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CN116283677A - 一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116283677A
CN116283677A CN202310163905.XA CN202310163905A CN116283677A CN 116283677 A CN116283677 A CN 116283677A CN 202310163905 A CN202310163905 A CN 202310163905A CN 116283677 A CN116283677 A CN 116283677A
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明提供了一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用，所述小分子化学交联剂的结构如下所示；其中R选自氢、取代或未取代的C1‑C6烷基、取代或未取代的C2‑C6烯基、取代或未取代的C2‑C6炔基、取代或未取代的C1‑C6酰胺基、取代或未取代的C6‑C12芳基中任意一种；所述取代的取代基选自卤素、羟基、氰基、C1‑C6烷基、C2‑C6烯基或C2‑C6炔基。本发明提供的小分子化学交联剂能够有效交联蛋白与其底物的结合，为研究蛋白的功能性质与应用提供了有效的工具。

Description

一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来生物质谱技术的发展使其在蛋白质结构和功能研究中发挥重要作用，为相关研究提供了重要支撑。化学交联结合质谱鉴定(Chemical cross-linking of proteinscoupled with mass spectrometry，CXMS)是近年发展起来研究蛋白质结构和相互作用的一项新技术。CXMS利用化学活性小分子交联剂将蛋白质或蛋白质复合物中空间距离接近的氨基酸通过共价键连接起来，形成蛋白质内部或分子间的共价结合。交联的蛋白质被胰酶降解以后得到交联多肽和其它多肽，再通过质谱分析得到交联多肽的序列及交联位点，从而获取蛋白质的结构信息，帮助解析蛋白质在三维空间的折叠状态及蛋白-蛋白相互作用的大致区域。CXMS对蛋白质样品量和纯度要求低，可捕获其在溶液中的动态构象，对样品的均一性及是否可结晶没有特殊要求，并且具有操作简单、快速等优点，因此近年来得到了广泛应用，如助力解析大型蛋白质复合物的精细结构，寻找蛋白-蛋白之间直接相互作用区域等。
亲和纯化质谱技术(Affinity Purification-Mass Spectrometry，APMS)是研究蛋白质-蛋白质相互作用的标准手段。蛋白质样品在亲合纯化漂洗磁珠过程中，瞬时、作用力弱的蛋白质-蛋白质相互作用通常会丢失，因而难以通过质谱检测到。另一方面，在亲和纯化后质谱分析得到的蛋白质列表之中，研究人员无法区分这些蛋白质与靶蛋白是直接相互作用的，还是间接相互作用的。此时，若在APMS实验中引入化学交联，化学交联剂把蛋白质之间的非共价结合转化为共价结合，有利于捕获瞬时和微弱的蛋白-蛋白相互作用。因此，在研究蛋白质-蛋白质相互作用时，化学交联与APMS技术联合使用会显著提高实验灵敏度，并且能够鉴别直接相互作用蛋白以及获取蛋白质相互作用界面等更加丰富的信息。特别地，对于药物研发极为重要的膜受体蛋白质，在利用亲和纯化技术处理此类蛋白质的过程中经常需要使用较为苛刻的细胞裂解和漂洗条件，因而往往会破坏蛋白质之间的相互作用。如果在亲和纯化之前使用交联剂固定膜受体蛋白质与作用蛋白，在后期样品操作过程中可以显著降低相互作用蛋白质的损失，因而将显著提高质谱分析中鉴定膜蛋白质配体及膜内结合蛋白质的效率。
近年来随着研究人员对蛋白精细结构解析、蛋白-蛋白相互作用研究等领域深入研究，一些化学交联剂被开发出来并广泛用于蛋白质化学和生物学研究。同时随着生物质谱技术的快速发展，人们鉴定化学交联剂处理后蛋白质样品中交联多肽及交联位点的技术也越来越成熟，因此CXMS技术在生物学研究研究甚至疾病病理研究中发挥越来越重要的作用。
尽管市场上已有不少化学交联剂，但是现有商业化试剂仍有一些不足之处：a)现有交联剂在蛋白质交联溶液中使用时易降解、细胞透膜性差，很少应用于活细胞；b)蛋白质分子内交联比例高，蛋白-蛋白之间交联比例低；c)交联剂往往功能单一，而多功能交联剂往往不易合成和没有商业化，或即使商业化了也非常昂贵。因此，针对商业化交联剂的不足，开发功能强大且便宜易得的化学交联剂并在体外蛋白、活细胞等多种生物学场景展示其生物学应用，具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小分子化学交联剂及其制备方法和应用。本发明提供的小分子化学交联剂能够有效交联蛋白与其底物的结合，为研究蛋白的功能性质与应用提供了有效的工具。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种小分子化学交联剂，所述小分子化学交联剂的结构如下所示：
Figure BDA0004095206160000031
其中R选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C1-C6酰胺基、取代或未取代的C6-C12芳基中任意一种。
所述取代的取代基选自卤素、羟基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基。
上述特定结构的化合物能够有效交联蛋白与其底物的结合，为研究蛋白的性质提供了有效的工具。
其中，C1-C6分别指结构中包括一个碳原子、两个碳原子、三个碳原子、四个碳原子、五个碳原子或六个碳原子等，C1-C6烷基例如可以是甲基、乙基、丙基、正丁基等，C2-C6烯基例如可以是乙烯基、丙烯基等、C2-C6炔基例如可以是乙炔基、丙炔基等。
优选地，所述R选自氢、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C1-C6酰胺基。
优选地，所述小分子化学交联剂的结构如下所示：
Figure BDA0004095206160000041
其中R具有与上述相同的限定范围。
优选地，所述小分子化学交联剂选自如下结构中任意一种：
Figure BDA0004095206160000042
优选地，所述小分子化学交联剂选自如下结构中任意一种：
Figure BDA0004095206160000043
第二方面，本发明提供了如上所述的小分子化学交联剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将苯二胺类化合物与2-氯乙烷磺酰氯缩合反应，即得到所述小分子化学交联剂。
反应路线如下：
Figure BDA0004095206160000044
其中R具有与上述相同的限定范围。
优选地，所述反应在碱存在下进行，所述碱包括4-二甲氨基吡啶、吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、碳酸钾或碳酸铯中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述反应的温度为20-30℃。
优选地，所述反应的时间为10-18h。
其中，反应的温度可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃或30℃等，时间可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h或18h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
第三方面，本发明提供了如上所述的小分子化学交联剂在研究酶和底物相互作用中的应用。
第四方面，本发明还提供了如上所述的小分子化学交联剂在蛋白质分析中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种具有特定结构的化合物，其能够有效通过化学交联捕获相互作用蛋白，为研究蛋白的功能性质提供了有效的工具。
附图说明
图1是体外PDES对Trx1与PAPR或PAPR C239S突变体进行化学交联后的蛋白质印迹分析结果图；
图2是Trx1与PAPR的复合物结构；
图3是大肠杆菌内PDES对Trx1与PAPR的化学交联后的蛋白质印迹分析结果图；
图4是大肠杆菌内PDES对Trx1与PAPR C239S突变体的化学交联后的蛋白质印迹分析结果图；
图5是293T细胞内PDES通过化学交联捕获TXN1直接互作蛋白的蛋白质印迹分析结果图；
图6是293T细胞内ePDES1通过化学交联捕获TXN1直接互作蛋白的蛋白质印迹分析结果图；
图7是293T细胞内ePDES11捕获TXN1直接互作蛋白后进行化学点击和生物素富集的质谱鉴定测试结果图；
图8是293T细胞内ePDES2通过化学交联捕获TXN1直接互作蛋白的蛋白质印迹分析结果图；
图9是293T细胞内ePDES2捕获TXN1直接互作蛋白后进行化学点击和生物素富集的质谱鉴定测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
化合物PDES的合成
Figure BDA0004095206160000061
间苯二胺(541mg5.0mmo1)溶于60mL二氯甲烷中，0℃下加入2-氯乙烷磺酰氯(2037.5mg，12.5mmo1)和吡啶(1977.5mg，25.0mmo1)，然后移到25℃，搅拌12h。反应混合物加水稀释，用乙酸乙酯(150mL)萃取。合并有机相，用饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠上干燥，浓缩。并通过硅胶色谱法纯化，得到795.6mg PDES(55％产率)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝10.08(s,2H),7.19(t,J＝8.1,1H),7.05(s,1H),6.81(dd,J＝8.1,1.8,2H),6.74(dd,J＝16.4,9.9,2H),6.13(d,J＝16.4,2H),6.06(d,J＝9.9,2H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ＝138.58,135.98,129.73,128.00,114.46,109.95、
HRMS(ESI)m/z:[M+H]+C10H16N3O4S2＝306.0577；发现,306.0573、
实施例2
化合物ePDES1的合成
Figure BDA0004095206160000071
5-碘-1,3-苯二胺(468mg，2.0mmol，1.0当量)、二苯基膦二氯化钯(34mg，0.048mmol，2.4mol％)、碘化亚铜(13mg，0.068mmo1，3.4mol％)和三甲基硅基乙炔(1.57g，16.0mmol，8.0当量)中加入2.0mL三乙胺和8.0mL四氢呋喃，25℃搅拌12h。反应完成后，上清液用四氢呋喃洗涤，合并有机相浓缩。硅胶柱层析分离得到目标产物化合物1，为棕色固体(370mg，90.69％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.24(2H,br d,J＝1.6Hz),5.99(1H,br t,J＝1.6Hz),0.22(9H,s)。MS(ESI)C11H17N2Si[M+H]+＝205.12,发现204.82。
化合物1(369mg，1.81mmol，1.0当量)，吡啶(760mg，9.61mmol，5.3当量)和催化量的4-二甲氨基吡啶(47mg，0.38mmol，0.2当量)溶于二氯甲烷中，在0℃下将2-氯乙烷磺酰氯(689mg，4.23mmol，2.3当量)滴加到反应液中。25℃反应，搅拌12h。1M盐酸(2次)和碳酸氢钠溶液洗涤混合物，然后酮饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，硅胶柱层析分离得到化合物2，为黄色油状物(360mg，51.72％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.22(2H,br s),7.10(1H,br t,J＝1.9Hz),6.84(2H,d,J＝1.9Hz),6.78(2H,dd,J＝16.4,9.9Hz),6.14(2H,d,J＝16.4Hz),6.09(2H,d,J＝9.9Hz),0.22(9H,s)。
化合物2溶于4.4mL N,N-二甲基甲酰胺中，25℃条件下，加入0.88mL水和氟化钾(119mg,2.05mmol,2.2当量)。25℃下反应4小时。加入饱和氯化铵和乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥，旋干，硅胶柱层析分离得到化合物3(即ePDES1)，为黄色油状物(360mg，51.72％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.06(1H,bt t,J＝1.9Hz),7.00(2H,d,J＝1.9Hz),6.82(2H,br s),6.56(2H,dd,J＝16.5,9.9Hz),6.37(2H,d,J＝16.5Hz),6.05(2H,d,J＝9.9Hz),3.11(1H,s)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ137.7,134.7,129.4,124.5,119.4,111.7,81.9,79.0。HRMS(ESI)C12H13N2O4S2[M+H]+＝313.0311,发现313.0293。
实施例3
化合物ePDES2的合成
Figure BDA0004095206160000081
Figure BDA0004095206160000091
3,5-二氨基苯甲酸甲酯(1.0g，6.02mm ol，1.0当量)、吡啶(2.38g，30.10mmol，5.0当量)和催化量4-二甲氨基吡啶(147mg，1.20mm ol，0.2当量)溶于30mL二氯甲烷中，冷却至0℃后将2-氯乙烷磺酰氯(2.16g，13.24mmol，2.2当量)滴加到反应液中，然后将反应液移至25℃，搅拌12h。用1M盐酸(2次)和碳酸氢钠溶液洗涤混合物，最后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干。硅胶柱层析分离得到黄色固体4(1.28g，61.54％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.34(2H,s),7.43(2H,d,J＝1.9Hz),7.30(1H,t,J＝1.9Hz),6.77(2H,dd,J＝16.4,9.9Hz),6.14(2H,d,J＝16.4Hz),6.08(2H,d,J＝9.9Hz),3.82(3H,s).MS Calcd forC12H15N2O6S2 347.04[M+H]+,found 347.00。
将化合物4溶于18.5mL四氢呋喃中，冷却到0℃，然后滴加18.5mL氢氧化锂溶液(354mg，14.78mmol，4.0当量)。25℃反应，搅拌12h。0℃下滴加1M盐酸溶液，调节pH至3～4，减压蒸馏除掉四氢呋喃，水溶液用10％甲醇/二氯甲烷(5次)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，然后浓缩至干燥，得到所需淡白色固体产品5(1.21g，98.37％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.09(1H,br s),10.28(2H,s),7.41(2H,d,J＝1.9Hz),7.27(1H,t,J＝1.9Hz),6.76(2H,dd,J＝16.4,9.9Hz),6.14(2H,d,J＝16.4Hz),6.08(2H,d,J＝9.9Hz)。
25℃条件下将化合物5(960mg，2.89mmol，1.0当量)、HATU(1.65g，4.34mmol，1.5当量)、三乙胺(585mg，5.78mm ol，2.0当量)和炔丙胺(160mg，2.89mmol，1.0当量)加入15m L干燥的N,N-二甲基甲酰胺中搅拌12h。反应液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤(3次)，无水硫酸钠干燥，旋干。硅胶柱层析分离得到黄色油状产物6(即ePDES1，255mg，收率23.88％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.24(2H,s),8.90(1H,t,J＝5.4Hz),7.23(2H,brd),7.18(1H,br t),6.77(2H,dd,J＝16.4,9.9Hz),6.14(2H,d,J＝16.4Hz),6.07(2H,d,J＝9.9Hz),3.98(2H,dd,J＝5.4,2.2Hz),3.12(1H,t,J＝2.2Hz).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ165.8,138.8,136.4,136.0,128.4,114.0,113.1,81.4,73.1,28.8。MS(ESI)C14H16N3O5S2[M+H]+＝370.0526，发现370.0526。
之后对实施例1-3提供的化合物进行测试。
材料和方法
蛋白质表达：pET-22b-Trx1-6×His， pET-22b-Tpx-flag-6×His，pET-22b-PAPR-flag-6×His ， pRSF-Duet1-Trx1-6×His-tpx-flag, ，pRSFDuet-1-Trx1-6×His-cysh-flag分别转化为BL21(DE3)化学感受态细胞。将转化子接种于含抗生素的LB琼脂平板上。将单个菌落接种到5mL含有抗生素的2×YT中，并在37℃下培养12h。将1mL的细胞培养液稀释到100mL含抗生素的LB中并震荡培养。当OD 600约为0.6时，加入400μmol IPTG(Sangon)诱导蛋白表达，然后在37℃下分别孵育4h(pET-22b-Trx1-6×His、pET-22b-TPx-FLAG-6×His和pET-22b-PAPR-FLAG-6×His)和2h(共表达质粒)。收集细胞，在4℃下4000×g离心30min，在-80℃下保存用于纯化或用于PDES的交联。
体外交联反应：在20μL反应中，10μM Trx1(在Hepes缓冲液中，pH8.0)和10μM的TPX或PAPR(在Hepes缓冲液中，pH8.0)用0.5mM的PDES在25℃下交联4h，对应的蛋白质/交联剂摩尔比为1:50。交联反应在25℃下通过加入100mM DTT(Sangon)并孵化20分钟终止。
活细胞交联反应：在30μL大肠杆菌或者293T细胞重悬液中用不同交联剂浓度(0、0.25mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM)进行浓度测试。PDES也是通过离心和PBS洗涤去除。通过蛋白质印迹分析来自这些30μL级体系的细胞样品。
His-Tag蛋白的纯化：细胞悬浮在12mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0,500mMNaCl，20mM咪唑，1％v/v吐温20，蛋白酶抑制剂cocktail)中，细胞裂解液在冰水浴中用超声仪(Fisher Science，
Figure BDA0004095206160000111
30％输出，10min，关闭2s，开启1s)用于大肠杆菌细胞裂解超声，然后离心(21000×g，30min，4℃)。收集可溶性组分，用预平衡的Ni-NTA琼脂糖树脂(200μL/100mL培养物，SMART-Lifesciences)在4℃恒定机械旋转下孵育1h。将浆液装入Poly-Prep色谱柱(Sangon Biotech)，用5mL洗涤缓冲液1(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl和20mM咪唑)洗涤3次，用200μL洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0,500mM NaCl和250mM咪唑)洗脱5次。使用Amicon Ultra柱(Millipore)将洗脱液浓缩并换到蛋白质储存缓冲液1(50mMHepes,pH 8.0,和250mM NaCl)，并储存在-80℃以备将来分析。
首先在体外研究了Trx1(硫氧还原蛋白)与其已知的蛋白结合蛋白3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸盐还原酶(PAPR)的BVSB交联性。PAPR催化3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸盐生成亚硫酸盐，其机制涉及与Trx1结合以恢复活性酶。为了共价捕获PAPR/Trx1复合体，将His标记的Trx1和PAPR与PDES在25℃下孵育4h。如图1所示，在Western印迹上检测到与Trx1/PAPR杂二聚体的共价复合物相对应的交联带，交联点是与Trx1和PAPR的酶活性中心相对应的半胱氨酸残基，它们在晶体结构上彼此接近(图2)。当活性部位Cys239突变为Ser时，没有检测到交联带(图1)，突出了PDES捕获互作蛋白活性半胱氨酸的特异性。重要的是，尽管Trx1以相对较低的结合亲和力(Kd～110μM)与PAPR的还原形式结合，但PDES仍然成功地捕捉到了这种弱的蛋白质-蛋白质相互作用。
接着，进一步通过共表达His标记的Trx1和Flag标记的PAPR在活的大肠杆菌细胞中测试了PDES的交联活性(图3)。用不同浓度的PDES进行活细胞交联后在蛋白质印迹分析发现，使用抗His和抗FLAG抗体均可见Trx1和PAPR异二聚体的交联带(图3)。然而，当PAPR的Cys239突变为Ser时，Trx1/PARP的交联条带基本消失(图4)。这些结果表明，PEDS是细胞渗透性交联剂，它能很好地靶向Trx1与其相互作用蛋白的结合界面上的Cys残基。
在哺乳动物细胞中，硫氧还蛋白(TXN)不仅参与二硫交换反应，还参与半胱氨酸残基的可逆亚硝基化(SNO)。以前的化学蛋白质组学研究发现，用S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)处理后，细胞提取物中有3632个潜在的SNO目标蛋白，表明SNO修饰的普遍性。虽然TXN1中的Cys32和35残基对二硫交换反应很重要，但Cys73被认为是催化转硝化作用的。因此，我们假设在3632个潜在的SNO目标蛋白中，那些能与TXN1的Cys73交联的蛋白是TXN1的潜在SNO底物。为了验证这一假设，我们用表达His标记的TXN1的质粒转染HEK293T细胞，并使用PDES进行活细胞交联。蛋白质印迹分析显示，与PDES交联后，有大量交联条带(图5)，表明成功捕获了TXN1结合蛋白。
之后对ePDES1、ePDES2进行测试，在补充有10％FBS和抗生素的DMEM中生长人293T细胞，并在37℃、5.0％CO 2培养箱中培养。
瞬时转染时，将15μg TXN1-6×它的哺乳动物表达载体和30μL PEI 25K(BIOHUB)分别与400μL DMEM混合并静置5分钟，然后将PEI溶液和质粒溶液混合并静置15分钟，然后将混合物加入一个10cm培养皿中。
48小时后，将转染后的293T细胞刮取下来并用PBS洗涤3次。最后用800μL PBS重悬细胞(最终体积约1.2mL)，并加入0.5mM ePDES1/2 3小时(4℃下缓慢旋转1小时使交联剂进入细胞，在25℃下静止2小时进行交联)。然后离心样品(500g，4℃，1分钟)以除去上层液体，然后用PBS洗涤3次以彻底去除多余的交联剂，并加入50mM NH4CO3以淬灭反应。
上述反应条件用于质谱分析。在此之前，在30μL细胞重悬液中用不同交联剂浓度(0、0.25mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM)进行浓度测试。ePDES1/2也是通过离心和PBS洗涤去除。通过蛋白质印迹分析来自这些30μL体系的细胞样品。
从293T细胞中纯化TXN1交联复合物：用补充有蛋白酶抑制剂(罗氏)的配置缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl，1％v/v吐温20)裂解细胞样品。在冰水浴中用超声仪(
Figure BDA0004095206160000131
30％输出，5分钟，2秒关闭，1秒开启)对细胞裂解物进行超声处理，然后离心(21000×g，30分钟，4℃)。收集可溶性组分并加入预平衡的Ni-NTA琼脂糖树脂(200μL/100mL培养物，智能生命科学)在4℃下孵育1小时，并具有恒定的机械旋转。将浆液上样到Poly-Prep色谱柱(Sangon Biotech)上，用5mL洗涤缓冲液1(50mM Tris-HCl pH 8.0、500mM NaCl和20mM咪唑)洗涤3次，并用200μL洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，500mM NaCl和250mM咪唑)洗脱5次。使用Amicon Ultra色谱柱(Millipore)浓缩洗脱液并将缓冲液交换到蛋白质储存缓冲液1(50mM Hepes，pH 8.0和250mM NaCl)中，并储存在-80℃以备将来分析。
点击化学和富集：将200μg样品稀释到缓冲液(50mM Hepes，pH 7.5和150mM NaCl)至0.5μg/μL，随后加入1mM生物素-PEG3-叠氮化物，10mM抗坏血酸钠，5mM TBTA和10mMCuSO4进行CuAAC反应。允许样品在25℃下反应2小时，旋转和光保护。将样品加载到10K过滤器中，在点击化学后用8M尿素缓冲液更换缓冲液5次。用5mM TCEP(Sigma)还原20分钟并在黑暗中用10mM碘乙酰胺(Sigma)烷基化15分钟后，用50mM NH4CO3更换缓冲液，并用胰蛋白酶(来自Promega，以50:1的蛋白质:酶比)在37℃下酶切16小时，然后在PBS缓冲液和20℃下用链霉亲和素珠富集2小时。链霉亲和素珠用1M KCl洗涤1次，PBS洗涤1次，10％乙腈洗涤3次，然后用200μL缓冲液(50％乙腈，5％FA)洗脱3次，抽干脱盐后用质谱分析。
质谱方法：将酶切的肽上样到Easy-nLC 1200系统的分析柱(75×15cm，1.9μmC18，1μm尖端)。以60分钟梯度以300nL min-1的流速分析样品，如下所示：2–8％ B持续2分钟，8–27％ B持续43分钟，27–35％ B持续8分钟，35–100％ B持续3分钟，100％ B持续4分钟。Q Exactive HF-X质谱仪在数据依赖模式下运行，在R＝60 000(m/z 200)下进行一次完整的MS扫描，然后进行20次HCD MS/MS扫描，R＝15 000，NCE＝27，隔离宽度为1.6m/z。MS1和MS2扫描的AGC靶标分别为1×106和5×104，MS1和MS2的最长注入时间分别为20和45ms；禁用了同位素的排除；动态排除设置为45秒。
数据分析：使用pLink 2软件鉴定交联肽。pLink搜索参数：母离子质量公差20ppm；片段质量公差20ppm；肽长度每链最少6个氨基酸，最大60个氨基酸；每链肽质量最小600，最大6000Da，半胱氨酸可变修饰为57.02146；酶：胰蛋白酶；每链三个缺失的解理位点。蛋白质序列从Uniprot下载。
测试结果见图6-9。从图6和图8的结果可以发现ePDES1、ePDES2均实现了在活细胞体内的交联，并且成功捕获了TXN1结合蛋白。此外从图7、9还可以发现，ePDES1、ePDES2通过点击化学反应和富集能够有效富集交联肽数目，能够进一步提升蛋白质谱分析的分辨率，鉴定低表达蛋白或不易捕获的瞬时相互作用蛋白。
以上内容充分证明了本发明提供的小分子化学交联剂能够有效通过化学交联捕获直接互作蛋白，并能够有效富集交联肽段，具有优秀的技术效果，为研究蛋白的功能性质提供了有效的工具。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的小分子化学交联剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种小分子化学交联剂，其特征在于，所述小分子化学交联剂的结构如下所示：
Figure FDA0004095206150000011
其中R选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C1-C6酰胺基、取代或未取代的C6-C12芳基中任意一种；
所述取代的取代基选自卤素、羟基、氰基、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基。
2.根据权利要求1所述的小分子化学交联剂，其特征在于，所述R选自氢、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C1-C6酰胺基。
3.根据权利要求1或2所述的小分子化学交联剂，其特征在于，所述小分子化学交联剂的结构如下所示：
Figure FDA0004095206150000012
其中R具有与权利要求1或2相同的限定范围。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的小分子化学交联剂，其特征在于，所述小分子化学交联剂选自如下结构中任意一种：
Figure FDA0004095206150000013
Figure FDA0004095206150000021
5.根据权利要求4所述的小分子化学交联剂，其特征在于，所述小分子化学交联剂选自如下结构中任意一种：
Figure FDA0004095206150000022
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的小分子化学交联剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将苯二胺类化合物与2-氯乙烷磺酰氯缩合反应，即得到所述小分子化学交联剂；
反应路线如下：
Figure FDA0004095206150000023
其中R具有与权利要求1-3中任一项相同的限定范围。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述反应在碱存在下进行，所述碱包括4-二甲氨基吡啶、吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、碳酸钾或碳酸铯中任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为20-30℃；
优选地，所述反应的时间为10-18h。
9.一种根据权利要求1-5中任一项所述的小分子化学交联剂在研究酶和底物相互作用中的应用。
10.一种根据权利要求1-5中任一项所述的小分子化学交联剂在蛋白质分析中的应用。
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