C基因基因座的插入为所述PPP1R12C基因的内含子1或内含子2。
281.如权利要求276所述的用途，其中，至所述CLYBL基因基因座的插入为所述CLYBL基因的内含子2。
282.如权利要求277所述的用途，其中，至所述ROSA26基因基因座的插入为所述ROSA26基因的内含子1。
283.如权利要求277所述的用途，其中，至所述安全港基因座的插入为SHS231基因座。
284.如权利要求277所述的用途，其中，至所述CD142基因基因座的插入为在所述CD142基因的外显子2或另一CDS。
285.如权利要求277所述的用途，其中，至所述MICA基因基因座的插入为在所述MICA基因的CDS。
286.如权利要求277所述的用途，其中，至所述MICB基因基因座的插入为在所述MICB基因的CDS。
287.如权利要求270至285中任一项所述的用途，其中，至所述B2M基因基因座的插入为在所述B2M基因的外显子2或另一CDS。
288.如权利要求270至285中任一项所述的用途，其中，至所述CIITA基因基因座的插入为在所述CIITA基因的外显子3或另一CDS。
289.如权利要求270至285中任一项所述的用途，其中，至所述TRAC基因基因座的插入为在所述TRAC基因的外显子2或另一CDS。
290.如权利要求270至285中任一项所述的用途，其中，至所述TRB基因基因座的插入为在所述TRB基因的CDS。
291.如权利要求262至289中任一项所述的用途，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
292.如权利要求290所述的用途，其中，源自原代T细胞的所述细胞包含降低表达的TRAC。
293.如权利要求261至289中任一项所述的用途，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的下述的一者或多者：
a.内源性T细胞受体；
b.细胞毒性T-淋巴细胞-相关性蛋白质4(CTLA4)；
c.程序性细胞死亡(PD1)；以及
d.程序性细胞死亡配体1(PD-L1)，其中，所述降低表达是由于修饰并且所述降低表达是相对于不包含所述修饰的相同细胞类型的细胞。
294.如权利要求292所述的用途，其中，所述细胞是源自诱导性多能干细胞的T细胞，其包含降低表达的TRAC和TRB。
295.如权利要求243至293中任一项所述的用途，其中，所述外源性多核苷酸可操作连接到启动子。
296.如权利要求294所述的用途，其中，所述启动子为CAG和/或EF1a启动子。
297.如权利要求243至295中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1天或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1天或更久。
298.如权利要求243至295中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少一周或更久，或在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少一周或更久。
299.如权利要求243至295中任一项所述的用途，其中，所述群细胞在所述患者对一种或多种同种异体抗原敏感之后，施用至少1个月或更久，在所述患者已接受所述同种异体移植物之后，施用至少1个月或更久。
300.如权利要求243至298中任一项所述的用途，其中，在施用所述群细胞后，所述患者呈现无免疫反应。
301.如权利要求299所述的用途，其中，在施用所述群细胞后的所述无免疫反应选自下列所组成的组：无全身性免疫反应、无适应性免疫反应、无先天性免疫反应、无T细胞反应、无B细胞反应和无全身性急性细胞免疫反应。
302.如权利要求300所述的用途，其中，所述患者呈现下述的一者或多者：
a.在施用所述群细胞后，无全身性TH1活化；
b.在施用所述群细胞后，无周边血液单核细胞(PBMC)的免疫活化；
c.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的供体特异性IgG抗体；
d.在施用所述群细胞后，无对抗所述群细胞的IgM和IgG抗体产生；以及
e.在施用所述群细胞后，无所述群细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
303.如权利要求243至301中任一项所述的用途，其中，在施用所述群细胞之前或之后，所述患者未被施用免疫抑制剂至少3天或更久。
304.如权利要求243至302中任一项所述的用途，其中，所述方法包含给药方案，其包含：
a.包含治疗有效量的所述群细胞的第一施用；
b.恢复期间；以及
c.包含治疗有效量的所述群细胞的第二施用。
305.如权利要求303所述的用途，其中，所述恢复期间包含至少1个月或更久。
306.如权利要求303所述的用途，其中，所述恢复期间包含至少2个月或更久。
307.如权利要求303至305中任一项所述的用途，其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
308.如权利要求303至306中任一项所述的用途，其中，所述低免疫性细胞通过自杀基因或安全开关系统而除去，并且其中，当来自所述第一施用的所述细胞不再能在所述患者中检测到时，开始所述第二施用。
309.如权利要求303至307中任一项所述的用途，进一步包含施用所述给药方案至少二次。
310.如权利要求243至308中任一项所述的用途，其中，施用所述群细胞用于治疗癌症。
311.如权利要求309所述的用途，其中，所述癌症选自下列所组成的组：B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰脏癌症、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性骨髓性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰脏腺癌、神经胶质母细胞瘤、神经胚细胞瘤、肺脏鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
312.如权利要求97或249所述的用途或如权利要求181所述的方法，其中，所述先前治疗包含同种异体CAR-T细胞为主的疗法或自体CAR-T细胞为主的疗法，其中，所述自体CAR-T细胞为主的疗法选自下列所组成的组：布卡巴吉奥仑赛、西卡思罗、艾卡巴吉维赛、利基迈仑赛马拉赛、替沙津鲁、来自Cartesian Therapeutics的Descartes-08或Descartes-11、来自Novartis的CTL110、来自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、来自Autolus Limited的AUTO4、来自Cellectis的UCARTCS、来自Precision Biosciences的PBCAR19B或PBCAR269A、来自Fate Therapeutics的FT819和来自Clyad Oncology的CYAD-211。
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