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CN116396884A - 鼠李糖乳杆菌和一种抑制幽门螺杆菌的组合物 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌和一种抑制幽门螺杆菌的组合物 Download PDF

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CN116396884A
CN116396884A CN202210974828.1A CN202210974828A CN116396884A CN 116396884 A CN116396884 A CN 116396884A CN 202210974828 A CN202210974828 A CN 202210974828A CN 116396884 A CN116396884 A CN 116396884A
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lactobacillus
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王伯韬
杜晶
张华月
崔树茂
翟齐啸
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Bloomage Biotech Co Ltd
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Jiangsu Huaxiyineng Biotechnology Co ltd
Bloomage Biotech Co Ltd
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Abstract

本申请公开了一株鼠李糖乳杆菌和包括鼠李糖乳杆菌和抑制幽门螺杆菌的组合物，组合物中还包括透明质酸或其盐，该组合物可以显著降低胃内幽门螺旋杆菌定植率，缓解H.pylori感染的炎症反应和胃肠道症状(GSRS评分)，提高H.pylori患者的转阴率和有效率，提高患者肠道有益菌的丰度，改善患者的胃肠道健康。

Description

鼠李糖乳杆菌和一种抑制幽门螺杆菌的组合物
技术领域
本申请涉及食品、保健品技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌和一种抑制幽门螺杆菌的组合物。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种微需氧性、螺旋状的革兰阴性杆菌。H.pylorii可以通过黏附素在胃粘膜上黏附与定植，侵入人体的防御系统，利用本身毒素的直接作用以及诱导炎症反应的间接作用从而造成胃炎等消化系统疾病以及缺血性心脑血管疾病、脑出血等非消化系统疾病。更关键的是，H.pylori感染可触发Correa级联反应，使胃内病变由非萎缩性胃炎发展为萎缩性胃炎、肠上皮化生等，严重者进一步发展为胃癌。由于H.pylori具有不可自愈性和高危性等特征，所以H.pylori被国际癌症研究机构认为是I类致癌原。在出现感染症状的患者中，抗生素治疗是一种可能的治疗方法。但是随着全球抗生素耐药性的上升以及其他不良反应的频频出现，H.pylori的根除率持续减少。
近年来，人们主要在探索一些非抗生素物质抗H.pylori的新方法，如益生菌、益生元、植物提取物、生物活性蛋白、多糖等，以期改善原有的治疗方案并提供新的有效的治疗方法。其中，益生菌因其良好的生物安全性、耐受恶劣的胃肠道环境和拮抗H.pylori效果而被广泛研究。当前研究较多的抗H.pylori的益生菌株主要包括罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和双歧杆菌等。益生菌在胃肠道疾病的补充预防方面发挥了重要作用，可作为辅助疗法最大限度地减少抗生素的使用及其副作用，加强黏膜的屏障作用，减少炎症反应，改善患者在治疗过程中的临床症状和依从性，直接或者间接提高了H.pylori的根除率，对H.pylori及相关疾病的防治具有重要意义。
专利CN108741090A公开了一种含有益生元、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的抑制H.pylori的复合益生菌食品，可用于预防H.pylori感染。专利WO2021/238890A1公开了一株抑制H.pylori的鼠李糖乳杆菌，其H.pylori清除率为61.54％。专利WO2004/031368公开了一株用于治疗或者预防与H.pylori相关炎症的罗伊氏乳杆菌，专利WO2013027087A1公开了一株不产生罗伊氏素、但能够抑制H.pylori体外生长的罗伊氏乳杆菌，专利CN102174450A涉及一种耐酸性、对H.pylori生长和尿素酶活性有抑制作用、对小鼠感染H.pylori具有预防或减轻感染程度的作用植物乳杆菌，专利WO2020/083983A1公开了可协同抗生素杀灭H.pylori的嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌，但均未报道H.pylori清除率。
发明内容
中国专利ZL2020113384895为本申请人前期的研究成果，公开了包含透明质酸及其盐的组合物用于抗H.pylori消化道感染活性，其中的分子量范围为800-2000kDa，优选1000-2000kDa，主要采用动物实验用于功效验证，包含HA对小鼠胃内H.pylori定植量等的影响，但未涉及H.pylori清除率。
现有技术中，未有关于透明质酸协同益生菌抗H.pylori的研究，且抗幽益生菌和透明质酸主要通过体外抑菌试验进行筛选验证，较少通过动物实验或者人体实验进行抗幽功效验证，缺乏相关H.pylori定植率和清除率数据，基于此，本申请提出透明质酸与益生菌进行组合，并通过动物和人体实验进行抗幽功效验证。
具体的，本申请采用如下技术方案
1、一株鼠李糖乳杆菌，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO.62419。
2、如项1所述的鼠李糖乳杆菌，其16s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3、如项1所述的鼠李糖乳杆菌，其用于抑制幽门螺杆菌。
4、一种抑制幽门螺杆菌的组合物，包括透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌。
5、根据项4所述的组合物，所述透明质酸的盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐中的任意一种或两种以上。
6、根据项4或5所述的组合物，所述透明质酸或其盐的平均分子量为1200-2000kDa，优选为1400-1800kDa。
7、根据项4-6中任一项所述的组合物，所述组合物能够提供≥80mg/天/人的透明质酸或其盐，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×109cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
优选地，所述组合物能够提供≥100mg/天/人的透明质酸或其盐，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×1010cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
8、根据项4-7中任一项所述的组合物，还包括辅料，优选，所述辅料为菊粉、低聚半乳糖，低聚异麦芽糖或麦芽糊精的一种或者两种以上。
9、根据项4-8中任一项所述的组合物，所述组合物的剂型可以为丸剂、颗粒剂、粉剂、片剂、胶囊剂或乳剂。
10、根据项4-9中任一项所述的组合物，所述鼠李糖乳杆菌为权利要求1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌。
11、项1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌，项4-10中任一项所述的组合物在制备抑制幽门螺旋杆菌食品或保健品中的应用。
12、鼠李糖乳杆菌和透明质酸或其盐共同用于制备抑制幽门螺杆菌食品或保健品的用途。
13、根据项12所述的用途，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥80mg/天/人，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×109cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌，
优选地，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥100mg/天/人，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×1010cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
14、根据项12或13所述的用途，所述透明质酸的盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐中的任意一种或两种以上。
15、根据项12-14中任一项所述的用途，所述透明质酸或其盐的平均分子量为1200-2000kDa，优选为1400-1800kDa。
16、根据项11-15中任一项所述的用途，所述鼠李糖乳杆菌为项1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌。
发明效果
1、本申请提供的透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌组合物经口服之后，胃内幽门螺旋杆菌定植率可以显著下降到正常水平，H.pylori感染引起的胃粘膜炎症反应和受试者的胃肠道症状(GSRS评分)均得到显著改善，H.pylori患者的转阴率和有效率分别可以达到70.59％和82.35％，且肠道有益菌群丰度增加，有利于改善患者胃肠道健康。
2、本申请提供的透明质酸及鼠李糖乳杆菌组合物，对于H.pylori易感人群的预防、防止已根除H.pylori患者的复发，及无临床症状H.pylori感染患者的治疗等提供了新的有效的治疗方法。
3、本申请提供的一种协同抑制H.pylori的透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌组合物，可以显著降低胃内幽门螺旋杆菌定植率，缓解H.pylori感染的炎症反应和胃肠道症状(GSRS评分)，提高H.pylori患者的转阴率和有效率，提高患者肠道有益菌的丰度，改善患者的胃肠道健康。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为不同处理对小鼠胃内H.Pylori定植量的影响；其中，图中的*表示干预组vs模型组有显著差异(p<0.05)；**表示干预组vs模型组有显著差异(p<0.01)；***表示干预组vs模型组有极显著差异(p<0.001)；&表示HA组、CCFM1259组vs复配组有显著差异(p<0.05)；##表示空白组vs模型组有显著差异(p<0.01)；
图2A、图2B、图2C、图2D、图2E为小鼠胃粘膜HE染色结果(200×)(图2A：空白组；图2B模型组；图2C：HA组；图2D：CCFM1259组；图2E：HA+CCFM1259复配组)；
图3为不同分子量HA与鼠李糖乳杆菌的复配对小鼠胃内H.Pylori定殖量的影响；其中，图中的*表示干预组vs模型组有显著差异(p<0.05)；**表示干预组vs模型组有显著差异(p<0.01)；***表示干预组vs模型组有极显著差异(p<0.001)；##表示空白组vs模型组有显著差异(p<0.01)；
图4为各组干预后GSRS的变化情况(*表示与干预前相比有显著差异性；p<0.05)；
图5A和图5B受试者肠道菌群门水平(图5A)和属水平(图5B)结果。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请提供了一株鼠李糖乳杆菌，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.62419，保藏地址为广州先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510070，保藏时间为2022年5月17日。
术语“鼠李糖乳杆菌”(Lactobacillus rhamnosus)符合本领域内的一般定义，简称是LGG，其从属乳杆菌属，是人体的正常菌群之一，存在于人体的口腔、肠道中，主要是在肠道内。鼠李糖乳杆菌是一种厌氧、耐酸、不产芽孢的一种益生菌，其革兰染色为紫色，故也是革兰氏阳性菌。鼠李糖乳杆菌的主要作用包括增强胃肠道黏膜屏障、调节机体免疫力、拮抗致病菌、助消化降血脂和护肝作用，是一种无毒、无副作用的益生菌，其功能特性主要有调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、毒素的排出和提升机体免疫力。
本申请所提供的鼠李糖乳杆菌接种在MRS固体平板上，37℃条件下恒温培养48h，菌落呈圆形，边缘较整齐，表面光滑有凸起，质地均匀，呈乳白色。
所述鼠李糖乳杆菌的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1：CTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAACTCGTTCGACTGCATGTATAG
本申请提供的鼠李糖乳杆菌可以用于抑制幽门螺杆菌。
本申请进一步提供了一种抑制幽门螺杆菌的组合物，包括透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌。
所述鼠李糖乳杆菌的活菌数不低于1×109CFU/g或1×109CFU/ml，进一步优选的，所述鼠李糖乳杆菌的活菌数不低于1×1010CFU/g或1×1010CFU/ml，所述鼠李糖乳杆菌的活菌数不低于1×1011CFU/g或1×1011CFU/ml。
术语“透明质酸”符合本领域内的一般定义，是指由成线性连接的重复单元N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸组成的生物聚合物材料，又名玻尿酸、玻璃酸，是一种酸性粘多糖，其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要功能。所述透明质酸或其盐用于包括透明质酸本身、其盐或其组合。透明质酸盐的实例包括但不限于：无机盐，诸如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸铋、透明质酸钴；以及有机盐，诸如透明质酸四丁铵。在本申请中，可以单独使用透明质酸本身或其盐，或者可以使用两种或更多种透明质酸或其盐的组合。例如可以包含一种透明质酸盐、两种透明质酸盐、三种透明质酸盐、四种透明质酸盐、五种透明质酸盐、六种透明质酸盐；所述盐的种类选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐和铋盐。
本申请中所述透明质酸或其盐不受限制，在一个优选的实施方式中，所述透明质酸盐为透明质酸水溶性盐，进一步优选为透明质酸钠、透明质酸锌、透明质酸镁或透明质酸钾中的任意一种。在一个具体的实施方式中，所述透明质酸盐为透明质酸钠。
在一种优选的实施方式中，所述透明质酸钠的平均分子量为1200-2000kDa，例如可以为1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa，优选为1400-1800kDa。
在一种优选的实施方式中，本申请提供的抗幽门螺杆菌的组合物中，所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×109cfu/天/人，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计，如果所述人的体重不为60kg，可按照此标准进行换算。
在一种优选的实施方式中，本申请提供的抗幽门螺杆菌的组合物中，所述透明质酸或其盐用量≥80mg/天/人，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
在一种优选的实施方式中，本申请提供的抗幽门螺杆菌的组合物中，所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×1010cfu/天/人，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
在一种优选的实施方式中，本申请提供的抗幽门螺杆菌的组合物中，所述透明质酸或其盐用量≥100mg/天/人，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
一种优选的实施方式中，所述组合物还包括辅料，本申请所述辅料可以是适当的溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
进一步优选的实施方式中，所述辅料为菊粉、低聚半乳糖，低聚异麦芽糖或麦芽糊精的一种或者两种以上。
本申请的组合物可以通过通用方法来制备，其中可加入一种或多种稀释剂或载体，例如，呈口服形式，例如丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。
本申请进一步提供了鼠李糖乳杆菌和透明质酸或其盐共同用于制备抑制幽门螺杆菌食品或保健品的用途。
所述共同用于可以是鼠李糖乳杆菌和透明质酸或其盐混合在一起使用，也可以是鼠李糖乳杆菌和透明质酸或其盐其中的一个为A剂，另一个为B剂，先使用A再使用B，或先使用B或再使用A，也可以同时使用A和B。
一种优选的实施方式中，在所述用途中，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥80mg/天/人，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
一种优选的实施方式中，在所述用途中，所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×109cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
一种优选的实施方式中，在所述用途中，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥100mg/天/人的透明质酸或其盐，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。
一种优选的实施方式中，在所述用途中，所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×1010cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌，本领域人员应该理解，通常情况下，人的体重以60kg计。一种优选的实施方式中，所述透明质酸的盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐中的任意一种或两种以上。
一种优选的实施方式中，所述透明质酸或其盐的平均分子量为1200-2000kDa，例如可以为1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa，优选为1400-1800kDa。
本申请提供的鼠李糖乳杆菌CCFM1259，其对幽门螺杆菌具有良好的抑制作用，其抑菌效果要强于其他菌株，例如副干酪乳杆菌TY-O1和植物乳杆菌SN-L3。其中，CCFM1259比另外两株菌的抑菌圈分别大0.76mm和1.67mm，也要优于其他鼠李糖乳杆菌，如鼠李糖乳杆菌TY-O4、鼠李糖乳杆菌FB-O1等，同时，本申请提供的鼠李糖乳杆菌CCFM1259具有较好的降低H.pylori粘附率的作用，优于副干酪乳杆菌TY-O1和植物乳杆菌SN-L3，CCFM1259比另外两株菌的粘附率分别低4.86和8.08个百分点，其粘附率也低于其他鼠李糖乳杆菌，如鼠李糖乳杆菌TY-O4、鼠李糖乳杆菌FB-O1等。
本申请提供的抑制幽门螺杆菌的包括透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌菌粉的组合物，使用透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌菌粉进行复配，其在降低H.Pylori定植量上具有更好的效果，要优于单独的透明质酸或其盐和单独的鼠李糖乳杆菌的效果，从本申请的实验数据可知，与单独的透明质酸或其盐和单独的鼠李糖乳杆菌相比本申请的组合物效果具有显著差异(p<0.05)，说明本申请的组合物在降低H.Pylori定植量上具有协同增效作用。
本申请提供的抑制幽门螺杆菌的包括透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌菌粉的组合物，对胃部病理具有更好的的改善，与单独的透明质酸或其盐和单独的鼠李糖乳杆菌相比，本申请的组合物处理后小鼠胃粘膜改善效果更加显著，基本没有炎症细胞浸润情况。进一步证明了本申请的组合物在拮抗H.Pylori感染引起的炎症反应有协同增效作用。
进一步的，对本申请组合物的抗幽门螺旋杆菌的效果进行了临床试验，通过对受试者服用安慰剂和本申请提供的透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌菌粉的组合物，复配组与安慰剂组相比，转阴率和有效率分别增长了125.88％和119.60％。安慰剂组在干预前后，胃肠道不良症状没有显著改变(p＞0.05)；但在组合物干预后，受试者胃肠道症状均得到了显著改善(GSRS评分，p<0.05)，受试者转阴率和有效率也得到倍数提升，说明组合物在拮抗胃部H.pylori感染具有显著效果。除此之外，本申请的组合物还兼具改善肠道菌群组成及多样性的作用，减少肠道致病菌占比，提高有益菌乳杆菌属及双歧杆菌属的丰度，有利于维护患者的肠胃道健康。
实施例
动物实验安排：
1)使用动物来源
4周龄、雄性、C57BL/6小鼠。
2)拟用饲养设施信息
江苏省血吸虫病防治研究所。
3)透明质酸钠(HA)来源
华熙生物科技股份有限公司，食品级透明质酸钠及相关产品。
4)益生菌来源
鼠李糖乳杆菌CCFM1259，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO.62419。
5)实验动物麻醉和处死方法
最后一次灌胃后，禁食24h，采用浓度为1％的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，使其麻醉后进行小鼠眼球取血，最后辅以颈椎脱臼法使其死亡，立即解剖取出胃，沿胃大弯剪开，取完整的胃组织(包括胃窦、胃体等)，一半用于病理学切片检测，另一半进行幽门定植、免疫因子等相关指标检测。
实施例1拮抗H.pylori乳杆菌株的筛选
(1)实验材料及使用方法
幽门螺杆菌为来源于NTCC国家典型培养物保藏中心的幽门螺杆菌H.pylori SS；H.pylori使用时，用接种环蘸取少量保菌管中菌液，在哥伦比亚血平板上(含7.5％的无菌脱纤维绵羊血)划线，置于37℃的三气培养箱中(85％N2，10％CO2，5％O2)培养3天，挑取平板表面的单菌落接种于液体BHI培养基中(含5％的胎牛血清)培养4天，再以2％的接种量接于新鲜的BHI培养基中培养4天后备用。
人胃腺癌细胞(AGS)购买自中国科学院上海细胞库；AGS细胞使用时，以含10％DMSO的胎牛血清重悬，梯度降温后冻存于液氮中保存。AGS细胞使用时，培养皿中加入10mL含5％胎牛血清的F-12培养基，将冻存管离心弃上清后，加入培养基重悬，倒入培养皿中使其均匀分散，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。当细胞长满单层时以1传3的比例进行传代，传代两次后的细胞待用。
乳杆菌来源于发酵食品、乳制品或人的唾液和粪便中分离得到。乳杆菌使用时，先在MRS平板上划线，37℃培养两天，挑取单菌落接种于MRS液体管种培养18h，以2％的接种量接于新鲜的MRS培养基培养18h后备用。
(2)乳杆菌对H.pylori生长抑菌效果的测定：将活化两代的H.pylori菌悬液浓度调整为1*108CFU/mL，取100μL均匀涂布在哥伦比亚血平板上，待培养基表面干燥后放上并轻压牛津杯，加入150μL乳杆菌菌悬液(1*108CFU/mL)，同时设置空白对照(pH6.2的MRS液体培养基100μL)，置于4℃扩散4h。扩散结束后，正置在三气培养箱中培养72h，观测抑菌结果并使用游标卡尺测量抑菌圈直径。
(3)乳杆菌对H.pylori粘附AGS细胞抑制能力的测定：AGS细胞接种于96孔板中(2×104个/孔)过夜培养，待细胞处于贴壁状态后用PBS洗涤3次去除死细胞，然后以感染复数(Multiplicity of infection，MOI)100加入F-12培养基(不含血清)重悬的H.pylori和乳杆菌分别共培养2h，再用PBS洗涤3次去除未粘附的乳杆菌和H.pylori，最后加入200μL尿素酶试剂(0.9％NaCl，14μg/mL苯酚红，20mmol/L尿素，pH6.8)培养3h，测定550nm波长的吸光值。
表1不同乳杆菌抑菌效果和粘附率的比较
Figure SMS_1
Figure SMS_2
注：*代表数值＞15.00mm；#代表数值＜80.00％。
(4)乳杆菌对H.pylori生长的抑菌效果
实验以30株乳杆菌为出发菌株，如表1所示，通过比较对H.pylori的抑菌圈大小，得到30株菌的抑菌圈在8.27-17.51mm之间，其中有6株菌对H.pylori的抑菌圈大于15mm，抑菌效果较其他菌株强。将6株菌株编号按照抑菌圈大小排序分别为：CCFM1259、FB-O1、NJ-F3、TY-O1、SN-L3和TY-O4。
(5)乳杆菌对H.pylori粘附AGS细胞的抑制效果
实验比较了30株乳杆菌对H.pylori粘附AGS细胞的抑制效果，如表1所示，结果显示不同乳杆菌降低H.pylori粘附效果的能力差异较大，经过不同乳杆菌处理之后，Hpylori的粘附率在66.53％-113.36％之间，其中有5株菌对应的H.pylori的粘附率小于80％。按照对H.pylori粘附率抑制能力的大小排序，5株菌的菌株编号分别为：FB-A3、CCFM1259、FB-O2、TY-O1和SN-L3。
(6)拮抗H.pylori乳杆菌株的选择
综合考虑乳杆菌抑制H.pylori生长的能力和抑制H.pylori粘附AGS细胞的能力，有3株菌在抑制H.pylori生长的同时具有较好的降低粘附率的作用，按照抑制粘附率大小的能力排序分别为：鼠李糖乳杆菌CCFM1259、副干酪乳杆菌TY-O1和植物乳杆菌SN-L3。其中，CCFM1259比另外两株菌的抑菌圈分别大0.76mm和1.67mm，粘附率分别低4.86和8.08个百分点。因此，实验优选鼠李糖乳杆菌CCFM1259作为拮抗H.pylori的乳杆菌株。
实施例2HA与鼠李糖乳杆菌复配抗幽门螺旋杆菌动物功效评价
若干C57BL/6小鼠正常喂养一周后，再随机分为5组(n＝10)：空白组，模型组，干预组。干预组分别用HA(本次采用平均分子量为1400kDa的HA)、鼠李糖乳杆菌CCFM1259(1*109CFU/mL)和两者复配品进行第一次灌胃，间隔1小时后灌胃BHI重悬的H.pylori(1*109CFU/mL)。而空白组、模型组小鼠第一次灌胃时灌胃等量的PBS，间隔1小时后灌胃等量BHI。实验小鼠隔天灌胃一次。定期测定实验小鼠的体重变化；实验结束后测定小鼠胃内幽门定植量、血清中抗幽门抗体和细胞因子(IL-8和TNF-α)水平，并进行胃窦、胃体的组织病理切片。小鼠给予正常饮水和标准饲料。
实验动物具体处理方案如表2所示。
表2实验动物处理方案1(n＝10)
Figure SMS_3
注：BHI为脑心浸出肉汤培养基。每天第一次与第二次灌胃间隔一小时。
HA组：透明质酸钠的量按照200mg/天/人计(人以60kg计)，换算成小鼠推荐剂量：9.1*200mg/60kg＝30mg/kg(小鼠以20g计)，按照灌胃量0.2mL算，透明质酸钠溶液浓度为3g/L。
HA+CCFM1259组：透明质酸钠和鼠李糖乳杆菌与HA组和CCFM1259组相比用量减半。
(1)实验过程中小鼠体重变化
由表3可知，实验过程中小鼠体重均保持在20g左右，各组之间小鼠体重无显著差异性，各组组间干预前后小鼠体重变化也不明显，即H.Pylori感染和复配组方干预并不会对小鼠体重有显著影响。
表3实验过程各组小鼠体重变化情况1(Mean±SD)
组别 0周体重/g 1周体重/g 2周体重/g
空白组 18.22±1.52 19.67±1.57 21.06±1.73
模型组 18.50±0.74 19.80±1.25 21.52±1.38
HA组 18.67±0.46 20.18±1.01 21.29±1.97
CCFM1259组 18.48±0.66 19.87±1.12 21.43±1.25
复配组 18.59±0.30 20.09±0.93 21.40±1.44
(2)不同处理对H.Pylori定植量的影响
H.Pylori在小鼠胃内定植量的变化情况是反映干预组方对H.Pylori感染作用效果最直接的指标。由图1可知：模型组小鼠胃内H.Pylori含量约为空白组的236倍，模型组H.Pylori定植量显著升高(p<0.01)，说明造模成功。经过HA(p<0.01)、鼠李糖乳杆菌CCFM1259(p<0.05)及复配组方(p<0.001)处理后，感染小鼠胃内H.Pylori定植量发生显著下降；与模型组相比，H.Pylori定殖量Log值的均值分别约下降了34.75％、29.33％和52.64％。除此之外，复配组显著优于HA组和CCFM1259组的效果(p<0.05)，与HA组和CCFM1259组相比，复配组H.Pylori定殖量Log值的均值分别下降了27.41％和32.97％。综上说明复配组方比单独使用HA和鼠李糖乳杆菌CCFM1259干预效果更加明显，鼠李糖乳杆菌CCFM1259与HA在降低H.Pylori定植量上具有协同增效作用。
(3)不同处理对胃部病理的改善情况
不同处理组小鼠胃粘膜HE染色后结果如图2所示，感染H.Pylori后小鼠胃粘膜固有层炎症细胞(淋巴细胞和嗜酸性粒细胞)浸润显著性增多(图2B)，经过HA组(图2C)、鼠李糖乳杆菌CCFM1259组(图2D)及复配组方(图4)处理后，H.Pylori感染引起的炎症反应有明显改善。与HA组(图2C)和鼠李糖乳杆菌CCFM1259组(图2D)相比，复配组方(图2E)处理后小鼠胃粘膜改善效果更加显著，基本没有炎症细胞浸润情况。进一步证明了鼠李糖乳杆菌CCFM1259与HA在拮抗H.Pylori感染引起的炎症反应有协同增效作用。
由本实施例结果可知，HA、鼠李糖乳杆菌CCFM1259及复配组方均能显著降低小鼠胃内H.Pylori定植量，并对H.Pylori感染引起的炎症反应有明显改善。复配组方比单独HA和单独益生菌在降低H.Pylori定植量和小鼠胃粘膜改善方面效果更加显著，小鼠胃粘膜固有层基本没有炎症细胞浸润情况，说明鼠李糖乳杆菌CCFM1259与HA在拮抗H.Pylori感染引起的炎症反应及降低小鼠胃内H.Pylori定植量方面有协同增效作用。
实施例3不同分子量HA与鼠李糖乳杆菌复配对幽门螺旋杆菌体内感染的效果评价
若干C57BL/6小鼠正常喂养一周后，再随机分为7组(n＝10)：空白组，模型组，干预组。干预组分别用平均分子量为1200kDa、1400kDa、1600kDa、1800和2000kDa的HA与鼠李糖乳杆菌CCFM1259(1*109CFU/mL)的照体积比为1:1混匀复配为组合物进行第一次灌胃，间隔1小时后灌胃BHI重悬的H.pylori(1*109CFU/mL)。而空白组、模型组小鼠第一次灌胃时灌胃等量的PBS，间隔1小时后灌胃等量BHI。实验小鼠隔天灌胃一次。定期测定实验小鼠的体重变化；实验结束后测定小鼠胃内幽门定植量。小鼠给予正常饮水和标准饲料。
实验动物具体处理方案如表4所示。
表4实验动物处理方案2(n＝10)
Figure SMS_4
Figure SMS_5
注：BHI为脑心浸出肉汤培养基。每天第一次与第二次灌胃间隔一小时。
透明质酸钠按照200mg/天/人(人以60kg计)，换算成小鼠推荐剂量：9.1*200mg/60kg＝30mg/kg(小鼠以20g计)，按照灌胃量0.2mL算，透明质酸钠溶液浓度为3g/L。
HA与鼠李糖乳杆菌按照1:1复配后，HA浓度为1.5g/L，鼠李糖乳杆菌浓度为5*108CFU/mL。
(1)实验过程中小鼠存活率和体重变化
由表5可知，实验过程中小鼠体重均保持在20g左右，各组之间小鼠体重无显著差异性，各组组间干预前后小鼠体重变化也不明显，即H.Pylori感染和复配组方干预并不会对小鼠体重有显著影响。
表5实验过程各组小鼠体重变化情况(Mean±SD)
Figure SMS_6
Figure SMS_7
(2)不同分子量HA与鼠李糖乳杆菌复配对H.Pylori定殖量的影响
由图3可知：与空白组相比，模型组H.Pylori定殖量显著升高(p<0.01)，均值约是空白组的155倍，说明造模成功。经过平均分子量为1200kDa、1400kDa、1600kDa、1800kDa和2000kDa的HA与鼠李糖乳杆菌CCFM1259复配处理后，可以显著降低小鼠胃内H.Pylori定殖量(p<0.05)；与模型组相比，H.Pylori定殖量Log值的均值分别下降了31.93％、47.83％、53.92％、49.16％和34.76％。尤其是平均分子量为1400kDa、1600kDa和1800kDa的HA与鼠李糖乳杆菌CCFM1259复配后，胃内H.Pylori定殖量发生极显著下降(p<0.001)，效果与空白组接近。
由本实施例结果可知，H Pylori感染的小鼠经灌胃平均分子量为1400-1800kDa的HA与鼠李糖乳杆菌CCFM1259的复配品后，与模型组相比，能显著降低胃内H.Pylori定植量(p<0.01)，且H.Pylori定殖量Log值的均值可以下降47.83％-53.92％，效果比1200kDa和2000kDa的HA复配品更加显著，接近正常水平。
实施例4透明质酸-鼠李糖乳杆菌组合物抗幽门螺旋杆菌临床试验功效评价
4.1研究人群
临床研究招募了40名幽门螺杆菌感染的阳性患者(28-65岁，男女各一半)。诊断标准为通过14C呼气试验、快速尿素酶试验或组织学检查。要求志愿者既往未进行抗幽门治疗，且在纳入研究前一个月未服用抗生素或益生菌产品；未进行过肠胃道手术；实验过程严格按照要求服用产品，且不能服用抗生素或其他益生菌产品。
4.2临床研究设计
(1)实验产品
实验产品中益生菌复配产品、透明质酸产品和安慰剂产品均为食品级产品，均可直接服用或温水(不超过37℃)冲服服用，由江南大学食品学院食品生物技术中心提供，所有产品均为粉末，外观、包装均相同。
A：HA-益生菌复配产品：①鼠李糖乳杆菌冻干菌粉(1×1011CFU/g菌粉)50mg/条；②平均分子量1600kDa透明质酸钠100mg/条；③菊粉300mg/条；④低聚半乳糖150mg/条；⑤低聚异麦芽糖80mg/条；⑥麦芽糊精1320mg/条。
B：安慰剂产品：①菊粉300mg/条；②低聚半乳糖150mg/条；③低聚异麦芽糖80mg/条；④麦芽糊精1470mg/条。
(2)实验设计与受试者分组
实验设计为双盲型、平行类随机对照试验。
40名受试者招募完毕后进行分组。通过计算机软件产生随机数字序列将40名幽门螺杆菌感染患者随机分为2组，即安慰剂组和透明质酸-益生菌复配组，每组20人。每组每天服用两次菌粉(安慰剂组和复配组除成分不同外，产品的外观和包装均相同，无明显差别)。
(3)研究周期
由于益生菌发挥其生理特性需要一定的时间，因此研究周期为10周。包括实验预备期2周，益生菌服用期4周，后续观察期4周。
(4)指标测定
14C呼气检测、量表指标(GSRS表)、肠道菌群分布。
4.3临床试验结果
(1)临床受试者基本信息
表6入组受试者基本信息
组别 人数(人) 性别(男/女) 年龄
安慰剂 16 5/11 48.69±16.87
复配组 17 6/11 43.24±12.73
临床实验共招募了40名符合要求的H.pylori阳性患者，其中，中途退出加失访7名，表6显示2组入组人群性别、年龄等基本信息，2组受试者基线情况无显著性差异。
(2)不同干预方式对受试者14C呼气值的影响
测定14C呼气值可以表征患者H.pylori的感染情况。表7和表8的实验结果显示，摄入复配组方后，幽门螺杆菌患者的转阴率和有效率分别达到70.59％和82.35％，与安慰剂组相比，转阴率和有效率分别增长了125.88％和119.60％。
表7复配组方对受试者H.pylori转阴率的影响
组别 N 阴性n 阳性n 转阴率％
安慰剂 16 5 11 31.25
复配组 17 12 5 70.59
表8复配组方对受试者抗幽有效率的影响
组别 N 有效n 无效n 有效率％
安慰剂 16 6 10 37.50
复配组 17 14 3 82.35
(3)不同干预方式对受试者胃肠道症状的影响
GSRS是临床患者胃肠症状严重程度和频率的重要指标，评分越低则症状越轻。受试者分别于实验开始前1天与结束后1天填写。根据图4统计结果显示，安慰剂组在干预前后，胃肠道不良症状没有显著改变(p＞0.05)；但在进行HA-益生菌复配组干预后，受试者胃肠道症状均得到了显著改善(p<0.05)。
(4)不同干预方式对受试者肠道菌群组成及多样性的影响
与安慰剂组相比，经过HA-益生菌复配组方干预后，受试者肠道菌群组成发生变化。
门水平分析：
如图5A所示，肠道菌群主要由厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门以及变形菌门等组成。与安慰剂组相比，复配组人群的粪便肠道菌群中放线菌门比例增加。
属水平分析：
进一步，对两组人群粪便肠道菌群进行属水平分析，结果如图5B所示，与安慰剂组相比，复配组降低了链球菌属、瘤胃球菌属、条件致病菌埃希氏菌-志贺氏菌属等菌群的丰度，提高了有益菌群丰度，如乳杆菌属、双歧杆菌属。
由上述实施例结果可知，通过HA与鼠李糖乳杆菌的益生元组合物干预之后，受试者的胃肠道症状均得到显著改善(GSRS评分，p<0.05)，患者转阴率和有效率也得到倍数提升，说明本申请的组合物在拮抗胃部H.pylori感染具有显著效果。复配品干预之后，H.pylori患者的转阴率和有效率分别达到70.59％和82.35％，是安慰剂组的2.126倍和2.120倍。除此之外，复配组还兼具改善肠道菌群组成及多样性的作用，减少肠道致病菌占比，提高有益菌乳杆菌属及双歧杆菌属的丰度，有利于维护患者的肠胃道健康。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO.62419。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其16s rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其用于抑制幽门螺杆菌。
4.一种抑制幽门螺杆菌的组合物，包括透明质酸或其盐和鼠李糖乳杆菌。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物能够提供≥80mg/天/人的透明质酸或其盐，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×109cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
优选地，所述组合物能够提供≥100mg/天/人的透明质酸或其盐，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的活菌数≥1×1010cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌为权利要求1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌。
7.权利要求1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌，权利要求4-6中任一项所述的组合物在制备抑制幽门螺旋杆菌食品或保健品中的应用。
8.鼠李糖乳杆菌和透明质酸或其盐共同用于制备抑制幽门螺杆菌食品或保健品的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥80mg/天/人，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×109cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌，
优选地，所述透明质酸或其盐的使用剂量为≥100mg/天/人，或者；
所述鼠李糖乳杆菌的使用剂量为活菌数≥1×1010cfu/天/人的鼠李糖乳杆菌。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌为权利要求1-3中任一项所述的鼠李糖乳杆菌。
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