CN116297985A - 一种基于uplc-ms/ms的牛黄检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于UPLC‑MS/MS的牛黄检测方法，所述方法包括(1)制备供试品溶液和胆汁酸对照品溶液；(2)利用UPLC‑MS/MS检测所述供试品和对照品；(3)根据UPLC‑MS/MS检测结果判断所述供试品溶液是否含有牛黄或对所述供试品溶液中所含牛黄进行定量。本发明所述方法具有快速、准确和/或重复性好的优点，更进一步，通过该检测方法能够区分天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及一种基于UPLC-MS/MS的牛黄检测方法。
背景技术
牛黄为我国传统名贵药材。天然牛黄自然发生率低，药源紧缺且价格高昂，难以满足临床用药需求，其常用代用品为人工牛黄和体外培育牛黄。天然牛黄疗效最佳，其价格远高于其代用品，体外培育牛黄药效接近天然牛黄，其价格很高。市场上牛黄质量参差不齐，含牛黄制剂中牛黄存在投料混乱的情况。
《中国药典》2020年版一部收载了3种牛黄原料的测定方法(薄层扫描法或UV法测定胆酸含量、UV法测定胆红素含量)，以及文献报道的HPLC-ELSD法测定胆汁酸类成分。牛黄制剂中多以TLC法鉴别胆酸为主，测定胆汁酸成分含量测定方法较少，特别是测定中药成方制剂中牛黄含量的方法更少。
牛黄原料和牛黄制剂的鉴别方法单一，通常采用TLC法鉴别胆酸(CA)、去氧胆酸(DCA)或猪去氧胆酸(HDCA)；含量测定方法采用薄层扫描法操作复杂，显色等影响因素较大，测定准确度不佳。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确和/或重复性好的牛黄检测方法，更进一步，通过该检测方法能够区分天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于UPLC-MS/MS的牛黄检测方法，包括：
(1)制备供试品溶液和胆汁酸对照品溶液；
(2)利用UPLC-MS/MS检测所述供试品和对照品；
(3)根据UPLC-MS/MS检测结果判断所述供试品溶液是否含有牛黄或对所述供试品溶液中所含牛黄进行定量。
在一些具体的实施方式中，所述UPLC-MS/MS检测中色谱的检测条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH；
流动相A：甲醇；
流动相B：0.1％甲酸溶液，所述甲酸溶液含10mmol/L甲酸铵；
梯度洗脱包括：
0～2分钟，流动相A的体积分数由30％上升至60％；
2～5分钟，流动相A的体积分数由60％上升至70％；
5～10分钟，流动相A的体积分数由70％上升至90％；
10～12分钟，流动相A的体积分数由90％上升至95％；
12～13分钟，流动相A的体积分数为95％；
流速：0.2～0.4ml/min；
柱温：35～45℃。
在一些具体的实施方式中，所述UPLC-MS/MS检测中色谱的检测条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH，2.1mm×100mm，1.7μm；
流动相A：甲醇；
流动相B：0.1％甲酸溶液，所述甲酸溶液含10mmol/L甲酸铵；
梯度洗脱包括：
0～2分钟，流动相A的体积分数由30％上升至60％；
2～5分钟，流动相A的体积分数由60％上升至70％；
5～10分钟，流动相A的体积分数由70％上升至90％；
10～12分钟，流动相A的体积分数由90％上升至95％；
12～13分钟，流动相A的体积分数为95％；
流速：0.3ml/min；
柱温：40℃。
在一些具体的实施方式中，所述UPLC-MS/MS检测中质谱的检测条件包括：
电喷雾负离子模式；
多反应监测；
毛细管电压：1～2kv；
离子源温度：100～200℃；
脱溶剂气温度：500～600℃；
雾化气体积流量：700～900L/h。
在一些具体的实施方式中，所述UPLC-MS/MS检测中质谱的检测条件包括：
电喷雾负离子模式；
多反应监测；
毛细管电压：1.5kv；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：550℃；
雾化气体积流量：800L/h。
在一些具体的实施方式中，所述质谱的20种对照品的保留时间、检测离子对、CV和/或CE如表1所示。
在一些具体的实施方式中，所述胆汁酸对照品溶液包括牛磺猪去氧胆酸(THDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸钠(TDCA-Na)、猪去氧胆酸(HDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、胆酸(CA)、猪胆酸(HCA)、牛磺胆酸钠(TCA-Na)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸钠(GCA-Na)、甘氨鹅去氧胆酸钠(GCDCA-Na)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)、甘氨脱氧胆酸钠(GDCA-Na)、甘氨猪去氧胆酸钠(GHDCA-Na)、甘氨石胆酸(GLCA)、去氢胆酸(DHCA)和牛磺石胆酸钠(TLCA-Na)。
在一些具体的实施方式中，所述牛黄为天然牛黄、人工牛黄、体外培育牛黄，所述牛黄为牛黄原料或牛黄制品。
在一些具体的实施方式中，制备所述供试品溶液包括：取粉末状样品，加入甲醇，经超声处理后放冷，过滤，取滤液加入甲醇混匀后即得供试品溶液。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括制备和通过UPLC-MS/MS方法检测牛黄参考品溶液，通过比较供试品和参考品的二十种胆汁酸指纹图谱判断所述供试品是否与所述牛黄参考品属于相同类型牛黄。
在一些具体的实施方式中，所述牛黄参考品溶液包括天然牛黄参考品溶液、体外培育牛黄参考品溶液和人工牛黄溶液，通过比较供试品和参考品的二十种胆汁酸指纹图谱判断所述供试品是否属于天然牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括根据胆汁酸的种类和/含量比值区分天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄：人工牛黄含猪去氧胆酸和猪胆酸，体外培育牛黄和天然牛黄不含去氧胆酸和猪胆酸。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括根据胆汁酸的种类和/含量比值区分天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄：人工牛黄中猪去氧胆酸/去氧胆酸含量比值为10±10％，去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值为4±10％，胆酸/去氧胆酸含量比值为6.5±10％；体外培育牛黄中去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值为40±10％，胆酸/去氧胆酸含量比值为2.6±10％；天然牛黄中去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值为6±10％，胆酸/去氧胆酸含量比值为3±10％。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括根据胆汁酸含量比值区分牛黄与其他含胆汁酸物质：牛黄的牛磺胆酸钠/牛磺胆脱氧酸钠含量比值为3±10％，甘氨胆酸钠/甘氨脱氧胆酸钠含量比值为4±10％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明建立一种UPLC-MS/MS检测方法，所述方法能够定性或定量检测牛黄或牛黄制品，具有快速、准确和/或重复性好的优点；
(2)本发明所述方法还能够通过检测图谱，区分天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为UPLC-MRM图-牛磺胆酸钠(定量离子对)；
图2为UPLC-MRM图-牛磺胆酸钠(定性离子对)；
图3为UPLC-MRM图-去氢胆酸(定量离子对)；
图4为UPLC-MRM图-去氢胆酸(定性离子对)；
图5为UPLC-MRM图-甘氨熊去氧胆酸(定量离子对)；
图6为UPLC-MRM图-甘氨熊去氧胆酸(定性离子对)；
图7为UPLC-MRM图-甘氨猪去氧胆酸钠(定量离子对)；
图8为UPLC-MRM图-甘氨猪去氧胆酸钠(定性离子对)；
图9为UPLC-MRM图-甘氨鹅去氧胆酸钠(定量离子对)；
图10为UPLC-MRM图-甘氨鹅去氧胆酸钠(定性离子对)；
图11为UPLC-MRM图-甘氨脱氧胆酸钠(定量离子对)；
图12为UPLC-MRM图-甘氨脱氧胆酸钠(定性离子对)；
图13为UPLC-MRM图-甘氨胆酸钠(定量离子对)；
图14为UPLC-MRM图-甘氨胆酸钠(定性离子对)；
图15为UPLC-MRM图-甘氨胆酸钠(定性离子对)；
图16为UPLC-MRM图-牛磺熊脱氧胆酸钠(定量离子对)；
图17为UPLC-MRM图-牛磺熊脱氧胆酸钠(定性离子对)；
图18为UPLC-MRM图-牛磺熊脱氧胆酸钠(定性离子对)；
图19为UPLC-MRM图-牛磺猪去氧胆酸钠(定量离子对)；
图20为UPLC-MRM图-牛磺猪去氧胆酸钠(定性离子对)；
图21为UPLC-MRM图-牛磺猪去氧胆酸钠(定性离子对)；
图22为UPLC-MRM图-牛磺鹅去氧胆酸钠(定量离子对)；
图23为UPLC-MRM图-牛磺鹅去氧胆酸钠(定性离子对)；
图24为UPLC-MRM图-牛磺鹅去氧胆酸钠(定性离子对)；
图25为UPLC-MRM图-牛磺脱氧胆酸钠(定量离子对)；
图26为UPLC-MRM图-牛磺脱氧胆酸钠(定性离子对)；
图27为UPLC-MRM图-牛磺脱氧胆酸钠(定性离子对)；
图28为UPLC-MRM图-猪胆酸(定量离子对)；
图29为UPLC-MRM图-猪胆酸(定性离子对)；
图30为UPLC-MRM图-胆酸(定量离子对)；
图31为UPLC-MRM图-胆酸(定性离子对)；
图32为UPLC-MRM图-胆酸(定性离子对)；
图33为UPLC-MRM图-熊去氧胆酸；
图34为UPLC-MRM图-猪去氧胆酸；
图35为UPLC-MRM图-鹅去氧胆酸；
图36为UPLC-MRM图-去氧胆酸；
图37为UPLC-MRM图-牛磺石胆酸钠(定量离子对)；
图38为UPLC-MRM图-牛磺石胆酸钠(定性离子对)；
图39为UPLC-MRM图-牛磺石胆酸钠(定性离子对)；
图40为UPLC-MRM图-甘氨石胆酸(定量离子对)；
图41为UPLC-MRM图-甘氨石胆酸(定性离子对)；
图42为UPLC-MRM图-石胆酸。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1建立UPLC-MS/MS检测方法
1.供试品溶液的制备
(1)牛黄原料供试品：精密称取牛黄粉末25mg，加甲醇50mL，超声处理30min，放冷，取上清液用微孔滤膜(0.22μm)滤过，精密吸取0.2mL，再精密加入甲醇0.8ml，混匀，即得供试品溶液(每1ml含牛黄0.1mg)。
(2)牛黄制品供试品：取适量供试品片剂、丸剂，或胶囊剂或颗粒剂的内容物，研细(大蜜丸剪碎)，取粉末适量(约相当于含牛黄5～10mg)，精密称定，加甲醇50mL，超声处理30min，放冷，取上清液用微孔滤膜(0.22μm)滤过或用甲醇稀释，即得供试品溶液(每1ml约含牛黄0.1mg)。
2.对照品溶液的制备
取20种胆汁酸对照品，加甲醇稀释制成每1ml约含5ng、10ng、20ng、50ng、100ng、200ng、500ng、1μg、5μg、10μg、20μg的系列浓度混合溶液。
3.UPLC-MS/MS的检测条件
(1)色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1mm×100mm，1.7μm)。
流动相A：甲醇。
流动相B：0.1％甲酸溶液，所述甲酸溶液含10mmol/L甲酸铵。
梯度洗脱条件：0～2min，30％→60％甲醇；2～5min，60％→70％甲醇；5～10min，70％→90％甲醇；10～12min，90％→95％甲醇；12～13min，95％甲醇。
流速：0.3ml/min。
柱温：40℃。
(2)质谱条件
电喷雾负离子模式(ESI-)；多反应监测(MRM)；毛细管电压：1.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：550℃；雾化气体积流量：800L/h。20种对照品的保留时间、监测离子对、锥孔电压(CV)和碰撞电压(CE)参考值见表1。
表120种对照品的保留时间、监测离子对、锥孔电压(CV)及碰撞能(CE)
实施例2方法学验证UPLC-MS/MS方法
1.系统适用性考察
对混合对照品溶液，参照实施例1的UPLC-MS/MS方法进行检测，其MRM色谱图如附图1～42所示，20种胆汁酸成分MRM色谱峰基本分开。
2.线性关系考察
取系列混合对照品溶液，参照实施例1的UPLC-MS/MS方法进行检测，记录峰面积，浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，回归方程参见表2。
表2胆汁酸线性结果
3.精密度考察
取对照品溶液连续进样6针，参照实施例1的UPLC-MS/MS方法进行检测，各成分定量离子峰保留时间、峰面积见表3。根据表3所示结果可知，本发明所述UPLC-MS/MS方法具有高精密度。
表3胆汁酸精密度结果
4.重复性考察
取牛黄粉末制备供试品溶液，参照实施例1的UPLC-MS/MS方法进行检测，结果见表4。
表4重复性试验结果
5.稳定性考察
取对照溶液、牛黄原料供试品溶液，参照实施例1的UPLC-MS/MS方法进行检测，进行溶液的稳定性考察，结果见表5-8。
表5对照品溶液各胆汁酸稳定性结果
表6体外培育牛黄溶液各胆汁酸稳定性结果
表7人工牛黄溶液各胆汁酸稳定性结果
表8天然牛黄溶液各胆汁酸稳定性结果
测试例
参照实施例1的UPLC-MS/MS方法，对人工牛黄5批、体外培育牛黄11批、天然牛黄13批原料或对照药材，并对27批次制剂进行测定，结果见表9-14。
表9体外培育牛黄测定结果(mg/g)
表10人工牛黄测定结果(mg/g)
表11天然牛黄测定结果(mg/g)
表12制剂测定结果1(mg/g)
表13制剂测定结果2——牛黄解毒片测定结果(mg/g)
根据实施例2和测试例的结果可知：1.人工牛黄含猪去氧胆酸、猪胆酸，体外培育牛黄、天然牛黄中几乎不含二者。2.人工牛黄、体外培育牛黄各胆汁酸成分含量相对稳定，天然牛黄含量差异较大。3.人工牛黄中猪去氧胆酸/去氧胆酸含量比值约为10，去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值约为4，胆酸/去氧胆酸含量比值约为6.5；体外培育牛黄中去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值约为40，胆酸/去氧胆酸含量比值约为2.6；天然牛黄中去氧胆酸/鹅去氧胆酸含量比值约为6，胆酸/去氧胆酸含量比值约为3。4.三种牛黄中牛磺胆酸钠/牛磺胆脱氧酸钠含量比值约为3，甘氨胆酸钠/甘氨脱氧胆酸钠含量比值约为4。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基于UPLC-MS/MS的牛黄检测方法，其特征在于，包括：
(1)制备供试品溶液和胆汁酸对照品溶液；
(2)利用UPLC-MS/MS检测所述供试品和对照品；
(3)根据UPLC-MS/MS检测结果判断所述供试品溶液是否含有牛黄或对所述供试品溶液中所含牛黄进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测中色谱的检测条件包括：
色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEH；
流动相A：甲醇；
流动相B：0.1％甲酸溶液，所述甲酸溶液含10mmol/L甲酸铵；
梯度洗脱包括：
0～2分钟，流动相A的体积分数由30％上升至60％；
2～5分钟，流动相A的体积分数由60％上升至70％；
5～10分钟，流动相A的体积分数由70％上升至90％；
10～12分钟，流动相A的体积分数由90％上升至95％；
12～13分钟，流动相A的体积分数为95％；
流速：0.2～0.4ml/min；
柱温：35～45℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测中色谱的检测条件包括：
色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEH，2.1mm×100mm，1.7μm；
流动相A：甲醇；
流动相B：0.1％甲酸溶液，所述甲酸溶液含10mmol/L甲酸铵；
梯度洗脱包括：
0～2分钟，流动相A的体积分数由30％上升至60％；
2～5分钟，流动相A的体积分数由60％上升至70％；
5～10分钟，流动相A的体积分数由70％上升至90％；
10～12分钟，流动相A的体积分数由90％上升至95％；
12～13分钟，流动相A的体积分数为95％；
流速：0.3ml/min；
柱温：40℃。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测中质谱的检测条件包括：
电喷雾负离子模式；
多反应监测；
毛细管电压：1～2kv；
离子源温度：100～200℃；
脱溶剂气温度：500～600℃；
雾化气体积流量：700～900L/h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS检测中质谱的检测条件包括：
电喷雾负离子模式；
多反应监测；
毛细管电压：1.5kv；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：550℃；
雾化气体积流量：800L/h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胆汁酸对照品溶液包括牛磺猪去氧胆酸(THDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸钠(TDCA-Na)、猪去氧胆酸(HDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、胆酸(CA)、猪胆酸(HCA)、牛磺胆酸钠(TCA-Na)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸钠(GCA-Na)、甘氨鹅去氧胆酸钠(GCDCA-Na)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)、甘氨脱氧胆酸钠(GDCA-Na)、甘氨猪去氧胆酸钠(GHDCA-Na)、甘氨石胆酸(GLCA)、去氢胆酸(DHCA)和牛磺石胆酸钠(TLCA-Na)。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛黄为天然牛黄、人工牛黄、体外培育牛黄，所述牛黄为牛黄原料或牛黄制品。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述供试品溶液包括：取粉末状样品，加入甲醇，经超声处理后放冷，过滤，取滤液加入甲醇混匀后即得供试品溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备和通过UPLC-MS/MS方法检测牛黄参考品溶液，通过比较供试品和参考品的二十种胆汁酸指纹图谱判断所述供试品是否与所述牛黄参考品属于相同类型牛黄。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述牛黄参考品溶液包括天然牛黄参考品溶液、体外培育牛黄参考品溶液和人工牛黄溶液，通过比较供试品和参考品的二十种胆汁酸指纹图谱判断所述供试品是否属于天然牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄。
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|---|---|---|---|---|
| CN117907487A (zh) * | 2024-02-02 | 2024-04-19 | 安徽中医药大学 | 一种天然牛黄及其代用品的鉴别方法和应用 |
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2023
- 2023-04-19 CN CN202310417795.5A patent/CN116297985A/zh active Pending
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