CN116496408A - 白细胞介素21及其受体复合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种包含白细胞介素21及其受体的二硫键改造多肽复合物。IL‑21和IL‑21Rα之间具有一个形成于IL‑21的第一突变残基和IL‑21Rα的第二突变残基之间的非天然的链间键，从而可以增强白细胞介素21及其受体复合物的稳定性。

Description

白细胞介素21及其受体复合物

优先权声明

本申请要求申请号为202210077607.4，申请日为2022年1月21日，发明名称为白细胞介素21及其受体复合物的中国发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种包含白细胞介素21及其受体的二硫键改造多肽复合物，以及其作为治疗剂特别是作为癌症等疾病治疗剂的用途。

背景技术

细胞因子在人体免疫调节中起重要作用，同时也参与肿瘤的免疫调控，与肿瘤的发生、发展密切相关。在免疫疗法中，细胞因子可直接作用于肿瘤微环境中的免疫效应细胞，增强肿瘤抑制效果。通过临床研究以及动物实验，许多细胞因子已被证明具有显著的抗肿瘤活性，已有多个细胞因子获得FDA批准上市。

白细胞介素21(IL-21)，于2000年被发现，属于四个小α螺旋束细胞因子家族(Small fourα-helix bundle family of cytokines)中的成员，主要由CD4+T细胞和NKT细胞分泌，它是一种有效的T细胞和自然杀伤细胞介导的抗肿瘤免疫刺激剂。

IL-21约含有162个氨基酸(aa)，形成一个14kDa的四螺旋束。IL-21与IL-21受体(IL-21R)结合，IL-21R是由普通γ链(CD132或γc)和特异性γ链组成的异二聚体复合物IL-21受体链(IL-21Rα或CD360)。IL-21Rα是一种跨膜糖蛋白75kDa，胞浆内6个酪氨酸残基，对IL-21信号传导至关重要。

近年来，IL-21及IL-21受体更多地用于构建融合蛋白，以改善其体内半衰期短，重复给药时剂量不好控制等问题，为了提高融合蛋白的稳定性，特提出本申请。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决IL-21及IL-21Rα在构建各种类型的融合蛋白时存在的体内外稳定性差、半衰期短、产品均一性差、或制备工艺复杂的问题。

本发明涉及一种IL-21及IL-21Rα的多肽复合物，其由第一多肽和第二多肽组成；其中，第一多肽为人IL-21多肽或其功能性片段；第二多肽为人IL-21Rα多肽或其功能性片段；第一多肽或第二多肽上具有一个或多个氨基酸位点突变成Cys，与对应的第二多肽或第一多肽氨基酸位点上突变成的Cys配对形成二硫键。

在本发明的一些具体实施方式中，上述的氨基酸Cys突变位点发生在IL-21多肽或其功能片段上的S4、S5、R10、I13、R14、Q17、I71、R81或K82上，和/或所述的氨基酸Cys突变位点发生在IL-21Rα多肽或其功能性片段上的Y36、E38、A71、D72、S92、或A127上。

在本发明的一些具体实施方式中，上述IL-21及IL-21Rα的多肽复合物的氨基酸位点突变选自以下突变组合中的一组或多组：1)第一多肽-R81C和第二多肽-E38C；2)第一多肽-Q17C和第二多肽-A71C；3)第一多肽-R14C和第二多肽-D72C；4)第一多肽-S5C和第二多肽-S92C；5)第一多肽-S4C和第二多肽-S92C；6)第一多肽-R10C和第二多肽-D72C；7)第一多肽-I13C和第二多肽-D72C；8)第一多肽-I71C和第二多肽-A127C；和/或9)第一多肽-K82C和第二多肽-Y36C。

在本发明的一些具体实施方式中，上述IL-21及IL-21Rα的多肽复合物中的第一多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：4的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：6的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：8的第140位-352位氨基酸、SEQID NO：10的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：12的第140位-352位氨基酸、SEQ IDNO：14的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：16的第140位-352位氨基酸、或SEQ ID NO：18的第140位-352位氨基酸。

在本发明的一些具体实施方式中，上述IL-21及IL-21Rα的多肽复合物中的第二多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1的第129位-266位氨基酸、SEQ ID NO：3的第129位-266位氨基酸、SEQ ID NO：5的第129位-266位氨基酸、SEQ ID NO：7的第129位-266位氨基酸、SEQID NO：15的第129位-266位氨基酸、或SEQ ID NO：17的第129位-266位氨基酸。

在本发明的一些具体实施方式中，上述IL-21及IL-21Rα的多肽复合物的第一多肽和/或第二多肽与Fc片段共价连接。

本发明还涉及含有如上所述的核酸的载体。

本发明还涉及含有如上所述的核酸或者如上所述的载体的宿主细胞。

本发明还涉及制备上述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物的方法，包括：1)用如上所述的载体转化宿主细胞；2)培养所转化的宿主细胞；3)收集宿主细胞中表达的IL-21及IL-21Rα多肽复合物。

本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物、如上所述的的核酸、如上所述的载体、或如上所述的宿主细胞和药学上可接受的载体，赋形剂，或稳定剂。

本发明还涉及如上所述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用。

本发明还涉及一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括：向患者施予如前所述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物或如前所述的药物组合物。

在本发明的一些具体实施方式中，上述的疾病可以为传染病、癌症、血液病和自身免疫性疾病。上述的癌症优选黑色素瘤、结直肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、肾细胞癌、实体瘤、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌；上述的传染病优选天花病毒感染、HIV感染、细菌感染、真菌感染、HBV感染；上述的血液病优选贫血、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、T-细胞大颗粒淋巴细胞性白血病；上述的自身免疫性疾病优选多发性硬化症、银屑病、风湿性关节炎、炎性疾病、胃炎、黏膜炎。

在本发明的一些具体实施方式中，上述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物或药物组合物可以单独使用，也可以与其它药物联合使用。上述其它药物为小分子抑制剂或抗体类药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施方式，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为IL-21/IL-21Rα复合物相互作用立体结构示意图；

图2为示例性的IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白结构示意图；

图3为示例性的IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白具体应用场景结构示意图；

图4为经二硫键改造的IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白凝胶电泳检测结果；

图5为经二硫键改造的与未改造的IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白对靶向区结合力(@TIGIT)的检测结果。

图6为经二硫键改造的与未改造达到IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白对靶向区结合力(@PD-L1)的检测结果。

图7为经二硫键改造的与未改造的IL-21/IL-21Rα复合物融合蛋白对与靶向区结合力(@TIGIT)的阻断检测结果。

具体实施方式

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

在本发明中，术语“氨基酸(amino acid)”是指二十个常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝胺酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

本发明所述的“多肽复合物”是指两个不同的单体多肽结合而成的蛋白。

本发明所述的“融合蛋白”是指，通过用基因重组方法、化学方法或其它适当方法将两个或多个基因的编码区连接，在同一调控序列控制下表达基因重组所得的蛋白质产物。在本发明的一些实施方案中，第一多肽为IL-21或其变体与生物活性多肽(如Fc片段)融合或非融合表达得到的单体蛋白质；第二多肽为IL-21Rα或其变体与生物活性多肽(如Fc片段)融合或非融合表达得到的单体蛋白质。本发明的融合蛋白中，两个或多个基因的编码区之间可由编码肽接头的序列于一个或数个位置融合。肽接头也可用于构建本发明的融合蛋白。

本发明所述的“连接肽(Linker)”在本发明中用于连接IL-21或IL-21Rα与Fc变体，以保证蛋白的正确折叠和稳定性的肽。本发明的“连接肽”优选为(GGGGS)nS，其中n可以为0、1、2、3、4、5或者更多，优选n为2-4。

本发明所述的“IL-21或功能性片段”可以是任何物种的IL-21(白细胞介素21)或其突变体，如人IL-21或非人哺乳动物IL-21或非哺乳动物IL-21。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选为人的IL-21或其功能性片段。人野生型白细胞介素21成熟分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，本发明IL-21所有氨基酸位点的编号以SEQ ID NO：9为基准，从N端至C端的顺序编号。

HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSC FQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEF LERFKSLLQKMIHQHLSS RTHGSEDS(SEQID NO：9)

本发明所述的“IL-21功能性片段”指通过一个或多个氨基酸替换、增加或者缺失突变获得的对IL-21生物功能有影响或其他性质发生改变的突变体，通过这类氨基酸变化可以增加或者降低IL-21与其受体之间的相互作用能力；或者通过这类氨基酸变化可以增加或者降低IL-21生物学活性比如其刺激免疫细胞增殖活性；或者通过这类氨基酸变化在IL-21和其受体之间建立共价键或者使共价连接更加稳定等。

本发明所述的“IL-21Rα或其功能性片段”可以是任何物种的IL-21Rα或者其突变体，如人IL-21Rα或非人哺乳动物IL-21Rα或非哺乳动物IL-21Rα。示例性非人哺乳动物如猪、兔、猴、猩猩、鼠等，非哺乳动物如鸡等。优选人的IL-21Rα，更优选的是人的IL-21Rα胞外区部分，简称IL-21Rα(SEQ ID NO：11)。本发明IL-21Rα所有氨基酸位点的编号以SEQ IDNO：11为基准，从N端至C端的顺序编号。

CPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPSTLTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADDIFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSDYEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPLEFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKE(SEQ IDNO：11)

本发明所述的“IL-21Rα功能性片段”，即通过一个或多个氨基酸替换、插入或者缺失突变所得的具有人白细胞介素21受体α活性的分子。

本发明所述的“Fc片段”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2以及不同的基因型。

本发明所述的“Fc片段”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区。更优选包括IgG1的一个CH2结构域，一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。本发明中的Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：13)

本发明所述的“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，以及其它组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，以及表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养过程中所用的培养基可选自各种常规培养基。宿主细胞在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。

实施例

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见分子克隆，实验室手册，当代分子生物学方法。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1突变体的选择

选择IL-21和IL-21Rα的晶体复合物结构(PDB ID:3TGX，图1)为初始结构。从结构上统计出位于IL-21和IL-21Rα的接触界面残基，IL-21及IL-21Rα复合物中接触界面残基如下表1所示。

表1IL-21及IL-21Rα复合物中接触界面残基

除了从以上接触界面筛选外，发明人尝试从更广的范围内筛选能够形成稳定二硫键的组合，通过大量筛选找出了IL-21上的S4、S5、I71和IL-21Rα上的S92、A127，经过多次优选，示例性地优选出9对突变残基，突变组合如下表2所示。

表2 IL-21和IL-21Rα复合物的突变组合

组合	IL-21	IL-21Rα
			1	R81C	E38C
2	Q17C	A71C
			3	R14C	D72C
4	S5C	S92C
			5	S4C	S92C
6	R10C	D72C
			7	I13C	D72C
8	I71C	A127C
			9	K82C	Y36C

实施例2 IL-21及IL-21受体复合物/融合蛋白的构建

本发明提供的IL-21及IL-21Rα复合物由第一多肽和第二多肽组成；其中，第一多肽为人IL-21多肽或其功能性片段；第二多肽为人IL-21Rα多肽或其功能性片段；第一多肽或第二多肽上具有一个或多个氨基酸位点突变成Cys，与对应的第二多肽或第一多肽氨基酸位点上突变成的Cys配对形成二硫键。

本发明通过基因工程方法构建稳定的、有明显抗肿瘤活性的、体内半衰期延长的蛋白复合物，且该复合物分子内包含IL-21或其衍生物和IL-21Rα或其衍生物的Fc融合蛋白分子。

人野生型白细胞介素21成熟分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，本发明IL-21所有氨基酸位点以SEQ ID NO：9氨基端顺序为基准。

HKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ IDNO：9)

人的IL-21Rα胞外区部分，简称IL-21Rα，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。本发明IL-21Rα所有氨基酸位点以SEQ ID NO：11氨基端顺序为基准。

CPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPSTLTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADDIFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSDYEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPLEFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKE(SEQ IDNO：11)

示例性的选取一种IL-21/IL-21Rα复合物的使用场景：靶向抗原的重链可变区(VH)通过Linker连接在IL-21Rα上，再通过Hinge(其氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示)与抗体的Fc的N端连接；靶向相同抗原的轻链可变区(VL)通过Linker(其氨基酸序列如SEQ IDNO：24所示)连接在IL-21上，制备一种具有靶向性的IL-21/IL-21Rα融合蛋白。示例性的复合物1～9的重链和轻链的氨基酸序列如下表3所示，其中，突变后的Cys用下划线并加粗进行标识。本实施例的Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

EPKSSDKTHTCPPCPAP(SEQ ID NO：21)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：24)

ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：13)

表3.示例性的复合物的重链和轻链的氨基酸序列

上述融合蛋白可应用于靶向同一抗原或靶点的分子，例如图3B或图3C(所述scfv靶向相同抗原或靶点)的结构，也可用于靶向2个或多个抗原或靶点分子，例如图3A或图3C(所述scfv靶向不同抗原或靶点)，本融合蛋白的应用场景不限于以上举例。

示例性的选取一种IL-21/IL-21Rα复合物的使用场景：以图3A为例制备融合蛋白，一侧为靶向TIGIT的抗体，另一侧为靶向PD-L1的抗体，靶向PD-L1的抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示。

靶向PD-L1的抗体的轻链氨基酸序列：

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPDQSPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO：19)

靶向PD-L1的抗体的重链氨基酸序列：

EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSITSGYWNWIRKPPGKGLEYMGYISYTGSTYQNPSLKSRITFSRDTSKNQYYLKLSSVTAADTATYYCARSRAWIRTYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：20)

实施例3复合物/融合蛋白样品的制备

蛋白瞬转表达

将含有目的基因的质粒通过与转染试剂PEI形成阳离子复合物后，导入到宿主细胞Expi293，质粒在细胞内期间，质粒上的外源基因在细胞内发生转录翻译，从而得到目的蛋白。

Expi293细胞在37℃、8％二氧化碳、130rpm条件培养，并在转染前通过细胞计数，将2E6的细胞接种至1L摇瓶中，培养体系约为300mL。配制转染复合物准备转染：首先将750μg目标质粒加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中，轻轻混匀，标记为A管；将1.5mg转染试剂PEI加入到含有15mL Opti-MEM试剂的50mL离心管中，轻轻混匀后，室温孵育5min，标记为B管；将B管PEI稀释液逐滴加入到A管DNA稀释液中，轻轻混匀后，室温孵育15min，孵育结束后，将PEI-目标质粒复合物加入到Expi293细胞，置于37℃摇床中继续培养。直到D7-D10后收样。

复合物样品的纯化

瞬转细胞表达液经过9000rpm/20min离心，收集上清，再经过0.22μm滤膜除菌过滤。采用ProA亲和层析进行纯化，过程如下：使用AKTAavant150层析设备，用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)平衡层析柱(如MabSelectSuRe LX，GE)，加载样品至层析柱，使目标蛋白吸附在层析柱上而其他杂质穿透分离。完成上样后使用至少5CV平衡缓冲液(10mM PBS)再次冲洗层析柱，随后使用洗脱缓冲液(20mM NaAc，pH＝3.4)洗脱目标蛋白，收集管中预先加入中和缓冲液(1M Tris，pH＝8.0)，中和缓冲液的加入体积根据洗脱样品的预估含量而定，一般加入10％洗脱体积量。

实施例4经二硫键改造的IL-21/IL-21Rα复合物/融合蛋白凝胶电泳检测

对二硫键改造的IL-21/IL-21Rα复合物进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图4所示，未进行二硫键改造的复合物(复合物10)在分子量25KD～35KD之间有条带，说明存在游离轻链；复合物1～复合物9在分子量25KD～35KD之间无条带，说明二硫键改造成功。

实施例5靶向部分亲和力检测

TIGIT端结合活性分析

通过FCM实验方法检测双抗分子(TIGIT端)与CHO-TIGIT细胞(表达TIGIT蛋白的CHO细胞)结合活性。配置3％BSA缓冲液：称取4.5g BSA到150mL 1X PBS中，混匀后放置冰上备用；抗体稀释：将受试抗体、阳性对照用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照稀释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL，3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个点；结合活性检测；细胞计数并铺板：将CHO-TIGIT细胞计数后，按100μL,2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8℃孵育0.5h；350xg离心5min后，去掉上清，按200μL/孔加入3％BSA；350xg离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc(1:500x稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8℃孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350xg离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1X PBS，重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程上机检测，检测结果见图5，与未进行二硫键改造的分子相比亲和力相当，说明二硫键改造未减弱靶向区的亲和力。

PD-L1端结合活性分析

通过FCM实验方法检测双抗分子(PD-L1端)与CHO-PD-L1细胞结合活性。配置3％BSA缓冲液：称取4.5gBSA到150mL 1XPBS中，混匀后放置冰上备用；抗体稀释：将受试抗体、阳性对照R1123(即复合物10，未经二硫键改造，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示)用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照稀释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL，3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个点；结合活性检测；细胞计数并铺板：将CHO-PD-L1细胞计数后，按100μL，2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8℃孵育0.5h；350xg离心5min后，去掉上清，按200μL/孔3％BSA；350xg离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PEGoat anti-mouse IgG Fc(1:500x稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8℃孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350xg离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1XPBS重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程上机检测。

阳性对照R1123的重链的氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGMIRPSDSETRLNQMFKDRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGIHDYGHGAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGCPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPSTLTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADDIFSVQITDQSGQYSQECGSFLLAESIKPAPPFDVTVTFSGQYQISWRSDYEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPLEFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKEEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：22)

阳性对照R1123的轻链的氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAASHLPDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPRTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO：23)

检测结果见图6，与未进行二硫键改造的分子相比亲和力相当，说明二硫键改造不会影响靶向区的亲和力。

TIGIT端阻断活性分析

通过FCM实验方法检测双抗分子(TIGIT端)阻断配体与CHO-TIGIT细胞结合活性。配置3％BSA缓冲液：称取4.5gBSA到150mL 1XPBS中，混匀后放置冰上备用；抗体稀释：将受试抗体、阳性对照(R1123，未经二硫键改造)用3％BSA稀释成初始浓度为800nM，亚型对照稀释成初始浓度为20μg/mL，体积300μL，3倍梯度稀释(100μL+200μL)共10个点；结合活性检测；细胞计数并铺板：将CHO-TIGIT细胞计数后，按100μL,2E+05/孔分到96孔V型板中；先将不同浓度抗体50μL加入到细胞中，2-8℃孵育0.5h，再加入50μL配体，2-8℃孵育0.5h；350xg离心5min后，去掉上清，按200μL/孔3％BSA；350xg离心5min后，去掉上清，3％BSA配制荧光抗体PE Goat anti-human IgG Fc和PE Goat anti-mouse IgG Fc(1:500x稀释)，按100μL/孔加入对应的96孔板中，2-8℃孵育30min；350g离心5min，去上清，3％BSA洗一遍细胞；350xg离心5min后，去掉上清，按100μL/孔加入1XPBS重悬细胞；按照CytoFLEX流式细胞仪标准操作规程上机检测。检测结果见图7，与未进行二硫键改造的分子相比亲和力相当，说明二硫键改造未减弱靶向区的亲和力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种IL-21及IL-21Rα的多肽复合物，其特征在于，其由第一多肽和第二多肽组成；其中，第一多肽为人IL-21多肽或其功能性片段；第二多肽为人IL-21Rα多肽或其功能性片段；

优选地，第一多肽或第二多肽上具有一个或多个氨基酸位点突变成Cys，与对应的第二多肽或第一多肽氨基酸位点上突变成的Cys配对形成二硫键；

其中所述的氨基酸Cys突变位点发生在IL-21多肽或其功能片段上的S4、S5、R10、I13、R14、Q17、I71、R81或K82上和/或所述的氨基酸Cys突变位点发生在IL-21Rα多肽或其功能性片段上的Y36、E38、A71、D72、S92、或A127上。

2.根据权利要求1所述多肽复合物，其特征在于，所述氨基酸位点突变选自以下突变组合中的一组或多组：

1)第一多肽-R81C和第二多肽-E38C；

2)第一多肽-Q17C和第二多肽-A71C；

3)第一多肽-R14C和第二多肽-D72C；

4)第一多肽-S5C和第二多肽-S92C；

5)第一多肽-S4C和第二多肽-S92C；

6)第一多肽-R10C和第二多肽-D72C；

7)第一多肽-I13C和第二多肽-D72C；

8)第一多肽-I71C和第二多肽-A127C；和/或

9)第一多肽-K82C和第二多肽-Y36C。

3.根据权利要求1～2任一项所述多肽复合物，其特征在于，所述第一多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2的第140位-352位氨基酸、SEQ IDNO：4的第140位-352位氨基酸、SEQ IDNO：6的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：8的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：10的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：12的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：14的第140位-352位氨基酸、SEQ ID NO：16的第140位-352位氨基酸、或SEQ ID NO：18的第140位-352位氨基酸。

4.根据权利要求1～3任一项所述多肽复合物，其特征在于，所述第二多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1的第129位-266位氨基酸、SEQ IDNO：3的第129位-266位氨基酸、SEQ IDNO：5的第129位-266位氨基酸、SEQ ID NO：7的第129位-266位氨基酸、SEQ ID NO：15的第129位-266位氨基酸、或SEQ ID NO：17的第129位-266位氨基酸。

5.根据权利要求1～4任一项所述多肽复合物，其特征在于，所述的第一多肽和/或第二多肽与Fc片段共价连接。

6.分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～5任一项所述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物。

7.载体，其特征在于，所述载体含有权利要求6所述的核酸。

8.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述核酸或者权利要求7所述载体。

9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～5任一项所述的IL-21及IL-21Rα的多肽复合物，和药学上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂。

10.权利要求1～5任一项所述的IL-21及IL-21Rα多肽复合物、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述载体、或权利要求8所述宿主细胞在制备用于治疗疾病的药物中的应用。