CN116375867A - 抗gprc5d抗体及其应用 - Google Patents
抗gprc5d抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116375867A CN116375867A CN202211702668.1A CN202211702668A CN116375867A CN 116375867 A CN116375867 A CN 116375867A CN 202211702668 A CN202211702668 A CN 202211702668A CN 116375867 A CN116375867 A CN 116375867A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- sequence shown
- lcdr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001040713 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member D Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102100021197 G-protein coupled receptor family C group 5 member D Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 405
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 17
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 34
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 22
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 102000044456 human GPRC5D Human genes 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 description 9
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 4
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 101000839679 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-39 Proteins 0.000 description 3
- 101001138089 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-39 Proteins 0.000 description 3
- 101001138133 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-5 Proteins 0.000 description 3
- 102100028312 Immunoglobulin heavy variable 4-39 Human genes 0.000 description 3
- 102100020910 Immunoglobulin kappa variable 1-39 Human genes 0.000 description 3
- 102100020769 Immunoglobulin kappa variable 1-5 Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 101000642536 Apis mellifera Venom serine protease 34 Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 101001100101 Homo sapiens Retinoic acid-induced protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101710134681 40 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001014684 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member B Proteins 0.000 description 1
- 101001014685 Homo sapiens G-protein coupled receptor family C group 5 member C Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100038453 Retinoic acid-induced protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000003778 chromosome 13q14 deletion syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- -1 e.g. Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 102000052260 human GPRC5A Human genes 0.000 description 1
- 102000046817 human GPRC5B Human genes 0.000 description 1
- 102000045252 human GPRC5C Human genes 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940020037 talquetamab Drugs 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供一种抗G蛋白偶联受体家族C类的5组D成员(GPRC5D)的抗体或其片段。本发明还提供所述抗体或其片段作为活性成分治疗肿瘤或癌症的应用。此外，本发明还提供一种包含所述抗体或其片段且针对GPRC5D和CD3的双特异性抗体。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2021年12月31日提交的申请号为CN202111663745.2的中国发明专利申请的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种新的抗GPRC5D抗体或其功能性片段。本发明还涉及所述抗体或其功能性片段的应用。
背景技术
G蛋白偶联受体家族C类的5组D成员(GPRC5D)是一种维甲酸诱导的40kDa蛋白，具有7个跨膜段和1个短的N端胞外区，在角化上皮细胞、胰腺、肾脏、小肠、脾脏和睾丸等中均有表达。2019年3月，Science Translational Medicine期刊发表了靶向GPRC5D CAR-T治疗多发性骨髓瘤的研究文章，初步显示出了GPRC5D作为一个全新的靶点用于治疗多发性骨髓瘤的潜力。组织表达谱研究发现GPRC5D特异性地在多发性骨髓瘤的浆细胞高表达。另外，已提出与GPRC5D相关的疾病包括染色体13Q14缺失综合征等。
鉴于GPRC5D在包括多发性骨髓瘤的疾病中的显著作用，需要识别GPRC5D的更多抗体。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种抗G蛋白偶联受体家族C类的5组D成员(GPRC5D)的抗体或其片段，并基于该抗体或其片段，提供其用途。此外，基于该抗体或其片段，本发明还提供一种针对GPRC5D和CD3的双特异性抗体。
本发明提供以下技术方案。
一方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性结合GPRC5D，特别是人GPRC5D。
具体而言，本发明提供的抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
(1)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列(SDYAWN)的HCDR-1、包含示于SEQ IDNO:29的氨基酸序列(YISYSGSATYNPSLKS)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列(GGIAGRGRWGAMDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列(KASQNVGTNVA)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列(SASYRDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:33的氨基酸序列(QQYKSYPLT)的LCDR-3；
(2)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列(SDYAWN)的HCDR-1、包含示于SEQ IDNO:34的氨基酸序列(YISYSGSATYSPSLKS)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列(GGIAGRGRWGAMDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列(KASQNVGTNVA)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列(SASYRDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:33的氨基酸序列(QQYKSYPLT)的LCDR-3；
(3)包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列(SYTIQ)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:36的氨基酸序列(YIIPSSGYTNYNQKFKD)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:37的氨基酸序列(NYGNWGFTY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:38的氨基酸序列(KASQNVGSAVT)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:39的氨基酸序列(SASNRYT)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:40的氨基酸序列(QQYSNYPLT)的LCDR-3；
(4)包含示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列(YYVMH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列(YINPYNDGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3；
(5)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列(YYVIH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列(YINPYNDGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3；和
(6)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列(YYVIH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:48的氨基酸序列(YINPYNAGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3。
在本发明的上下文中，所提供的轻重链CDR的组合均来自本发明的抗体或其片段，基于给定抗体或其片段包含的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的CDR。例如，根据本发明的具体实施方式，采用KABAT定义方法限定可变区氨基酸序列中的CDR。
在本发明提供的抗体或其片段中，优选地，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:20的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
更优选地，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和
(8)示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
在本发明的上下文中，“至少75％同一性”为75％至100％之间的任何百分比数字的同一性，例如75％、80％、85％、90％，甚至91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。
特别地，本发明的抗体或其片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上述CDR以及间隔的框架区(framework region)，各个结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。进一步可选地，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列上的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生。
就抗原而言，本发明的抗体或其片段为抗GPRC5D的抗体或其片段；优选地，所述抗体为鼠抗、兔抗、单克隆抗体、嵌合抗体、部分或全部人源化的抗体等任意形式，或者，所述片段为半抗体或者抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；更优选地，所述抗体为IgG。根据本发明的具体实施方式，本发明提供特异性地结合GPRC5D(例如人GPRC5D)的经分离和结构表征的人抗体，例如人单克隆抗体。
除了可变区之外，本发明提供的抗体或其片段还包含恒定区，例如人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；更优选地，所述抗体或其片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
根据本发明的具体实施方式，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型。优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区包含示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或者与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链恒定区包含示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或者与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的具体实施方式，本发明的抗人GPRC5D抗体为单克隆抗体。优选地，本发明提供的抗人GPRC5D抗体为免疫球蛋白，例如，所述免疫球蛋白的类型为人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。进一步优选地，所述抗体为人IgG1或IgG4亚型。
本发明提供的抗体或其片段还可用于构建抗GPRC5D×CD3的双特异性抗体。因此，如下文所述，本发明还提供如下双特异性抗体构建体。
本发明提供一种双特异性抗体构建体，所述抗体构建体包含结合G蛋白偶联受体家族C类的5组D成员(GPRC5D)的第一结合结构域，和结合T细胞表面上的CD3的第二结合结构域。
在本发明提供的双特异性抗体构建体中，所述第一结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
(1)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列(SDYAWN)的HCDR-1、包含示于SEQ IDNO:29的氨基酸序列(YISYSGSATYNPSLKS)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列(GGIAGRGRWGAMDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列(KASQNVGTNVA)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列(SASYRDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:33的氨基酸序列(QQYKSYPLT)的LCDR-3；
(2)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列(SDYAWN)的HCDR-1、包含示于SEQ IDNO:34的氨基酸序列(YISYSGSATYSPSLKS)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列(GGIAGRGRWGAMDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列(KASQNVGTNVA)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列(SASYRDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:33的氨基酸序列(QQYKSYPLT)的LCDR-3；
(3)包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列(SYTIQ)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:36的氨基酸序列(YIIPSSGYTNYNQKFKD)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:37的氨基酸序列(NYGNWGFTY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:38的氨基酸序列(KASQNVGSAVT)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:39的氨基酸序列(SASNRYT)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:40的氨基酸序列(QQYSNYPLT)的LCDR-3；
(4)包含示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列(YYVMH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列(YINPYNDGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3；
(5)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列(YYVIH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列(YINPYNDGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3；和
(6)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列(YYVIH)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:48的氨基酸序列(YINPYNAGTKYNEKFKG)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列(GGVRRYFDY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列(RASQDIGSNLN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列(ATSSLDS)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:46的氨基酸序列(LQYATFPYT)的LCDR-3。
优选地，在所述第一结合结构域中，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:20的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
更优选地，所述第一结合结构域包含的重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或
(8)示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
在本发明提供的双特异性抗体构建体中，所述第二结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
包含示于SEQ ID NO:49的氨基酸序列(TYAMN)的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:50的氨基酸序列(RIRSKYNNYATYYADSVKD)的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:51的氨基酸序列(HGNFGNSYVSYFAY)的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:52的氨基酸序列(RSSTGAVTTSNYAN)的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:53的氨基酸序列(GTNKRAP)的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:54的氨基酸序列(ALWYSNLWV)的LCDR-3。
优选地，在所述第二结合结构域中，所述重链可变区包含示于SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，所述轻链可变区包含示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
进一步优选地，本发明提供的双特异性抗体构建体包含四个多肽链：
1)重链1，所述重链1从N端到C端包含按照VH-CH1-CH2-CH3排列的结构域；
2)重链2，所述重链2从N端到C端包含按照VL-CH1-CH2-CH3排列的结构域；
3)轻链1，所述轻链1从N端到C端包含按照VL-CL排列的结构域；
4)轻链2，所述轻链2从N端到C端包含按照VH-CL排列的结构域；
其中，重链1和轻链1中包含的VH和VL配对形成所述结合GPRC5D的第一结合结构域；重链2和轻链2中包含的VL和VH配对形成所述结合CD3的第二结合结构域。本发明提供的双特异性抗体构建体的结构示意图见图1。
根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的双特异性抗体构建体中，重链1中的CH1-CH2-CH3结构域包含示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；重链2中的CH1-CH2-CH3结构域包含示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；轻链1中的CL结构域包含示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；轻链2中的CL结构域包含示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明提供的抗体或其片段或者本发明提供的双特异性抗体构建体中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此又一方面，本发明还提供一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞。因此，还一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明提供的抗体或其片段以及双特异性抗体构建体可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链和轻链的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
本发明提供的抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或可以被包含在组合物中，更特别地被包含在药物组合物例如药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，例如药物组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体和/或宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
再一方面，本发明还提供所述抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为肿瘤或癌症。优选地，所述疾病为与GPRC5D表达(例如高表达)相关的肿瘤或癌症，例如淋巴瘤或骨髓瘤，特别是多发性骨髓瘤。
因此相应地，本发明还提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，所述疾病为肿瘤或癌症。优选地，所述疾病为与GPRC5D表达(例如高表达)相关的肿瘤或癌症，例如淋巴瘤或骨髓瘤；所述疾病特别是多发性骨髓瘤。优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
还一方面，本发明还提供所述抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于诊断疾病或检测抗原GPRC5D存在的试剂中的用途，所述疾病为肿瘤或癌症。优选地，所述疾病为与GPRC5D表达(例如高表达)相关的肿瘤或癌症，例如淋巴瘤或骨髓瘤，特别是多发性骨髓瘤。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体或其片段、双特异性抗体构建体、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物。所述试剂盒可以用于上述治疗，或者用于诊断或抗原检测中。取决于预期的应用方式，所述试剂盒还包含用于治疗、诊断或检测的其他试剂。例如，所述试剂盒为用于采用ELISA来检测任何生物学样本中GPRC5D存在的试剂盒。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为抗人GPRC5D×CD3双特异性抗体的结构示意图。
图2显示杂交瘤细胞上清与不同细胞结合的FACS检测结果。
图3显示杂交瘤细胞上清与不同细胞结合的FACS检测结果。
图4显示杂交瘤细胞上清与不同细胞结合的FACS检测结果，其中4-1：MM1R细胞；4-2：Nalm6细胞；4-3：OPM2细胞；4-4：NCI-H929细胞。
图5显示人源化抗体与人GPRC5D表达细胞结合的FACS检测结果，其中5-1：9D7(hz)；5-2：26D1(hz)；5-3：24F5(hz)；5-4：6E97(hz)。
图6显示人源化抗体与猴GPRC5D表达细胞结合的FACS检测结果，其中6-1：9D7(hz)；6-2：26D1(hz)；6-3：24F5(hz)；6-4：6E97(hz)。
图7显示人源化抗体与不同肿瘤细胞系细胞结合的FACS检测结果，其中7-1：MM.1R细胞；7-2：MOLP8细胞。
图8显示人源化抗体与GPRC5D的亲和力检测结果，其中8-1：GPRC5D×CD3 JNJ；8-2：9D7(hz)；8-3：26D1(hz)；8-4：24F5(hz)；8-5：6E97(hz)。
图9显示人源化抗体介导ADCC的检测结果，其中9-1：野生型NCI-H929；9-2：GPRC5D敲除的NCI-H929。
图10显示双特异性抗体介导T细胞杀伤的检测结果，其中10-1：共培养实验1；10-2：共培养实验2；10-3：共培养实验3。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：
人GPRC5D蛋白：Genbank登记号NM_018654；
猴GPRC5D蛋白：Genbank登记号XM_005570193.2。
实施例1杂交瘤细胞的制备以及抗体蛋白的获得
将表达人GPRC5D细胞(康源博创生物科技(北京)有限公司(kyinno公司)，货号KC-1583)在含2％ FBS的PBS中制备成细胞浓度为1×107个细胞/ml的细胞悬液。
将该细胞悬液作为免疫原免疫小鼠，5只小鼠皮下免疫，5只小鼠肌肉免疫，佐剂采用quick antibody 5W水溶性佐剂，加强免疫以后2周测效价，选取效价高的2只小鼠进行免疫冲击，3天之后取血清，解剖后取脾脏。分离的脾细胞与培养的骨髓瘤细胞在96孔板中进行融合，同时加入选择性培养基进行筛选，7天后换液，10天后进行基于细胞的ELISA检测。ELISA检测使用表达人GPRC5D的293T细胞(kyinno公司，货号KC-1723)，选择OD值大于阴性对照(正常小鼠的血清)10倍以上的细胞再进行流式细胞术检测，流式细胞术中使用表达人GPRC5D的293T细胞(kyinno公司，货号KC-1723)。
挑选ELISA和FACS检测结果均为阳性的细胞，通过细胞有限稀释法进行亚克隆铺板，挑选单克隆细胞。将挑选出的单克隆细胞，取培养上清，进行ELISA检测及流式细胞术检测，挑选双阳的细胞扩大培养。
收集所得杂交瘤细胞的培养上清，离心、浓缩后使用G蛋白亲和柱纯化。然后，将纯化后的样品使用20mM柠檬酸+100mM NaCl，pH5.5缓冲溶液10倍稀释，超滤浓缩管浓缩至合适体积后，分装至1.5mL EP管中，200μL/管，-80℃保存。同时取出部分样品进行SDS-PAG和FACS鉴定，验证蛋白的纯度及活性。
实施例2杂交瘤细胞培养上清与人GPRC5D结合的ELISA检测
将表达人GPRC5D的BXPC-3细胞(kyinno公司，货号KC-1717)在含2％FBS的PBS中制备成细胞浓度为1×105个细胞/ml的细胞悬液，以100μl/孔加入96孔板中，置37℃培养过夜。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每孔加80μl 4％组织固定液(Beyotime，货号P0099)，于室温下固定15min，用PBS洗涤两次，晾干，每孔加250μl含2％ BSA的封闭液，37℃孵育1h，PBS洗板三次。向每孔中加入50-100μl待检杂交瘤细胞的培养上清，同时设立阳性对照(加入融合小鼠的血清)、阴性对照(加入正常小鼠的血清)和空白对照(加入培养基)。在37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。然后向每孔中加入酶标二抗，为1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(SIGMA，货号A9044-2ml)，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。向每孔中加入新鲜配制的底物显色液TMB 50-100μl，37℃孵育10-30分钟。
加入2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
结果判定：以P/N>2:1(P代表阳性数值，N代表正常小鼠血清数值)为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。结果见表1。
表1杂交瘤细胞培养上清与人GPRC5D结合的ELISA检测结果
实施例3抗人GPRC5D×CD3双特异性抗体的构建
采用强生公司的Talquetamab(JNJ-64407564)中靶向GPRC5D的结构域与靶向CD3的结构域构建抗人GPRC5D×CD3双特异性抗体。该双特异性抗体的结构示意图见图1，其中各条链包含的结构域从N端至C端依次为：重链1：VH-CH1-CH2-CH3
>VH(SEQ ID NO:1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNS
DTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWGQGTL
VTVSS
>CH1-CH2-CH3(SEQ ID NO:25)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAA
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重链2：VL-CH1-CH2-CH3
>VL(SEQ ID NO:2)
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
>CH1-CH2-CH3(SEQ ID NO:26)
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDDRVEPKSCDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链1：VL-CL
>VL(SEQ ID NO:3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVATHVGWYQQKPGKAPKRLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNRYPYTFGQGTKLEIK
>CL(SEQ ID NO:24)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
轻链2：VH-CL
>VH(SEQ ID NO:4)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
>CL(SEQ ID NO:27)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
对于上述四条多肽链，设计引物，合成相应的编码基因，连入真核表达质粒中，将获得的四个重组表达质粒共转染HEK293F细胞，细胞培养5-7天后，收获分泌抗体的上清液；使用MabSelectSure亲和层析技术和SP阳离子交换层析技术，从细胞培养物上清中纯化双特异性抗体。
将得到的双特异性抗体命名为“GPRC5D×CD3 JNJ”。
实施例4杂交瘤细胞培养上清与人GPRC5D结合的FACS检测
将如上表达人GPRC5D的293T细胞在含2％ FBS的PBS中制备成细胞浓度为1×105个细胞/ml的细胞悬液。
向每个流式管(样品管)中放入50μl细胞悬液，然后分别加入50μl待检杂交瘤细胞的培养上清和作为阳性对照抗体的抗人GPRC5D×CD3双特异性抗体GPRC5D×CD3 JNJ，4℃孵育60分钟。向每个流式管中加入1ml的流式缓冲液，1200rpm下离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。同时设置对照管1(不加入培养上清和下文的二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入培养上清，仅加入细胞悬液和下文的二抗)。
然后向每个流式管中加入100μl流式缓冲液进行重悬，根据实验要求加入5μl PE标记的抗鼠Fc标签的二抗(Biolegend，货号409304)，4℃避光孵育30分钟，然后加入1ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。
再次向每个流式管中加入250μl流式缓冲液，重悬混匀，上机检测。检测结果见表2-1至表2-4和图2中的2-1至2-4。
表2-1
| 样品(以杂交瘤细胞编号示出) | 26D1 | 阳性对照抗体 |
| EC50(μg/mL) | 0.7881 | 1.684 |
| MFI.Max | 11491 | 10980 |
表2-2
| 样品(以杂交瘤细胞编号示出) | 26D1 | 9D7 |
| EC50(μg/mL) | 0.1688 | 0.1853 |
| MFI.Max | 9755 | 9785 |
表2-3
表2-4
| 样品(以杂交瘤细胞编号示出) | 9D7 | 57G4 |
| EC50(μg/mL) | 0.2793 | 0.1918 |
| MFI.Max | 9255 | 9227 |
实施例5杂交瘤细胞上清与猴GPRC5D结合的FACS检测
按照实施例4所述的操作，将人GPRC5D表达细胞换成表达猴GPRC5D的293T细胞(kyinno公司，货号KC-1586)，检测本发明的杂交瘤细胞的培养上清与猴GPRC5D的结合。
FACS结合的检测结果见表3-1至表3-3和图3中的3-1至3-3；阳性对照抗体为GPRC5D×CD3 JNJ。
表3-1
| 样品(以杂交瘤细胞编号示出) | 26D1 | 阳性对照抗体 |
| EC50(μg/mL) | 12.31 | 13.07 |
| MFI.Max | 1317 | 726 |
表3-2
表3-3
实施例6杂交瘤细胞上清与不同细胞结合的FACS检测
按照实施例4所述的操作，将人GPRC5D表达细胞换成其他细胞：NALM6(kyinno公司，货号KC-0626)、NCI-H929(kyinno公司，货号KC-0629)、MM1R(kyinno公司，货号KC-0619)、OPM2(kyinno公司，货号KC-0631)细胞，检测本发明的杂交瘤细胞的培养上清与人GPRC5D的结合。
FACS结合的检测结果见表4和图4中的4-1至4-4；阳性对照抗体为GPRC5D×CD3JNJ。
表4.杂交瘤细胞上清与细胞结合的FACS检测结果
实施例7本发明的鼠抗抗体的序列鉴定
选择筛选的杂交瘤细胞株，从单克隆细胞中提RNA，逆转录成cDNA，cDNA扩增，胶回收后连入测序载体中进行测序分析。
从杂交瘤细胞中获得的示例性鼠抗体重轻链可变区的序列如下，其中加粗且带下划线部分示出了CDR(根据KABAT方法定义得到)。
A1：
>9D7-H(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:5/28/29/30)
QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSATYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSMTTEDTATYYCARGGIAGRGRWGAMDYWGQGTSVTVSS
>9D7-L(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:6/31/32/33)
DIVMTQAQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQNKPGQSPKALIYSASYRDS
GVPDRFTGRGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYKSYPLTFGAGTKLELK
A2：
>26D1-H(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:7/35/36/37)
QVQLKQSGAELAGPGASVKMSCKASGYTFTSYTIQWIKQRPGQGLEWIGYIIPSSGYTNYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCANNYGNWGFTYWGQGTLVTVSA
>26D1-L(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:8/38/39/40)DILMTQSQKFMSTSVRDRVSISCKASQNVGSAVTWYQQKPGQSPRLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYS NYPLTFGGGTKLEIK
A3
>24F5-H(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:9/41/42/43)
QVQLKESGPELVKPGASVKISCKASGYTFPYYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAALTSDKSSSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCARGGVRRYFDYWGQGTTLTVSS
>24F5-L(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:10/44/45/46)
DIQMTQTPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSNLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYATFPYTFGGGTKLEIK
A4
>6E97-H(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:11/47/42/43/)
QVQLKESGPELVKPGASVKISCKASGYTFPYYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAALTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGGVRRYFDYWGQGTTLTVSS
>6E97-L(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:12/44/45/46)
QIVLTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSNLNWLQQEPDGTIKRLISATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYFCLQYATFPYTFGGGTKLEIK
实施例8基于鼠抗体的嵌合抗体和人源化抗体的制备
对A1抗体(鼠抗9D7)，分别选取了如下人germline的序列作为重链与轻链的模板：IGHV4-39和IGKV1-39。对A1抗体进行同源建模，进行Fab区域的结构模拟。经过同源建模计算，最后得到预测的A1抗体的Fab结构。
通过对预测的Fab结构及重链与IGHV4-39序列进行比对分析，将该VH中除了CDR区及2V、49M、68I、72R为原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGHV4-39模板人的氨基酸。
通过对预测的Fab结构及轻链与IGKV1-39序列进行比对分析，将该VL中除了CDR区及42Q、43S、46A、60D保留原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGKV1-39模板人的氨基酸。得到的人源化序列如下(其中重链和轻链CDR以加粗和下划线示出，其根据KABAT定义方法得到)：
抗体的人源化抗体的序列如下：
>9D7-H人源化序列(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:13/28/34/30)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYSGSATYSPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGIAGRGRWGAMDYWGQGTTVTVSS
>9D7-L人源化序列(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:14/31/32/33)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYKSYPLTFGQGTRLEIK
对A2抗体(鼠抗26D1)，分别选取了如下人germline的序列作为重链与轻链的模板：IGHV1-46和IGKV1-5。对A2抗体进行同源建模，进行Fab区域的结构模拟。经过同源建模计算，最后得到预测的A2抗体的Fab结构。
通过对预测的Fab结构及重链与IGHV1-46序列进行比对分析，将该VH中除了CDR区及37I、38K、48I、67R、68A、70L、72A、74K、76S、77N、79A、98N为原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGHV1-46模板人的氨基酸。
通过对预测的Fab结构及轻链与IGKV1-5序列进行比对分析，将该VL中除了CDR区及45R、60D、87F保留原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGKV1-5模板人的氨基酸。得到的人源化序列如下(其中重链和轻链CDR以加粗和下划线示出，其根据KABAT定义方法得到)：
抗体的人源化抗体的序列如下：
>26D1-H人源化序列(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:15/35/36/37)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTIQWIKQAPGQGLEWIGYIIPSSGYTNYNQKFKDKATLTADKSSNTAYMELSSLTSEDTAVYYCANNYGNWGFTYWGQGTTVTVSS
>26D1-L人源化序列(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:16/38/39/40)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQNVGSAVTWYQQKPGKAPRLLIYSASNRYTG
VPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYFCQQYSNYPLTFGQGTRLEIK
对A3抗体(鼠抗24F5)，分别选取了如下人germline的序列作为重链与轻链的模板：IGHV1-46和IGKV1-15。对A3抗体进行同源建模，进行Fab区域的结构模拟。经过同源建模计算，最后得到预测的A3抗体的Fab结构。
通过对预测的Fab结构及重链与IGHV1-46序列进行比对分析，将该VH中除了CDR区及48I、68A、70L、72S、74K、79A为原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGHV1-46模板人的氨基酸。
通过对预测的Fab结构及轻链与IGKV1-15序列进行比对分析，将该VL中除了CDR区及36L、42G、43T、44I、46R、66R、69S、71Y保留原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGKV1-15模板人的氨基酸。得到的人源化序列如下(其中重链和轻链CDR以加粗和下划线示出，其根据KABAT定义方法得到)：
抗体的人源化抗体的序列如下：
>24F5-H人源化序列(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:17/41/42/43)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPYYVMHWVRQAPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGVRRYFDYWGQGTTVTVSS
>24F5-L人源化序列(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:18/44/45/46)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDIGSNLNWLQQKPGGTIKRLIYATSSLDSGVPSRFSGSRSGSEYTLTISSLQPDDFATYYCLQYATFPYTFGQGTRLEIK
对A4抗体(鼠抗6E97)，分别选取了如下人germline的序列作为重链与轻链的模板：IGHV1-46和IGKV1-15。对A4抗体进行同源建模，进行Fab区域的结构模拟。经过同源建模计算，最后得到预测的A4抗体的Fab结构。
通过对预测的Fab结构及重链与IGHV1-46序列进行比对分析，将该VH中除了CDR区及48I、68A、70L、72S、74K、79A为原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGHV1-46模板人的氨基酸。
通过对预测的Fab结构及轻链与IGKV1-15序列进行比对分析，将该VL中除了CDR区及4L、36L、42G、43T、44I、46R、66R、69S、71Y保留原始鼠的氨基酸外，其它的鼠的氨基酸全部替换成相应的IGKV1-15模板人的氨基酸。得到的人源化序列如下(其中重链和轻链CDR以加粗和下划线示出，其根据KABAT定义方法得到)：
抗体的人源化抗体的序列如下：
>6E97-H人源化序列(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:19/47/48/43)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPYYVIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYNAGTKYNEKFKGRATLTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGVRRYFDYWGQGTTVTVSS
>6E97-L人源化序列(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:20/44/45/46)
DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDIGSNLNWLQQKPGGTIKRLISATSSLDSGVPSRFSGSRSGSEYTLTISSLQPDDFATYYCLQYATFPYTFGQGTRLEIK
以SEQ ID NO:23所示序列作为重链恒定区，SEQ ID NO:24所示序列作为轻链恒定区，对于测序得到的针对GRRC5D靶点的抗体DNA序列，重新设计引物，合成相应的嵌合抗体及人源化抗体的基因，连入真核表达载体中，转化DH5alpha感受态细胞，37℃恒温培养箱培养过夜，挑单克隆菌株测序鉴定。挑选序列正确的菌株，摇菌，大提质粒，转染哺乳动物表达细胞293F，置于37℃、5％ CO2的培养箱中，表达培养7天。
收取上清，离心，过滤，选择protein G亲和层析柱进行纯化，纯化的抗体通过SDS-PAGE电泳检测纯度，用BCA蛋白检测试剂盒检测抗体浓度，分装，保存于-80℃冰箱中备用。其中，将嵌合抗体命名为“鼠抗体简称(chi)”，将人源化抗体命名为“鼠抗体简称(hz)”。
>CH1-CH3重链恒定区(SEQ ID NO:23)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>CL1轻链恒定区(SEQ ID NO:24)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例9人源化抗体与人GPRC5D结合的FACS检测
实验过程参照实施例4，使用表达人GPRC5D的293T细胞(kyinno公司，货号KC-1584)，加入待检抗体、阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ或阴性对照抗体(hIgG1)，浓度参见图4。同时设置对照管1(不加入抗体和二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和二抗)。
结果见表5和图5中的5-1至5-4。
表5.人源化抗体与细胞结合的FACS检测结果
实施例10人源化抗体与猴GPRC5D结合的FACS检测
实验过程参照实施例4，使用表达猴(cyno)GPRC5D的293T细胞(kyinno公司，货号KC-1586)，加入待检抗体、阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ或阴性对照抗体(hIgG1)，浓度参见图6。同时设置对照管1(不加入抗体和二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和二抗)。
结果见表6和图6中的6-1至6-4。
表6.人源化抗体与细胞结合的FACS检测结果
实施例11人源化抗体与GPRC5A/B/C结合的FACS检测
实验过程参照实施例4，使用表达G蛋白偶联受体家族C类的5组其他成员的细胞：表达人GPRC5A的293T细胞293T-GPRC5A(kyinno公司，货号KC-1888)，表达人GPRC5B的293T细胞293T-GPRC5B(kyinno公司，货号KC-1854)，表达人GPRC5C的293T细胞293T-GPRC5C(kyinno公司，货号KC-1889)，按照2μg/mL浓度分别加入待检抗体、阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ或阴性对照抗体(hIgG1)。同时设置对照管1(不加入抗体和二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和二抗)。
结果见表7。
表7.人源化抗体与细胞结合的FACS检测结果(μg/mL)
实施例12人源化抗体与肿瘤细胞系结合的FACS检测
实验过程参照实施例4，使用的细胞换为多发性骨髓瘤细胞MM.1R(kyinno公司，货号KC-0619)和MOLP8(kyinno公司，货号KC-0622)，加入待检抗体、阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ或阴性对照抗体(hIgG1)。同时设置对照管1(不加入抗体和二抗，仅加入细胞悬液)和对照管2(不加入抗体，仅加入细胞悬液和二抗)。
结果见表8和图7中的7-1和7-2。
表8.人源化抗体与肿瘤细胞系结合的FACS检测结果
实施例13人源化抗体与GPRC5D蛋白的亲和力检测
将待测抗体使用PBS缓冲液制备成浓度为10μg/mL溶液，按照Fortebio说明书，使用AHC芯片捕获抗体。使提前准备的人GPRC5D蛋白(恺佧生物，货号GPR-HM05P)(蛋白按照最高浓度为200nM，2倍稀释，6个梯度)流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。结果见表9和图8中的8-1至8-5。
表9.人源化抗体与GPRC5D蛋白的亲和力检测结果
| 抗体 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| 阳性对照抗体 | 9.47E-10 | 2.18E+04 | 2.06E-05 |
| 9D7(hz) | <1.0E-12 | 2.26E+04 | <1.0E-07 |
| 26D1(hz) | 1.70E-09 | 1.85E+04 | 3.15E-05 |
| 24F5(hz) | 1.36E-09 | 3.99E+04 | 5.42E-05 |
| 6E97(hz) | 4.58E-10 | 4.55E+04 | 2.08E-05 |
实施例14人源化抗体介导ADCC的检测
在U底的96孔板中每孔加入20000个报告细胞Jurkat-NFAT-luc-CD16-V158(kyinno公司，货号KC-1507)，20000个野生型NCI-H929细胞(CFSE-H929，kyinno公司，货号KC-0629)或GPRC5D敲除的NCI-H929细胞(CFSE-H929GPRC5DKO，kyinno公司，货号KC-2203)，以及不同浓度的抗体(10，3.16，1，0.316，0.1，0.0316，0.01，0.00316μg/ml)。共培养6个小时，然后检测荧光素酶(luciferase)的信号。
结果见表10和图9中的9-1至9-2；阳性对照抗体为GPRC5D×CD3 JNJ。
表10.人源化抗体介导ADCC的检测结果
实施例15抗CD3抗体的获得和靶点亲和力的检测
从专利US10066015B2获得鼠源抗体的重链可变区序列SEQ ID NO.10和轻链可变区序列SEQ ID NO.5。对该抗体进行抗体序列的人源化，得到的人源化序列如下(其中重链和轻链CDR以加粗和下划线示出，其根据KABAT定义方法得到)：
>VH人源化序列(VH/HCDR-1/HCDR-2/HCDR-3：SEQ ID NO:21/49/50/51)QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS
>VL人源化序列(VL/LCDR-1/LCDR-2/LCDR-3：SEQ ID NO:22/52/53/54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKAPKALIGGTNKRAPGVPSRFSGSLSGDDATLTISSLQPEDFATYYCALWYSNLWVFGQGTRLEIK
按照实施例8所述，获得包含上述人源化序列的抗体，命名为SP34V1(hz)；同样，以专利US10066015B2中的上述鼠源抗体的重、轻链可变区序列，获得嵌合抗体，命名为SP34(chi)。
将该人源化抗体与嵌合抗体使用PBS缓冲液制备成浓度为10μg/mL溶液，按照Fortebio说明书，使用AHC芯片捕获抗体。使提前准备的人CD3蛋白(恺佧生物，货号GPR-HM05P)(蛋白按照最高浓度为200nM，2倍稀释，6个梯度)流过芯片，具体条件为：流速30μl/min；抗原抗体结合时间200秒，解离时间500秒。测得的结果用仪器专用配套软件拟合，以分析抗体与抗原的亲和力。结果见表11。
表11.抗体与CD3蛋白的亲和力检测结果
| 抗体 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| SP34V1(hz) | 1.80E-08 | 4.42E+05 | 7.95E-03 |
| SP34(chi) | 5.46E-09 | 5.01E+05 | 2.74E-03 |
实施例16本发明的双特异性抗体的构建
按照实施例3所述，构建本发明的双特异性抗体，区别仅在于将重链1中VH和轻链1中的VL分别替换为本发明的人源化抗体9D7(hz)、26D1(hz)、24F5(hz)和6E97(hz)的VH和VL，将重链2中VL和轻链2中的VH分别替换为实施例15中得到的针对CD3的人源化序列。
将分别包含本发明的人源化抗体9D7(hz)、26D1(hz)、24F5(hz)和6E97(hz)的VH和VL与如上序列的抗人GPRC5D×CD3双特异性抗体分别命名为“GPRC5D×CD3 9D7(hz)”、“GPRC5D×CD3 26D1(hz)”、“GPRC5D×CD324F5(hz)”、“GPRC5D×CD3 26D1(hz)”。
实施例17GPRC5D和CD3双抗介导T细胞杀伤实验
将PBMC和CD3/CD28磁珠以数量比2：1混合在含10ng/ml的IL-2和10％ FBS的RPMI1640中，培养扩增7天，以激活T细胞。
共培养实验1：将293T LDHA-Hibit-GPRC5D细胞(kyinno公司，货号KC-2151)提前一天铺板(96孔板)，然后每孔加入10000个上述T细胞，以及分别加入不同浓度的阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ和本发明的双特异性抗体(1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001，0.0000001μg/ml)，在含10ng/ml IL-2和10％ FBS的RPMI1640中共培养18个小时。使用Nano-
HiBiT Extracellular Reagent(Promega，货号N2420)检测上清中死亡细胞释放的LDHA-HIBIT，由此检测杀伤细胞比例。本实验针对2个抗体各设置了2组对照：加入293T LDHA-Hibit-GPRC5D细胞和抗体，但不加T细胞；加入293T LDHA-Hibit细胞(kyinno公司)、T细胞和抗体，以排除非抗体介导的杀伤和抗体介导的非T细胞杀伤。结果见图10中的10-1。
共培养实验2：NCI-H929(表达GPRC5D)和K562细胞(不表达GPRC5D)用CFSE进行染色，分别命名为CFSE-H929和CFSE-K562。在U底的96孔板中每孔加入10000个激活的T细胞，3000个CFSE-H929，以及分别加入不同浓度的阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ和本发明的双特异性抗体(1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001，0.0000001μg/ml)，在含10ng/ml的IL-2和10％ FBS的RPMI1640中共培养18个小时。然后用7-AAD染色，流式检测，计数CFSE+7-AAD+细胞在CSFE+细胞中的比例为细胞的杀伤比例。本实验针对2个抗体各设置了2组对照：加入CFSE-H929细胞和抗体，但不加T细胞；加入CFSE-K562、T细胞和抗体，以排除非抗体介导的杀伤和抗体介导的非T细胞杀伤。结果见图10中的10-2。
共培养实验3：野生型NCI-H929(kyinno公司，货号KC-0629)和GPRC5D敲除的NCI-H929细胞(kyinno公司，货号KC-2203)用CFSE进行染色，分别命名为CFSE-H929和CFSE-H929GPRC5DKO。在U底的96孔板中每孔加入10000个激活的T细胞，3000个CFSE-H929，以及加入不同浓度的阳性对照抗体GPRC5D×CD3 JNJ和本发明的双特异性抗体(1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001，0.0000001μg/ml)，在含10ng/ml的IL-2和10％FBS的RPMI1640中共培养18个小时。然后用7-AAD染色，流式检测，计数CFSE+7-AAD+细胞在CSFE+细胞中的比例为细胞的杀伤比例。本实验针对4个抗体各设置了2组对照：加入CFSE-H929细胞和抗体，但不加T细胞；加入CFSE-H929GPRC5DKO、T细胞和抗体，以排除非抗体介导的杀伤和抗体介导的非T细胞杀伤。结果见图10中的10-3。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (18)
1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
(1)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:33的氨基酸序列的LCDR-3；
(2)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:33的氨基酸序列的LCDR-3；
(3)包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:39的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:40的氨基酸序列的LCDR-3；
(4)包含示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3；
(5)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3；或
(6)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:19的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:20的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和
(8)示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为抗GPRC5D的抗体或其片段；
优选地，所述抗体为鼠抗、兔抗、单克隆抗体、嵌合抗体、部分或全部人源化的抗体等任意形式；或者，所述片段为半抗体或者抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；
更优选地，所述抗体为IgG。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段还包含恒定区；
优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；更优选地，所述抗体或其片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
6.一种双特异性抗体构建体，所述抗体构建体包含结合G蛋白偶联受体家族C类的5组D成员(GPRC5D)的第一结合结构域，和结合T细胞表面上的CD3的第二结合结构域，其中：
所述第一结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
(1)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:33的氨基酸序列的LCDR-3；
(2)包含示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HCDR-2、SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:32的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:33的氨基酸序列的LCDR-3；
(3)包含示于SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:38的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:39的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:40的氨基酸序列的LCDR-3；
(4)包含示于SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3；
(5)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3；和
(6)包含示于SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ ID NO:48的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LCDR-3。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体构建体，其特征在于，在所述第一结合结构域中，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的双特异性抗体构建体，其特征在于，所述第一结合结构域包含的重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或
(8)示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的双特异性抗体构建体，其特征在于，所述第二结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(HCDR-1、HCDR-2、HCDR-3；LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3)：
包含示于SEQ ID NO:49的氨基酸序列的HCDR-1、包含示于SEQ IDNO:50的氨基酸序列的HCDR-2、包含示于SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HCDR-3；和，包含示于SEQ ID NO:52的氨基酸序列的LCDR-1、包含示于SEQ ID NO:53的氨基酸序列的LCDR-2、包含示于SEQ ID NO:54的氨基酸序列的LCDR-3。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的双特异性抗体构建体，其特征在于，在所述第二结合结构域中，所述重链可变区包含示于SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，所述轻链可变区包含示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的双特异性抗体构建体，其特征在于，所述双特异性抗体构建体包含四个多肽链：
1)重链1，所述重链1从N端到C端包含按照VH-CH1-CH2-CH3排列的结构域；
2)重链2，所述重链2从N端到C端包含按照VL-CH1-CH2-CH3排列的结构域；
3)轻链1，所述轻链1从N端到C端包含按照VL-CL排列的结构域；
4)轻链2，所述轻链2从N端到C端包含按照VH-CL排列的结构域；
其中，重链1和轻链1中包含的VH和VL配对形成所述结合GPRC5D的第一结合结构域；重链2和轻链2中包含的VL和VH配对形成所述结合CD3的第二结合结构域。
12.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段中或者权利要求6至11中任一项所述的双特异性抗体构建体中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。
13.一种载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求12所述的核酸分子和/或权利要求13所述的载体。
15.一种组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6至11中任一项所述的双特异性抗体构建体、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体和/或权利要求14所述的宿主细胞；
优选地，所述组合物为药物组合物，其还包含任选的药学上可接受的辅料。
16.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6至11中任一项所述的双特异性抗体构建体、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病为肿瘤或癌症；
优选地，所述疾病为与GPRC5D表达(例如高表达)相关的肿瘤或癌症，例如淋巴瘤或骨髓瘤，特别是多发性骨髓瘤。
17.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6至11中任一项所述的双特异性抗体构建体、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的组合物在制备用于诊断疾病或检测抗原GPRC5D存在的试剂中的用途，所述疾病为肿瘤或癌症；
优选地，所述疾病为与GPRC5D表达(例如高表达)相关的肿瘤或癌症，例如淋巴瘤或骨髓瘤，特别是多发性骨髓瘤。
18.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6至11中任一项所述的双特异性抗体构建体、权利要求12所述的核酸分子、权利要求13所述的载体、权利要求14所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的组合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2021116637452 | 2021-12-31 | ||
| CN202111663745 | 2021-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116375867A true CN116375867A (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=86968101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211702668.1A Pending CN116375867A (zh) | 2021-12-31 | 2022-12-28 | 抗gprc5d抗体及其应用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4458851A1 (zh) |
| KR (1) | KR20240130125A (zh) |
| CN (1) | CN116375867A (zh) |
| AU (1) | AU2022424142A1 (zh) |
| WO (1) | WO2023125728A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117510636B (zh) * | 2023-11-17 | 2024-05-28 | 上海吉凯生物技术有限公司 | Gprc5d抗体及其应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2982693A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-10 | Affimed Therapeutics AG | CD3 binding domain |
| IL285101B2 (en) * | 2014-12-05 | 2024-03-01 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | G protein-coupled receptor-directed antibodies and methods of use |
| TWI781108B (zh) * | 2016-07-20 | 2022-10-21 | 比利時商健生藥品公司 | 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途 |
| RU2019128134A (ru) * | 2017-02-07 | 2021-03-09 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Антитело против gprc5d и молекула, содержащая антитело |
| WO2019094626A1 (en) * | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Bispecific antibody compositions and related methods for improved pretargeted radioimunotherapies |
| TWI829667B (zh) * | 2018-02-09 | 2024-01-21 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 結合gprc5d之抗體 |
| US12077592B2 (en) * | 2019-01-18 | 2024-09-03 | Janssen Biotech, Inc. | GPRC5D chimeric antigen receptors and cells expressing the same |
| CN115335399A (zh) * | 2019-12-06 | 2022-11-11 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 针对gprc5d靶结合结构域的抗独特型抗体以及相关组合物和方法 |
-
2022
- 2022-12-28 CN CN202211702668.1A patent/CN116375867A/zh active Pending
- 2022-12-28 KR KR1020247025806A patent/KR20240130125A/ko unknown
- 2022-12-28 EP EP22914978.6A patent/EP4458851A1/en active Pending
- 2022-12-28 AU AU2022424142A patent/AU2022424142A1/en active Pending
- 2022-12-28 WO PCT/CN2022/143042 patent/WO2023125728A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023125728A1 (zh) | 2023-07-06 |
| EP4458851A1 (en) | 2024-11-06 |
| AU2022424142A1 (en) | 2024-08-08 |
| KR20240130125A (ko) | 2024-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110305210B (zh) | 新型抗体分子、其制备方法及其用途 | |
| WO2021196268A1 (zh) | 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途 | |
| CN110914304B (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| JP7215759B2 (ja) | ４－１ｂｂ抗体およびその製造方法と使用 | |
| CN111518214A (zh) | 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用 | |
| CN113330036B (zh) | 结合pd-l1和ox40的双特异性抗体 | |
| CN112745391B (zh) | Pd-l1结合分子 | |
| CN116648462A (zh) | Cd3人源化抗体及其应用 | |
| CN113906052A (zh) | 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| EP4458854A1 (en) | Gprc5d antibody and application thereof | |
| CN115386006A (zh) | 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途 | |
| CN112703204B (zh) | 针对可溶性bcma的抗体 | |
| CA3231761A1 (en) | Anti-human cd3 antibody and use thereof | |
| WO2023125728A1 (zh) | 抗gprc5d抗体及其应用 | |
| Büyükköroğlu et al. | Engineering monoclonal antibodies: Production and applications | |
| WO2022247804A1 (zh) | 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途 | |
| CN117586397A (zh) | 抗人cd147的单克隆抗体、表达载体、细胞株及其应用 | |
| CN116547300A (zh) | 双特异性抗体及其应用 | |
| CN112759647A (zh) | 一种抗pd-l1的抗体及其制药用途 | |
| WO2023125729A1 (zh) | 一种抗cd3的人源化抗体及其在制备双特异性抗体中的应用 | |
| WO2024012513A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| WO2024012434A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| CN116789833B (zh) | 一种抗体或其片段及其制药用途 | |
| CN111434686A (zh) | 一种抗人pbx1单克隆抗体，其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途 | |
| WO2023232110A1 (zh) | 抗人cd24抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |