CN116375889B

CN116375889B - 狂犬病病毒糖蛋白抗原、截短体及其应用

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Publication number: CN116375889B
Application number: CN202310640411.6A
Authority: CN
Inventors: 张琼林; 巩玉洁; 赵荣茂; 段博芳; 盛有鑫; 杨晓霞; 赵方圆; 袁婷婷; 陈娟; 相德才; 曾邦权
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2023-06-01
Filing date: 2023-06-01
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2043-06-01
Also published as: CN116375889A

Abstract

本发明公开了一种狂犬病病毒糖蛋白抗原、截短体及其应用。如下M1）所示的蛋白质：M1）狂犬病病毒糖蛋白自N端起第20‑69位氨基酸残基和狂犬病病毒糖蛋白自N端起第210‑415位氨基酸残基连接形成，所述狂犬病病毒糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明根据已有的蛋白质三维结构，对狂犬病病毒糖蛋白与抗体的结构进行了分析，选择与抗体直接相互作用的稳定性较好的抗原片段，使用真核昆虫表达系统进行表达，该蛋白经过免疫学实验验证，可以很好地结合抗体，该截短体蛋白抗原与抗体的亲和力强，可用于制备高敏感性的诊断试剂盒。

Description

狂犬病病毒糖蛋白抗原、截短体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种狂犬病病毒糖蛋白抗原、截短体及其应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）引起的人畜共患急性传染病，属于乙类传染病和二类动物疫病。狂犬病病毒是一种单链RNA病毒，属于弹状病毒科狂犬病病毒属，外形呈子弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面有包膜。狂犬病病毒在野生哺乳动物中广泛传播，肉食性哺乳动物是其天然宿主，宠物犬和猫是人类和家畜发生狂犬病的主要传染源。

狂犬病病毒主要攻击人类和动物的神经系统，发病后缺乏有效治疗方法，病死率接近100%，目前有效的防治手段主要是接种狂犬疫苗和注射抗狂犬病病毒血清。发达国家由于宠物强制免疫，由宠物传染人类的病例较少，主要关注野生动物的传染。

宠物接种狂犬疫苗是保护宠物和人类，防治狂犬病的有效方法。狂犬病病毒疫苗常用灭活/减毒病毒或假病毒作为抗原。免疫后检测宠物血液中蛋白抗体的水平，能确定动物对病毒株的抵抗力。对宠物的狂犬病病毒抗体水平的日常监测是选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握健康状态的重要手段，也是适时注射疫苗的主要依据。目前针对狂犬病病毒抗体水平的诊断试剂参差不齐，建立一种快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法势在必行。

狂犬病病毒的主要抗原包括病毒外膜上的糖蛋白（G）抗原和内层的核蛋白（N）抗原。糖蛋白G能与人类和动物神经系统中乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，可以使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用。核蛋白N可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，但是不具有保护作用。因此选择检测抗体的抗原蛋白时，已有的研究和专利常用病毒颗粒、单独糖蛋白G或者串联的糖蛋白G和核蛋白N。糖蛋白G由于C端有跨膜区，膜蛋白表达纯化成本很高，因此通常选择截短体蛋白使用。

结构生物学的发展使得科学家可以更直观的观察病毒抗原蛋白与抗体的相互作用。目前狂犬病病毒糖蛋白G和核蛋白N的结构均已公开发表，中国、美国和英国的团队分别发表了狂犬病病毒糖蛋白G与单克隆抗体轻链、重链可变区的复合物结构，为深入理解糖蛋白G与单克隆抗体的结合提供了重要支持。世界动物卫生组织（OIE）中提到，病毒中和试验（VN）和酶联免疫吸附试验（ELISA）是狂犬病监测接种疫苗动物抗体反应的推荐方法。开展VN方法需要使用活的狂犬病病毒和Vero细胞，敏感性和特异性好，但由于狂犬病病毒为高致病性病原微生物，实验室操作风险高，常作为验证性试验，不适用于临床大规模检测。

综上所述，现有的检测方法存在着各种缺陷，亟待通过免疫学原理、基因工程技术等手段，筛选出合适的狂犬病病毒抗原、抗体，使得可采用ELISA包被板为载体发生反应，快速、简便、可批量检测，更适用于临床检测。

发明内容

为此，本发明实施例提供狂犬病病毒糖蛋白抗原、截短体及其应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

本发明提供如下M1）所示的蛋白质：M1）狂犬病病毒糖蛋白自N端起第20-69位氨基酸残基和狂犬病病毒糖蛋白自N端起第210-415位氨基酸残基连接形成；

所述狂犬病病毒糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种蛋白质或截短体，所述截短体为如下（1）-（4）中任一所示：

（1）氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

（2）在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

（3）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

（4）与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供上述所述蛋白质或其截短体的编码基因。

本发明的一个实施例中，上述所述蛋白质或截短体的编码基因为如下1）-3）任一所示：

1）SEQ ID No.4所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述M1）所述蛋白质或上述所述截短体的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有95%以上的同一性且编码上述M1）所述蛋白质或上述所述截短体的DNA分子。

本发明还提供下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

（a1）含有上述所述编码基因的表达盒；

（a2）含有上述所述编码基因的重组载体；

（a3）含有上述所述编码基因的重组菌；

（a4）含有上述所述编码基因的转基因细胞系。

本发明还提供上述所述的蛋白质或其截短体和/或上述所述编码基因和/或上述所述的生物材料在制备免疫原和/或抗原中的应用，或，所述免疫原或抗原是针对狂犬病病毒或狂犬病病毒糖蛋白的。

本发明还提供所述的蛋白质和/或上述所述的蛋白质或其截短体和/或上述所述编码基因和/或上述所述的生物材料作为抗原在制备针对狂犬病病毒抗体中的应用；

或，上述所述的蛋白质或其截短体和/或上述所述编码基因和/或上述所述的生物材料在制备预防和/或治疗狂犬病病毒引起的疾病的产品中的应用；

或，上述所述的蛋白质或其截短体和/或上述所述编码基因和/或上述所述的生物材料在预防和/或治疗狂犬病病毒引起的疾病中的应用。

本发明还提供所述的蛋白质或其截短体和/或上述所述编码基因和/或上述所述的生物材料在如下（b1）-（b6）任一种中的应用：

（b1）抑制病毒感染；

（b2）抑制病毒感染的产品；

（b3）抑制病毒入侵；

（b4）抑制病毒入侵的产品；

（b5）检测病毒抗体；

（b6）检测病毒抗体的产品；

所述病毒为狂犬病病毒。

本发明还提供一种产品，其活性成分为上述所述的蛋白质或上述所述的蛋白质或其截短体；

所述产品的功能为如下（c1）-（c3）：

（c1）抑制病毒感染的药物或疫苗；

（c2）抑制病毒入侵的药物或疫苗；

（c3）检测病毒抗体的试剂；

所述病毒为狂犬病病毒。

本发明最后还提供一种多抗，是以上述所述的蛋白质或上述所述的蛋白质或其截短体为免疫原制备得到的。

本发明实施例具有如下优点：

本发明根据已有的狂犬病病毒糖蛋白的蛋白质三维结构，对狂犬病病毒糖蛋白与抗体的结构进行了分析，选择与抗体直接相互作用的稳定性较好的抗原片段，使用真核昆虫表达系统进行表达，获得狂犬病病毒糖蛋白截短体蛋白。经过免疫学实验验证，该截短体蛋白抗原可以很好地结合抗体，与抗体的亲和力强，可用于制备高敏感性的诊断试剂盒，以及建立高敏感性的诊断方法。该截短体抗原相比已有常用抗原，稳定性更好，表达量更高，成本更低，检测抗体水平的特异性和灵敏度都更好。所制备的Elisa抗体检测试剂盒和抗体检测试纸条效果好，成本更低，特异性和稳定性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的狂犬病病毒糖蛋白G的蛋白序列比对结果；

图2为本发明实施例提供的狂犬病病毒糖蛋白G三聚体结合抗体的结构（PDB编号7U9G）；

图3为本发明实施例提供的一个角度的狂犬病病毒糖蛋白G单体结合抗体的结构（PDB编号7U9G）；

图4为发明实施例提供的另一个角度的狂犬病病毒糖蛋白G单体结合抗体的结构（PDB编号7U9G）；

图5为本发明实施例提供的狂犬病病毒糖蛋白G截短体表达纯化后电泳结果图；

图6为本发明实施例制备的检测试纸条的特异性血清检测结果；

图7为本发明实施例制备的检测试纸条的敏感性血清检测结果。

图中：11-第二变区结构；12-第一结构域；13-第二结构域；14-第一变区结构。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，pFast-Bac1购自Thermo公司，经人工改造加入标签后获得pFastBac-6p-1；DH10Bac工程菌购自北京擎科生物科技股份有限公司；Sf9细胞购自Thermo公司；合成截短体基因序列公司：武汉金开瑞生物工程有限公司。

实施例1、狂犬病病毒糖蛋白G序列比对及结构分析

本实施例狂犬病病毒糖蛋白G的序列参考美国生物技术信息中心NCBI的NP_056796.1氨基酸序列，共524位氨基酸残基，包括信号肽1-19位氨基酸残基和跨膜区459-476位氨基酸残基，全长对应的核苷酸序列为NC_001542.1，1575bp。将该蛋白质序列在NCBIBlast功能中与蛋白结构数据库PDB中数据进行对比，结果如图1所示，目前已有多个已解析的狂犬病病毒糖蛋白G的结构，其中有4个与该序列全长相似度极高，接近或大约90%，其中7U9G结构A链更是与该序列100%一样，覆盖524位氨基酸残基中的439个，为该序列的蛋白三维结构。

已发表的狂犬病病毒糖蛋白G的三聚体结构如图2所示，狂犬病病毒糖蛋白G的三聚体共有3个糖蛋白G的多肽链和6条抗体轻链/重链的多肽链。选择一个糖蛋白G单体进行分析，不同角度如图3和图4所示，第一结构域12和第二结构域13为糖蛋白G单体的两个结构域，第一变区结构14为抗体轻链可变区结构，第二变区结构11为抗体重链可变区结构。

由图3和图4可知，狂犬病病毒糖蛋白G的第一结构域12为20-69aa和210-415aa能够与抗体的轻链和重链直接相互作用，结构中包含了结合抗体的直接相互作用面，69位和210位氨基酸残基距离也很近。第二结构域13为70-209aa，与抗体距离较远，根据图2分析，推测可能与稳定三聚体结构有关。

除了7U9G结构以外，还分析了其他狂犬病病毒糖蛋白G与抗体的复合物结构，8A1E结构中，与抗体直接相互作用的第一结构域包含20-69aa和209-418aa；6LGW结构中，与抗体直接结合的第一结构域包含20-50aa和281-414aa，对比这三个狂犬病病毒糖蛋白G的复合物结构，结合抗体的结构域基本是一致的。

通过对三个狂犬病病毒糖蛋白G的复合物结构分析，本发明选择使用柔性的无规则卷曲序列GGGGSGGGGS将狂犬病病毒糖蛋白G自N端的20-69位氨基酸残基和自N端的210-415位氨基酸残基连接起来，作为一个新的抗原进行表达纯化。

狂犬病病毒糖蛋白G全长氨基酸序列（SEQ ID No.1）：

MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPGGNCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLVSSVIPLMHPLADPSTVFKNGDEAEDFVEVHLPDVHERISGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCWRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESYKSGGETGL。

狂犬病病毒糖蛋白G全长核苷酸序列（SEQ ID No.3）：

ATGGTTCCGCAGGCCCTGCTGTTTGTTCCGCTGCTGGTGTTTCCGCTGTGTTTTGGTAAATTTCCGATTTATACCATCCCGGATAAACTGGGCCCGTGGAGCCCGATTGATATTCATCATCTGAGTTGTCCGAATAATCTGGTTGTGGAAGATGAAGGCTGCACCAATCTGAGTGGTTTTAGTTATATGGAACTGAAAGTTGGCTATATTAGTGCAATTAAAATGAACGGCTTCACCTGTACCGGCGTGGTGACCGAAGCCGAAACCTATACCAATTTTGTTGGTTATGTGACCACCACCTTTAAACGCAAACATTTTCGTCCGACCCCGGATGCATGTCGTGCAGCCTATAATTGGAAAATGGCAGGCGATCCGCGCTATGAAGAAAGCCTGCATAATCCGTATCCGGATTATCATTGGCTGCGTACCGTGAAAACCACCAAAGAAAGTCTGGTTATTATTAGCCCGAGTGTTGCCGATCTGGACCCTTATGATCGTAGCCTGCATAGTCGCGTGTTTCCGGGCGGTAATTGTAGCGGTGTGGCCGTTAGCAGCACCTATTGCAGCACCAATCATGATTATACCATTTGGATGCCGGAAAATCCGCGCCTGGGCATGAGTTGTGATATTTTTACCAATAGTCGCGGTAAACGTGCCAGCAAAGGCAGTGAAACCTGCGGTTTTGTGGATGAACGTGGTCTGTATAAAAGCCTGAAAGGCGCCTGTAAACTGAAACTGTGTGGTGTGCTGGGTCTGCGTCTGATGGATGGCACCTGGGTGGCCATGCAGACCAGTAATGAAACCAAATGGTGTCCGCCGGGCCAGCTGGTGAATCTGCATGATTTTCGCAGCGATGAAATTGAACATCTGGTTGTGGAGGAACTGGTGAAAAAACGCGAAGAATGTCTGGATGCACTGGAAAGCATTATGACCACCAAAAGCGTTAGTTTTCGTCGTCTGAGCCATCTGCGCAAACTGGTGCCGGGCTTTGGTAAAGCCTATACCATTTTTAATAAGACCCTGATGGAAGCAGATGCACATTATAAAAGCGTTCGCACCTGGAATGAAATTATTCCGAGCAAAGGCTGCCTGCGCGTGGGTGGTCGTTGTCATCCGCATGTGAATGGTGTGTTTTTTAATGGCATTATTCTGGGTCCGGATGGCAATGTTCTGATTCCGGAAATGCAGAGTAGTCTGCTGCAGCAGCATATGGAACTGCTGGTTAGTAGTGTGATTCCGCTGATGCATCCGCTGGCCGATCCGAGCACCGTTTTTAAAAATGGTGATGAAGCAGAAGATTTCGTGGAAGTTCATCTGCCGGATGTTCATGAACGCATTAGCGGTGTGGATCTGGGTCTGCCGAATTGGGGTAAATATGTGCTGCTGAGCGCAGGTGCACTGACCGCACTGATGCTGATTATTTTTCTGATGACCTGCTGGCGCCGTGTGAATCGTAGCGAACCGACCCAGCATAATCTGCGCGGTACCGGCCGCGAAGTTAGTGTTACCCCGCAGAGCGGCAAAATTATTAGTAGCTGGGAAAGTTATAAGAGCGGTGGTGAAACCGGTCTGTAA。

狂犬病病毒糖蛋白G 20-69aa+210-415aa截短体氨基酸序列（下划线为连接的无规则卷曲）（SEQ ID No.2）：

KFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYGGGGSGGGGSIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLVSSVIPLM。

编码狂犬病病毒糖蛋白G 20-69aa+210-415aa截短体蛋白的核苷酸序列（SEQ IDNo.4）：（下划线为连接的无规则卷曲）：

AAATTTCCGATTTATACCATCCCGGATAAACTGGGCCCGTGGAGCCCGATTGATATTCATCATCTGAGTTGTCCGAATAATCTGGTTGTGGAAGATGAAGGCTGCACCAATCTGAGTGGTTTTAGTTATATGGAACTGAAAGTTGGCTATGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCATTTTTACCAATAGTCGCGGTAAACGTGCCAGCAAAGGCAGTGAAACCTGCGGTTTTGTGGATGAACGTGGTCTGTATAAAAGCCTGAAAGGCGCCTGTAAACTGAAACTGTGTGGTGTGCTGGGTCTGCGTCTGATGGATGGCACCTGGGTGGCCATGCAGACCAGTAATGAAACCAAATGGTGTCCGCCGGGCCAGCTGGTGAATCTGCATGATTTTCGCAGCGATGAAATTGAACATCTGGTTGTGGAGGAACTGGTGAAAAAACGCGAAGAATGTCTGGATGCACTGGAAAGCATTATGACCACCAAAAGCGTTAGTTTTCGTCGTCTGAGCCATCTGCGCAAACTGGTGCCGGGCTTTGGTAAAGCCTATACCATTTTTAATAAGACCCTGATGGAAGCAGATGCACATTATAAAAGCGTTCGCACCTGGAATGAAATTATTCCGAGCAAAGGCTGCCTGCGCGTGGGTGGTCGTTGTCATCCGCATGTGAATGGTGTGTTTTTTAATGGCATTATTCTGGGTCCGGATGGCAATGTTCTGATTCCGGAAATGCAGAGTAGTCTGCTGCAGCAGCATATGGAACTGCTGGTTAGTAGTGTGATTCCGCTGATG。

实施例2、狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白的表达、纯化和抗原活性验证

根据实施例1结构预测的结果，选择狂犬病病毒糖蛋白G的第20-69位氨基酸残基和210-415位氨基酸残基通过柔性无规则卷曲GGGGSGGGGS连接形成的截短体蛋白进行表达纯化。

在基因公司合成截短体对应的基因序列，通过分子克隆的方法，构建到含有GST标签的pFastBac-6p-1改造载体上，鉴定正确后转化至DH10Bac工程菌，进行蓝白斑筛选，挑取白斑鉴定后，通过质粒提取，获得重组插入目的片段的杆粒Bacmid，转染进入昆虫Sf9细胞中。72小时后观察出现病变，收集第一代病毒P1，继续感染Sf9细胞，收集P2和P3代病毒。使用P3代病毒感染正常Sf9昆虫细胞，进行目的蛋白狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白地表达。离心收集细胞后，使用GST亲和层析纯化目的蛋白，再加入PreScission Protease蛋白酶进行柱上酶切，切去标签后洗脱目的蛋白。

收集感染病毒72h的昆虫细胞，2000rpm，离心10min，用缓冲液A（50mM Tris,pH8.0, 150mM NaCl, 1mM DTT）悬起，放入冰浴的50ml玻璃烧杯中，使用超声波细胞粉碎机进行昆虫细胞的破碎。

昆虫细胞的破碎选择250W功率，每个循环3s超声，9s停止，每轮总时间3min，共进行2轮。裂解后的悬浊液在4℃条件下使用低温高速离心机以12000rpm的转速离心20min，上清液继续进行后续纯化实验。

在0~4℃低温条件下，将离心后的上清液流过GST亲和层析柱，并重复结合3-4次，使目的蛋白充分结合在亲和层析柱上。再用50ml缓冲液A洗去杂质蛋白，加入PreScission蛋白酶（sigma）在4℃环境下酶切12小时。最后用缓冲液A将切去GST标签的目的蛋白质洗脱下来。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测纯化结果。通过SDS-PAGE进行鉴定，表达的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白的结果如图5所示，在25kDa位置附近有目的蛋白条带，纯度较高，为目的蛋白狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白。

将纯化获得的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白使用Elisa方法验证抗原活性。包被纯化的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白1 μg/ml，100 μl/孔，4℃包被过夜，0.1%明胶37℃封闭2 h，250 μl/孔的 PBST洗液（0.1%）洗板3次，加入稀释后的临床狂犬病病毒阳性血清100μl/孔，37℃孵育1 h（阳性对照组为狂犬病病毒阳性血清，阴性对照组为狂犬病病毒阴性血清，每组做三次重复），250 μl/孔的PBST洗液（0.1%）洗板3次，拍干后加入HRP标记的兔抗犬二抗（以PBS按照1:10000稀释）100 μl/孔，37℃反应30 min，再次洗板3次，拍干后加入TMB显色液（商品化）100 μl/孔，室温显色10 min，最后加入0.5M硫酸，50 μl/孔，终止反应，用酶标仪测定OD_450nm值。结果如表1所示，狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白可与临床血清、阳性对照、阴性对照发生特异性反应，具有较好的抗原活性。

表1狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白抗原活性验证结果

阳性对照	阴性对照	临床血清
			1.623	0.055	1.522
1.705	0.063	1.476
			1.562	0.058	1.604

实施例3、包被狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白的Elisa抗体检测试剂盒

1. 狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白作为抗原包被的Elisa抗体检测试剂盒制备和检验步骤：

利用实施例2制备的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白作为抗原制备的间接法Elisa抗体检测试剂盒，用于检测犬血清中狂犬病病毒抗体水平的酶联免疫检测试剂盒，其中，该检测试剂盒中包被纯化的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白浓度为1 μg/ml。

从检测试剂盒中取出包被狂犬病病毒糖蛋白G短体蛋白抗原包被板，在血清稀释板上用样品稀释液100倍稀释待检测的血清（198 μl样品稀释液和2 μl待检血清混合），取100 μl混合液加入酶标板中，同时阳性血清和阴性血清各加2孔，每孔100 μl。

轻轻振荡均匀各孔中样品，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。

弃去板孔中的溶液，每孔加入250 μl工作洗涤液，重复3次，最后一次洗板后将液体彻底拍干。

每孔加入100 μl酶标抗体，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。

每孔加入100 μl底物溶液，用封板膜覆盖包被板，室温孵育10分钟。

每孔加入50 μl终止液终止反应。

测定样品和对照于450 nm波长的吸光值（OD_450nm）。阳性对照OD_450nm值≥0.6，阴性对照OD_450nm值≤0.2，试验成立。

判读标准：S/P=（待检样品OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值）/（阳性对照OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值）。S/P≥0.3为样品阳性，待检样品血清抗体达到保护水平；S/P＜0.3为样品阴性，待检样品血清抗体未达到保护水平。

2. Elisa抗体检测试剂盒特异性试验

用制备的试剂盒检测犬细小病毒CPV、犬瘟热病毒CDV和犬传染性肝炎病毒CAV I标准抗体阳性血清和狂犬病病毒RABV抗体阳性血清。检测结果见下表2所示，除狂犬病病毒标准抗体阳性血清的S/P值显著大于0.3外，其余血清S/P值小于0.3，符合阴性血清的判定标准，表明本发明的检测试剂盒具有良好的特异性。

表2特异性血清检测结果

3. Elisa抗体检测试剂盒敏感性试验

将狂犬病病毒标准抗体血清（4.0 IU/ml）分别稀释为2.0、1.5、1.0、0.8、0.5、0.3、0.1 IU/ml，使用本发明制备的Elisa抗体检测试剂盒以及外购狂犬病病毒Elisa抗体检测试剂盒同时进行检测。检测结果如表3所示，本发明的Elisa抗体检测试剂盒可检测至0.5IU/ml的狂犬标准抗体阳性血清，外购试剂盒也可检测至0.5 IU/ml的狂犬病病毒标准抗体阳性血清，说明本发明的狂犬病病毒Elisa抗体检测方法具有良好的敏感性。

表3敏感性血清检测结果

4. Elisa抗体检测试剂盒符合率试验

使用本发明的Elisa抗体检测试剂盒及外购狂犬病病毒Elisa抗体检测试剂盒同时检测35份犬血清样本，结果进行对比，本发明的Elisa抗体检测试剂盒与外购试剂盒样本检测的符合率为100%，说明与外购试剂盒有良好的适应性，具体检测结果如表4和表5所示。

表4本发明的Elisa抗体检测试剂盒样本符合率比较

表5 本发明的Elisa抗体检测试剂盒和外购试剂盒的样本符合率

实施例4、包被狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白的胶体金抗体检测试纸条

1、本实施例利用实施例2制备的狂犬病病毒糖蛋白G截短体蛋白作为抗原所制备的胶体金抗体检测试纸条是一种基于免疫层析平台、采用双抗原夹心法检测犬血清或血浆中狂犬病病毒抗体水平的试纸条，利用该试纸条检测的过程包括如下步骤：

从试剂盒中取出狂犬病病毒胶体金抗体检测试纸条，恢复至室温。

取10μl犬血清或血浆，加入到样本稀释液中，振荡混匀，为待测液。

取80μl待测液加入试纸条样本孔中，反应15分钟，肉眼判断结果。

判定标准：C线显色，说明该试纸条结果有效，试验成立；C线显色，T线显色，说明待测样品中狂犬病病毒抗体达到保护水平；C线显色，T线不显色，说明待测样品中狂犬病病毒抗体未达到保护水平，建议加强免疫。

2、特异性试验

用狂犬病病毒胶体金抗体检测试纸条检测犬细小病毒CPV、犬瘟热病毒CDV、犬传染性肝炎病毒CAV I、犬冠状病毒CCV标准抗体阳性血清和狂犬病病毒RABV抗体阳性血清。结果见下图，除狂犬病病毒标准抗体阳性血清T线有显色外，其余血清T线均不显色，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好，如图6所示。

3、敏感性试验

将狂犬病病毒标准抗体血清（4.0 IU/ml）分别稀释为2.0、1.5、1.0、0.8、0.5、0.3、0.1 IU/ml，使用本研究方法及外购狂犬病病毒Elisa抗体检测试剂盒同时进行检测。结果见下表，本实施例建立的方法可检测至0.5 IU/ml的狂犬病病毒抗体阳性血清，外购试剂盒也可检测至0.5 IU/ml的狂犬病病毒抗体阳性血清，说明本实施例建立的胶体金抗体检测试纸条具有良好的敏感性，如图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种狂犬病病毒糖蛋白的蛋白质截短体，所述蛋白质截短体的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.权利要求1所述的蛋白质截短体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如SEQ ID No.4所示的DNA分子。

4.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

（a1）含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒；

（a2）含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体；

（a3）含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌；

（a4）含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

5.权利要求1所述的蛋白质截短体和/或权利要求2-3任一项所述编码基因和/或权利要求4所述的生物材料在制备抗原中的应用，所述抗原是针对狂犬病病毒或狂犬病病毒糖蛋白的。

6.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白质截短体；

所述产品的功能为检测病毒抗体的试剂；

所述病毒为狂犬病病毒。