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CN116179483B - 一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法 - Google Patents

一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法 Download PDF

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CN116179483B CN202211627868.5A CN202211627868A CN116179483B CN 116179483 B CN116179483 B CN 116179483B CN 202211627868 A CN202211627868 A CN 202211627868A CN 116179483 B CN116179483 B CN 116179483B
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Abstract

本发明提供了一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，属于生物医药技术领域，主要是将提取的肿瘤淋巴细胞TILs在第一溶液中培养，收集细胞，将收集的细胞与饲养层细胞在第二溶液中进行培养，收获干细胞样记忆性宫颈癌TILs，所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞处理获得，所述基因工程化Hela细胞株为表达跨膜的细胞因子IL‑7、IL‑15，IL‑21的细胞株，本发明提供的TILs扩增方法，培养周期短、杀伤力强，具有很高的临床应用价值。

Description

一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞 的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，目前最佳的防控策略是早期筛查和疫苗接种，但由于我国人口基数大，区域发展不平衡，筛查和疫苗接种没有全面普及，宫颈癌的发病率仍然很高。而免疫治疗特别是细胞免疫治疗可以调节机体免疫功能，改变肿瘤微环境(TME)，诱导特异性肿瘤免疫，达到治疗宫颈癌、减少宫颈癌复发和转移的目的，已经成为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方式。
基于肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes，TILs)的过继免疫治疗也越来越受到国内外学者的关注。TILs是从肿瘤组织中分离出来的肿瘤抗原特异性淋巴细胞群，含有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞。研究表明在治疗转移性黑色素瘤、乳腺癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌等实体瘤中取得良好疗效，这充分显示出TILs用于治疗实体瘤的潜力。然而，国内外上关于TILs在治疗宫颈癌的临床研究比较少。
目前在TILs提取和培养上主要是在Rosenberg教授研究基础上的改良。在TILs提取上，主要步骤就是把肿瘤组织剪成碎块，使用胶原酶消化成单细胞悬液，接着用淋巴细胞分离液进行不连续梯度密度离心提纯出TILs。在获取单细胞悬液这一步也有学者使用组织块培养法(寡克隆培养法)、细穿刺抽吸培养法等。在TILs培养上，Rosenberg使用的快速扩增方案(Redpid explantion protocal，REP)，又叫二步法，即第一步，加入一定剂量的IL-2，让TILs扩增到一定数量，接着第二步，细胞转入含有抗CD3单克隆抗体(OKT3)、IL-2以及经辐射灭活的健康供者的外周血单个核细胞(PBMC)中培养，实现进一步扩增。
肿瘤抗原特异性记忆T细胞(memory T cells)是一类具有抗肿瘤作用的T细胞亚型，当再次遇到同样抗原时能够产生快速且更强的抗肿瘤免疫应答。记忆T细胞通过是否表达CCR7、CD45RA可分为干细胞样记忆性T细胞(Tscm)(CCR7+CD45RA+)、中央型记忆性T细胞(Tcm)(CCR7+CD45RA-)、效应记忆性T细胞(Tem)(CCR7-CD45RA-)、效应T细胞(Teff)(CCR7-CD45RA+)。值得注意的是，Tscm不仅能维持自我更新，在抗原的再次刺激分化为Tcm和Tem，临床前研究发现将Tscm、Tcm、Tem荷瘤小鼠输注后，Tscm组肿瘤缩小程度最大，Tcm次之，Tem则最弱。这表明离体扩增出更高比例的Tscm、有助于TILs发挥更持久更有效的作用。
因此，开发一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌TILs的方法，以获得可供临床治疗应用的TILs，对宫颈癌的治疗具有重要意义。
中国专利文献CN114686430A(申请号：202011629408.7)公开了一种制备TIL的方法，其主要内容对含TIL细胞的初始细胞群与饲养层feeder细胞进行共培养后得到含扩增的TIL细胞的第一扩增细胞群，然后将所述第一扩增细胞群与第二feeder细胞进行共培养获得含扩增的TIL细胞的第二扩增细胞群。该专利虽然能够从极少量的易获取的肿瘤样本中快速培养得到大量TIL，但是其培养周期最短也需要3周，时间较长。另外，该发明使用的feeder来源包括但不限于PBMC和/或抗原递呈细胞，其来源不但存在一定困难，而且制备质量存在异质性。
中国专利文献CN114763530A(申请号：202110054608.2)公开了一种诱导和制备TIL细胞的方法，其主要内容预处理肿瘤组织；之后用第一培养基孵育肿瘤组织，获得第一TIL细胞群；最后用第二培养基孵育第一TIL细胞群，获得第二TIL细胞群。该专利虽然能够可扩增至临床所需数量，但是其培养周期最短也需要25-30天时间较长。此外，该发明中提高的是CD3+CD8+细胞比例，并未考虑到T细胞亚群，抗肿瘤活性有限。
目前TILs扩增方式一般需要至少3周的时间才能生产可用于输注的T细胞，且抗瘤活性低下，临床效果并不理想，同时培养成本以及要求高，限制了TILs在宫颈癌治疗的推广应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法。
本发明解决了TILs细胞在体外培养周期长，扩增倍数低且抗瘤活性低的技术难题。
本发明的技术方案如下：
一种体外扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从宫颈癌肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；
(2)将步骤(1)提取的肿瘤淋巴细胞TILs在第一溶液中培养，培养时间为2～5天，培养后收集细胞，所述第一溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、50～150ng/ml CD3激动剂、50～150ng/ml CD28激动剂、50～150ng/ml CD137激动剂、5～50ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基；
(3)将步骤(2)收集的细胞与饲养层细胞在第二溶液中进行培养，细胞与饲养层细胞的细胞数比例为1:(1～3)，培养时间为10-13天，收获干细胞样记忆性宫颈癌TILs；
所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞处理获得；
所述第二溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、5～50ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基；
所述基因工程化Hela细胞株为表达跨膜的细胞因子IL-7、IL-15，IL-21的细胞株(以下简称Hela-rhIL-7/15/21)；
所述跨膜的细胞因子IL-7包括：CD8α信号肽、IL-7、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；
所述跨膜的细胞因子IL-15包括：CD8α信号肽、IL-15、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.6；
所述跨膜的细胞因子IL-21包括：CD8α信号肽、IL-21、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述第一溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、100ng/ml CD3激动剂、100ng/ml CD28激动剂、100ng/ml CD137激动剂、30ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述第二溶液的配方包括：体积分数为10％人AB血清、30ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞经过辐照获得。
进一步优选的，取基因工程化Hela细胞进行辐照40Gy，获得饲养层细胞。
上述基因工程化Hela细胞的制备方法，包括如下步骤：
①将上述跨膜的细胞因子IL-7、跨膜的细胞因子IL-15、跨膜的细胞因子IL-21插入相应载体构建pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293T细胞包装成三种慢病毒，即表达IL-7慢病毒、表达IL-15慢病毒、表达IL-21慢病毒；
②将表达IL-7慢病毒转染Hela细胞株、并采用Hygro抗生素筛选获得稳定表达IL-7Hela细胞株；然后将表达IL-15慢病毒转染稳定表达IL-7Hela细胞株、并采用Neo抗生素筛选获得稳定表达IL-7和IL-15Hela细胞株；最后将表达IL-21慢病毒转染稳定表达IL-7和IL-15Hela细胞株，并采用Puro抗生素筛选获得稳定表达IL-7、IL-15和IL-21Hela细胞株，即为基因工程化Hela细胞株(Hela-rhIL-7/15/21)。
有益效果
1、本发明解决了TILs体外培养周期长，扩增倍数低且抗瘤活性低的技术难题。
2、本发明提供的TILs扩增方法，经过14天的体外培养，TILs增殖倍数达到2000倍以上，干细胞样性记忆细胞占比超过90％，体外细胞杀伤率以及体内肿瘤体积抑制率均达到90％以上，本发明提供的TILs扩增方法，培养周期短、杀伤力强，具有很高的临床应用价值。
附图说明
图1为pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒图。
图2为pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒图。
图3为pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒图。
图4为Hela细胞表达IL-7的流式鉴定图；
图中：结果为99.70％。
图5为Hela细胞表达IL-15的流式鉴定图；
图中：结果为99.91％。
图6为Hela细胞表达IL-21的流式鉴定图；
图中：结果为98.57％。
图7为不同换液量对TILs扩增倍数的影响图。
图8为Hela-rhIL-7饲养层细胞、Hela-rhIL-7/15饲养层细胞、Hela-rhIL-7/
15/21饲养层细胞以及IL-7/15/21因子对TILs分化的影响图。
图9为TILs对宫颈癌的杀伤效果图。
图10为TILs在体内对宫颈癌的杀伤效果图；
图中：与干细胞样记忆性高比例TILs细胞治疗组相比***P<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中使用的药品及试剂，若无特殊说明，则为以上市普通产品，实施例中未详加说明的内容，均按本领域现有技术。
Hela细胞：购自南京科佰生物科技有限公司。
实施例1
基因工程化Hela细胞为表达跨膜的细胞因子IL-7、IL-15，IL-21的基因工程化Hela细胞株(以下简称Hela-rhIL-7/15/21)。
基因工程化Hela细胞的制备，包括如下步骤：
(1)pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒的构建
所述跨膜的细胞因子IL-7包括：
CD8α信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；IL-7，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；CD8α跨膜区，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；并按顺序连接，连接后核苷酸序列如SEQID NO.4所示；
所述跨膜的细胞因子IL-15包括：
CD8α信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；IL-15，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD8α跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；并按顺序连接，连接后核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
所述跨膜的IL-21包括：
CD8α信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；IL-21，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；CD8α跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；并按顺序连接，连接后核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8委托云舟生物科技(广州)股份有限公司合成其整个表达框并依次插入表达载体pLV[Exp]-Hygro-EF1A、pLV[Exp]-Neo-EF1A、pLV[Exp]-Puro-EF1A构建成pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7(见图1)、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15(见图2)、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21(见图3)；并将构建的载体分别导入大肠杆菌进行保存。
(2)pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒的提取
将步骤(1)中含有pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21的大肠杆菌分别进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)分别提取pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒，并采用NanoDrop测出pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒浓度均不低于400ng/μl。
(3)三种慢病毒包装、浓缩及滴度检测
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒制备三种慢病毒。具体步骤为：
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒：10μg；GM easyTM LentiviralMix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24h后，吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有体积分数为10％人AB血清DMEM培养基继续培养。48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。再以体积比例4:1与5×PEG-8000+NaCl母液混合，次日于4℃，12000r/min，离心30min，得到表达IL-7慢病毒。
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒：10μg；GM easyTM LentiviralMix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24h后，吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有体积分数为10％人AB血清DMEM培养基继续培养。48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。再以体积比例4:1与5×PEG-8000+NaCl母液混合，次日于4℃，12000r/min，离心30min，得到表达IL-15慢病毒。
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒：10μg；GM easyTM LentiviralMix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24h后，吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有体积分数为10％人AB血清DMEM培养基继续培养。48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。再以体积比例4:1与5×PEG-8000+NaCl母液混合，次日于4℃，12000r/min，离心30min，得到表达IL-21慢病毒。
用DMEM培养基溶解上述三种慢病毒沉淀，并储存在-80℃冰箱中以备后用。取上述三种溶解慢病毒液100μl，采用慢病毒载体(HIV P24)快速检测卡测定滴度，三种慢病毒的滴度均不低于1.0×106TU/ml。
(4)基因工程化Hela细胞(简称为Hela-rhIL-7/15/21)的构建、筛选以及流式鉴定
将步骤(3)中的3个病毒依次感染Hela细胞，制备出Hela-rhIL-7/15/21，具体内容如下：
1)将2×105个Hela细胞和100μl步骤(3)中表达IL-7慢病毒悬液至24孔板中，用含有体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基调节体积至300μl，并加聚凝胺至10μg/ml。次日换液，并在含有600μg/ml Hygro、体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基培养8d，37℃，5％的CO2条件下培养，得到稳定表达IL-7Hela细胞株，采用FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FITC通道检测IL-7表达，结果为99.70％，结果见图4。
2)将2×105个步骤1)制备的表达IL-7Hela细胞和100μl步骤(3)中表达IL-15慢病毒悬液至24孔板中，用含有体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基调节体积至300μl，并加聚凝胺至10μg/ml。次日换液，并在含有1500μg/ml Neo、体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基培养8d，37℃，5％的CO2条件下培养，得到稳定表达IL-7和IL-15Hela细胞株，采用FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)PE通道检测IL-15表达，结果为99.91％，结果见图5。
3)将2×105个步骤2)制备的表达IL-7和IL-15Hela细胞和100μl步骤(3)中表达IL-21慢病毒悬液至24孔板中，用含有体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基调节体积至300μl，并加聚凝胺至10μg/ml。次日换液，并在含有4μg/ml Puro、体积分数为10％人AB血清RPMI-1640培养基培养3d，37℃，5％的CO2条件下培养，得到稳定表达IL-7、IL-15和IL-21Hela细胞株，即Hela-rhIL-7/15/21，采用FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)PC5.5通道检测IL-21表达，结果为98.57％，结果见图6。
(5)Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞的制备
采用生物辐照仪将步骤(4)构建的Hela-rhIL-7/15/21进行40Gy辐照，之后将Hela-rhIL-7/15/21细胞混悬600g离心10min，弃上清后获得Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞。
实施例2
宫颈癌肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs
将宫颈癌组织样品至于含有20ml生理盐水的10cm培养皿中，充分浸泡洗涤10分钟，去除较明显的坏死组织、血管组织、脂肪组织、正常组织等，收获6g宫颈癌组织。将组织转移到50mL离心管中，用医用剪刀将肿瘤组织剪成糊状组织，之后加入20ml生理盐水充分浸泡洗涤10分钟，去上清。再用吸管将组织转移到15mL离心管中，按组织(g)：混合酶(mL)＝1g:0.25mL比例，向糊状组织中加入混合酶(质量分数0.05％胰酶和质量分数0.1％ I型胶原酶)，置37℃恒温摇床，60min后(组织消化呈团絮状，没有明显肉眼可见硬块)加入与混合酶等体积且含有体积分数为20％人AB血清X-vivoTM15培养基终止消化，用40um细胞滤网过滤，收集滤液，600g离心10min，去上清，用生理盐水重悬细胞；按细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比＝1:1比例混合，将细胞悬液缓慢加入淋巴分离液上层，进行不连续密度梯度离心，800g离心30min，用巴氏吸管吸取中间层的淋巴细胞，离心弃上清。用45mL生理盐水重悬细胞，同时取20ul细胞悬液进行台盼蓝染色，计数后260g离心10min，弃上清，备用。提取的肿瘤浸润组织淋巴细胞TILs活细胞计数为0.75×106个细胞。
实施例3
一种体外快速扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，包括如下步骤：
(1)TILs的激活：第0天(分离获得细胞的当天作为0天)，取实施例2提取的TILs细胞，按TILs细胞密度1×106cells/ml接种到第一溶液，并置于二氧化碳培养箱培养3天，37℃，5％的CO2条件下培养，得到激活后TILs。
其中第一溶液包含体积分数为10％人AB血清、100ng/ml CD3激动剂、100ng/mlCD28激动剂、100ng/ml CD137激动剂、30ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基。
(2)TILs的扩增：将步骤(1)中培养3天激活后TILs进行完全换液，600g离心10min后弃上清并用第二溶液进行重悬TILs，同时添加3倍数量的Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞，并用第二溶液将细胞密度调整为1×106cells/ml，进行培养，37℃，5％的CO2条件下培养；
其中第二溶液包含体积分数为10％人AB血清、30ng/ml IL-2的X-vivoTM15培养基。
第5天，根据密度补液，补液密度维持在1×106cells/ml。第8天，根据细胞数量添加3倍数量的Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞，同时根据密度补液，补液密度维持在1×106cells/ml。第11天，根据密度补液，补液密度维持在1×106cells/ml。培养至第14天，将TILs进行计数后收获细胞。活细胞计数为1.65×109个细胞，且流式细胞术检测TILs细胞中的CCR7、CD45RA的表达率，CCR7+CD45RA+>90％，即获得干细胞样记忆性宫颈癌TILs。
实验例1
第3天换液量对TILs扩增倍数的影响
取60份宫颈癌肿瘤组织进行TILs的扩增，利用实施例3的方法扩增，不同的是在第3天是否将TILs进行换液，分为不换液组(n＝20)、半量换液组(n＝20)、完全换液组(n＝20)。比较各组TILs培养倍数。结果为在第3天，将激活后TILs进行完全换液则扩增倍数最高，可达2000倍，具体见图7。
实验结果说明本发明提供的制备方法极大的提高TILs的增殖活性。
实验例2
Hela-rhIL-7饲养层细胞、Hela-rhIL-7/15饲养层细胞以及Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞对TILs分化的影响
取80份肿瘤组织进行TILs的扩增，利用实施例3的方法扩增，不同的是添加饲养层细胞的种类，分为Hela-rhIL-7组(n＝20)、Hela-rhIL-7/15组(n＝20)、Hela-rhIL-7/15/21组(n＝20)。并与常规培养方式[(IL-7/15/21因子组(n＝20)]进行对比。
其中常规培养方式[(IL-7/15/21因子组(n＝20)]具体培养方法为：TILs的提取和激活参照实施例2和实施例3。TILs的扩增是在第3天，将激活后TILs进行换液，600g离心10min后弃上清并用第三溶液进行重悬TILs，密度维持在1×106cells/ml，其中第三溶液包含体积分数为10％人AB血清、30ng/ml IL-2、40ng/ml IL-7、50ng/ml IL-15、50ng/ml IL-21的X-vivoTM15培养基，之后在第5天、第8天、第11天，采用第三溶液补液，使密度维持在1×106cells/ml，培养至第14天，将TILs进行计数后收获细胞。
结果为Hela-rhIL-7组干细胞样记忆性宫颈癌TILs占比26.58％，Hela-rhIL-7/15组干细胞样记忆性宫颈癌TILs占比76.00％，Hela-rhIL-7/15/21组干细胞样记忆性宫颈癌TILs占比94.54％，IL-7/15/21因子组干细胞样记忆性宫颈癌TILs占比64.29％。说明本发明设计的Hela-rhIL-7/15/21饲养层细胞有利于促进干细胞样记忆性宫颈癌TILs产生，具体见图8。
效果例1
TILs在体外对宫颈癌的杀伤效果
以Hela宫颈癌细胞系为靶细胞，实施例3制备的TILs细胞或者实验例2中Hela-rhIL-7组制备的TILs细胞为效应细胞，分别按20:1的效/靶比将效应细胞加入到靶细胞中，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和等体积含体积分数10％胎牛血清RPMI-1640培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。靶细胞数为1×104个，靶细胞接种6h后加入效应细胞，分别于37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养2、4、6h时向各孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育1h±10min，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。杀伤率由下式计算：杀伤率％＝[1-(效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100％。结果在效靶比为20:1的情况下，作用4h后，实施例3制备TILs对靶细胞的杀伤率达到90％以上，明显高于实验例2中Hela-rhIL-7组制备的TILs细胞的杀伤率(t＝12.20，P<0.001)。具体见图9，说明本发明制备TILs具有较高的杀伤力。
效果例2
TILs在体内对宫颈癌的杀伤效果
雄性BALB/c裸鼠(4～6周龄，n＝18)，饲养在无菌环境中，24℃和50％～70％湿度条件下，12/12h的光/暗循环，并允许自由获得食物和水。所有动物实验均经本院动物伦理委员会批准。Hela细胞(6×106/mL)重悬于100μL PBS溶液中，注射入裸鼠左侧腋下皮下组织。接种后，每天用游标卡尺测量肿块的长度和宽度。按V＝0.5×a×b2(a为长度，b为宽度)计算肿瘤体积。
当肿瘤体积达到约500mm3时，将裸鼠随机分为对照组、干细胞样记忆性高比例TILs细胞治疗组和干细胞样记忆性低比例TILs细胞治疗组，6只/组。按如下将细胞溶于1mlPBS通过尾静脉注射裸鼠体内。
对照组：空白对照只加1ml PBS。
干细胞样记忆性高比例TILs细胞治疗组：1×107个实施例3制备的TILs细胞。
干细胞样记忆性低比例TILs细胞治疗组：1×107个实验例2中Hela-rhIL-7组制备的TILs细胞。
输注后，继续用游标卡尺测量肿瘤结节的长度和宽度，评估肿瘤体积，共观察60d。当对照组肿瘤体积达到>2000mm3时，处死裸鼠。统计各组裸鼠的肿瘤体体积以及治疗组的肿瘤体积抑制率[肿瘤体积抑制率＝(VC-Vt)/VC×100％，其中VC为阴性对照组平均瘤体体积，Vt为各实验组平均瘤体体积]。结果表明干细胞样记忆性高比例TILs细胞治疗组肿瘤体积(132.50±44.20)mm3明显小于对照组(2002.00±37.78)mm3(P<0.05)和干细胞样记忆性低比例TILs细胞治疗组(569.20±72.29)mm3(P<0.05)，具体见图10。在肿瘤体积抑制率方面，干细胞样记忆性低比例TILs细胞治疗组肿瘤体积抑制率为71.57％，而干细胞样记忆性高比例TILs细胞治疗组肿瘤体积抑制率为93.38％。
本发明提供的TILs扩增方法，经过14天的体外培养，TILs增殖倍数达到2000倍以上，干细胞样性记忆细胞占比超过90％，体外细胞杀伤率以及体内肿瘤体积抑制率均达到90％以上，本发明提供的TILs扩增方法，培养周期短、杀伤力强，具有很高的临床应用价值。

Claims (6)

1.一种体外扩增干细胞样记忆性宫颈癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）从宫颈癌肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；
（2）将步骤（1）提取的肿瘤淋巴细胞TILs在第一溶液中培养，培养时间为2~5天，培养后收集细胞，所述第一溶液的配方组成为：体积分数为10%人AB血清、50~150ng/ml CD3激动剂、50~150ng/ml CD28激动剂、50~150ng/ml CD137激动剂、5~50ng/ml IL-2的X-vivo™ 15培养基；
（3）将步骤（2）收集的细胞与饲养层细胞在第二溶液中进行培养，细胞与饲养层细胞的细胞数比例为1:（1~3），培养时间为10-13天，收获干细胞样记忆性宫颈癌TILs；
所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞处理获得；
所述第二溶液的配方组成为：体积分数为10%人AB血清、5~50ng/ml IL-2的 X-vivo™15培养基；
所述基因工程化Hela细胞株为表达跨膜的细胞因子IL-7、IL-15，IL-21的细胞株；
所述跨膜的细胞因子IL-7包括：CD8α信号肽、IL-7、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.4；
所述跨膜的细胞因子IL-15包括：CD8α信号肽、IL-15、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.6；
所述跨膜的细胞因子IL-21包括：CD8α信号肽、IL-21、CD8α跨膜区，并按顺序连接，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述第一溶液的配方组成为：体积分数为10%人AB血清、100ng/ml CD3激动剂、100ng/ml CD28激动剂、100ng/ml CD137激动剂、30ng/ml IL-2的X-vivo™ 15培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第二溶液的配方组成为：体积分数为10%人AB血清、30ng/ml IL-2的X-vivo™ 15培养基。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述饲养层细胞是由基因工程化Hela细胞经过辐照获得。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，取基因工程化Hela细胞进行辐照40Gy，获得饲养层细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程化Hela细胞的制备方法，包括如下步骤：
①将所述跨膜的细胞因子IL-7、跨膜的细胞因子IL-15、跨膜的细胞因子IL-21插入相应载体构建pLV[Exp]-Hygro-EF1A-IL-7质粒、pLV[Exp]-Neo-EF1A-IL-15质粒、pLV[Exp]-Puro-EF1A-IL-21质粒，采用慢病毒包装试剂盒分别转染293T细胞包装成三种慢病毒，即表达IL-7慢病毒、表达IL-15慢病毒、表达IL-21慢病毒；
②将表达IL-7慢病毒转染Hela细胞株、并采用Hygro抗生素筛选获得稳定表达IL-7Hela细胞株；然后将表达IL-15慢病毒转染稳定表达IL-7 Hela细胞株、并采用Neo抗生素筛选获得稳定表达IL-7和IL-15 Hela细胞株；最后将表达IL-21慢病毒转染稳定表达IL-7和IL-15 Hela细胞株，并采用Puro抗生素筛选获得稳定表达IL-7、IL-15和IL-21 Hela细胞株，即为基因工程化Hela细胞株。
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