CN116162138A

CN116162138A - 树枝状多肽及其用途

Info

Publication number: CN116162138A
Application number: CN202310163775.XA
Authority: CN
Inventors: 杨莉; 张瑞
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2023-02-24
Publication date: 2023-05-26

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及树枝化多肽及其用途。本发明要解决的技术问题是提高抗原从注射部位转运至淋巴结的效率，从而增强疫苗的免疫效果。本发明解决技术问题的方案是提供了树枝状多肽DP7，并进一步提供了树枝状多肽DP7在促进疫苗免疫效果等方面的用途。本发明树枝状DP7具有淋巴结靶向的特性，能够作为药物传递系统携带抗原进入淋巴结，提高疫苗的免疫效力，此外还能促进DC细胞疫苗向淋巴结迁移，提高其免疫效果，具有很好的应用前景。

Description

树枝状多肽及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种树枝状多肽及其用途。

背景技术

肿瘤疫苗具有特异性高、毒副作用小的特点。因此是取代或协助传统疗法以提高疗效的一种很好的选择。肿瘤疫苗的主要作用方式是将肿瘤抗原传递给抗原递呈细胞(APC)，从而激活固有免疫应答和抗原特异性适应性免疫应答，发挥系统性和特异性抗肿瘤作用。以疫苗为基础的抗肿瘤治疗虽然具有优越的理论基础，但仍未能取得令人满意的临床治疗效果。因此，提高疫苗的体内免疫刺激效果是肿瘤免疫治疗领域的重要研究方向之一。适应性免疫反应主要在次级淋巴器官中启动，因此，疫苗在淋巴结(LNs)中的有效积累是其诱导强大的抗原特异性免疫反应的先决条件。LN是抗原提呈的主要场所，大量的APC在其中定居，这些细胞与初始T细胞相邻，在抗原摄取后可以实现快速抗原提呈。此外，定居在LNs中的APC是不成熟的表型，具有较强的抗原摄取能力。因此，将肿瘤疫苗有效地传递给LNs是提高疫苗效率的重要策略之一。

令人失望的是，由于抗原(如蛋白质)和佐剂(如铝佐剂)的内淋巴引流趋势相对有限，这表明需要对抗原和佐剂具有高亲和力的专业靶向递送平台。目前，肿瘤疫苗向LNs的有效递送主要依赖于纳米递送系统。由于纳米递送系统具有被APC捕获的固有特性，因此将纳米技术用于癌症疫苗设计具有巨大的前景。然而，目前的纳米疫苗系统在实现有效的肿瘤治疗方面仍然存在障碍。部分原因是由于疫苗载体的设计不令人满意，大多数载体功能单一、不具备免疫佐剂的功效，或者复杂的合成过程不利于随后的大规模使用。

DP7(VQWRIRVAVIRK)是申请人在之前研究的氨基酸活性预测方法的基础上开发的一种新型阳离子亲水性抗菌肽，然后用胆固醇对其进行修饰，发现Chol-DP7(DP7-C)具有载体和免疫佐剂的双重功能。它可以通过小窝蛋白和网格蛋白依赖的途径有效地将小RNA和多肽传递给肿瘤细胞和免疫细胞，可作为递送载体。作为免疫佐剂，它可以通过激活TLR2-MyD88-IKK-IκB-NF-κB信号通路刺激DC成熟，并增强负载肿瘤抗原的DC疫苗的抗肿瘤作用。虽然以前的实验已经证明，DP7-C可以用于增强负载肿瘤抗原的DC疫苗的抗肿瘤效果，但由于DC疫苗在体外的复杂性和耗时制备，故认为DP7-C与肿瘤抗原直接孵育皮下给药可使患者能更方便、更快速接受治疗，同时成本更低。但DP7-C与抗原复合后的淋巴结靶向作用还有提高的空间。

所以，有效提高抗原的淋巴结引流效率是目前疫苗制备领域需要解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提高抗原的淋巴结引流效率，进而提高基于抗原的疫苗的免疫效果。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了树枝状多肽DP7，用于增强抗原淋巴结靶向效率，并且由于树枝状多肽DP7本身具有免疫佐剂的功效，因此增强了疫苗的免疫效果。本发明树枝状多肽中所述的多肽为DP7多肽，其氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ IDNo.1)；DP7多肽相互之间偶联形成的树枝状多肽，其由2～16个DP7多肽分子偶联而成。

优选的，所述树枝状多肽由2、4、8个DP7多肽分子偶联而成。

其中，本发明树枝状多肽中所述的DP7多肽分子之间是由赖氨酸作为连接媒介完以成偶联。

其中，本发明树枝状多肽中所述的DP7多肽分子参与偶联的部位为碳端和/或氮端的氨基酸残基。进一步的，本发明树枝状多肽的结构式为以下的至少一种：

式Ⅱ

或者

本发明提供了上述树枝状多肽在制备药物递送载体、药物或疫苗中的用途。

其中，上述用途中所述的药物递送载体、药物或疫苗为淋巴结靶向的药物递送载体、药物或疫苗。

其中，上述用途中所述的疫苗是指感染性疾病疫苗、自身免疫性疾病疫苗或肿瘤疫苗中的至少一种。

进一步的，上述用途中所述的感染性疾病疫苗为病毒疫苗或细菌疫苗中的至少一种。

本发明还提供了上述树枝状多肽在制备树突状细胞迁移促进剂或免疫佐剂中的用途。进一步的，上述的促进树突状细胞迁移是指促进树突状细胞向淋巴结迁移。

进一步的，上述树枝状多肽可在体外与树突状细胞共孵育以提高其迁移能力，或与树突状细胞直接配合进一步提高其迁移能力。其中，所述的直接配合使用是指注射使用。

本发明也提供了一种树突状细胞疫苗，其由上述的树枝状多肽处理后的树突状细胞作为主要活性成分。其中，所述的树突状细胞为髓样DC细胞或为淋巴样DC细胞。进一步的，所述的树突状细胞为由患者自体获取的离体树突状细胞。

其中，上述树突状细胞疫苗中所述的处理，为与树突状细胞共孵育后制成疫苗使用；或者，与树突状细胞混合后制成疫苗使用。

进一步的，上述树突状细胞疫苗可使用以下方法制备得到：

a、取诱导培养后的未成熟树突状细胞(imDCs)；

b、向培养基中加入上述的树枝状多肽，以及加入刺激树突状细胞成熟的试剂和抗原，孵育后获得负载有抗原且成熟的树突状细胞；

c、将步骤b获得的负载有抗原且成熟的树突状细胞制备为树突状细胞疫苗。

进一步的，上述树突状细胞疫苗还包括有药学上可接受的辅助性成分。

进一步的，所述的在药学上可接受的辅助性成分为保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂或细胞培养基中的至少一种。

本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含有抗原和免疫佐剂；所述的免疫佐剂为上述的树枝状多肽。

其中，上述疫苗中所述的抗原为能在重组蛋白疫苗、多肽疫苗、mRNA疫苗、细胞疫苗中直接或间接提供免疫原性的抗原组分。进一步的，所述的细胞疫苗为树突状细胞疫苗。

进一步的，上述疫苗中的抗原和免疫佐剂处于同一包装或独立的不同包装中。

进一步的，上述疫苗中还包括有药学上可接受的辅助性成分。

其中，上述疫苗中所述的在药学上可接受的辅助性成分为保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂或细胞培养基中的至少一种。

本发明的有益效果在于：本发明创造性地合成得到树枝状的DP7，并发现其有特殊的优异性能。首先，树枝状DP7多肽与活性物质共孵育后注射能够提高活性物质抗原的淋巴结靶向效率，可作为一种淋巴结特异性靶向递送载体。另外，其能激活细胞免疫反应辅助抗原特异性免疫反应，可作为免疫佐剂使用，可增强以抗原为活性成分的疫苗的免疫效果。在疫苗制备过程中只需要将树枝状多肽与抗原共孵育5min后皮下注射即可，制备方法简单，成本低，有助于后续推广使用，具有很好的应用前景。此外，此外，本发明树枝状DP7多肽还能促进树突状细胞迁移，并能通过树突状细胞的搬运功能将抗原高效、特异性靶向递送到淋巴结，诱导抗肿瘤免疫反应，在树突状细胞疫苗中有特别的应用优势。

附图说明

图1：KK2DP7的结构以及HPLC和MS数据。

图2：KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7和OVA孵育后能够提高OVA被DC摄取的效率。(****表示p<0.0001)

图3：KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7能够刺激DC成熟。(****表示p<0.0001，**表示p<0.01)

图4：KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7和OVA孵育后与DC孵育能够提高DC对OVA的递呈效率

图5：KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7与DC孵育后能够提高DC的迁移效率。(****表示p<0.0001，**表示p<0.01)

图6：KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7和cy7-OVA孵育后皮下给药淋巴结中荧光强度比较。(****表示p<0.0001，**表示p<0.01)

图7：KK2DP7/OVA复合物疫苗皮下注射的免疫效果检测。a-b)CD8⁺T细胞增殖效率；c-d)CD8⁺四聚体比例检测；e-f)ELISPOT检测抗原特异性淋巴细胞反应。(****表示p<0.0001)

图8：KK2DP7/OVA复合物疫苗皮下注射的抗肿瘤效果。(****表示p<0.0001)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的介绍对本发明进行具体的说明。

在本发明的前期研究中，获得了一种具有抗菌作用的多肽，其序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.1)，将其命名为DP7。在进一步的研究中，发现对DP7多肽进行疏水化修饰后成为具有自组装成胶束能力的两亲化合物DP7-C，一方面能降低DP7多肽的细胞毒性，保持抗菌活性；另一方面作为组装成纳米粒子后能作为一些药物的递送载体。除此之外，疏水化修饰的DP7具有作为免疫佐剂的功效，它可以通过激活TLR2-MyD88-IKK-IκB-NF-κB信号通路刺激DC成熟，并增强负载新抗原的DC疫苗的抗肿瘤作用。虽然以前的实验已经证明，DP7-C可以用于增强抗原负载DC疫苗的抗肿瘤效果，但由于DC疫苗在体外的复杂性和耗时制备，我们认为DP7-C与抗原直接孵育给药皮下给药可使患者能更方便、更快速接受治疗，同时成本更低。但是，进一步的研究发现DP7-C与抗原复合后的靶向淋巴结的效应还不能令人满意。

因此，本发明创造性地设计了一种具有增强淋巴结靶向性等有益特性的树枝状DP7多肽，特别适合于开发纳米疫苗系统。

首先，本发明提供了一种树枝状多肽，其为多个DP7多肽分子相互之间偶联形成的树枝状多肽。偶联可以由多个DP7多肽分子偶联而成，一般可以选择2～16个DP7多肽分子偶联而成。在本发明的实施例中，制备得到了并考察了2、4和8个DP7多肽分子偶联而成的树枝状DP7多肽，分别为二分枝DP7(后续缩写为KDP7)、四分枝DP7(后续缩写为KK2DP7)及八分枝DP7(后续缩写为KK2K4DP7)。

本发明所述的DP7多肽分子之间是由赖氨酸作为连接媒介以实现的偶联。DP7多肽参与偶联的部位可为碳端或者氮端的氨基酸残基。

本发明的树枝状多肽能够作为药物递送载体中传送药物。尤其是作为淋巴结靶向的药物递送载体。本发明树枝状多肽可用于装载递送蛋白多肽类药物、核酸类药物以及小分子化学药物。

同时，本发明的树枝状多肽还能用于制备疫苗。比如，其可用于制备感染性疾病疫苗、自身免疫性疾病疫苗或肿瘤疫苗。

本发明的树枝状多肽能激活细胞免疫反应辅助抗原特异性免疫反应，能作为免疫佐剂用于制备各种疫苗。

本发明的树枝状多肽还能用于制备树突状细胞迁移促进剂。所述的促进树突状细胞迁移是指促进树突状细胞向淋巴结迁移。

在具体的运用中，本发明的树枝状多肽可在体外与树突状细胞共孵育以提高其迁移能力，或与树突状细胞直接配合使用进一步提高其迁移能力。比如，与树突状细胞直接配合进行注射使用。

本发明还提供了一种树突状细胞疫苗，由上述树枝状多肽处理后的树突状细胞作为主要活性成分。树突状细胞可为髓样DC细胞或为淋巴样DC细胞。日常操作中，可选用患者自体获取的离体树突状细胞。

而上述的处理，为与树突状细胞共孵育后，取孵育后的树突状细胞制成疫苗使用；或者，与树突状细胞混合后制成疫苗使用。

具体的制备可参考如下方法：

a、取诱导培养后的未成熟树突状细胞(imDCs)；

自然地，上述疫苗还可以包括有药学上可接受的辅助性成分。如保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂或细胞培养基中的至少一种。

本发明还进一步提供了一种疫苗，其包含有抗原和免疫佐剂；所述的免疫佐剂即为上述的树枝状多肽。

其中，上述的抗原为能在重组蛋白疫苗、多肽疫苗、mRNA疫苗、细胞疫苗直接或间接提供免疫原性的抗原组分。如，抗原蛋白、抗原肽、用于表达抗原蛋白或抗原肽的mRNA、用于制备树突状细胞疫苗的抗原、树突状细胞疫苗等。

所述的抗原和树突状细胞迁移促进剂可处于同一包装或独立的不同包装中。还包括有药学上可接受的辅助性成分。

本领域技术人员可以理解，本发明上述的抗原可以是肿瘤抗原，包括由肿瘤细胞表达的特异性的蛋白质或多肽。比如WT1、MUC1、EGFRvIII、HER-2、MAGE-A3、NY-ESO-1、PSMA、GD2或MART1等现已报道的肿瘤抗原或基于病人肿瘤序列测定的个体化的突变新抗原组合。

上述的抗原也可以是病毒抗原，例如组成病毒部分的蛋白质或多肽，或者在受病毒表达机制控制的病毒感染的细胞中表达的特异性的蛋白质或多肽。比如EBV、LMP2、HPVE6 E7、腺病毒5Hexon或HCMV pp65等病毒相关抗原。

上述的抗原也可以是细菌抗原，包括由细菌表达的蛋白质或多肽。比如绿脓杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、肺炎链球菌、沙门氏菌等细菌抗原。

本领域技术人员也可以理解，所述抗原也以是与疾病相关的抗原，包括自身免疫相关抗原，例如涉及自身免疫疾病或病症或在自身免疫疾病过程中过表达的抗原。比如，ppIAPP、IGRP、GAD65或髓磷脂碱性蛋白质抗原等自身免疫相关抗原。

以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细描述。

实施例中主要使用的实验材料和设备如下：

1、实验用细胞株及实验动物

EG7-OVA细胞系购自美国模式菌种收藏所(American Type Culture Collection,ATCC)。用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibico公司)的RPMI-1640(Gibico公司)培养基进行培养。实验所用6-8周龄的C57/BL6J雌性小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，饲养于SPF级环境中。

2、主要试剂材料及试剂盒

实验用细胞培养基：1640培养基(RPMI-1640)和胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)均购自于美国Gibco公司。

细胞因子CCL19、CCL21购自absin生物科技有限公司。

0.5μm的24孔Transwell小孔购自康宁生物科技有限公司。

GM-CSF购自上海普欣生物科技有限公司。

ELISPOT试剂盒和CFDA-SE细胞标记试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

3、主要仪器设备

流式细胞仪：FACSCalibur。

实施例1分枝状多肽KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7的合成

分枝DP7多肽是通过标准的固相肽合成法合成的。简要描述如下：将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH挂在树脂上，去掉2个Fmoc，后裸露出2个NH2，按照多肽序列VQWRIRVAVIRK，从右往左以此缩合，这样就得到了2分枝多肽。

通过将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH挂在树脂上，去掉2个Fmoc，后裸露出2个NH2，2个裸露的NH2再接上2个Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，去掉所有的Fmoc后，裸露4个氨基，按照多肽序列VQWRIRVAVIRK，从右往左以此缩合，这样就得到了4分枝多肽。

通过将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH挂在树脂上，去掉2个Fmoc，后裸露出2个NH2，2个裸露的NH2再接上2个Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，去掉所有的Fmoc后，裸露4个氨基，再接上4个Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。去掉所有的Fmoc后，裸露8个氨基，按照多肽序列VQWRIRVAVIRK，从右往左以此缩合，这样就得到了8分枝多肽。

对所合成的分枝肽进行HPLC和MS检测来验证所合成的终产物。结构以及HPLC和MS结果见图1。结果表明合成得到了分枝状多肽KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7。

实施例2KDP7/OVA、KK2DP7/OVA、KK2K4DP7/OVA复合物被DC摄取的效率检测1、KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7与OVA复合物的制备

KDP7(VQWRIRVAVIRKK)、KK2DP7((VQWRIRVAVIRK)₂KK)和KK2K4DP7(((VQWRIRVAVIRK)₂K)₂KK)由上海楚肽生物技术有限公司通过固相肽合成法合成。终产物经过HPLC纯化和质谱鉴定。

KDP7、KK2DP7和KK2K4DP7冻干粉直接加入去离子水溶解，分装于-20℃保存。制备他们与OVA的复合物时，只需将他们与OVA水溶液在去离子水、培养基中孵育5min即可。

2、DC细胞的获取及培养

①取6周龄左右的成年C57BL/6J雌性小鼠的胫骨和腓骨,放置于75％乙醇中浸泡5min以杀死细菌，接着剔除肌肉组织，将腿骨浸泡在RPMI 1640+1％PS的培养基中；用灭菌的剪刀剪除腿骨两端，再用注射器吸取新鲜的RPMI 1640+1％PS培养基吹出骨髓细胞，直至将骨髓细胞全部吹出为止；

②用70μm的筛网将收集的含有骨髓细胞的培养基进行过滤，1200rpm离心3min，弃去上清，再用红细胞裂解液(称取1.3g Tris-base和3.74g NH4Cl，用490ml超纯水溶解，用浓盐酸将溶液pH值调至7.2-7.4，再加入超纯水定容至500ml，0.22μm滤器去除细菌，4℃保存，现配现用)重悬细胞，室温静置3min，1200rpm离心3min，最后使用RPMI1640+10％FBS+1％PS培养基将红细胞裂解液洗除，并重悬细胞；

③将重悬的细胞分至培养皿中，每皿2×10⁶-3×10⁶个细胞，每皿加入10ml的RPMI1640+10％FBS+1％PS培养基，并加入20ng/ml GM-CSF细胞因子，将培养皿置于37℃细胞培养箱中培养，在培养的第三天加入新鲜的含有20ng/ml GM-CSF的RPMI1640+10％FBS+1％PS培养基，直至培养到第8天得到未成熟DCs(imDCs)。取培养至第8天培养的DCs，使用1ml PBS洗去培养基后，用100μl的PBS重悬细胞，加入1μl APC Hamster Anti-Mouse CD11c流式抗体，轻轻混匀后置于4℃避光孵育40min；待孵育结束后用PBS洗去多余抗体，再用200μl PBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测CD11c⁺DCs所占比例。当CD11c比例大于80％时，则说明DC诱导成功。

3、KDP7/OVA、KK2DP7/OVA、KK2K4DP7/OVA复合物转染DC的效率

取培养第8天的未成熟的DC铺于24孔板中，每孔5×10⁵个细胞。分别加入30μl在1640完全培养基孵育5min的KDP7/OVA、KK2DP7/OVA、KK2K4DP7/OVA复合物，其中OVA带有FITC标记使用浓度为10μg/ml，KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7的使用浓度为5、10、20、40μg/ml。继续培养24h后收取细胞，洗去多余培养基后用200μl PBS重悬后，使用流式细胞仪检测带荧光的细胞所占比例。

从结果可知，从转染效率上看KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7转染OVA到DC的效率均可达到90％以上(图2)。

实施例3KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7刺激DC成熟的效率检测

取培养第8天的未成熟的DC铺于24孔板中，每孔5×10⁵个细胞。分别用10、20、40、80μg/ml的KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7处理。24h后，收集细胞进行CD11c、CD80、CD86染色，检测BMDCs的成熟情况。

从流式细胞术的结果来看，KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7均可诱导DCs成熟，并且其中KK2DP7在诱导DCs成熟方面相较KDP7和KK2K4DP7更具优势(图3)。

实施例4KDP7/OVA、KK2DP7/OVA、KK2K4DP7/OVA复合物被DC递呈的效率检测

取培养第8天的未成熟的DC铺于24孔板中，每孔5×10⁵个细胞。分别加入30μl在1640完全培养基孵育5min的KDP7/OVA、KK2DP7/OVA、KK2K4DP7/OVA复合物，其中OVA的使用浓度为10ug/ml，KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7的使用浓度为40μg/ml。继续培养24h、48h、72h后收取细胞，洗去多余培养基后用SIINFEKL-H2K^b+抗体4℃染色40min，加入PBS洗涤一次。随后用200μl PBS重悬，使用流式细胞仪检测带荧光的细胞所占比例。

从结果可知，从抗原递呈效率上看KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7转染OVA到DC后细胞对其递呈效率均明显增高，在72h时，KK2DP7组的抗原递呈效率明显高于KDP7组与KK2K4DP7组(图4)。

实施例5KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7体外刺激DC迁移的效率检测

取培养第8天的未成熟的DC铺于24孔板中，每孔5×10⁵个细胞。分别加入10、20、40μg/ml的KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7处理24h。将细胞消化后使用1640双无培养基洗涤3遍后，使用1640培养基重悬。将细胞铺于24孔板的transwell小孔中(孔径为5.0μm)，每孔1×10⁵个细胞体积为100μl。下室加入：500μl 1640完全培养基+CCL19(250ng/ml)+CCL21(250ng/ml)；24h后将下室细胞进行计数，计算DCs迁移的效率。

结果显示与对照组相比，KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7均能在一定程度上提高DC的体外迁移效率，并且其中KK2DP7促进DC迁移的效率最佳(图5)。

实施例6分枝状多肽/OVA复合物的淋巴结靶向效率检测

将60μg的KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7和20ug的Cy7-OVA在100μl PBS中孵育5min后注射到小鼠皮下淋巴结旁。4h后取小鼠近端淋巴结和远端淋巴结进行荧光成像，检测淋巴结中荧光强度并进行统计学分析。

结果显示，与单独的OVA组以及KDP7/OVA组合KK2K4DP7/OVA组相比，KK2DP7/OVA组近端淋巴结和远端淋巴结中的荧光强度均显著增高(图6)。我们后续实验主要选用淋巴结靶向能力强的KK2DP7作为研究对象。

实施例7KK2DP7/OVA复合物的免疫效果检测

将6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠随机分为3组(PBS组、OVA组、KK2DP7/OVA组)，每组3只小鼠。在第-21、-14、-7天在小鼠淋巴结旁注射100μl的OVA(20μg)或KK2DP7(60μg)/OVA(20μg)。在第0天处死小鼠取其脾脏进行后续实验。

(1)流式细胞术检测T细胞增殖-CFSE分裂法

①最后一次免疫7天后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，取3×10⁶个细胞，用1mlCFDASE细胞标记液悬浮细胞，置于15mlBD管中；

②用CFDASE细胞标记液稀释CFDASE储存液至2×，混匀；

③将1ml CFDA储存液(2×)加入①中，轻轻混匀；

④37℃避光孵育30min；

⑤加入10ml1640+10％FBS培养基，混匀，终止标记；

⑥离心去上清，重复⑤；

⑦用1640+10％FBS培养基将细胞稀释至2×10⁶/ml，在96孔板中每孔加入50μl细胞(1×10⁵个/孔)，分别用10μg/ml OVA_257-264多肽刺激，每组设3个复孔，用含10％FBS的1640完全培养基将总体积补至200μl，混匀后将96孔板置于CO₂培养箱中培养4天。

⑧收集培养的细胞至流式管，每管加入100μl PBS重悬细胞，分别加入1μlT细胞的表面标志(PE-CD8)抗体，然后进行流式分析。

实验结果显示：KK2DP7/OVA免疫组的小鼠T细胞增殖效率明显高于OVA组和PBS组(图7a-7b)。

(2)流式细胞术检测免疫后脾脏中的CD8四聚体

①最后一次免疫7天后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，取1×10⁶个细胞使用1640+10％FBS+PS培养在12孔板中；

②加入10μg/ml OVA_257-264刺激7天；

③收集培养的细胞至流式管，每管加入100μl PBS重悬细胞，分别加入1μl T细胞的表面标志(PE-CD8)抗体和四聚体染料，然后进行流式分析。

实验结果显示：KK2DP7/OVA免疫组的小鼠CD8⁺T细胞四聚体比例明显高于OVA组和PBS组(图7c-7d)。

(3)ELISPOT检测免疫后抗原特异性淋巴细胞反应

第一天：

①预包被板的活化：每孔加入200μlRPMI-1640无血清培养基，室温静置5-10min后将其扣出；

②加入细胞悬液：将分离的脾淋巴细胞重悬为5×10⁶细胞/ml，加入100μl脾淋巴细胞悬液及对照，即5×10⁵个细胞/孔；

③加入刺激物：OVA_257-26410μg/孔，设置3个复孔；

④孵育：盖好板盖，放入37℃，5％CO2培养箱培养48h；

第三天：

①裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基，加冰冷的ddH₂O，200μl/孔，4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞；

②洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μl/孔，洗涤5-7次；每次停留30-60s；最后一次，在吸水纸上扣干；

③检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/孔；37℃孵育1h；

④洗板：按照②；

⑤酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μl/孔；37℃孵育1h；

⑥洗板：按照②；

⑦显色：将现配的AEC显色液工作液加入各实验孔，100μl/孔；在37℃孵箱避光做显色，每隔5-10min检查一次；

⑧终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用ddH₂O洗涤正反面及底座5遍，终止显色；将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；

⑨ELISpot板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

实验结果显示：KK2DP7/OVA免疫组的小鼠抗原特异性淋巴细胞产生的IFN-γ斑点数明显高于OVA组和PBS组(图7e-7f)。

实施例8KK2DP7/OVA复合物的抗肿瘤效果检测

将6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠随机分为3组(PBS组、OVA组、KK2DP7/OVA组)，每组6只小鼠。在第0天每只小鼠右背部皮下接种1×10⁶个EG7-OVA肿瘤细胞，分别在第4、11和18天在小鼠淋巴结旁注射100μl的KK2DP7(60μg)/OVA(20μg)，待肿瘤长出后每隔2天测量肿瘤大小，瘤体积计算公式为0.52×长×宽²。记录每组内每只小鼠肿瘤生长曲线和各组肿瘤平均生长曲线以及肿瘤生存率，并进行统计学分析。

结果显示KK2DP7/OVA免疫组肿瘤生长最为缓慢，并且与OVA组合PBS组相比具有显著差异(图8)。

本发明上述实例中提供了具有较好淋巴结靶向的基于树枝状多肽KDP7、KK2DP7、KK2K4DP7的多种药物递送系统。基于树枝状多肽的递送系统能够将OVA高效递送到DC中，作为免疫佐剂能够刺激DC成熟、提高DC对OVA的递呈效率，并且具有促进DC迁移的能力。其中的KK2DP7的整体效果更为优秀。该递送系统成功提高了OVA的淋巴结靶向、增强了疫苗的免疫效果。在疫苗制备过程中，只需要将树枝状多肽与抗原共孵育5min后皮下注射即可达到效果，制备方法简单、成本低，有助于后续推广使用，具有很好的应用前景。

Claims

1.树枝状多肽，其特征在于：所述多肽为DP7多肽，其氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK；相互之间偶联形成的树枝状多肽，其由2～16个DP7多肽分子偶联而成。

2.根据权利要求1所述的树枝状多肽，其特征在于：由2、4、8个DP7多肽分子偶联而成。

3.根据权利要求1～2任一项所述的树枝状多肽，其特征在于：所述的DP7多肽分子之间是由赖氨酸作为连接媒介完以成偶联。

4.根据权利要求1～3任一项所述的树枝状多肽，其特征在于：所述DP7参与偶联的部位为碳端和/或氮端的氨基酸残基。

5.根据权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽，其特征在于所述的树枝状多肽的结构式为以下的至少一种：

6.权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽在制备药物递送载体、药物、或疫苗中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的药物递送载体、药物或疫苗为淋巴结靶向的药物递送载体、药物或疫苗。

8.权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽在制备疫苗中的用途。

9.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的疫苗是指感染性疾病疫苗、自身免疫性疾病疫苗或肿瘤疫苗中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的感染性疾病疫苗为病毒疫苗或细菌疫苗中的至少一种。

11.权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽在制备树突状细胞迁移促进剂或免疫佐剂中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的促进树突状细胞迁移是指促进树突状细胞向淋巴结迁移。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述树突状细胞迁移促进剂可在体外与树突状细胞共孵育以提高其迁移能力，或与树突状细胞直接配合进一步提高其迁移能力。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述的直接配合使用是指注射使用。

15.树突状细胞疫苗，其特征在于：由权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽处理后的树突状细胞作为主要活性成分。

16.根据权利要求15所述的树突状细胞疫苗，其特征在于：所述的树突状细胞为髓样DC细胞或为淋巴样DC细胞。

17.根据权利要求15所述的树突状细胞疫苗，其特征在于：所述的树突状细胞为由患者自体获取的离体树突状细胞。

18.根据权利要求15～17任一项所述的树突状细胞疫苗，其特征在于：所述的处理，为与树突状细胞共孵育后制成疫苗使用；或者，与树突状细胞混合后制成疫苗使用。

19.根据权利要求15～18任一项所述的树突状细胞疫苗，其特征在于使用以下方法制备得到：

a、取诱导培养后的未成熟树突状细胞；

b、向培养基中加入权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽，以及加入刺激树突状细胞成熟的试剂和抗原，孵育后获得负载有抗原且成熟的树突状细胞；

20.根据权利要求15～19任一项所述的树突状细胞疫苗，其特征在于：还包括有药学上可接受的辅助性成分。

21.根据权利要求16所述的树突状细胞疫苗，其特征在于：所述的在药学上可接受的辅助性成分为保护剂、赋型剂、免疫佐剂、分散剂或细胞培养基中的至少一种。

22.疫苗，其特征在于包含有抗原和免疫佐剂；所述的免疫佐剂为权利要求1～5任一项所述的树枝状多肽。

23.根据权利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述的抗原为能在重组蛋白疫苗、多肽疫苗、mRNA疫苗或细胞疫苗中直接或间接提供免疫原性的抗原组分；进一步的，所述的细胞疫苗为树突状细胞疫苗。

24.根据权利要求22或23所述的疫苗，其特征在于：所述的抗原和免疫佐剂处于同一包装或独立的不同包装中。

25.根据权利要求22～24任一项所述的疫苗，其特征在于：还包括有药学上可接受的辅助性成分。