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CN116171198A - 用于快速早期检测感染的宿主rna生物标志物和早期鉴定人的covid-19冠状病毒感染的系统、方法和组合物 - Google Patents

用于快速早期检测感染的宿主rna生物标志物和早期鉴定人的covid-19冠状病毒感染的系统、方法和组合物 Download PDF

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CN116171198A
CN116171198A CN202080076043.1A CN202080076043A CN116171198A CN 116171198 A CN116171198 A CN 116171198A CN 202080076043 A CN202080076043 A CN 202080076043A CN 116171198 A CN116171198 A CN 116171198A
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host
biomarker
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infection
rna
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S·L·索耶
N·R·迈耶森
C·L·佩奇
杨青
R·道尔
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Original Assignee
University of Colorado
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Abstract

本发明技术涉及检测病原性感染的宿主特征的系统、方法和组合物，并且具体地涉及被配置成检测可能是感染的生物标志物的靶RNA转录物的快速检测测定。在一个实施例中，本发明包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速自施用测试条，所述快速自施用测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并存在于唾液中的一种或多种RNA转录物生物标志物。

Description

用于快速早期检测感染的宿主RNA生物标志物和早期鉴定人 的COVID-19冠状病毒感染的系统、方法和组合物
本申请要求于2019年9月3日提交的美国临时申请第62/895,387号和于2019年11月13日提交的美国临时申请第62/934,754号以及于2020年4月7日提交的美国临时申请第63/006,570号的权益和优先权。上文引用的申请的整个说明书和附图特此通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在由国防威胁降低局(DTRA)授予的授权号HDTRA1-18-1-0032下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2020年8月30日的所述ASCII副本命名为“90245.00432-Sequence-Listing.txt”并且大小是2476千字节。
技术领域
本发明技术涉及检测病原性感染的宿主特征的系统、方法和组合物，并且具体地涉及被配置成检测可能是感染的生物标志物的靶RNA转录物的快速检测测定。
背景技术
病原性微生物感染的早期检测对于适当的治疗和积极的临床结果至关重要。然而，受感染个体可能在感染后几天保持无症状，同时积极地将病原体传播给其它人。传统的病原体检测系统通常不能有效地检测感染，直到症状发作之后。传统的病原体测试包含血清学或基于抗体的测试、细菌/病毒/真菌生长培养和基于核酸的检测，如PCR(聚合酶链式反应)。此类传统测试通常是费时费力的，并且仅在患者开始表现出感染症状之后才有效。另外，传统的诊断测试需要对特定病原体进行临床怀疑、昂贵的实验室设备和受过训练的人员，并且具有增加的上游和最终用户成本。
例如，如图2中突出显示的，在典型的感染过程中，暴露于未知病原体发生在第零天并且然后进展通过随后的临床感染阶段，如沿着图的左侧竖直延伸的时间线所指示的。在病原体在受感染的人体内复制时，标准的诊断测试通常被设计成在症状发作之后工作，此时人们知道有什么错误并且寻求医疗保健和诊断。然而，此时所述受感染的人可能已经传染给其它人数天或数周。实施早期隔离并限制病原体无阻碍传播的破坏性下游效应的机会已经错过。在患者知道自己具有传染性之前，这种对诊断的时间延迟可能导致不良的患者结果和持续的疾病传播。
与专门的并且后来发展适应性免疫应答相反，宿主抵御病原性微生物的第一道防线是“先天免疫”应答。身体的先天免疫是发生在感染数小时内的自我扩增和非特异性生理应答。如此，检测由宿主的先天免疫应答产生的分子的存在的能力可以提供在患者仍无症状时在最早阶段快速检测感染的能力。这种进步将允许更有效的隔离方案，以及改进的治疗和临床结果。
全球冠状病毒疫情已经放大了对检测病原体的改进方法的需求，尤其是在感染周期的早期。冠状病毒(冠状病毒科和冠状病毒亚科的成员)发现于哺乳动物和鸟类中。一个突出的成员是严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)。另一种突出的冠状病毒(被称为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS冠状病毒或MERS-CoV)MERS-CoV)与SARS-CoV爆发有一些相似性。SARS、MERS和COVID-19冠状病毒感染的典型症状包含发烧、咳嗽、呼吸短促、肺炎和胃肠道症状。严重的疾病可能导致需要在重症监护病房进行机械通气和支持的呼吸衰竭。两种冠状病毒似乎在老年人、免疫系统薄弱的人和患有如癌症、慢性肺病和糖尿病等慢性病的人中引起更严重的疾病。目前没有疫苗或特异性治疗可用于COVID-19。诊断患有COVID-19冠状病毒感染的患者仅接受基于个体的症状和临床病状的支持性治疗。
如下文所述，诸位发明人已经克服传统病原体检测系统的限制，同时利用宿主的早期先天免疫应答(包含但不限于干扰素应答)来快速检测指示感染，并且特别是COVID-19冠状病毒感染的RNA生物标志物。当患者通常无症状时，这种快速的护理点诊断应用允许在早期阶段检测感染。这种早期检测与更靶向且有效的治疗干预以及整体改善的临床结果直接相关。
发明内容
本发明技术可以包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速测试条，所述快速测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并存在于唾液中的一种或多种RNA转录物生物标志物。
在另一方面，本发明技术可以包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速测试条，所述快速测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并可能存在于唾液中的根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸序列编码的一种或多种RNA转录物生物标志物。
本发明的另外的方面包含根据SEQ ID NO.1-444和657-815中鉴定的核苷酸序列，一种或多种生物标志物用于人的感染，并且优选地病原体感染的用途。
在另一方面，本发明技术可以包含用于检测这些靶RNA转录物的系统、方法和组合物，所述靶RNA转录物可以充当受试者的早期感染的生物标志物。
在另一方面，本发明技术可以包含用于检测受试者的早期感染的系统、方法和组合物，所述系统、方法和组合物可以包含至少：侧流测定测试条装置，所述侧流测定测试条装置可以优选地包含被配置成允许液体通过毛细作用流动的基于纤维或纸的侧流条；2)RT-RPA(逆转录重组酶聚合酶扩增)反应，所述反应可以发生在预制备的反应筒中，所述反应筒可以包含被配置成从受试者接收流体样品并且预制备以进行RT-RPA反应的集合容器；以及3)在流体样品中供应的通常也被称为生物标志物的一种或多种RNA生物标志物转录物，例如由鉴定为SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的一种或多种生物标志物，所述流体样品在优选实施例可以包含由受试者提供的唾液样品。在优选实施例中，RNA生物标志物转录物可以在等温扩增RT-RPA反应中在反应筒中扩增，以形成具有单链衔接子序列的杂交dsDNA探针或含有用于下游杂交的5'修饰的dsDNA产物。
另外的方面可以包含可以与杂交dsDNA探针偶联的新型缀合的报告探针。在某些方面，新型缀合的探针可以包含GNP，或与可以与dsDNA探针结合的ssDNA序列或抗体或抗体片段缀合的其它单个报告基因。而本发明的另外的方面可以包含新型靶捕获探针，所述靶捕获探针可以结合并形成固定化“夹心”复合物聚集体，所述复合物聚集体包括与杂交dsDNA探针偶联的嵌入式捕获探针，所述杂交dsDNA探针进一步与缀合的报告探针并且优选地GNP报告探针偶联。在此方面，局部固定可以促进例如在测试条或甚至溶液上产生视觉信号。
本发明的另外的方面包含用于对早期宿主源性感染生物标志物进行定量的系统、方法和组合物，所述生物标志物可以与或可以不与针对优选地通过PCR、RT-PCR或qRT-PCR产生的病原体特异性生物标志物的定量数据组合。在一个优选的方面，RNA可以从潜在暴露或由感染的受试者提供的生物样品中提取。RNA可以进行qRT-PCT反应，以确定病原体生物标志物以及宿主源性感染生物标志物，并且优选地存在于受试者的唾液中的宿主源性RNA生物标志物的水平。可以从一个或多个受试者获取多个生物样品，以产生显示病原体和宿主源性生物标志物随时间推移的相对水平的感染时程。此数据可以用于产生用于侧流测定的生物标志物候选物，以检测病原体特异性宿主源性生物标志物。此侧流测定可以施用于有需要的受试者，并且提供感染的指示以及一种或多种特定病原体的感染阶段。在一个优选的方面，特定病原体可以包含SARS-CoV-2，通常被称为COVID-19冠状病毒。
本发明的另外的方面可以包含权利要求中阐述的一个或多个优选实施例。
本发明的另外的方面可以从下面提供的说明书、权利要求和附图中得到证明。
附图说明
通过结合附图进行的以下详细描述将更好地理解本公开的新颖的方面、特征和优点，所有附图仅通过说明的方式给出并且不限制本公开的实施例，在附图中：
图1(A)示出了本发明的一个实施例中的侧流测定的总体示意图；(B)示出了本发明的一个实施例中的侧流测定测试条的另一个总体概况。
图2示出了一个感染过程的代表性实例。
图3(A)示出了示例性小鼠体内实验，其展示了用于检测病原体感染的现有技术。在这种情况下，一组小鼠可能感染病原体，并且将在感染后的指定天数收集血液样品。这些样品将用于进行高通量测序以表征生物标志物的存在，并且还可以用于进行测试以将本发明与当前现有技术的检测方法进行比较。下面示出了显示本发明在其它方法之前数天检测病原体感染的能力的示例性数据。所有说明的测定将在先前的体内实验期间进行。(B)示出了假设的病毒感染以及被设计成检测所述感染的各种测试的时间线。
图4示出了在其一个实施例中的示例性病原体检测装置并且具体地突出了装置用于多重化的能力。本发明的技术，并且具体地侧流测定测试条或测试条，可根据最终用户的目的而适用于多种配置。(A)作为初步筛选测试，最重要的参数是敏感性，以确保当受感染个体实际上是“生病的”时，没有受感染个体被无意地标记为“未生病”。高度灵敏性测试鉴定出接近100％的疾病的真正阳性病例，并且具有接近0％的假阴性率。RNA转录物生物标志物测定的敏感性可通过添加用于不同生物标志物的多个测试线来调整，如果组合检测，则增加鉴定所有真阳性的概率。(B)对于在不同的医疗环境(例如，急诊室、初级护理办公室、辅助护理机构、野战医院等)中评估已经有症状的患者的临床医生而言，重要的是区分病原体的一般类别(即，病毒对细菌对真菌)，以在完全鉴定病原体之前开始最佳早期治疗。本发明的测定可以告知治疗计划并且在非细菌感染的情况下显著减少抗生素的使用，以帮助限制抗生素抗性细菌的扩散。(C)响应特定生物体的宿主信号的早期研究可以允许测定配置，其中可以鉴定特定病原性生物体的感染。所测试的微生物小组可以由最终用户的需求指定。例如，军方可能对空气传播和可武器化病原体的品种最感兴趣，而国内诊所需要评估患者的季节性流感、RSV、鼻病毒和诺如病毒。
图5示出了在其一个实施例中示例性病原体检测装置的使用。在此实施例中，患者将唾液样品提供到反应筒中，所述反应筒在此可以表示为预装载有反应试剂的管容器，所述反应试剂可以允许扩增反应在室温下进行以增加生物标志物浓度。此后，含有经扩增生物标志物的溶液可以施加到侧流测试条上。当流体沿条向下流动时，出现可见的粉色信号。在条的最简单迭代中，一个条带意味着阴性结果并且两个条带等于指示感染的阳性结果。在消费产品实施例中，条将包含在外壳中以便于结果解释。
图6(A)示出了维恩图，所述维恩图表明根据健康人样品的测序数据，唾液和PBMC(外周血单核细胞)中表达的RNA转录物的同一性存在显著重叠。这种重叠意味着血液中存在的转录物也可能出现在唾液中。请注意，此转录物测序数据被归一化为平均1000万个读取覆盖率，并且未描述这些转录物的丰度。(B)代表性PCC(模式相关系数)图，其示出了唾液和PBMC(来自同一个体的两个样品)两者中存在的RNA转录物的相对表达水平。此图中的每个点表示A中的维恩图的重叠部分中的不同转录物。平均r值＝0.64(>0.5被认为是显著相关)。总体而言，PBMC对唾液中存在大多数转录物的较高水平表达，而且存在相对于PBMC在唾液中上调的转录物子集。由于此数据，诸位发明人可以致力于将唾液作为样品类型的选择，从中鉴定早期感染的关键信号。
图7示出了在其一个实施例中用于鉴定感染生物标志物的一般方法。
图8示出了使用体外转录组数据集鉴定的用于感染的宿主RNA生物标志物IFIT2的实例。在水平方向上，用表示基因的编码区的深蓝色条显示基因结构。在垂直方向上，峰的高度表示所指示RNA的相对丰度。对于每项研究，“-”泳道指示未感染的样品，而“+”泳道指示各种类型的病毒感染。不同研究的丰度变化以不同的颜色突出显示。总之，经鉴定的RNA生物标志物在9种不同的细胞类型和10种不同的病毒感染中上调。可以早在感染后4小时(这在任何可观察到的症状之前)在体外检测这种生物标志物的上调。可以在与上文一般描述的类似程序中鉴定和选择用于本发明的另外的生物标志物。
图9示出了受感染细胞中的生物标志物候选物的qPCR。将人肺细胞(A549)模拟感染或用流感病毒(左)或水疱性口炎病毒(VSV，右)感染24小时。收集RNA并且使用qPCR对其进行定量。结果显示为“相对于模拟的倍数变化”，并且虚线表示在感染期间没有变化。IFIT2是作为感染的全局标志物的RNA的实例，如图8所展示的。在此实例中，NEAT1将VSV与流感进行区分，并且OAS1将流感与VSV进行区分。
图10示出了用于从人唾液扩增和检测生物标志物的优化步骤的示意图。步骤3.1，将来自2μL人唾液的RNA成功地逆转录为DNA，并且使用定制的RT-RPA试剂盒进行扩增。反应在20分钟内在恒定37℃下完成。步骤3.2，在成功检测到用于感染的潜在生物标志物时，设计具有不同长度和序列的多个引物组以优化生物标志物扩增。选择导致最高扩增效率(由凝胶图像上条带的强度反映)的引物组用于实际诊断。步骤3.3，对来自先前步骤的所选择引物进行修改以携带衔接子序列，从而允许与侧流测定测试条和金纳米颗粒报告探针的下游杂交。在37℃下RT-RPA扩增20分钟之后，所得扩增子含有衔接子序列和来自靶生物标志物的序列两者。然后可以将最终反应产物直接施加到测试条上进行可视化。
图11展示了互补DNA结合形式的聚集用于视觉读出的核酸“夹心(sandwiches)”。经扩增生物标志物具有侧接特异性单链突出衔接子的双链DNA(dsDNA)区。将具有这种生物标志物的溶液与金纳米颗粒报告基因混合，所述金纳米颗粒报告基因本身缀合到与经扩增生物标志物的衔接子和硝酸纤维素上的对照捕获探针互补的单链DNA衔接子。由于互补DNA碱基配对的机制，当这些突出DNA衔接子链在流过膜的溶液中相互作用时，所述衔接子链将与ssDNA缀合的金纳米颗粒和固定的寡核苷酸捕获探针结合并形成dsDNA结构，从而形成核酸“夹心”(图4A)。随着越来越多的这些报告基因扩增的生物标志物-捕获探针夹心结构形成和聚集，可见的粉色信号出现在靶检测区(B)中的硝酸纤维素上，这表明原始样品中存在所述生物标志物。在此，最左边的粉色点代表图A中所展示的复合物，并且第二个粉色点是对照，其中金报告基因单独与其互补探针结合。此对照验证了样品正确地流过条。
图12示出了用合成RT-RPA产物的10倍稀释液运行的一系列测试条的比色图像。
图13A-D示出了在其一个实施例中具有易于使用的外盖的侧流测定测试条。
图14示出了在本发明的一个实施例中结合基于抗体的捕获机制的侧流测定的一般示意图。
图15示出了用于检测生物标志物的示例性基于实验室的测试和侧流测试的总体流程图。
图16示出了设计和验证用于生物标志物候选物的引物的流程图。在美国临时申请第62/934,873号和第63/006561号中描述了所述系统，所述美国临时申请关于图16的公开内容通过引用并入本文。
图17A-B：示出了宿主RNA生物标志物是源自受感染细胞的最早免疫应答的基因转录物。热图由所公开的RNA测序数据集产生并且示出在用不同病原体感染培养的人细胞后某些RNA物种的表达变化水平(左侧的色码)(顶部)。在所有情况下，比较模拟受感染(-)细胞和受感染(+)细胞。一些SARS-CoV-2和甲型流感特异性生物标志物显示在橙色和绿色突出显示框中。
图18示出了响应于不同类型的感染而上调的并且在人唾液中可检测的各种RNA生物标志物。(A)热图由所公开的RNA测序数据集产生并且示出在用不同病原体感染培养的人细胞后某些RNA物种的表达变化水平(下面的色码)(顶部)。(B)在所有情况下，比较模拟受感染(-)细胞和受感染(+)细胞。在此，具有来自传染病房的3个患者的唾液样品。这些唾液样品表示真菌(患者1；球孢子菌(Coccidioides))、病毒(患者2；水痘带状疱疹病毒)和细菌(患者3；大肠杆菌(E.coli))的急性感染。进行定量RT-PCR，以测量八种生物标志物RNA相对于健康唾液对照的倍数变化。请注意Y轴上的对数刻度，其表明这些生物标志物在受感染个体的唾液中发现的水平比健康个体的唾液高10-10,000倍。还存在唾液生物标志物可能能够将一种类型的感染与其它感染区分开来，如对真菌感染没有反应但在病毒感染中被上调100,000倍的EGR1。
图19示出了可以在多重RT-qPCR反应中检测宿主生物标志物上调。将人肺细胞(A549)模拟感染或用流感病毒感染，并且在感染后24小时从细胞裂解物中纯化RNA。然后使用Taqman探针和化学对RNA进行RT-qPCR反应。使用表4中列出的引物和探针，在单重(黑色条)或多重(橙色条)反应中测量X轴上指示的生物标志物。通过首先使用宿主对照基因对样品进行内部归一化，并且然后与模拟受感染样品进行比较来计算相对mRNA表达(Y轴)。
图20示出了一些宿主生物标志物上调先于病毒RNA检测。将人肝细胞系(Huh7)模拟感染或用SARS-CoV-2冠状病毒感染。在感染后0、2、4、8、12、24和48小时(X轴)从细胞裂解物中纯化RNA。然后使用表4中列出的引物和探针对RNA进行RT-qPCR。通过首先使用宿主对照基因对样品进行内部归一化，并且然后与模拟受感染样品进行比较来计算相对mRNA表达(Y轴)。左侧示出了一整组生物标志物，而右侧示出了生物标志物的子集，所述子集突出了在感染早期(蓝色)、感染晚期(绿色)上调的生物标志物和未上调的宿主对照生物标志物(灰色)。SARS-CoV-2核蛋白基因(N2)的检测也以红色显示。
图21示出了具有抗体捕获方案的示例性侧流条。根据图4的示意图将侧流条进行剥离。产生sMimic扩增子以测试侧流条的敏感性。“过量”线捕获过量的抗FITC缀合的金纳米颗粒。“对照”线捕获与FITC和生物素缀合的模拟扩增子。“测试”线捕获与FITC和DIG缀合的模拟扩增子。
图22示出了表3，其包含用于检测感染的宿主生物标志物的引物。选择候选生物标志物的子集进行引物优化。使用所列出的引物组进行RT-qPCR，以优化两种宿主对照生物标志物(RACK1或CALR)的引物效率、Ct值、熔融曲线和对数倍数变化。将未处理的人肺细胞(A549)中的表达与经干扰素处理的A549细胞(A549+IFN)或流感病毒感染的A549细胞(A549+流感)进行比较。
图23示出了表4，其包含用于多重检测宿主生物标志物的引物和探针。基于其大倍数变化，选择来自表3的候选生物标志物的子集。针对每个引物组设计Taqman探针，以与RT-qPCR反应中的Taqman荧光化学相容。基于Ct值将生物标志物分成三联体，以便与多重化相容。
图24示出了表5，其包含用于使用等温RT-RPA扩增宿主生物标志物的引物。选择候选生物标志物的子集来优化RT-RPA反应(A)。然后对满足图16中呈现的条件的那些引物组进行修饰以含有5'修饰(FITC、生物素或DIG)，以便获得与本发明的侧流测定的相容性(B)。
图25示出了可以在侧流条上检测到来自RT-RPA反应的经扩增产物。(A)用二级抗兔抗体(金纳米颗粒过量线)、链霉亲和素(对照线)或抗DIG抗体(生物标志物线)进行剥离的侧流条用于解析所指示的RT-RPA反应。样品#1仅含有PBS并且没有RT-RPA反应产物，而所有其它样品含有RT-RPA反应(20分钟反应)产物。使用来自流感感染的人肺细胞(A549)的经纯化RNA作为模板进行RT-RPA。(B)使用如图A中描述的侧流条来确认引物组本身不产生假阳性信号。将所指示的引物组与PBS以相同浓度的RT-RPA反应混合，并在条上耗尽。
具体实施方式
本发明技术可以包含用于通过新型侧流测定早期检测无症状受试者的病原体和/或感染的系统、方法和组合物，在优选实施例中，所述新型侧流测定可以包含快速自施用测试条，所述快速自施用测试条被配置成检测由受试者的先天免疫系统响应于病原体或感染而产生并存在于唾液中的一种或多种宿主RNA转录物生物标志物(编码或非编码)。
如图1B总体所示，本发明技术的一个实施例可以包含用于检测受试者的早期感染的系统、方法和组合物，所述系统、方法和组合物可以包含至少：侧流测定测试条装置(也被称为测试条或侧流条)，所述侧流测定测试条装置可以优选地包含被配置成允许液体通过毛细作用流动的基于纤维或纸的侧流条；2)RT-RPA(逆转录重组酶聚合酶扩增)反应，所述反应可以发生在预制备的反应筒中，所述反应筒可以包含被配置成从受试者接收流体样品并且预制备以进行RT-RPA反应的集合容器；以及3)一种或多种RNA生物标志物转录物，通常也被称为生物标志物，在流体样品中供应，所述流体样品在优选实施例中可以包含由受试者提供的唾液样品。
由患者的免疫应答(通常是先天免疫应答或感染后上调的任何其它细胞途径)产生并且在唾液中发现的特异性靶RNA转录物或生物标志物可以指示早期感染。因此，本发明技术的一个实施例可以包含用于检测这些靶RNA转录物的系统、方法和组合物，所述靶RNA转录物可以充当受试者的早期感染的生物标志物。然而，如上所述，在此实施例中，存在于由人受试者提供的典型流体样品中的靶RNA转录物生物标志物通常以低浓度存在并且需要检测扩增。为了克服这种物理限制，如图1B进一步所示，在本发明的一个实施例中，受试者可以将流体样品(在这种情况下可以包括唾液样品)沉积到反应筒中，在所述反应筒中所述流体样品可以经历扩增步骤。具体地，反应筒可以接收流体样品，其中所述反应筒可以经历RT-RPA反应以扩增存在于流体样品中的RNA生物标志物转录物。在此优选实施例中，反应筒可以预装载有一定量的预制备的蛋白质、酶、盐以及可以允许在反应筒内进行RT-RPA反应的其它试剂。如图1A所示，反应筒可以预装载有针对靶RNA生物标志物转录物的引物，所述转录物可以进一步包含C3间隔子元件。在另一个优选实施例中，反应筒可以进一步预装载有一个或多个缀合的报告探针，如缀合的金纳米颗粒(GNP)报告探针。
在其它实施例中，缀合的报告探针，如缀合的金纳米颗粒(GNP)报告探针可以被预嵌入、干燥、冻干或以其它方式连接到缀合物垫上而不是预装载到反应筒中。此具体实施例可以允许产生具有带有不同的缀合的报告探针的多个预嵌入的缀合物垫的侧流测定测试条。
再次，如图1B所示，可以由受试者手动地或通过另一个自动化或半自动化过程将流体样品引入到反应筒中，使得存在于流体样品中的一种或多种RNA生物标志物转录物与RT-RPA组分相互作用，包含预装载到反应筒中的经修饰引物以促进RT-RPA扩增反应。重要的是，在此优选实施例中，反应筒可以被配置成等温地产生RT-RPA反应。
在一个实施例中，反应筒可以含有RT-RPA反应在大约室温(约25℃)或体温(约37℃)下通过握在手中等温地进行所必需的预制备的蛋白质、酶、盐和其它试剂，从而消除对通常需要扩增核酸的实验室设备的需要。在一个优选的实施例中，RT-RPA反应可以在反应筒中进行大约30分钟或更短的一段时间。
如图1A中突出显示的，这种等温RT-RPA反应的结果可以包含工程化探针，所述工程化探针在这种情况下具有通过C-3间隔子与其3'和5'端处的突出单链DNA(ssDNA)区偶联的靶生物标志物序列(绿色)的杂交双链DNA(dsDNA)探针。在图1a中，dsDNA探针的5'端处的第一突出ssDNA区可以包含退火区(橙色)，而在此在dsDNA探针的5'端处示出的第二突出ssDNA区可以包含靶捕获区(蓝色)。
一旦RT-RPA反应完成，就可以将反应筒的内容物引入到一个或多个缀合的报告探针，在优选实施例中，所述一个或多个缀合的报告探针可以通过产生例如样品中靶RNA生物标志物转录物的存在的可观察指示来充当视觉报告基因。如上所示，缀合的报告探针可以包含缀合的金纳米颗粒(GNP)，所述缀合的金纳米颗粒缀合到与杂交双链DNA分子的退火区和如下所述的对照捕获探针两者互补的单链DNA(ssDNA)分子。自然地，GNP的使用仅是示例性的，因为各种几何形状和大小的各种准金属纳米颗粒报告基因可以结合到本发明技术中。另外的实施例还可以包含一种或多种非金属报告探针，如荧光、酶或抗体报告基因。
再次参考图1A，在上面突出显示的优选实施例中，此退火区可以通过硫醇、PEG18和PolyA构建体与GNP偶联。值得注意的是，在此配置中，当缀合的GNP报告探针浓缩在溶液中或在小表面积中时，如图13所示的侧流测试条上的一个或多个离散条带，所述报告探针可以提供视觉信号，在此实施例中，所述视觉信号可以包含彩色条带，在图1B和13中以红色条带显示。
如图1B中进一步所示，可以将含有靶dsDNA转录物序列的杂交dsDNA探针与DNA缀合的GNP报告探针组合，所述靶dsDNA转录物序列具有在反应筒中的扩增反应中产生的退火区和靶捕获区。在此实施例中，在存在最佳运行缓冲液的情况下，杂交DNA分子和DNA缀合的GNP报告探针的互补区域可以粘接，从而形成聚集体复合物。如从本公开应当理解的，此类聚集体复合物可以仅在预期的靶序列，在这种情况下为指示早期感染的生物标志物存在于样品中并且通过位于反应筒中的RT-RPA反应扩增时形成。
现在参考图1A-B，在优选实施例中，可以将含有由与DNA缀合的GNP报告探针偶联的杂交dsDNA探针形成的聚集体复合物的组合溶液引入到侧流条。在优选实施例中，可以将这种组合溶液引入到优选地由玻璃纤维制成的缀合物垫区中。组合溶液可以通过毛细作用穿过膜，如硝酸纤维素纤维膜，流向侧流条上的吸收垫区，所述吸收垫区可以包含具有嵌入侧流条表面，并且优选地测试条的硝酸纤维素膜表面的一个或多个捕获探针的检测区。可以调整嵌入在测试条的硝酸纤维素膜中的捕获探针的位置和定向，以优化信号产生或样品-探针相互作用。值得注意的是，吸收垫区可以被定位在侧流条的远端处，以促进样品通过毛细作用流过检测区。
如图1A中突出显示的，捕获探针可以包含嵌入在侧流条的硝酸纤维素表面中的固定化链霉亲和素碱基四聚体。这种固定化链霉亲和素碱基可以与生物素-TEG连接子偶联，所述生物素-TEG连接子可以进一步与可以与杂交dsDNA探针上的靶捕获区互补的ssDNA靶捕获探针序列偶联。
再次，在图1A所示的优选实施例中，杂交dsDNA探针的靶捕获区可以与互补捕获探针ssDNA序列粘接，从而形成固定化“夹心”复合物聚集体，所述复合物聚集体包括与进一步与DNA缀合的GNP报告探针偶联的杂交dsDNA探针偶联的嵌入式捕获探针。从图1A-1B中可以看出，在存在所关注生物标志物(即，指示受试者的病原体感染的生物标志物)的情况下，“夹心”复合物可以沿侧流条固定在离散位置处。如上所述，本发明的GNP报告探针在溶液中或当固定在侧流条上时产生红色信号。如此，当紧密靠近彼此地捕获某一浓度的复合物聚集体时，可以产生检测区内的可见信号，在此示例性实施例中，所述可见信号被示出为侧流条上的红粉条带。检测区内的这种可见信号可以指示阳性结果，所述阳性结果表明靶病原体的存在或受试者的感染的早期指示。值得注意的是，如上总体描述的这个过程可能花费少于10分钟，并且在一些情况下，少于3分钟来运行到完成并且提供可辨别的信号。如图1A进一步所示，未固定在检测区内的任何未结合的GNP报告探针可以继续通过侧流条流向远侧吸收垫并且与固定在侧流条表面上的对照区的对照捕获探针粘接。以此方式，固定在对照区的未结合的GNP报告探针还将产生可见信号，从而为系统提供阳性对照。
在替代性实施例中，本发明可以包含具有基于抗体的捕获机制的侧流测定条。与图1A中描述的侧流测定类似，这种等温RT-RPA反应的结果可以包含可以充当对照生物标志物的经扩增RPA产物以及可以充当感染生物标志物的另一种经扩增RPA产物。一旦RT-RPA反应完成，就可以将反应筒的内容物引入到一个或多个缀合的抗体报告探针，在优选实施例中，所述一个或多个缀合的抗体报告探针可以通过产生例如样品中靶RNA生物标志物转录物的存在的可观察指示来充当视觉报告基因。更具体地，如图14所示，等温RT-RPA反应可以产生至少两种经扩增RPA产物或扩增子，即分别具有经修饰的5'ssDNA突出区的对照生物标志物和感染生物标志物，从而分别形成探针捕获区和靶捕获区。在此实施例中，对照生物标志物可以包含与5'FITC正向ssDNA寡核苷酸(绿色)和5'生物素反向ssDNA寡核苷酸(橙色)偶联的dsDNA转录区。此实施例的感染生物标志物可以包含与5'FITC正向ssDNA寡核苷酸(绿色和粉色)和5'DIG ssDNA反向寡核苷酸(蓝色)偶联的dsDNA转录区。
如图14进一步所示，GNP可以与抗FITC(异硫氰酸荧光素)抗体并且优选地在兔中产生的抗FITC抗体缀合。还如图14所示，还可以将链霉亲和素剥离到如以上总体描述的膜上，以捕获存在于经扩增RPA产物中的对照生物标志物扩增子。在此实施例中，还可以将抗DIG(地高辛(Digoxigenin))抗体并且优选地在小鼠中产生的抗DIG抗体剥离到侧流膜上，以捕获存在于经扩增RPA产物中的感染生物标志物扩增子。
如图14进一步所示，可以将在扩增反应中产生的杂交dsDNA对照和感染扩增子探针与抗FITC抗体缀合的GNP报告探针组合。在此实施例中，抗FITC抗体可以与对照和感染生物标志物的5'FITC正向寡核苷酸结合，从而形成聚集的复合物。在此实施例中，可以将聚集的复合物进一步引入到本发明的侧流条。在优选实施例中，可以将这种组合溶液引入到优选地由玻璃纤维制成的缀合物垫区中。组合溶液可以通过毛细作用穿过膜，如硝酸纤维素纤维膜，流向侧流条上的吸收垫区，所述吸收垫区可以包含具有嵌入侧流条表面，并且优选地测试条的硝酸纤维素膜表面的一个或多个捕获探针的检测区。可以调整嵌入在测试条的硝酸纤维素膜中的捕获探针的位置和定向，以优化信号产生或样品-探针相互作用。值得注意的是，吸收垫区可以被定位在侧流条的远端处，以促进样品通过毛细作用流过检测区。
如上所述，捕获探针可以包含嵌入在侧流条的硝酸纤维素表面中的固定化链霉亲和素碱基四聚体。这种固定化链霉亲和素碱基可以与生物素-TEG连接子偶联，所述生物素-TEG连接子可以进一步与可以与杂交dsDNA探针并且优选地5'生物素-反向寡核苷酸上的靶捕获区互补的ssDNA靶捕获探针序列偶联。另外，捕获探针可以包含可以被配置成与5'DIG反向寡核苷酸结合的固定化抗DIG抗体。在此配置中，对照和感染生物标志物扩增子可以通过其相应的捕获探针与其相应的位置结合。如上所述，本发明的GNP报告探针在溶液中或当固定在侧流条上时产生红色信号。如此，当紧密靠近彼此地捕获某一浓度的复合物聚集体时，可以产生检测区内的可见信号。检测区内的这种可见信号可以指示阳性结果，所述阳性结果表明靶病原体的存在或受试者的感染的早期指示。值得注意的是，如上总体描述的这个过程可能花费少于10分钟，并且在一些情况下，少于3分钟来运行到完成并且提供可辨别的信号。
如图1A进一步所示，未固定在检测区内的任何未结合的GNP报告探针可以继续通过侧流条流向远侧吸收垫并且与固定在被配置成捕获未结合的抗体缀合的GNP报告探针的侧流条表面上的对照区的抗兔对照捕获探针粘接。以此方式，固定在对照区的未结合的GNP报告探针还可以产生可见信号，从而为系统提供阳性对照。
自然地，系统可以适用于各种实际应用。例如，系统可以被修饰以在侧流条上的多个检测区处检测与多个不同捕获探针对应的多个生物标志物RNA转录物。此外，应当注意，此类探针及其设计仅是示例性的，因为各种不同的探针配置以及探针生成的信号可以在如本文总体描述的系统内互换。
例如，如图4所示，在一个实施例中，上述侧流检测系统可以用于以不同程度的敏感性来检测已知或未知病原体对受试者的感染。在其它实施例中，上述侧流检测系统可以用于确定病原体类型，如细菌、病毒或真菌。在另外的实施例中，上述侧流检测系统可以用于确定特定病原体或其血清型。
在一个实施例中，本发明技术可以包含用于检测有需要的受试者的病原体特异性感染的新型系统、方法和组合物。在一个优选实施例中，本发明技术可以提供对人受试者的特定病原体的感染的检测。在此优选实施例中，可以优选地包含唾液样品的生物样品可以由受试者提供，所述受试者可以含有用于特定病原体感染的一种或多种生物标志物。在此实施例中，唾液样品可以例如通过现场或场外临床实验室被进一步处理，其中提取存在于唾液样品中的RNA分子进行进一步测试。然后将经提取RNA进行qRT-PCR过程，其中病原体的生物标志物。在实施例中，已知针对靶病原体的组分的引物测序仪中的一个或多个引物测序仪可以用于鉴定由靶病原体产生的特定生物标志物。在此实施例中，受试者可以提供多个生物样品用于RNA提取和qRT-PCT处理，以便产生病原体生物标志物的时程。这些多个样品可以提供靶病原体生物标志物相对于暴露于受试者的病原体的初始点的定量基线进展。如从前述内容可以理解的，此过程可以针对多种靶病原体来实施，并且可以进一步使用多个受试者连续进行以产生靶病原体的时程生物标志物文库。
如上所述，本发明技术可以允许检测可以在可以检测到病毒之前且在任何感染症状可能发生之前存在于受试者的生物样品中的宿主源性生物标志物。在一个优选实施例中，可以从生物样品中提取RNA，所述生物样品在这种情况下是含有宿主源性感染生物标志物并且进一步经受qRT-PCR的唾液样品。在此实施例中，受试者可以提供多个生物样品用于RNA提取和qRT-PCT处理，以便产生宿主源性生物标志物的时程。再次，多个样品可以提供宿主源性生物标志物，如由宿主先天免疫应答响应于靶病原体从暴露于病原体的初始点到潜伏期产生的RNA生物标志物的定量化基线进展。再次，如从前述内容可以理解的，此过程可以针对多种靶病原体来实施，并且可以进一步使用多个受试者连续进行以产生时程宿主源性生物标志物并且优选地响应于靶病原体产生的宿主源性RNA生物标志物的文库。通过组合来自在潜伏期期间发生的宿主先天免疫应答和来自靶病原体本身两者的RNA标志物，本发明可以扩大各种病原体感染的检测窗口。
在一个优选实施例中，本发明技术可以用于对人受试者的新型冠状病毒SARS-CoV-2(COVID-19)的感染并且具体地响应于人受试者的新型冠状病毒SARS-CoV-2(COVID-19)的感染产生的宿主源性感染生物标志物的检测。如上所述，此实例仅仅是可以结合到COVID-19冠状病毒位置的多种不同病原体的实例。如图15所示，在此优选实施例中，可以优选地包含唾液样品的生物样品可以由受试者提供，所述受试者可以含有一种或多种COVID-19感染的生物标志物。在此实施例中，唾液样品可以例如通过现场或场外临床实验室被进一步处理，其中提取存在于唾液样品中的RNA分子进行进一步测试。然后将经提取RNA进行qRT-PCR过程，其中鉴定病原体的生物标志物，在这种情况下是COVID-19冠状病毒。在实施例中，下表2(SEQ ID NO.469-480)中鉴定的引物测序仪中的一种或多种引物测序仪可以用于鉴定由COVID-19冠状病毒产生的特定生物标志物。在此实施例中，受试者可以提供多个生物样品用于RNA提取和qRT-PCT处理，以便产生病原体生物标志物的时程。例如，如图15B所示，多个样品可以提供病原体生物标志物相对于暴露于病原体的初始点的定量基线进展。
如上所述，本发明技术可以允许检测可以存在于受试者的生物样品中的宿主源性生物标志物，可以在任何感染症状可能发生之前检测到病毒。在一个优选实施例中，可以从生物样品中提取RNA，所述生物样品在这种情况下是含有宿主源性感染生物标志物并且进一步经受qRT-PCR的唾液样品。在此实施例中，受试者可以提供多个生物样品用于RNA提取和qRT-PCT处理，以便产生宿主源性生物标志物的时程。例如，如图15B所示，多个样品可以提供宿主源性生物标志物，如由宿主先天免疫应答响应于COVID-19病原体从暴露于病原体的初始点到潜伏期产生的RNA生物标志物的定量化基线进展。再次，如图15所示，通过组合来自在潜伏期期间发生的宿主先天免疫应答和来自COVID-19冠状病毒本身两者的RNA标志物，本发明可以扩大COVID-19冠状病毒感染的检测窗口。
现在参考图15C，在另一个实施例中，侧流测定条可以被配置成检测一种或多种宿主源性COVID-19感染生物标志物，并且优选地宿主源性COVID-19感染RNA生物标志物以及COVID-19感染生物标志物。如图15C所示，侧流测定条可以被配置成包含多个宿主源性COVID-19感染RNA生物标志物，所述生物标志物根据其在通过上述qRT-PCR建立的感染的时程期间的流行率顺序地定位。以此方式，本发明的侧流测定条不仅可以鉴定已经暴露于如COVID-19冠状病毒等病原体的受试者，而且可以包含嵌入有对应于所选择的感染时程的一种或多种生物标志物的顺序检测线。在此优选实施例中，受试者可以提供生物样品，并且优选地唾液样品。唾液样品被允许经历扩增反应以增加生物标志物的数量，并且然后施加到如上文总体描述的侧流测定条。在此实施例中，宿主源性COVID-19感染RNA生物标志物可以通过靶捕获探针固定，从而形成固定化聚集体复合物，所述聚集体复合物又可以再次产生如上文总体描述的可见信号。
值得注意的是，在此实施例中，COVID-19生物标志物也可以通过靶捕获探针固定，从而形成固定化聚集体复合物，所述聚集体复合物又可以产生与宿主源性RNA生物标志物视觉信号分离的可见信号。以此方式，受试者或卫生保健工作者可以能够快速鉴定：1)在这种情况下，如果受试者已经暴露于COVID-19冠状病毒；2)如果受试者感染上COVID-19冠状病毒但仍处于病毒感染周期的潜伏期；3)自暴露于COVID-19冠状病毒以来的大致时间；4)感染上COVID-19冠状病毒生物标志物可能具有传染性的大致时间。如可以进一步理解的，在另外的实施例中，侧流测定条可以被进一步配置成鉴别症状前受试者以及无症状受试者。最重要的是，侧流测定的结果可以允许早期鉴定感染并且促进适当的隔离和接触追踪方案。
现在通过参考以下实例将更容易理解总体上描述的本发明，所述实例仅出于说明本发明的实施例的某些方面的目的而包含在内。如本领域的技术人员将从上文教导和以下实例中将认识到的，其它技术和方法可以满足权利要求书并且可以在不脱离要求保护的本发明的范围的情况下采用，实例不旨在限制本发明。实际上，虽然参考其优选的实施例已经具体地示出和描述了本发明，本领域的技术人员将会理解的是，在不脱离由所附权利要求书涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出不同的在形式和细节上的改变。
实例
实例1：感染的靶生物标志物的鉴定。
在一个实施例中，本发明可以包含用于鉴定和使用一种或多种RNA转录物生物标志物的系统、方法和组合物。如图7所示，在一个优选实施例中，可以建立并测试第一组织培养实验(左)，以鉴定可以在实验感染期间可能被上调并且也可以从靶细胞分泌的靶RNA转录物。上调的RNA可以用作候选生物标志物，并且被工程化以与上文总体描述的侧流系统相容。同时，来自健康人唾液和受感染人唾液的RNA可以在临床试验中进行表征(右)，以鉴定人的感染的RNA生物标志物。如果尚未在组织培养实验中鉴定出那些生物标志物，则所述生物标志物将用于与如上文总体描述的侧流系统相容。
实例2：早期宿主生物标志物的鉴定。
如图8总体所示，本发明的一个实施例包含使用生物信息学元分析鉴定感染的早期宿主生物标志物。为了鉴定响应于处于早期的感染而产生的宿主核酸生物标志物，诸位发明人搜索了可公开获得的转录组数据集。所选择的数据集针对使用在多个时间点被不同病毒感染的各种人组织类型生成的那些数据集。诸位发明人使用标准化生物信息学渠道分析了这些数据集，并且鉴定了响应感染而上调的人编码和非编码RNA。这些数据总结了在不同研究中通常上调的宿主RNA转录物。这个通常上调的RNA转录物的列表由示例性候选RNA转录物生物标志物构成。这些RNA转录物的上调表明正在进行的感染(图1中的实例)。
同时，诸位发明人还收集并测序了从健康和临床人参与者的唾液样品中纯化的RNA。通过生物信息学数据分析，对健康参与者与受感染患者之间显著不同的RNA转录物进行鉴定和分类。然后，可以使用这些临床数据集来过滤出潜在的生物标志物。总之，宿主RNA生物标志物的最终列表可能具有使用唾液作为非侵入性诊断材料将健康个体与被各种病原体(病毒、细菌、真菌和原生生物)感染的受试者区分的潜力。
实例3：靶生物标志物的验证。
如图9总体所示，本发明的一个实施例包含使用定量聚合酶链式反应(PCR)方案验证靶生物标志物。作为使用以上概述的方法鉴定的生物标志物可以在组织培养感染实验中得到进一步确认。RNA的逆转录定量PCR(RT-qPCR)允许将候选生物标志物的上调特异性定量为与未感染的细胞相比受感染细胞中的“倍数变化”。当评估侧流测定棒相对于给定生物标志物的检测敏感性时，此类信息是有帮助的。
虽然在此仅示出了六种示例性生物标志物候选物，但这种列表不应被解释为对可以与本发明一起使用的生物标志物的数量的限制。实际上，可能存在许多可以结合到如本文所述的本发明中的候选生物标志物。
实例4：来自体液样品的感染生物标志物的等温扩增。
在成功验证在体外感染期间上调的RNA生物标志物后，靶RNA生物标志物可能经受一个或多个优化过程，以确保来自人唾液的生物标志物的成功的等温扩增和在侧流测定棒上进行的可视化。
如图10总体所示，使用等温一步逆转录和重组酶聚合酶扩增(RT-RPA,Piepenburg等人,《公共科学图书馆·生物学(PLoS Biology)》2006)(图10步骤3.1)确认体液样品中靶RNA转录物生物标志物的存在，在优选实施例中，所述体液样品可以包含唾液。RT-RPA可以通过将TwistDX TwistAmp Basic RPA试剂盒与另外的RNase抑制剂、逆转录酶和寡核苷酸dT引物组合来定制。这种定制试剂的使用允许从靶RNA到DNA的一步转化，然后可以将其在37℃(近似体温)下在10-20分钟内扩增以增强信号。
如图3步骤3.1进一步所示，扩增子可以在2％琼脂糖凝胶上分离，并且通过溴化乙锭染色可视化。与阳性对照相比，RT-RPA使用低至2μL人唾液作为输入扩增靶RNA生物标志物，而无需另外的纯化。为了实现有效的扩增和检测，设计了多个引物组来扩增靶生物标志物(图10步骤3.2)。这些引物组的长度和序列不同。在保持其它参数恒定的同时，基于在2％琼脂糖凝胶上可视化的扩增子的强度，比较每个引物组扩增靶RNA的效率。在图10所示的实例中，虽然所有引物组都能够扩增靶生物标志物，但引物组#3的扩增效率最高。因此，将引物组#3进一步整合到下游过程中。最后，基于步骤3.2的测试结果，将最佳引物序列与3'和5'端上的定制衔接子序列连接，这些衔接子序列可以分别与嵌入在测试条中的基于金纳米颗粒的探针和靶捕获探针上的探针序列互补(图3步骤3.3)。然后使用具有衔接子的引物来扩增生物标志物RNA。
为了确保在RPA扩增后衔接子序列保持单链，本发明人在引物序列中引入三碳链间隔子(C3)，以防止DNA聚合酶产生衔接子序列的互补链。因此，最终产物可以包含经扩增的杂交DNA探针，其具有靶dsDNA转录区，同时保持用于下游杂交的单链衔接子序列。
实例5：使用侧流测定棒可视化经扩增产物。
如图11所示，检测测定的初级单元是膜，所述膜是含有经扩增生物标志物和报告基因的溶液流过的底物。在一个优选实施例中，膜可以包含能够结合流过膜的溶液中的互补探针的一个或多个嵌入式捕获探针。当捕获探针与其相应的经扩增生物标志物或报告基因结合时，出现指示感染或无感染的信号。此测定的这种广泛描述内的多个变量是可调节的，以能够表达不同类型的结果。
用合成RT-RPA产物的10倍稀释液运行的一系列测试条的比色图像如图12所示。在此实例中，样品含有2μL经扩增生物标志物、10μL金报告基因和8μL运行缓冲液施加到测试条的缀合物垫。(RT-RPA产物的浓度与视觉读出一起列出。)溶液通过毛细作用流过硝酸纤维素膜流朝向吸收垫。具有高于检测极限的经扩增生物标志物的样品将聚集在检测区的第一圆圈处。无论是因为过量金报告基因不存在于初始样品中还是其浓度低于检测极限，不与经扩增生物标志物相互作用的所述金报告基因将继续沿条向下流动并聚集在对照区处。
在(A)所示的条的实例中，阴性结果将在右侧上显示一个圆圈，并且阳性结果将显示存在的两个圆圈(即使强度微弱)。为了增强视觉信号的强度，将另外的10μL金报告基因和8μL运行缓冲液组合并且再次施加到缀合物垫。(B)是用于比较的与(A)中相同的条的彩色图像。(C)在RT-RPA反应中，可以使用测试条上的不同捕获探针和不同衔接子引物组装测定以进行多重化。
实例6：材料和方法。
如图总体所示的，在一个实施例中，侧流测定测试条或测试条可以由硝酸纤维素膜形成，所述硝酸纤维素膜可以是GE Whatman支持的硝酸纤维素膜FF120HP；5cm×0.4cm。玻璃纤维缀合物垫可以包含Millipore G041“SureWick”GFCP103000，1cm×0.4cm。纤维素吸收垫可以包含Millipore C083“SureWick”纤维素纤维样品垫条CFSP173000，1cm×0.75cm。如图所示和上文总体描述的，缀合的GNP探针可以包含与链霉亲和素结合的生物素化寡核苷酸捕获探针，然后可以将所述链霉亲和素嵌入在硝酸纤维素膜上。在一个实例中，将600μM寡核苷酸捕获探针与200μM链霉亲和素在室温下温育1小时。在捕获探针现在与链霉亲和素形成复合物的情况下，所述捕获探针可以被稀释到不同的浓度，以优化结合条件和信号强度。在优选实例中，将0.5μL的含有这种捕获探针-链霉亲和素复合物的溶液以适当的定向移液到硝酸纤维素膜上，其中靶探针放置在最靠近缀合物垫处并且对照探针放置在最靠近吸收垫处。
如上所述，缀合的GNP探针或报告基因可以通过盐老化方法与一个或多个直径为-60nm或15nm或12.5nm的单链DNA序列偶联。恰好在测试条上运行之前，可以将运行缓冲液与RT-RPA扩增的溶液产物和缀合的金纳米颗粒混合。
本文所使用的术语用于描述实施例并且不旨在是限制性的。如本文所使用的，除非内容和上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，对“生物标志物”的引用可以包含两种或更多种这种生物标志物的组合。除非另外定义，否则所有科学和技术术语应被理解为具有与其所属领域中通常使用的含义相同的含义。如本文所使用的，“约”或“大约”意指在规定浓度范围的10％内或在规定时间范围的10％内。
如本文在说明书中和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指这样联合的要素中的“任一个或两个”，所述要素即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体指明的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体指出的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言，如“包括”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指代A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中，仅指代B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中，指代A和B两者(任选地包含其它要素)等。
可以分离或“提取”本发明的核酸和/或其它部分。如本文所使用的，“分离的”意指与通常与之相关的至少一些组分分离，无论所述组分源自天然存在的来源还是全部或部分合成制备的。可以纯化本发明的核酸和/或其它部分。如本文所使用的，纯化意指与大多数其它化合物或实体分离。化合物或部分可以是部分纯化的或基本上纯化的。纯度可以通过重量测量来表示并且可以使用多种分析技术，如但不限于质谱、HPLC等来确定。
如本文所使用的术语“引物”是指能够在合适条件下充当DNA合成的起始点的寡核苷酸。这些条件包含在存在四种不同的核苷三磷酸和用于延伸的药剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)的情况下，在适当的缓冲液中并且在合适的温度下，诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的那些条件。
引物优选地是单链DNA。引物的适当长度取决于引物的预期用途，但通常引物的范围为约6到约225个核苷酸，包含中间范围，如15到35个核苷酸、18到75个核苷酸和25到150个核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度，以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板核酸的确切序列，但必须充分互补以与模板杂交。用于扩增给定靶序列的合适引物的设计是本领域众所周知的并且在本文引用的文献中进行描述。
如本文所使用的，生物标志物(“生物标志物”或“标志物”)是被客观地测量和评估为正常生物过程、病原性过程或对治疗干预具有药理学应答的指标的特征，这与NIH生物标志物定义工作组(NIH Biomarker Definitions Working Group)(1998)一致。标志物还可以包含指示特定生物过程的特征的模式或集合。生物标志物测量可以增加或减少以指示特定生物事件或过程。另外，如果生物标志物测量通常在不存在特定生物过程的情况下发生变化，则恒定测量可以指示所述过程的发生。在优选实施例中，生物标志物包含可以指示感染或其它正常或异常生理过程的一种或多种RNA转录物。
如本文提及的，术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核苷酸”可以互换使用。所述术语涉及脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其呈单独片段形式或作为较大构建体(直链或支链、单链、双链、三链或其杂交体)的组分的修饰形式的聚合物。所述术语还涵盖RNA/DNA杂交体。多核苷酸可以包含DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA分子可以是例如但不限于：互补DNA(cDNA)、基因组DNA、合成DNA、重组DNA或其杂交体。RNA分子可以是例如但不限于：ssRNA或dsRNA等。所述术语进一步包含由天然存在的碱基、糖和共价核苷间键构成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，所述寡核苷酸与相应的天然存在的部分类似地起作用。术语“核酸区段”和“核苷酸序列区段”或更通常地“区段”将被本领域的技术人员理解为功能术语，所述功能术语包含基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列以及被编码或可以适于编码肽、多肽或蛋白质的较小工程化核苷酸序列。除非另外指出，否则所有核酸引物，如SEQIN NO.445-468以5'到3'主要方向呈现。
如本文所使用的，“互补”是指多核苷酸的单链(或其部分)通过反平行多核苷酸单链的核苷酸(不被任何未配对的核苷酸中断)之间的连续碱基配对与反平行多核苷酸链(或其部分)杂交，由此在互补链之间形成双链多核苷酸的能力。如果第一多核苷酸的每个核苷酸与第二多核苷酸的互补区内的核苷酸形成碱基配对，则第一多核苷酸被认为与第二多核苷酸链“完全互补”。如果第一多核苷酸中的一个核苷酸不与第二多核苷酸中的对应核苷酸碱基配对，则第一多核苷酸与第二多核苷酸不完全互补(即，部分互补)。多核苷酸链之间的互补性程度对多核苷酸链之间的粘接或杂交的效率和强度具有显著影响。这在取决于多核苷酸链之间的结合的扩增反应中特别重要。如果寡核苷酸引物的至少50％(优选地60％，更优选地70％、80％，仍更优选地90％或更多)的核苷酸与靶多核苷酸上的核苷酸形成碱基对，则所述引物与靶多核苷酸“互补”。
如本文提及的，术语“数据库”是指可以以数字形式存储的核苷酸序列信息的有组织的集合。在一些实施例中，数据库可以包含任何序列信息。在一些实施例中，数据库可以包含受试者或微生物的基因组序列。在一些实施例中，数据库可以包含表达的序列信息，例如EST(表达的序列标签)或cDNA(互补DNA)数据库。在一些实施例中，数据库可以包含非编码序列(即，非翻译序列)，例如RNA家族集合(Rfam)，所述非编码序列含有关于非编码RNA基因、结构化顺式调节元件和自剪接RNA的信息。在示例性实施例中，数据库可以选自冗余或非冗余GenBank数据库(其是NIH基因序列数据库，所有可公开获得的DNA序列的注释集合)。示例性数据库可以选自但不限于：GenBank CDS(编码序列数据库)、PDB(蛋白质数据库)、SwissProt数据库、PIR(蛋白质信息资源)数据库、PRF(蛋白质序列)数据库、EMBL核苷酸序列数据库等或其任何组合。
如本文所使用的，术语“检测”是指定性确定样品中的微生物的存在或不存在。术语“检测”还包含微生物的“鉴定”，即，根据本领域公认的分类学且如本说明书中描述的确定微生物的属、物种或菌株。术语“检测”进一步包含样品中的微生物的定量，例如以微升(或毫升或升)或微克(或毫克或克或千克)为单位的样品中的微生物的拷贝数。术语“检测”还包含受试者或样品中的感染的鉴定。
如本文所使用的，术语“病原体”是指一种生物体，包含微生物，所述生物体通过直接感染另一种生物体或通过产生在另一种生物体中引起疾病的药剂(例如，产生病原性毒素等的细菌)而在另一种生物体(例如，动物和植物)中引起疾病。如本文所使用的，病原体包含但不限于细菌、原生动物、真菌、线虫、类病毒和病毒或其任何组合，其中每种病原体能够单独或与另一种病原体协同地引发脊椎动物的疾病，所述脊椎动物包含但不限于哺乳动物，并且包含但不限于人。如本文所使用的，术语“病原体”还涵盖在非免疫受损宿主中通常可能不具有病原性的微生物。
如本文所使用的术语“感染(infection或infect)”是指受试者身体和/或受试者细胞内微生物的存在。例如，病毒可以感染受试者细胞。寄生虫(例如，线虫)可以感染受试者细胞/身体。在一些实施例中，微生物可以包括病毒、细菌、真菌、寄生虫或其组合。根据一些实施例，微生物是病毒，例如dsDNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssDNA病毒(例如，细小病毒)、dsRNA病毒(例如，呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(+)有义RNA(例如，微小核糖核酸病毒，披膜病毒)、(-)ssRNA病毒(-)有义RNA(例如，正粘病毒，弹状病毒)、具有生命周期中的DNA中间体的ssRNA-RT病毒(+)有义RNA(例如，逆转录病毒)、dsDNA-RT病毒(例如，肝脱氧核糖核酸病毒(Hepadnaviruses))。在一些实施例中，微生物是细菌，例如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌等。在一些实施例中，微生物是真菌，如酵母、霉菌等。在一些实施例中，微生物是寄生虫，例如原生动物和蠕虫等。在一些实施例中，微生物引起的感染可能给受试者造成疾病和/或临床上可检测的症状。在一些实施例中，微生物引起的感染可能不会引起临床上可检测的症状。在一些实施例中，微生物是共生微生物。在另外的实施例中，微生物可以包括古细菌、原生生物；微观植物(绿藻)、浮游生物和真涡虫。在一些实施例中，微生物是单细胞的(unicellular/single-celled)。在一些实施例中，微生物是多细胞的。
如本文所使用的，术语“无症状”是指不表现出受给定病原体或给定病原体组合感染的特征性身体症状的个体。
本发明的靶生物标志物可以用于诊断和预后目的，以及用于治疗、药物筛选和患者分级目的(例如，将患者分组成多个“子集”以进行评估)，以及本文所述的其它目的。
本发明的一些实施例包括检测来自患者的样品中的生物标志物的水平，其中生物标志物的存在或表达水平指示一种或多种病原体的感染或可能的感染。如本文所使用的，术语“生物样品”或“样品”包含来自任何体液或组织的样品。适合根据本文提供的方法使用的生物样品或样品包含但不限于血液、血清、尿液、唾液、组织、细胞和器官或其部分。“受试者”是任何所关注生物体，通常是哺乳动物受试者并且优选地是人受试者。
根据本文提供的方法，可以使用任何等温扩增方案。等温扩增的示例性类型包含但不限于基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、RNA技术的信号介导的扩增(SMART)、滚环扩增(RCA)、等温多重置换扩增(EVIDA)、单引物等温扩增(SPIA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和聚合酶螺旋反应(PSR,可在万维网上从nature.com/articles/srepl2723获得)。在一些情况下，使用正向引物将T7启动子位点引入到所得DNA模板中，以使得经扩增RNA产物能够通过T7RNA聚合酶进行转录。在其它情况下，使用反向引物来添加立足点序列结构域的触发序列。
如本文所使用的，术语“扩增的”是指作为特定多核苷酸的拷贝在扩增反应中产生的多核苷酸。根据本发明的经扩增产物可以是DNA或RNA，并且所述经扩增产物可以是双链或单链的。经扩增产物在本文中也被称为“扩增子”。如本文所使用的，术语“扩增子”是指来自核酸扩增反应的扩增产物。所述术语通常指使用给定的一组扩增引物产生的已知大小的预期特异性扩增产物。
表1：金标准测试与本发明的侧流测定棒的比较
Figure GDA0004206899370000261
表2：用于检测SARS-CoV-2(COVID-19)的引物
Figure GDA0004206899370000262
Figure GDA0004206899370000271

Claims (76)

1.一种检测宿主RNA转录物生物标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
-从含有RNA转录物生物标志物的受试者收集体液样品；
-将所述RNA转录物生物标志物转化成DNA探针，如双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)或和杂交双链DNA(dsDNA)探针，所述DNA探针具有：
-dsDNA靶序列；
-单链DNA(ssDNA)退火区；以及
-ssDNA靶捕获区；
-将所述杂交dsDNA探针引入到DNA缀合的报告探针，其中杂交dsDNA探针上的所述ssDNA退火区与所述DNA缀合的报告探针的ssDNA退火区互补，使得两个探针在溶液中偶联在一起；
-将所述杂交dsDNA探针和DNA缀合的报告探针溶液引入到侧流测定测试条；
-使所述溶液穿过所述侧流测定测试条上的至少一个检测区，其中所述检测区含有多个嵌入式靶捕获探针，所述多个嵌入式靶捕获探针具有与所述杂交dsDNA探针上的所述ssDNA靶捕获区互补的ssDNA区；
-通过使所述杂交dsDNA探针上的互补靶捕获区与所述靶捕获探针上的靶捕获区粘接来形成包括所述杂交dsDNA探针、所述DNA缀合的报告探针和所述靶捕获探针的固定化复合物聚集体；
-允许在所述检测区中形成多个固定化复合物聚集体，使得产生可检测信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化步骤包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应将所述RNA转录物生物标志物转化成DNA探针的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将产生等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应所必需的试剂预装载到反应筒中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述dsDNA靶序列通过连接子与所述ssDNA退火区和所述ssDNA靶捕获区偶联。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述连接子包括三碳链间隔子(C3)连接子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(GNP)探针。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述缀合的(GNP)探针包括通过硫醇、PEG18和PolyA构建体与所述ssDNA退火区偶联的GNP。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素-TEG连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-TEG连接子可进一步与所述ssDNA靶捕获探针序列偶联，所述ssDNA靶捕获探针序列与所述杂交链霉亲和素上的所述靶捕获区互补。
10.根据权利要求1和8中任一项所述的方法，其中所述侧流测定测试条进一步包括：
-缀合物垫，所述缀合物垫与允许所述溶液通过毛细作用朝着吸收垫流动的膜流体连通，其中所述吸收垫定位于所述检测区的远侧；
-对照区，所述对照区可固定未结合的缀合的金纳米颗粒(GNP)探针。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物生物标志物包括至少一种RNA转录物生物标志物，所述至少一种RNA转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：SEQ ID NO.1-444和657-815。
13.一种用于早期检测RNA转录物生物标志物的侧流测定，所述侧流测定包括：
-来自受试者的具有宿主RNA转录物生物标志物的体液样品；
-反应筒，所述反应筒被配置成接收唾液样品，并且被进一步配置成通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应产生经扩增样品，其中所述经扩增样品包括与DNA缀合的报告探针偶联的杂交dsDNA探针；
-缀合物垫，所述缀合物垫被配置成接收所述经扩增样品；
-膜，所述膜与所述缀合物垫流体连通，并且被进一步配置成允许所述溶液通过毛细作用流过所述膜；
-检测区，所述检测区含有多个嵌入式靶捕获探针，所述多个嵌入式靶捕获探针被配置成结合和固定所述杂交dsDNA探针；
-对照区，所述对照区被配置成结合和固定一个或多个未结合的DNA缀合的报告探针；以及
-吸收垫，所述吸收垫定位于所述检测区和所述对照区的远侧。
14.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
15.根据权利要求13所述的侧流测定，其中将产生所述等温RT-RPA反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
16.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
17.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述杂交dsDNA探针包括：
-dsDNA靶序列；
-ssDNA退火区；以及
-ssDNA靶捕获区。
18.根据权利要求17所述的侧流测定，其中杂交dsDNA探针上的所述ssDNA退火区与所述DNA缀合的报告探针的ssDNA退火区互补，使得两个探针在所述经扩增溶液中偶联在一起。
19.根据权利要求18所述的侧流测定，其中所述dsDNA靶序列通过连接子与所述ssDNA退火区和所述ssDNA靶捕获区偶联。
20.根据权利要求19所述的侧流测定，其中所述连接子包括三碳链间隔子(C3)连接子。
21.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述DNA缀合的报告探针包括缀合的金纳米颗粒(GNP)探针。
22.根据权利要求21所述的侧流测定，其中所述缀合的GNP探针包括通过硫醇、PEG18和PolyA构建体与所述ssDNA退火区偶联的GNP。
23.根据权利要求13和17中任一项所述的侧流测定，其中所述靶捕获探针包括具有与生物素-TEG连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-TEG连接子可进一步与所述ssDNA靶捕获探针序列偶联，所述ssDNA靶捕获探针序列与所述杂交dsDNA探针上的所述靶捕获区互补。
24.根据权利要求13所述的侧流测定，其中所述宿主RNA转录物生物标志物包括至少一种RNA转录物生物标志物，所述至少一种RNA转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：SEQ ID NO.1-444和657-815。
25.一种用于早期检测RNA转录物生物标志物的基于抗体的侧流测定，所述侧流测定包括：
-来自受试者的具有宿主RNA转录物生物标志物的体液样品；
-反应筒，所述反应筒被配置成接收唾液样品，并且被进一步配置成通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应产生经扩增样品，其中所述经扩增样品包括与抗体缀合的报告探针偶联的杂交dsDNA探针；
-缀合物垫，所述缀合物垫被配置成接收所述经扩增样品；
-膜，所述膜与所述缀合物垫流体连通，并且被进一步配置成允许所述经扩增样品通过毛细作用流过所述膜；
-检测区，所述检测区含有多个嵌入式抗体靶捕获探针，所述多个嵌入式抗体靶捕获探针被配置成结合和固定所述杂交dsDNA探针；
-对照区，所述对照区含有多个嵌入式抗体靶捕获探针，所述多个嵌入式抗体靶捕获探针被配置成结合和固定所述杂交dsDNA探针；
-捕获区，所述捕获区具有抗体，所述抗体被配置成结合和固定一个或多个抗体DNA缀合的报告探针。
26.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述体液样品包括唾液样品。
27.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中将产生所述等温RT-RPA反应所必需的试剂预装载到所述反应筒中。
28.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述膜包括硝酸纤维素膜。
29.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述杂交dsDNA探针包括：
-dsDNA靶序列；
-5′正向ssDNA寡核苷酸；以及
-5′反向ssDNA寡核苷酸。
30.根据权利要求29所述的基于抗体的侧流测定，其中所述5′正向ssDNA寡核苷酸包括5′FITC正向寡核苷酸。
31.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述5′反向ssDNA寡核苷酸包括5′DIG反向寡核苷酸或5′生物素反向寡核苷酸。
32.根据权利要求30所述的基于抗体的侧流测定，其中所述缀合的报告探针包括与形成抗体缀合的报告探针的抗体偶联的金纳米颗粒(GNP)。
33.根据权利要求32所述的基于抗体的侧流测定，其中所述抗体包括抗FITC抗体。
34.根据权利要求30和33所述的基于抗体的侧流测定，其中所述FITC抗体与所述杂交dsDNA探针的所述5′FITC正向寡核苷酸结合。
35.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述检测区的所述靶捕获探针包括抗DIG抗体。
36.根据权利要求31和35所述的基于抗体的侧流测定，其中所述抗DIG抗体与所述杂交dsDNA探针的所述5′DIG反向寡核苷酸结合。
37.根据权利要求25和31所述的基于抗体的侧流测定，其中所述对照区的所述靶捕获探针包括具有与生物素-TEG连接子偶联的固定化链霉亲和素碱基四聚体的靶捕获探针，所述生物素-TEG连接子可进一步与所述5′生物素反向寡核苷酸偶联。
38.根据权利要求30所述的基于抗体的侧流测定，其中所述检测区的所述靶捕获探针包括抗兔抗体。
39.根据权利要求25所述的基于抗体的侧流测定，其中所述宿主RNA转录物生物标志物包括至少一种RNA转录物生物标志物，所述至少一种RNA转录物生物标志物由至少一个选自由以下组成的组的核苷酸序列编码：SEQ ID NO.1-444和657-815。
40.一种早期病原体检测的方法，所述方法包括以下步骤：
-从第一受试者收集体液样品；
-从所述体液样品提取宿主源性感染生物标志物和病原体生物标志物；
-通过PCR、实时PCR(RT-PCR)或定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)来对所述宿主源性感染生物标志物和病原体生物标志物进行定量；
-建立宿主源性感染生物标志物的水平的时间进程，并且任选地使所述宿主源性感染生物标志物与所述体液样品中的所述病原体生物标志物的水平相关；
-任选地在不同的时间点重复上述四个步骤；
-从第二受试者收集含有宿主源性感染生物标志物的体液样品；
-检测与所述病原体感染相关的一种或多种宿主源性感染生物标志物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染RNA生物标志物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述病原体生物标志物包括选自由以下组成的组的病原体生物标志物：病毒病原体生物标志物、细菌病原体生物标志物和病原体真菌生物标志物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述病毒病原体生物标志物包括来自新型冠状病毒SARS-CoV-2的病毒病原体生物标志物。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述来自新型冠状病毒SARS-CoV-2的病毒病原体生物标志物包括一种或多种可在PCR反应中通过根据SEQ ID NO.469-480的核苷酸引物扩增的生物标志物。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染RNA生物标志物，并且所述方法进一步包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应将所述宿主源性感染RNA生物标志物转化成杂交双链DNA(dsDNA)探针的步骤。
47.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括根据权利要求1到12所述的方法。
48.一种检测有需要的受试者的感染的方法，所述方法包括从由所述受试者提供的生物样品中检测至少一种宿主源性感染RNA生物标志物的步骤，其中所述至少一种宿主源性感染RNA生物标志物选自由以下组成的组：由根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性感染RNA生物标志物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述检测步骤包括根据权利要求1到12所述的方法。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述检测步骤包括检测所述宿主源性感染RNA生物标志物的步骤包括使用PCR、RT-PCR或qRT-PCR检测宿主源性感染RNA生物标志物。
51.一种侧流测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：由根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性RNA生物标志物。
52.一种测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：由根据SEQ IDNO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性RNA生物标志物，其中所述测定是PCR测定、RT-PCR测定或qRT-PCR测定。
53.一种微阵列测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：由根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性RNA生物标志物。
54.一种侧流测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：IFIT2、ICAM1、ERG1、IFIH1、ISG15、CFB、CXCL10、DDX58和IRAK2。
55.一种测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：IFIT2、ICAM1、ERG1、IFIH1、ISG15、CFB、CXCL10、DDX58和IRAK2，其中所述测定是PCR测定、RT-PCR测定或qRT-PCR测定。
56.一种微阵列测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：IFIT2、ICAM1、ERG1、IFIH1、ISG15、CFB、CXCL10、DDX58和IRAK2。
57.一种检测有需要的受试者的病毒感染的方法，所述方法包括检测由受试者提供的生物样品中指示的至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：IFIT2、ICAM1、ERG1、IFIH1、ISG15、CFB、CXCL10、DDX58和IRAK2，并且所述生物样品是唾液。
58.一种侧流测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示SARS-CoV-2感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：MX1、PARP12、IFITM2、CD68和SERINB3。
59.一种测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示SARS-CoV-2感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：MX1、PARP12、IFITM2、CD68和SERINB3，其中所述测定是PCR测定、RT-PCR测定或qRT-PCR测定。
60.一种微阵列测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示SARS-CoV-2感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：MX1、PARP12、IFITM2、CD68和SERINB3。
61.一种检测有需要的受试者的SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括检测由受试者提供的生物样品中的至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示SARS-CoV-2感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：MX1、PARP12、IFITM2、CD68和SERINB3，并且所述生物样品是唾液。
62.一种侧流测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示流感感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：PLRG1、MSC、NKG7、NME8和MMP12。
63.一种测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示流感感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：PLRG1、MSC、NKG7、NME8和MMP12，其中所述测定是PCR测定、RT-PCR测定或qRT-PCR测定。
64.一种微阵列测定，其被配置成从由受试者提供的生物样品中检测至少一种指示流感感染的宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示病毒感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：PLRG1、MSC、NKG7、NME8和MMP12。
65.一种检测有需要的受试者的流感感染的方法，所述方法包括检测由受试者提供的生物样品中的至少一种宿主源性RNA生物标志物，其中所述至少一种指示流感感染的宿主源性RNA生物标志物选自由以下组成的组：PLRG1、MSC、NKG7、NME8和MMP12，并且所述生物样品是唾液。
66.根据权利要求51到65中任一项所述的方法，其中所述RNA生物标志物选自由以下组成的组：由根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性RNA生物标志物。
67.一种编码用于检测有需要的受试者的感染的宿主源性RNA生物标志物的核苷酸序列，其中所述RNA生物标志物选自由以下组成的组：根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列。
68.一种检测宿主源性RNA生物标志物的方法，所述方法包括：
-收集可能含有宿主源性RNA生物标志物以及任选地病毒、细菌或真菌感染的生物标志物的体液样品；
-使用选自由以下组成的组的方法鉴定所述样品中的所述宿主源性RNA生物标志物以及任选地病毒、细菌或真菌感染的生物标志物的转录物：PCR、RT-PCR、qPCR、转录物测序、侧流测定、杂交测定、微阵列、核酸检测测定。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述体液样品包括唾液样品。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染RNA生物标志物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述宿主源性感染RNA生物标志物包括选自由以下组成的组的病原体生物标志物：病毒病原体生物标志物、细菌病原体生物标志物和病原体真菌生物标志物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述病毒病原体生物标志物包括来自新型冠状病毒SARS-CoV-2的病毒病原体生物标志物。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述来自新型冠状病毒SARS-CoV-2的病毒病原体生物标志物包括一种或多种可在PCR反应中通过根据SEQ ID NO.469-480的核苷酸引物扩增的生物标志物。
74.根据权利要求70所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括宿主源性感染RNA生物标志物，并且所述方法进一步包括通过等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)反应将所述宿主源性感染RNA生物标志物转化成杂交双链DNA(dsDNA)探针的步骤。
75.根据权利要求70所述的方法，其中所述宿主源性感染生物标志物包括选自由以下组成的组的宿主源性感染RNA生物标志物：由根据SEQ ID NO.1-444和657-815的核苷酸序列编码的宿主源性感染RNA生物标志物。
76.根据权利要求70所述的方法，其中所述病毒、细菌或真菌感染生物标志物包括病毒、细菌或真菌感染RNA生物标志物。
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