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CN116270598A - 包含泰德诺b的药物组合物及泰德诺b在治疗乳腺癌中的应用 - Google Patents

包含泰德诺b的药物组合物及泰德诺b在治疗乳腺癌中的应用 Download PDF

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CN116270598A
CN116270598A CN202310137529.7A CN202310137529A CN116270598A CN 116270598 A CN116270598 A CN 116270598A CN 202310137529 A CN202310137529 A CN 202310137529A CN 116270598 A CN116270598 A CN 116270598A
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CN
China
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breast cancer
her2
pharmaceutical composition
sodium
tedenob
Prior art date
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Pending
Application number
CN202310137529.7A
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English (en)
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孙宇辉
项瑾
邓子新
张亚峰
蒋洁琳
潘淑康
丁章贵
杨锐
刘敏
赵兴平
贾鳗
谢吉林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Menghai Tea Industry Co ltd
Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd
Original Assignee
Menghai Tea Industry Co ltd
Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供了包含泰德诺B的药物组合物及泰德诺B在治疗乳腺癌中的应用。所述药物组合物包含作为活性成分的泰德诺B，和可药用的辅料，其中所述药物组合物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。本发明的包含泰德诺B的药物组合物可用作抑制乳腺癌细胞生长和增殖、抗乳腺癌或预防乳腺癌的药物，特别是对于三阴性乳腺癌具有显著的抑制作用。

Description

包含泰德诺B的药物组合物及泰德诺B在治疗乳腺癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及包含泰德诺B(Teadenol B)的药物组合物及泰德诺B在治疗乳腺癌中的应用。
背景技术
乳腺癌是最常见的女性癌症。全世界有超过100万女性受到这种疾病的影响。乳腺X射线摄影筛查的实施、辅助全身治疗的改进以及激素替代治疗使用的减少，使发达国家乳腺癌发病率和死亡率均有所降低。然而，在世界范围内，乳腺癌仍是女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一，亚洲乳腺癌的发病率呈现逐年上升的趋势。乳腺癌细胞根据雌激素受体ER、孕激素受体PR、人类表皮生长因子受体HER2表型特征主要分为四类：三阴乳腺癌(ER-，PR-，HER2-)、HER2阳性乳腺癌(ER-，PR-，HER2+)、Luminal A型乳腺癌(ER+，PR+/-，HER2-)和Luminal B型乳腺癌(ER+，PR+/-，HER2+)。
诸如普洱熟茶之类的微生物发酵茶中含有许多生物活性物质，主要为多酚类、儿茶素类、黄烷双醇、黄酮类、酚酸类、茶色素类、皂苷、多糖、生物碱、维生素、氨基酸和有机酸类等被研究和报道过的化学成分，且大多数物质为茶叶共有物质，只有极少数化合物被报道为仅能从普洱熟茶中分离得到。鉴定普洱茶特征性化学成分的生物活性，是开展普洱茶功效机制研究的基础。
通过对比普洱熟茶和微生物发酵茶指纹图谱数据，发现了普洱熟茶与其他微生物发酵茶存在一种共性化合物成分——泰德诺B(Teadenol B)，其化学结构式如下式I所示。
Figure BDA0004087042100000011
2011年，日本专利JP2011083280A公开了分离自曲霉属真菌(Aspergillus sp.PK-1)发酵茶叶代谢产物的新化合物泰德诺B，并且公开了泰德诺B的脂联素分泌促进活性和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B)表达抑制活性及应用。日本专利JP2011084560A公开了通过使微生物发酵茶叶经过提取处理而分离出泰德诺B。专利文献CN108117558A公开了从发酵茶中拆分出泰德诺B的方法。2016年报道了泰德诺B的全合成。然而，目前关于泰德诺B的其他功能活性研究未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了包含泰德诺B的药物组合物及泰德诺B在治疗乳腺癌中的应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种药物组合物，包含作为活性成分的泰德诺B，和可药用的辅料，其中所述药物组合物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
(2)根据(1)所述的药物组合物，其中所述可药用的辅料包括纤维素类助溶稳定剂、胆盐、表面活性剂、脂肪酸、环糊精、甘油酯、水杨酸盐、螯合剂、可溶胀性聚合物、调节剂；优选地，所述纤维素类助溶稳定剂包括羧甲基纤维素钠；所述胆盐包括胆酸钠、脱氧胆酸钠、硫磺胆酸钠、甘胆酸钠；所述表面活性剂包括聚山梨酯、月桂醇硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠；所述脂肪酸包括癸酸钠、油酸；所述环糊精包括羟丙基β-环糊精、甲基β-环糊精；所述甘油酯包括植物油、中链甘油酯、磷脂、聚氧乙烯甘油酯；所述水杨酸盐包括水杨酸钠、甲氧水杨酸钠；所述螯合剂包括乙二胺四乙酸、皂角苷；所述可溶胀性聚合物包括淀粉、壳聚糖；所述调节剂包括柠檬酸。
(3)根据(1)所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为通过口服给药的口服剂型，所述口服剂型包括口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂，所述口服液体制剂包括溶液剂、乳剂、混悬剂。
(4)根据(1)所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，每周施用2次至7次。
(5)泰德诺B在制备用于预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。
(6)根据(5)所述的应用，其中所述药物包含治疗有效量的泰德诺B；优选地，所述药物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
(7)根据(5)所述的应用，其中所述药物被配制为通过口服给药。
(8)根据(5)所述的应用，其中所述药物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，每周施用2次至7次。
(9)根据(5)所述的应用，其中所述乳腺癌包括含有以下一种或多种乳腺癌细胞的乳腺癌，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
(10)泰德诺B在体外抑制以下一种或多种乳腺癌细胞的应用，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1.本发明首次证实了泰德诺B具有优良的抑制乳腺癌细胞生长与增殖的活性。
2.本发明提供了泰德诺B对MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、BT474乳腺癌细胞的抑制活性和敏感乳腺癌潜在作用靶点。
3.本发明的包含泰德诺B的药物组合物以口服方式给药，可有效抑制乳腺癌肿瘤体积和肿瘤重量增加率，并且在以75mg/kg的剂量、每周2次至3次施用4周后无明显毒性反应。
4.本发明的包含泰德诺B的药物组合物可用作抑制乳腺癌细胞生长和增殖、抗乳腺癌或预防乳腺癌的药物，特别是对于三阴性乳腺癌具有显著的抑制作用。
附图说明
图1示出了MDA-MB-231细胞存活率随泰德诺B浓度的变化(**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)。
图2示出了MDA-MB-453细胞存活率随泰德诺B浓度的变化(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)。
图3示出了MCF-7细胞存活率随泰德诺B浓度的变化(**p＜
0.01，***p＜0.001，n＝5)。
图4示出了BT474细胞存活率随泰德诺B浓度的变化(**p＜
0.01，***p＜0.001，n＝5)。
图5示出了泰德诺B干预MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、BT474乳腺癌细胞产生差异蛋白表达的KEGG通路分析结果。
图6示出了裸鼠的乳腺肿瘤体积随时间变化的图，其中实心圆表示施用泰德诺B组，实心方块表示对照组(NS，p>0.05，*p＜0.05，
**p＜0.01，n＝7)。
图7示出了施用泰德诺B对乳腺肿瘤重量增加率的影响(*p＜
0.05，n＝7)。
图8示出了裸鼠体重随时间变化的图，其中实心圆表示施用泰德诺B组，实心方块表示对照组(p>0.05，n＝7)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参考附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明对泰德诺B的生物活性及药理性质进行了进一步研究，发现并证实了其能够有效抑制乳腺癌细胞，从而开发了用于预防和/或治疗乳腺癌的药物组合物。特别地，对于雌激素受体ER、孕激素受体PR和人类表皮生长因子受体HER2表型均为阴性的三阴性乳腺癌而言，其具有有丝分裂率高、淋巴细胞浸润率高、分级高、肿瘤体积大的特点，是目前临床治疗预后最差的一类乳腺癌。本发明为乳腺癌的治疗提供了新的思路和有效方案。
本发明一个方面提供了一种药物组合物，包含作为活性成分的泰德诺B，和可药用的辅料，其中所述药物组合物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，更优选包含单次剂量为25mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
本发明使用的泰德诺B可以根据专利申请CN108117558A和专利CN108117558B所述的方法制备，所得的泰德诺B的纯度大于95％。这些专利文献的全部内容以引用方式并入本文。本领域技术人员可以理解，本发明使用的泰德诺B也可以根据本领域已知的其他方法制备，只要纯度满足本发明的要求即可。
在一些实施方案中，本发明使用的泰德诺B的纯度可大于96％、大于97％，大于98％，甚至大于99％。
基于本发明的研究数据，在一些优选的实施方案中，所述药物组合物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，更优选包含单次剂量为25mg/kg至75mg/kg的泰德诺B；每周施用2次至7次，优选每周施用2次至5次。所述药物组合物可以连续施用2周、3周、4周、或更长的时间。
本领域技术人员可以理解，根据乳腺癌患者的具体症状和病情，可通过多个疗程的方式施用本发明的药物组合物。例如将4周作为一个疗程，施用本发明的药物组合物1个、2个或更多个疗程。
还优选地，所述药物组合物被配制为通过口服给药的口服剂型。口服剂型的实例可包括口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂。在一些实施方案中，口服液体制剂包括溶液剂、乳剂、混悬剂。
在一些实施方案中，可药用的辅料包括口服药物制剂常用辅料。口服药物制剂常用辅料的实例包括纤维素类助溶稳定剂、胆盐、表面活性剂、脂肪酸、环糊精、甘油酯、水杨酸盐、螯合剂、可溶胀性聚合物、调节剂。
在一些实施方案中，纤维素类助溶稳定剂包括羧甲基纤维素钠。在一些实施方案中，胆盐包括胆酸钠、脱氧胆酸钠、硫磺胆酸钠、甘胆酸钠。在一些实施方案中，表面活性剂包括聚山梨酯、月桂醇硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠。在一些实施方案中，脂肪酸包括癸酸钠、油酸。在一些实施方案中，环糊精包括羟丙基β-环糊精、甲基β-环糊精。在一些实施方案中，甘油酯包括植物油、中链甘油酯、磷脂、聚氧乙烯甘油酯。在一些实施方案中，水杨酸盐包括水杨酸钠、甲氧水杨酸钠。在一些实施方案中，螯合剂包括乙二胺四乙酸、皂角苷。在一些实施方案中，可溶胀性聚合物包括淀粉、壳聚糖。在一些实施方案中，调节剂包括柠檬酸。
本发明的药物组合物还可包含其他可药用成分，例如任何合适的药物赋形剂，例如掩盖或改善泰德诺B味道的调味剂、改善泰德诺B分散性的分散剂和缓冲剂。
可通过混合各种成分，并且必要时为了实现均匀性而进行加热和/或搅动，从而制备本发明的药物组合物。在优选的实施方案中，将泰德诺B置于合适的容器中，然后添加羧甲基纤维素钠水溶液以得到混合物。可对混合物进行加热和搅动(例如通过搅拌)以加快泰德诺B的溶解或使其均匀分散。加热混合物的温度应低于使混合物中各成分产生化学变化的温度。然后使混合物冷却(例如，冷却至环境温度附近，例如20℃至30℃)。可在该方法的任意合适的阶段添加其他成分，例如调味剂、分散剂和缓冲剂。
本发明另一个方面还提供了泰德诺B在制备用于预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。
所述药物可包含治疗有效量的泰德诺B。优选地，所述药物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，更优选包含单次剂量为25mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
还优选地，所述药物被配制为通过口服给药。口服给药的剂型的实例包括，口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂。在一些实施方案中，口服液体制剂包括溶液剂、乳剂、混悬剂。
还优选地，所述药物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，更优选包含单次剂量为25mg/kg至75mg/kg的泰德诺B；每周施用2次至7次，优选每周施用2次至5次。在一些实施方案中，所述药物可以连续施用2周、3周、4周、或更长的时间。
在一些实施方案中，所述乳腺癌包括含有以下一种或多种乳腺癌细胞的乳腺癌，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
特别地，本发明发现泰德诺B对于(ER-，PR-，HER2-)三阴性乳腺癌具有显著的抑制作用。
受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)的乳腺癌细胞的例子包括MDA-MB-231；受体表型特征为(ER-，PR-，HER2+)的乳腺癌细胞的例子包括MDA-MB-453；受体表型特征为(ER+，PR+/-，HER2-)的乳腺癌细胞的例子包括MCF-7；受体表型特征为(ER+，PR+/-，HER2+)的乳腺癌细胞的例子包括BT474。
本发明另一个方面还提供了泰德诺B在体外抑制以下一种或多种乳腺癌细胞的应用，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
本发明所发现的泰德诺B抗乳腺癌细胞的作用除了可用于制备乳腺癌细胞增殖抑制药物以外，还可以用于抗乳腺癌或预防乳腺癌药物的研究。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
实施例
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
以下除非特别说明，否则以下例子中所用原辅料、设备、仪器均可由常规渠道或市场购得。
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
实施例1：泰德诺B对乳腺癌细胞的抑制活性
1.试剂
细胞培养试剂
PBS缓冲液(细胞培养级)，天津灏洋华科生物科技有限公司；L-15培养液(含酚红)，杭州吉诺生物医药技术有限公司；MEM培养液(含酚红)，杭州吉诺生物医药技术有限公司；RPMI 1640培养液(含酚红)，杭州吉诺生物医药技术有限公司；RPMI 1640培养液(无酚红)，杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；0.25％胰蛋白酶，上海朗顿生物技术有限公司；胰岛素，上海阿拉丁试剂公司；100×非必需氨基酸，武汉科瑞生物技术有限公司。
MTT测试试剂
MTT(噻唑蓝)，武汉科瑞生物技术有限公司进口分装；聚乙二醇400(PEG400，化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜(DMSO，分析纯、细胞培养级)，武汉贝茵莱生物科技有限公司进口分装。
对照药物
他莫昔芬(TAM，Sigma-Aldrich)。
2.细胞株及细胞培养
根据受体表型特征，本发明选择了四种乳腺癌细胞系作为研究对象，即MDA-MB-231(受体表型特征ER-，PR-，HER2-)、MDA-MB-453(受体表型特征ER-，PR-，HER2+)、MCF-7(受体表型特征ER+，PR+/-，HER2+)、BT474(受体表型特征ER+，PR+/-，HER2+)。乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT474和MCF-7购自广州赛库生物技术有限公司；乳腺癌细胞株MDA-MB-453购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。
本发明所用乳腺癌细胞具体分类见下表1。
表1.本发明所用的乳腺癌细胞及其受体表型特征
Figure BDA0004087042100000091
注：ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；HER2：人类表皮生长因子受体；
+：阳性表达；-：阴性表达。
MDA-MB-231和MDA-MB-453培养于含10％胎牛血清的含酚红的L-15培养基，在37℃培养箱中培养；MCF-7培养于含10％胎牛血清、10μg/mL胰岛素和1×非必需氨基酸的含酚红的MEM培养基，在37℃和5％ CO2培养箱中培养；BT474培养于含10％胎牛血清、10μg/mL胰岛素的含酚红的RPMI 1640培养基，在37℃和5％ CO2培养箱中培养。
3.乳腺癌细胞活性抑制的测定
分别收集上述MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7或BT474乳腺癌对数期细胞接种于96孔板，每孔添加100μL细胞悬液，将细胞密度调节为8000个细胞/孔。5％ CO2、37℃培养至细胞单层铺满孔底，换用无酚红的RPMI 1640培养液，添加具有梯度浓度的泰德诺B溶液(0～200μg/mL泰德诺B(根据专利申请CN108117558A和专利CN108117558B的实施例一所述的方法制备，纯度大于96％)，溶剂为无酚红的RPMI 1640培养液，含0.1％ PEG400作为助溶剂)，5％CO2、37℃培养24h。每孔添加10μL MTT溶液，使MTT浓度为5mg/mL，继续培养4h。终止培养，弃去培养液，用PBS冲2次后，每孔添加150μL DMSO，轻轻振荡，使结晶物充分溶解。
用酶标仪(美国Bioteck EON)测定各孔在570nm处的吸光度值。同时设置空白调零孔(培养基、MTT)，对照孔(细胞、培养液、MTT、0.1％ PEG400)，操作均与上述相同，每组设定5个复孔。
4.乳腺癌细胞活性抑制的结果
如图1所示，对于MDA-MB-231细胞，当泰德诺B浓度大于等于20μg/mL后，细胞存活率发生显著下降，并且与对照组相比具有统计学差异。
如图2所示，对于MDA-MB-453细胞，当泰德诺B浓度大于等于10μg/mL后，细胞存活率与对照组相比都具有统计学差异，并且当泰德诺B浓度大于等于50μg/mL后，细胞存活率发生显著下降。
如图3所示，对于MCF-7细胞，当泰德诺B浓度大于等于100μg/mL后，细胞存活率与对照组相比都具有统计学差异。
如图4所示，对于BT474细胞，当泰德诺B浓度大于等于10μg/mL后，细胞存活率与对照组相比都具有统计学差异。
由上述结果可知，泰德诺B对于乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT474的抑制作用更强，对于乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用稍弱。泰德诺B对上述四种乳腺癌细胞的半数抑制浓度IC50示于下表2中。
表2.泰德诺B对乳腺癌细胞株的IC50(μg/mL)
细胞株 受体表型特征 泰德诺B TAM
MDA-MB-231 ER-，PR-，HER2- 35 7
MDA-MB-453 ER-，PR-，HER2+ 30 5
MCF-7 ER+，PR+/-，HER2- 145 5
BT474 ER+，PR+/-，HER2+ 25 5
注：TAM为对照药物他莫昔芬。
由表2的结果可知，泰德诺B对于乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT474的IC50在25μg/mL至35μg/mL的较低范围内。对于乳腺癌细胞MCF-7的IC50为145μg/mL。
实施例2：泰德诺B抗乳腺癌潜在作用靶点的筛选
1.试剂
细胞培养试剂
与实施例1中的细胞培养试剂相同。
非标记定量(Label-free)检测试剂
二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、脱氧胆酸钠(SDC)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甲酸(FA,LC-MS)、蛋白酶抑制剂混合物片剂、盐酸均购于Sigma-Aldrich公司；乙腈(ACN,LC-MS)、H2O(LC-MS)、丙酮均购于上海安谱实验科技股份有限公司；乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；三氟乙酸(TFA)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；增强型BCA蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。
2.泰德诺B的施用及样品收集
细胞培养
对于MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7或BT474细胞，将培养瓶中的贴壁细胞使用0.25％的胰酶消化后，使用血细胞计数板进行细胞计数，在6孔板中按照5×105个细胞/mL添加2mL细胞悬液，将6孔板置于含5％ CO2、37℃的细胞培养箱中继续培养，待细胞重新贴壁，并且细胞汇合度达到80％时进行后续实验。
泰德诺B的施用
吸弃培养液，使用PBS漂洗1次后，对各细胞施用泰德诺B。将实验组分为泰德诺B施用组和溶剂对照组，泰德诺B施用组每孔添加泰德诺B溶液2mL(20μg/mL泰德诺B，溶剂为无酚红的RPMI 1640培养液，含0.1％ PEG400作为助溶剂)，溶剂对照组每孔添加溶剂对照液2mL(无酚红的RPMI 1640培养液，含0.1％ PEG400作为助溶剂)，于37℃、5％ CO2条件下培养1h后，去除培养液，使用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次，将培养皿置于冰上，添加200μL 4℃预冷的PBS并用细胞刮将贴壁细胞刮下，用移液枪将细胞液转至离心管，于4℃、1000g离心1min，去除上清，液氮速冻后存于-80℃备用。
3.蛋白样品处理
蛋白提取
将蛋白酶抑制剂片剂溶于2mL水中，配制成蛋白酶抑制剂储备液(25×)。取样品至新EP管中，添加适量的RIPA工作液(25mM Tris-HCl pH 7.6、15mM氯化钠、1％ NP40、1％脱氧胆酸钠、1％ SDS、蛋白酶抑制剂(1×))。每200μL样品添加50μL RIPA工作液充分混匀，冰浴超声1min，充分裂解样品。于12000rpm，4℃离心15min，转移上清至新的EP管中。
BCA法蛋白定量
吸取BCA工作液添加至96孔板，每孔200μL，设置7个标准点(浓度分别为0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL)，1个空白；添加20μL样品(稀释相应倍数，使各样品浓度在BCA法的适应范围内)或标准蛋白(BSA)(BSA浓度对应于上述7个标准点的浓度)。37℃震荡30min，检测562nm波长处的吸光度。
蛋白重溶、还原、烷基化
于4℃、12000rpm离心10min，小心去除上清。添加200μL 4℃预冷的80％丙酮溶液润洗沉淀2次，于12000rpm离心，小心去除上清。添加100μL蛋白复溶液(100mM HEPES、1％SDC)，水浴超声3min以溶解蛋白沉淀。添加DTT至5mM，55℃振荡孵育20min。冷却样品至室温，添加IAA至10mM避光反应30min。
蛋白酶解
用PBS缓冲液溶解胰蛋白酶至0.5μg/μL，室温孵育5min。按胰蛋白酶:蛋白＝1:50(体积比)的比例将胰蛋白酶与样品充分混匀。简单离心后，于37℃、800rpm震荡孵育过夜。
去除脱氧胆酸钠(SDC)
将TFA添加至混合样品中(终浓度2％，pH<2)，充分混匀沉淀SDC。高速离心10min，转移上清至新EP管中。添加100μL 2％ TFA充分混匀，于12000rpm高速离心10min，提取共沉淀的多肽(重复提取2次)。合并几次上清组分，高速离心10min，取上清至新EP管，得到多肽样品。
多肽脱盐
向C18小柱(Dr.Maisch，德国)添加1mL缓冲液C(100％乙腈)进行活化，再添加1mL缓冲液A(含0.1％甲酸、2％乙腈的水溶液)进行平衡。添加样品上清，收集流出液。添加1mL缓冲液A冲洗2次，然后添加400μL缓冲液B(含0.1％甲酸、80％乙腈的水溶液)洗脱，用移液器将洗脱液压至新EP管。流出液重复除盐1次，合并两次洗脱液，4℃真空干燥过夜。
4.Nano LC-MS/MS检测
使用Nano-UPLC EASY-nLC1200与UltiMate 3000联用设备(Thermo Scientific，美国)进行数据采集。进样量为2μg，反相色谱柱为Reprosil-Pur 120C18-AQ(100μm ID×15cm)，流动相采用乙腈-水-甲酸体系，流速为300nL/min。流动相A为含0.1％甲酸的98％水-2％乙腈溶液，流动相B为含0.1％甲酸的80％乙腈-20％水溶液。流动相B比例：2％至5％持续2min，5％至22％持续88min，22％至45％持续26min，45％至95％持续2min，95％持续2min。
质谱分析采取正离子检测模式。一级扫描范围为350m/z至1600m/z，分辨率为120k(@200m/z)，自动收集控制目标为3E6，最大离子注入时间为50ms；一级扫描中强度最高的20个离子经四极杆筛选后使用HCD裂解后进行碎片离子扫描。四极杆隔离窗口为1.2m/z，标准化碰撞能为27％，自动收益控制目标为1E5，最大离子注入时间为110ms。二级扫描分辨率15k。根据色谱峰峰宽，动态排除时间设为45s；单电荷及>6价的离子不进行二级扫描。
5.数据结果
差异表达蛋白的筛选
以差异倍数(FLOD CHANGE)≤0.5或差异倍数≥2，同时蛋白有对应基因名称为标准，筛选出泰德诺B施用组相较于对照组的差异表达蛋白，所有差异表达的蛋白汇总数据示于下表3中。
表3.泰德诺B施用组相较于对照组的差异表达蛋白统计信息
组别 上调(fc≥2) 下调(fc≤0.5) 差异蛋白
MDA-MB-231 473 872 1345
MDA-MB-453 472 1604 2076
MCF-7 272 416 688
BT474 331 932 1263
KEGG富集分析
将与对照组比较具有显著表达差异的蛋白进行KEGG通路分析，从而发现泰德诺B对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和BT474发挥干预作用的生物学途径，图5示出了根据Fisher精确检验，蛋白表达差异前十的KEGG通路富集分析结果。
如图5所示：
泰德诺B干预MDA-MB-231细胞，表达产生显著差异的蛋白主要富集于代谢通路(Metabolic pathways，hsa01100)，差异最显著，并且差异蛋白数量最多。
泰德诺B干预MDA-MB-453细胞，表达产生显著差异的蛋白主要富集于代谢通路(Metabolic pathways，hsa01100)，差异蛋白数量最多，差异也比较显著，仅次于沙门氏菌感染通路(Salmonella infection，hsa05132)和志贺氏菌感染通路(Shigellosis，hsa05131)。
泰德诺B干预MCF-7细胞，表达产生显著差异的蛋白主要富集于代谢通路(Metabolic pathways,hsa01100)，差异蛋白数量最多，差异的显著程度仅次于其他类型的O-聚糖生物合成途径(other types of O-glycan biosynthesis，hsa00514)和结肠直肠癌通路(Colorectal cancer，hsa05210)，但差异程度相较其他三种乳腺癌细胞是最弱的。
泰德诺B干预BT474细胞，表达产生差异最显著的依次为慢性粒细胞白血病通路(Chronic myeloid leukemia,hsa05220)和人类T细胞白血病病毒1感染通路(Human T-cell leukemia virus 1，hsa05166)，这两条通路富集的差异蛋白数量与其他通路差别不大。
由图5示出的KEGG通路分析结果可知，在上述四种不同的乳腺癌细胞中，MDA-MB-231细胞受泰德诺B干预所产生的蛋白表达差异最显著，并且差异蛋白数量最多。值得注意的是，MDA-MB-231乳腺癌细胞的雌激素受体ER、孕激素受体PR和人类表皮生长因子受体HER2表型均为阴性，因此选择三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231作为动物试验的研究对象。三阴性乳腺癌具有有丝分裂率高、淋巴细胞浸润率高、分级高、肿瘤体积大的特点，是目前临床治疗预后最差的一类乳腺癌，急需开发新的治疗方法。
实施例3：泰德诺B对裸鼠移植瘤的抑制作用
1.细胞株及细胞培养
使用三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，细胞来源和培养条件与实施例1中所述的相同。
2.动物
BALB/c裸鼠，22只，雄性，年龄5至6周，体重20g至22g，购自武汉贝赛模式生物科技有限公司。
3.实验方法
造模
培养MDA-MB-231乳腺癌细胞，取对数生长期细胞(活细胞数>95％)，用培养基:基质胶(康宁公司，356231)＝1:1调整细胞浓度为5×107个细胞/mL。
向2只裸鼠腋下注射0.1mL制备好的乳腺癌细胞悬液(含有约5×106个细胞)。待接种裸鼠的肿瘤长到体积为约1000mm3之后，将其平均切成小块，每个小块体积为约1mm3，腋下移植到20只裸鼠中，每只裸鼠移植1个体积为约1mm3肿瘤组织。
实验分组
将上述20只移植了肿瘤的雄性BALB/c裸鼠随机分为对照组和泰德诺B施用组，每组各10只裸鼠。
4.泰德诺B施用方案
用0.5％羧甲基纤维素钠(AbMole公司，M9317)溶解泰德诺B，使泰德诺B浓度为7.5mg/mL。
肿瘤移植4周后，进行以下施用方案：对照组的裸鼠进行0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，剂量为10mL/kg；对泰德诺B施用组的裸鼠进行泰德诺B灌胃，剂量为75mg/kg泰德诺B。每三天施用1次，施用周期为4周。
5.样品处理
施用周期结束后，对裸鼠进行眼球取血采集血清，颈椎脱臼处死裸鼠。取肿瘤组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，做石蜡组织切片，其余样本经液氮速冻之后保存于-80℃冰箱。
6.结果分析
施用泰德诺B对裸鼠的乳腺肿瘤体积的影响
每周测量两次瘤体长径(a)和短径(b)，并计算肿瘤体积(V)，计算公式为：
Figure BDA0004087042100000161
结果如图6所示，泰德诺B以75mg/kg剂量、每周两次的方式灌胃给药，与对照组相比，泰德诺B施用组裸鼠的乳腺肿瘤体积在施用泰德诺B开始后2周(即肿瘤移植后42天)表现出对于肿瘤体积增长的明显抑制作用，肿瘤体积增长减少了46.7％((675.6-360.1)/675.6＝46.7％)；当施用泰德诺B 4周后，肿瘤体积增长减少了44.9％((1669.6-920.4)/1669.6＝44.9％)。该结果证实了泰德诺B对于乳腺癌的肿瘤生长具有显著的抑制作用，表现出优良的抗乳腺癌活性。
施用泰德诺B对裸鼠的乳腺肿瘤重量增加率的影响
施用周期结束后，颈椎脱臼处死裸鼠，取肿瘤组织后称重，计算乳腺肿瘤重量增加率。
结果如图7所示，泰德诺B以75mg/kg剂量、每周两次的方式灌胃给药，与对照组相比，泰德诺B施用组裸鼠在施用泰德诺B 4周后，乳腺肿瘤重量增加率表现出了明显的降低，由此进一步证明泰德诺B具有优良的抗乳腺癌活性。
施用泰德诺B的毒性反应
通过观察对照组与泰德诺B施用组的裸鼠的体重，评价施用泰德诺B的毒性反应。
结果如图8所示，泰德诺B施用组的裸鼠体重与对照组相比没有统计学差异，依此初步判断以75mg/kg施用泰德诺B，每三天施用1次，施用4周的方式，不会引起明显毒性反应。

Claims (10)

1.一种药物组合物，包含作为活性成分的泰德诺B，和可药用的辅料，其中所述药物组合物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述可药用的辅料包括纤维素类助溶稳定剂、胆盐、表面活性剂、脂肪酸、环糊精、甘油酯、水杨酸盐、螯合剂、可溶胀性聚合物、调节剂；优选地，所述纤维素类助溶稳定剂包括羧甲基纤维素钠；所述胆盐包括胆酸钠、脱氧胆酸钠、硫磺胆酸钠、甘胆酸钠；所述表面活性剂包括聚山梨酯、月桂醇硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠；所述脂肪酸包括癸酸钠、油酸；所述环糊精包括羟丙基β-环糊精、甲基β-环糊精；所述甘油酯包括植物油、中链甘油酯、磷脂、聚氧乙烯甘油酯；所述水杨酸盐包括水杨酸钠、甲氧水杨酸钠；所述螯合剂包括乙二胺四乙酸、皂角苷；所述可溶胀性聚合物包括淀粉、壳聚糖；所述调节剂包括柠檬酸。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为通过口服给药的口服剂型，所述口服剂型包括口服液体制剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂；所述口服液体制剂包括溶液剂、乳剂、混悬剂。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，每周施用2次至7次。
5.泰德诺B在制备用于预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物包含治疗有效量的泰德诺B；优选地，所述药物包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B。
7.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物被配制为通过口服给药。
8.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物被配制为包含单次剂量为1mg/kg至75mg/kg的泰德诺B，每周施用2次至7次。
9.根据权利要求5所述的应用，其中所述乳腺癌包括含有以下一种或多种乳腺癌细胞的乳腺癌，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
10.泰德诺B在体外抑制以下一种或多种乳腺癌细胞的应用，所述乳腺癌细胞的受体表型特征为(ER-，PR-，HER2-)、(ER-，PR-，HER2+)、(ER+，PR+/-，HER2-)或(ER+，PR+/-，HER2+)。
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