CN116157118A - 2-hoba治疗动脉粥样硬化的用途 - Google Patents

Abstract

治疗有需要的个体中的家族性高胆固醇血症加速的动脉粥样硬化的方法，包括施用有效量的二羰基化合物清除剂。

Description

2-HOBA治疗动脉粥样硬化的用途

政府支持

本发明在由NIH授予的HL116263和DK59637的政府支持下做出。政府在本发明中拥有某些权利。

发明背景

动脉粥样硬化(心脏病发作和中风的潜在原因)是工业世界中最常见的死亡和残疾的原因¹。高水平的含有脂蛋白的载脂蛋白B(LDL和VLDL)和低水平的HDL增加动脉粥样硬化的风险¹。尽管用HMG-CoA还原酶抑制剂降低LDL已经显示出在大的转归试验中降低心脏病发作和中风的风险，但仍然存在重大的心血管事件剩余风险²。动脉粥样硬化是氧化应激发挥关键作用的慢性炎症性疾病^3,4。含有脂蛋白的apoB的氧化修饰增强了导致泡沫细胞形成的细胞内摄作用(internalization)^1,5。此外，氧化的LDL诱导炎症、免疫细胞活化和细胞毒性^1,5。HDL经由多种作用(包括促进胆固醇流出、防止LDL氧化、维持内皮屏障功能)并通过使细胞氧化应激和炎症最小化来防止动脉粥样硬化^1,4,6。HDL-C浓度与心血管疾病(CVD)呈负相关⁶，但是最近的研究表明，HDL功能的测定可以为CVD风险提供新的独立标记^7,8。证据表明HDL的氧化修饰损害其功能，并且研究表明氧化的HDL确实是致动脉粥样化的^1,6,9。

在脂质过氧化过程中，形成高活性二羰基化合物(dicarbonyl)，包括4-氧代-壬烯醛(4-ONE)、丙二醛(MDA)和isolevuglandin(IsoLG)。这些活性脂质二羰基化合物与DNA、蛋白质和磷脂共价结合，导致脂蛋白和细胞功能的改变^1,10,11。特别地，用活性脂质二羰基化合物修饰促进了可能与动脉粥样硬化相关的炎性反应和毒性^12,13,14,15。鉴定有效的策略以评估活性脂质二羰基化合物对体内疾病过程的贡献是有挑战性的。尽管理论上可以简单地通过使用膳食抗氧化剂降低活性氧(ROS)的水平来抑制包括二羰基化合物的活性脂质物质的形成，但是将抗氧化剂用于防止动脉粥样硬化心血管事件已经证明是有问题的，其中大多数临床转归试验未能显示益处^1,16。膳食抗氧化剂，如维生素C和维生素E，是氧化损伤和脂质过氧化的相对无效的抑制剂。事实上，对患有高胆固醇血症的患者的仔细研究发现，显著降低脂质过氧化所需的维生素E的剂量显著大于在大多数临床试验中通常使用的那些¹⁷。此外，抑制脂质过氧化所需的高剂量的抗氧化剂已经与显著的副作用相关，很可能是因为ROS在正常生理学(包括防止细菌感染)中以及在许多细胞信号转导途径中起关键作用。最后，出于发现的目的，抗氧化剂的使用提供的关于活性脂质二羰基化合物的作用的信息很少，因为ROS的抑制抑制除了活性脂质二羰基化合物之外的广泛的氧化修饰的大分子的形成。

利用抗氧化剂广泛抑制ROS的一种替代方法是使用小分子清除剂，该小分子清除剂在不改变ROS水平的情况下选择性地与活性脂质二羰基化合物反应，从而防止脂质二羰基化合物修饰细胞大分子而不破坏正常的ROS信号转导和功能。2-羟基苄胺(2-HOBA)与脂质二羰基化合物(诸如IsoLG、ONE和MDA)迅速反应，但不与脂质单羰基化合物(诸如4-羟基壬烯醛)反应^15,18,19,20。2-HOBA异构体4-羟基苄胺(4-HOBA)作为二羰基化合物清除剂是无效的²¹。这两种化合物都是口服生物可利用的，因此它们可用于检验体内脂质二羰基化合物清除的作用^13,22。2-HOBA防止氧化应激相关的高血压¹³、氧化剂诱导的细胞毒性¹⁵、神经变性¹⁴和快速起搏诱导的淀粉样蛋白寡聚物形成²³。尽管有证据表明活性脂质二羰基化合物在动脉粥样化形成中起作用^6,7，但迄今为止尚未检查到清除脂质二羰基化合物对动脉粥样硬化形成的影响。

本发明人已经发现，用本发明的化合物来治疗显著减弱了动脉粥样硬化形成。本发明人已经发现，本发明的化合物抑制病变细胞死亡和坏死中心形成，从而导致更稳定的斑块特征的形成，这由增加的病变胶原含量和纤维帽厚度证明。与来自2-HOBA治疗的动脉粥样硬化减少是由于活性二羰基化合物的清除一致，相对于对照小鼠，动脉粥样硬化病变MDA和IsoLG加合物含量在2-HOBA治疗的小鼠中显著降低。本发明人进一步表明，用本发明的化合物来治疗导致减少的MDA-LDL和MDA-HDL。此外，MDA-apoAI加合物形成降低，并且重要的是，2-HOBA治疗导致降低巨噬细胞胆固醇存储的HDL功能更有效。因此，用本发明的化合物清除活性羰基具有多种抗动脉粥样硬化的治疗效果，该治疗效果可能有助于其降低动脉粥样硬化形成的能力。

本发明人还已经发现，与对照个体相比，来自患有严重家族性高胆固醇血症(FH)的人的HDL含有增加的MDA加合物，并且FH-HDL在减少巨噬细胞胆固醇存储方面极度受损。因此，本发明的一个实施方案是在有需要的个体中清除活性二羰基化合物，作为预防和治疗人动脉粥样硬化的新治疗方法。

本发明的介绍和概述

本发明人已经表明，动脉粥样硬化的发病可能因产生脂质过氧化的氧化应激而加速。脂质过氧化的产物中有高活性的二羰基化合物，包括共价修饰蛋白质的isolevuglandin(IsoLG)和丙二醛(MDA)。本发明的实施方案包括用本发明的化合物，包括二羰基化合物清除剂，2-羟基苄胺(2-HOBA，水杨胺)治疗高脂血症Ldlr^-/-小鼠(家族性高胆固醇血症(FH)模型)的HDL功能和动脉粥样硬化。

与用媒介物治疗的小鼠相比，在血脂水平没有变化的情况下，2-HOBA显著降低了高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠动脉粥样硬化，在近侧主动脉减少31％以及在正面主动脉(enface aorta)中减少60％。2-HOBA降低HDL和LDL中MDA含量。消耗西式饮食增加了Ldlr^-/-小鼠的血浆MDA-apoAI加合物水平。2-HOBA抑制MDA-apoAI的形成，并增加小鼠HDL减少巨噬细胞胆固醇存储的能力。

本发明人还表明，2-HOBA降低了Ldlr^-/-小鼠动脉粥样硬化主动脉中的MDA-赖氨酰和IsoLG-赖氨酰含量。此外，2-HOBA减少了巨噬细胞中氧化应激诱导的炎症反应，将动脉粥样硬化病变中TUNEL阳性细胞的数量减少了72％，并降低了血清促炎细胞因子。此外，2-HOBA增强了小鼠的胞葬作用并促进了稳定斑块形成的特征，如由坏死中心减少69％(p<0.01)以及增加的胶原含量(2.7倍)和纤维帽厚度(2.1倍)所证明的。与对照相比，FH患者的HDL具有增加的MDA含量，导致FH-HDL降低巨噬细胞胆固醇含量的能力降低。本发明表明，用2-HOBA清除二羰基化合物对脂蛋白具有多种防止动脉硬化的(atheroprotective)效果，并减少FH鼠类模型中的动脉粥样硬化，这支持其作为预防和治疗人类动脉粥样硬化性心血管疾病的新治疗方法的潜力。

本发明的一个方面是使用本发明化合物清除MDA的方法。

本发明的另一方面是保护HDL和LDL免受活性二羰基化合物影响的方法。

本发明的另一方面是治疗有需要的个体中的动脉粥样硬化的方法，其包括施用有效量的二羰基化合物清除剂。

在某些实施方案中，所述个体被诊断为患有家族性高胆固醇血症。

在某些实施方案中，所述活性二羰基化合物是isolevuglandin(IsoLG)和丙二醛(MDA)。

在某些实施方案中，所述化合物选自下式：

其中R为C-R₂；每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；R₄为H，2H，取代或未取代的烷基，羧基；以及其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，所述化合物是2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或甲基-2-羟基苄胺。

在某些实施方案中，所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

在其他实施方案中，所述化合物选自：

其中R₅是H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)-CH₃。

本发明的另一个实施方案是降低有需要的个体中动脉粥样硬化主动脉中MDA-赖氨酰和IsoLG-赖氨酰含量的方法，其包括施用二羰基化合物清除有效量的化合物，所述化合物可选自下式：

其中R为C-R₂；每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；R₄为H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案是治疗有需要的个体中的动脉粥样硬化的方法，其包括施用二羰基化合物清除有效量的下式化合物：

其中R为C-R₂；每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；R₄为H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐；以及联合施用具有治疗动脉粥样硬化的已知副作用的药物。

附图简述

图1A-1E示出了2-HOBA减弱了高胆固醇血症雌性Ldlr^-/-小鼠的动脉粥样硬化。具体地，用1g/L 2-HOBA或1g/L 4-HOBA(无活性类似物)或媒介物(水)预治疗8周龄的Ldlr^-/-小鼠2周，然后使治疗继续16周，在此期间给小鼠饲喂西式饮食。图A和C的代表性图像显示了近侧主动脉根部切片(图A)和打开固定的(open-pinned)主动脉(图C)中的油红O染色。图B和D显示了主动脉根部切片(图B)和正面主动脉(图D)中的平均油红O可染色病变面积的定量。图E显示了血浆总胆固醇和甘油三酯水平。(图B、D和E)N＝9或10/组。**p<0.01，***p，0.001，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图2A-2E显示2-HOBA降低了Ldlr^-/-小鼠中近侧主动脉粥样硬化病变的MDA加合物含量。通过使用抗MDA第一抗体和荧光标记的第二抗体的免疫荧光法来检测MDA。用Hoechst(蓝色)对细胞核进行复染。图2A的代表性图像显示了近侧主动脉根部切片中的MDA染色(红色)。图2B显示了使用ImageJ软件定量主动脉根部切片中的平均MDA阳性病变面积。数据表示为平均值±SEM，N＝6/组，***p，0.001。采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。图C和D显示了从Ldlr^-/-小鼠分离的主动脉组织，并且通过LC/MS/MS测量二赖氨酰(Dilysyl)-MDA交联(图C)或IsoLG-赖氨酰(图D)。数据表示为平均值±SEM(图C和D)，N＝8或9/组，*p<0.05，Mann-Whotney检验。

图3A-3D显示2-HOBA促进了Ldlr^-/-小鼠中稳定的动脉粥样硬化斑块的特征。进行Masson三色染色，以分析Ldlr^-/-小鼠的近侧主动脉切片中与动脉粥样硬化病变稳定性相关的特征。图3A显示的代表性图像显示了主动脉根部切片中的Masson三色染色。使用ImageJ软件定量胶原含量(图3A)、纤维帽厚度(图3C)和坏死面积(图D)。N＝8/组。*p<0.05，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。比例尺＝100μm。蓝色表示胶原，红色表示细胞质，黑色表示细胞核。

图4A-4D显示2-HOBA防止Ldlr^-/-小鼠动脉粥样硬化病变中的细胞死亡并增加胞葬作用。(4A)代表性图像显示了通过近侧主动脉切片的TUNEL染色(红色)检测的死亡细胞。巨噬细胞通过抗巨噬细胞第一抗体检测(绿色)，细胞核用Hoechst复染(蓝色)。(4B)采用较高的放大倍数采集的代表性图像指示巨噬细胞相关的TUNEL染色(黄色箭头)，并且白色箭头指示与巨噬细胞不相关的游离死亡细胞。(4C)近侧主动脉切片中的TUNEL阳性细胞核数量的定量。(4D)通过对近侧主动脉切片中的游离细胞与巨噬细胞相关的TUNEL阳性细胞进行定量比较来检查胞葬作用。数据表示为平均值±SEM(N＝8/组)。比例尺＝50μm，**p<0.01，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图5A-5D显示2-HOBA降低了高胆固醇血症Ldlr'·小鼠的血浆炎症细胞因子。采用ELISA法测定了来自消耗西式饮食16周并用2-HOBA、4-HOBA或媒介物治疗的小鼠的血浆中的炎症细胞因子，包括IL-1β(5A)、IL-6(5B)、TNF-α(5C)和SAA(5D)。N＝8/组。*p<0.05，**p<0.01。***p<0.001。采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图6A-H显示用2-HOBA的体外治疗抑制氧化应激诱导的细胞凋亡和炎症。(6A和6B)将小鼠主动脉内皮细胞(6A)或原代巨噬细胞(6B)单独用250μM H₂O₂或与4-HOBA或2-HOBA(500μM)温育24小时。然后通过膜联蛋白V染色和流式细胞术检测凋亡细胞。(6C至6H)通过实时PCR分析与经氧化的LDL(6C-6E)或250μM H₂O₂(6F-6H)单独温育24小时或者与4-HOBA或2-HOBA(500μM)温育24小时的腹膜巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。(6A至6H)数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM，***p<0.001，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图7A-7G示出了2-HOBA对MDA-HDL加合物和HDL功能的影响。(7A)通过ELISA测定从如图1所述治疗的Ldlr小鼠分离的HDL中的MDA加合物的水平。数据表示为平均值±SEM(N＝8/组)，***p<0.001，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。(7B)通过使用抗apoAl第一抗体进行免疫沉淀而从血浆中分离的HDL中apoAl和MDA-apoAl的蛋白质印迹。如图1所述治疗Ldlr小鼠，并且包括来自消耗普通饮食(chow diet)的Ldlr小鼠的apoAl和MDA-apoAl以进行比较。(7C)使用lmageJ软件定量通过蛋白质印迹(7B)检测的MDA-apoAl与apoAl的平均密度比(任意单位)。(7D)从消耗西式饮食16周并用2-HOBA或4-HOBA或媒介物治疗的Ldlr小鼠的血浆中分离HDL。将富含胆固醇的巨噬细胞用HDL(25μg蛋白/ml)温育24小时，并测量细胞胆固醇含量的降低％。数据表示为平均值±SEM。N＝7/组，*p<0.05。**p<0.01，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。(7E)在LDL分离前后，通过ELISA测量从对照或FH个体分离的HDL中的MDA加合物。N＝7或8，***p<0.001，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。(7F)来自对照或FH个体的HDL中的MDA-赖氨酰交联含量(n＝6/组)，p＝0.02，Mann-Whitney检验。(7G)在LDL分离前后来自对照或FH个体的HDL(n＝7/组)降低apoE巨噬细胞胆固醇含量的能力。

图8A-8D显示2-HOBA不影响高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠体重、水摄入量、食物消耗量或脂蛋白谱。在消耗西式饮食16周并用1g/L 2-HOBA、4-HOBA或媒介物治疗的Ldlr^-/-小鼠中测量体重(图8A)、水摄入量(图8B)和饮食消耗量(图8C)。(图8D)从禁食6小时的高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠(4只小鼠/组)汇集血浆。使用Superose 6柱进行快速高效液相色谱(FPLC)。通过酶分析法测定总胆固醇，并示出了每组小鼠两个混合血浆样品的平均值。

图9A-9E显示2-HOBA减少高胆固醇血症雄性Ldlr^-/-小鼠的动脉粥样硬化病变。用1g/L 2-HOBA或媒介物(水)预治疗12周龄雄性Ldlr^-/-小鼠2周，然后使治疗继续16周，在此期间给小鼠饲喂西式饮食。(图9A)代表性图像显示了近侧主动脉根部切片中的油红O染色。(图9B)主动脉根部切片中平均油红O可染色病变面积的定量。(图9C)代表性图像显示了打开固定的主动脉中的油红O染色和(图9D)正面病变面积的定量。(图9E)2-HOBA不影响雄性Ldlr^-/-小鼠的胆固醇水平。(B、D和E)N＝9或10/组，**p<0.05。***p<0.001，t检验。

图10A和10B显示2-HOBA不影响抗MDA抗体与MDA-BSA的相互作用。将一系列剂量的单独的MDA-BSA或MDA与1x或5x 2-HOBA温育。然后将每个样本的2μL加载到HyBond-C膜上，并在剧烈洗涤后与封闭缓冲液、抗MDA第一抗体和荧光第二抗体温育。由Odyssey系统捕获图像(图10A)，并由ImageJ软件定量(图10B)。

图11A-11C示出了在Ldlr^-/-小鼠的血浆和组织中测量的2-HOBA或4-HOBA的浓度。A：8周龄的雄性Ldlr^-/-小鼠饲喂WD 16周，并连续用含有2-HOBA(n＝9)或4-HOBA (n＝6)的水治疗。用2-HOBA或4-HOBA(每只小鼠5mg)口服管饲小鼠30分钟后收集血浆。(各自显示为平均值±SEM，p＝0.388，Mann-Whitney检验)。B-C：在口服管饲2-HOBA或4-HOBA(每只小鼠5mg)后30分钟，测量消耗普通饮食的雄性Ldlr^-/-小鼠的主动脉和心脏中的HOBA水平。(各自显示为平均值±SEM，N.S.t检验)。如“方法”中所述，使用LC/MS测量血浆和组织中2-HOBA或4-HOBA的水平。

图12A-12D示出了C57BL/6J小鼠血浆和组织中2-HOBA或4-HOBA的水平。A：在腹膜内注射1mg 2-HOBA(n＝3)或1mg 4-HOBA(n＝3)后，从消耗普通饮食的雌性C57BL/6J小鼠收集血浆样品。*p<0.01，t检验。B-D：腹腔注射后30分钟，WT小鼠肝脏(B)、脾脏(C)和肾脏(D)中2-HOBA和4-HOBA的水平。(各自显示为平均值±SEM，N.S.t检验)。如“方法”中所述，使用LC/MS测量血浆和组织中2-HOBA或4-HOBA的水平。

图13示出了在2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠的肝脏中检测到的isolevuglandin修饰的2-HOBA(IsoLG-2-HOBA)的代谢物。如补充方法中所述鉴定推定的代谢物。来自用2-HOBA(左)和4-HOBA(右)治疗的小鼠的肝脏的代表性色谱图示出了三种最丰富的IsoLG-HOBA代谢物(三个上图)和内标(下图)。色谱图的左侧显示了每种代谢物的一种可能的结构。

图14A-14D显示MDA-2-HOBA加合物相对于MDA-4-HOBA加合物在体内更容易形成。在用2-HOBA或4-HOBA对雄性Ldlr^-/-小鼠进行WD口服管饲后16小时收集尿样。16小时后，处死Ldlr^-/-小鼠，并使用LC-MS/MS测量尿液(14A)、肝脏(14B)、肾脏(14C)和脾脏(14D)中的HOBA-丙烯醛加合物，如“方法”中所述(14A-D)(Mann-Whitney检验，**表示p<0.01，***表示p<0.001)。

图15显示2-HOBA不影响高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠的尿F2-IsoP。通过LC/MS/MS测量消耗西式饮食16周并用1g/L 2-HOBA、4-HOBA或媒介物治疗的Ldlr^-/-小鼠的尿F2-IsoP水平。N＝5或6/组，p＝0.43，Kruskal-Wallis检验。测量尿肌酐水平以用于标准化。

图16显示了饲喂普通饮食6周并仅用水或含有1g/L 2-HOBA或4-HOBA的水连续治疗的Ldlr^-/-血清中细胞因子的水平。用ELISA(R&D系统)测量血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。N＝7或8只小鼠/组，N.S.，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图17显示在有或无100μM H₂O₂的情况下，使用或不使用浓度增加的2-HOBA处理WT巨噬细胞24小时。分离并纯化总RNA，合成cDNA，通过实时PCR检测IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。数据来自三个独立的实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，单因素方差分析(Bonferroni事后检验)。

图18A-18D显示用2-HOBA处理巨噬细胞导致2-HOBA-MDA加合物形成。从C57BL/6J小鼠中分离腹膜巨噬细胞，并与50μg/mL ox-LDL温育，并用250μM 2-HOBA或4-HOBA(18A)，或5μM 2-HOBA或4-HOBA(18B、18C、18D)处理24h。收集细胞样品，并使用LC-MS/MS测量HOBA-MDA加合物，如补充方法中所述。*p<0.05，采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。

图19A-19B显示2-HOBA不影响巨噬细胞中Akt信号转导。使用或不使用媒介物(水)、250μM 4-HOBA或2-HOBA处理WT巨噬细胞1小时，然后根据指示使用或不使用100nM胰岛素温育15分钟。通过蛋白质印迹检测磷酸Akt(S473)和GAPDH(19A)。通过ImageJ软件定量条带密度(19B)。进行了两个独立的实验。

图20示出了2-HOBA对前列腺素代谢物的影响。在用2-HOBA或水治疗12周后，在代谢笼中收集尿样，每个笼中有2只小鼠。采用LC/MS/MS分析了PGE-M(20A)、tetranor PGD-M(20B)、2,3-dinor-6-酮-PGF1(20C)和11-脱氢TxB2(20D)的含量。(20A-20D)各自表示为平均值±SEM，N.S.，Mann-Whitney检验。

图21A-D示出了2-HOBA对高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠血浆和LDL MDA加合物的影响。(20A)通过TBARS法测定消化西式饮食16周并用2-HOBA、4-HOBA或媒介物治疗的Ldlr^-/-小鼠血浆中的MDA含量(*p<0.05，**p<0.01)。(20B)通过ELISA测量从Ldlr^-/-小鼠分离的LDL中MDA加合物的水平。N＝10/组，***p<0.001。(20C)在LDL分离前后从对照和FH个体(n＝6)中分离LDL，并通过ELISA测量MDA加合物含量。(20D)从2-HOBA、4-HOBA或媒介物治疗的高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠中分离LDL。WT腹腔巨噬细胞与LDL温育24小时，并如“方法”中所述测量细胞胆固醇含量。(20A-D)采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析)。

图22A-B显示随着MDA浓度增加，HDL的修饰以剂量依赖的方式损害了胆固醇流出。(22A)用MDA修饰HDL，通过ELISA法测定MDA加合物。(22B)将Apoe^-/-腹腔巨噬细胞与ac-LDL温育40h，然后与50ug/ml HDL或MDA-HDL温育24h。如“方法”中所述，测量净胆固醇流出能力(采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析，*表示p<0.05)。

图23A-B示出了检测2-HOBA醛加合物的相同多反应监测(MRM)参数也检测4-HOBA醛加合物。图A：PITC衍生的2-HOBA(左)和PITC衍生的4-HOBA(右)的MRM m/z 259→m/z 107色谱图。图B：IsoLG(羟基内酰胺)-2-HOBA(左)和IsoLG(羟基内酰胺)-4-HOBA(右)的MRM色谱图m/z 472→m/z 107。MDA(丙烯醛)-2-HOBA加合物和MDA(丙烯醛)-4-HOBA加合物的MRM色谱图先前已经发表。

图24示出了当[²H₄]2-HOBA用作内标时，4-HOBA的PITC衍生物的浓度响应曲线不同于2-HOBA的浓度响应曲线，因此需要使用校正因子。将不同浓度(20-400nmol)的2-HOBA或4-HOBA与1nmol的[²H₄]2-HOBA(用PITC衍生的化合物)混合，然后使用MRM跃迁(transition)m/z 259→m/z 107或m/z 259→153对2-HOBA和4-HOBA进行LC/MS分析，使用m/z 263→m/z111或m/z 263→153对[²H₄]2-HOBA进行分析，并使用峰面积比计算测量的nmol。使用GraphPad Prism计算各自的浓度响应斜率，并将4-HOBA的校正因子计算为两个斜率的比率。

本发明的描述

本文中阐述了当前公开的主题的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文中提供的信息之后，对本文中描述的实施方案和其他实施方案的修改对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解而提供的，而不应由此理解为不必要的限制。在冲突的情况下，以本文的说明书，包括定义为准。

尽管相信本文所用的术语是本领域普通技术人员充分理解的，但是阐述某些定义以便于解释本公开的主题。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

在公开和描述本发明化合物、组合物、制品、系统、装置和/或方法之前，应理解，除非另有说明，否则它们不限于特定的合成方法，或除非另有说明，否则不限于特定的试剂，因此当然可能会变化。还应当理解，本文使用的术语只为了描述特定方面，而不意在限制。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述示例性方法和材料。

本文提及的所有出版物通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。本文论述的出版物仅是为了它们在本申请的提交日期之前公开而提供的。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，本文提供的出版日期可能不同于实际出版日期，可能需要单独确认。

如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“官能团”、“烷基”或“残基”包括两个或更多个这样的官能团、烷基或残基的混合物等。

本文可将范围表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一方面。还应理解的是，每个范围的端值不论是与另一个端值相关，还是与另一个端值不相关，都是有意义的。还应该理解，本文公开了许多数值，并且每个数值在本文中也被公开为“约”该特定数值以及该数值本身。例如，如果公开了数值“10”，那么还公开了“约10”。还应理解为特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。

如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。

如本文所用，术语“个体”是指给药对象。本文公开的方法的个体可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的个体可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不指具体的年龄或性别。因此，不论是雄性的还是雌性的成年和新生个体及胎儿都被涵盖。患者是指患有疾病或病症的个体。术语“患者”包括人和兽类个体。

如本文所用，术语“治疗”是指患者的医学管理，其旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即特别地旨在改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即旨在消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症形成的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。

如本文所使用的，术语“预防(prevent)”或“防止(preventing)”是指排除、阻止、避免、防止、预防或阻碍某事发生，尤其是通过提前行动。应当理解，除非另有明确说明，在本文使用减少、抑制或预防的情况下，也明确公开了其他两个词的使用。如本文中所见，治疗和预防的定义存在重叠。

如本文所用，术语“经诊断的”意指已经由本领域技术人员(例如，医师)进行身体检查，并且发现其具有可被诊断或通过本文所公开的化合物、组合物或方法治疗的病症。如本文所用，短语“鉴定为需要治疗病症”等是指基于对治疗病症的需要选择个体。例如，基于本领域技术人员的早期诊断可以将个体鉴定为需要治疗病症(例如，与炎症有关的病症)，然后接受该病症的治疗。在一个方面，预期鉴别可以由与进行诊断的人不同的人来执行。在另一方面，还预期可由随后进行给药的人来给药。

如本文所用，术语“施用(administering)”和“给药(administration)”是指向个体提供药物制剂的任何方法。这些方法是本领域技术人员公知的，包括但不限于口服给药、透皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼科给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射，例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地给药制剂；即给药以治疗现有的疾病或病症。在其他各个方面，可以预防性地给药制剂；即给药以预防疾病或病症。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需结果或对不希望的病症具有效力的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现所需治疗结果或对不希望的症状具有效力，但通常不足以引起不良副作用的量。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的特定化合物的排泄速度；治疗的持续时间；与所用特定化合物联合或同时使用的药物以及医学领域熟知的相似因素。例如，在本领域的技术范围内是：以低于达到期望的治疗效果所需的剂量的水平开始化合物的剂量，逐步增加剂量，直至达到期望的治疗效果。无需要，可将有效日剂量分为多个剂量用于给药。所以，单剂量组合物可含有这样的量或者其约数以达到每日剂量。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天以一或多次剂量给药施用，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。在其他各个方面，制剂可以“预防有效量”给药；即，有效预防疾病或病症的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在使用前重建成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或载剂包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素和它们合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如，可通过以下方式来维持合适的流动性：使用包衣材料例如卵磷脂，对于分散剂通过维持所需的粒径，以及使用表面活性剂。这些组合物也可以包含辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物的作用的预防可通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。也可能需要包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。通过形成药物在生物可降解聚合物(例如聚乳酸-乙醇酸、聚(原酸酯)和聚酸酐)中的微胶囊基质，制成可注射的“储库”形式。取决于药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。通过将药物包裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中也制得贮库型可注射制剂。例如通过用留住细菌的滤器进行过滤，或在临使用之前通过掺入可以溶于或分散于无菌水或其他的无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂，将可注射的制剂灭菌。合适的惰性载体可包括糖，例如乳糖。以重量计，期望的是，至少95重量％的活性成份的颗粒具有0.01至10μm的有效粒径。

如本文所用，术语“清除剂”或“清除”是指可以被给药以将杂质或不需要的反应产物除去或灭活的化学物质。例如，isolevuglandin不可逆地与蛋白质上的赖氨酸残基特异性加合。本发明的isolevuglandin清除剂在isolevuglandin与赖氨酸残基加合之前与它们反应。因此，本发明化合物“清除”isolevuglandin，从而防止它们与蛋白质加合。

如本文所使用，术语“取代的”旨在包括有机化合物所有可允许的取代基。在一个概括的方面，可运许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的或无支链的、碳环的和杂环的、芳香性的和非芳香性的取代基。示例性的取代基包括例如下面所述的那些取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可为一个或多个并其可相同或不同。为了本发明目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或本文描述的、符合杂原子化合价的、有机化合物的任何可允许的取代基。不欲以任何方式通过有机化合物的可允许的取代基限制本发明。而且，术语“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即此类取代符合被取代的原子及取代基的允许的化合价，并且该取代形成稳定的化合物，例如不会通过诸如重排、环化、消去等自发进行转变的化合物。

本文所用的术语“烷基”是1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可以是环状或非环状的。烷基可以是支链或非支链的。烷基也可以是取代的或未取代的。例如，烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇，如本文所述。“低级烷基”基团是含有1至6个(例如，1至4个)碳原子的烷基。

在整个说明书中，“烷基”通常用于表示未取代的烷基和取代的烷基二者；然而，取代的烷基在本文中也通过鉴定该烷基上的特定取代基而被具体提及。例如，术语“卤代烷基”具体是指被一个或多个卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“烷氧基烷基”具体是指被一个或多个如下所述的烷氧基取代的烷基。术语“烷基氨基”具体是指被一个或多个如下所述的氨基取代的烷基，等等。当在一种情况下使用“烷基”并且在另一种情况下使用例如“烷基醇”的特定术语时，并不表示意指术语“烷基”也不是指例如“烷基醇”之类的特定术语等。

该实践也用于本文描述的其他组。也就是说，虽然例如“环烷基”的术语是指未取代的环烷基部分和取代的环烷基部分二者，但是取代的部分还可以在本文中被特别地标识；例如，特定的取代的环烷基可以称为例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可以特别地称为例如“卤代烷氧基”，特定的取代的烯基可以是例如“烯基醇”等。同样，使用例如“环烷基”的通用术语和例如“烷基环烷基”的特定术语的实践并不意味着暗示通用术语也不包括特定术语。

本文所用的术语“环烷基”是包含至少三个碳原子的非芳族碳基环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基等。术语“杂环烷基”是如上定义的一类环烷基，并且包括在术语“环烷基”的含义内，其中环的至少一个碳原子被杂原子替代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。环烷基和杂环烷基可以为取代的或未取代的。环烷基和杂环烷基可以被一个或多个基团取代，包括但不限于本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基氧基或硫醇。

如本文所用的术语“聚亚烷基”是具有两个或更多个彼此连接的CH₂基团的基团。聚亚烷基可由式-(CH₂)_a-表示，其中“a”为2至500的整数。

本文所用的术语“烷氧基(alkoxy)”和“烷氧基(alkoxyl)”是指通过醚键键合的烷基或环烷基；也就是说，“烷氧基”基团可以定义为-OA¹，其中A¹是如上定义的烷基或环烷基。“烷氧基”还包括如上所述的烷氧基聚合物；也就是说，烷氧基可以是聚醚，例如-OA¹-OA²或-OA¹-(OA²)_a-OA³，其中“a”是1-200的整数，并且A¹、A²和A³是烷基和/或环烷基。

本文所用的术语“胺”或“氨基”由式NA¹A²A³表示，其中A¹、A²和A³可独立地为氢或如本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。

本文所用的术语“羟基”由式-OH表示。

本文所用的术语“硝基”由式-NO₂表示。

术语“药学上可接受的”描述了在生物学上或其他方面不是不合需要的材料，即，不会产生不可接受的水平的不良生物学效应或以有害的方式相互作用的材料。

本文使用的缩写包括以下：2-HOBA：2-羟基苄胺；4-HOBA：4-羟基苄胺；MDA：丙二醛；4-HNE：4-羟基壬烯醛；IsoLG：Isoevuglandin；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；LDLR：低密度脂蛋白受体；ApoAI：载脂蛋白AI；ApoB：载脂蛋白B；ROS：活性氧；IL：白介素。

在本发明的实施方案中，化合物可选自下式：

其中：

R是C-R₂；

每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；

R₄是H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

在其他实施方案中，所述化合物是2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或甲基-2-羟基苄胺。

在另一个实施方案中，所述化合物是2-羟基苄胺。

在另一个实施方案中，所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，所述化合物选自：

其中R₅是H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)-CH₃。

在另一个实施方案中，任何上述化合物存在于包含所述化合物和药学上可接受的载体的药物组合物中。

在一些方面，所公开的药物组合物包含作为活性成分的所公开的化合物(包括其药学上可接受的盐)、药学上可接受的载体和任选存在的其他治疗成分或辅剂。本发明的组合物包括适于口服、直肠、局部和肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的那些，然而在任何给定的情况下最合适的途径取决于特定宿主，以及施用活性成分的疾病的性质和严重性。所述药物组合物可以方便地以单位剂型的形式提供，并通过药学领域熟知的任何方法制备。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明化合物是酸性的时，其相应的盐可以方便地从药学上可接受的无毒性碱(包括无机碱和有机碱)制备。得自此类无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜(二价和一价)盐、三价铁盐、二价铁盐、锂盐、镁盐、锰(三价和二价)盐、钾盐、钠盐、锌盐等。特别优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺以及环胺和取代的胺(例如天然存在和合成的取代的胺)的盐。可用来形成盐的其他药学上可接受的无毒有机碱包括离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N`-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。

如本文所用，术语“药学上可接受的无毒酸”包括无机酸、有机酸和由其制备的盐，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、异亮氨酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。

在实践中，可以根据常规制药技术，将本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分与药用载体紧密混合。所述载体可依据给药(例如口服或肠胃外(包括静脉内))所需的制剂形式有很多种形式。因此，本发明的药物组合物可以以适合口服的分离单元的形式提供，例如各自包含预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂。此外，所述组合物可以作为散剂、颗粒剂、溶液、在水性液体中的混悬剂、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液提供。除了上述常见剂型外，本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐还可以通过控释装置和/或递送装置给药。所述组合物可以通过任何药学方法来制备。通常，此类方法包括将活性成分与构成一种或多种必需成分的载体组合在一起的步骤。通常，通过将活性成分和液体载体或研磨成细粉的固体载体或它们两者均一而紧密地混合在一起，来制备所述组合物。然后，可以方便地将产物的形状制成需要的形式。

因此，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体和本发明化合物或本发明化合物的药学上可接受的盐。本发明化合物或其药学上可接受的盐也可以与一种或多种其他的治疗活性化合物组合而被包含在所述药物组合物中。所用的药物载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的实例包括乳糖、白陶土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的实例包括二氧化碳和氮气。

在制备用于口服剂型的组合物时，可以使用任何方便的药物基质。例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制剂，例如混悬剂、酏剂和溶液；而诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体可用于形成口服固体制剂，例如散剂、胶囊剂和片剂。因为给药方便，所以片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，由此使用的载体是固体药用载体。任选地，片剂可通过标准的水性或非水技术包衣。

含有本发明组合物的片剂可以任选地与一种或者多种附属组分或者助剂通过压制或者成型来制备。压制片剂可在合适的机器上将以自由流动的形式例如粉末或颗粒存在的活性成分任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合压制而成。铸形片剂可以通过在适宜的机械中，将粉末化的用惰性液体稀释剂湿润后的化合物进行塑形而制得。

本发明的药物组合物可利包含作为活性成分的本发明的化合物(或其药学上可接受盐)、药学上可接受的载体和任选存在的一种或多种其他治疗剂或辅剂。本发明的组合物包括适合口服、直肠、局部和胃肠外(包括皮下、肌内和静脉内)给药的组合物，然而在任何既定情况下最适合的途径将取决于特定宿主以及给予活性成分所为的病症的性质和严重程度。所述药物组合物可以方便地以单位剂型的形式存在，并通过药学领域中熟知的任何方法制备。

适于胃肠外给药的本发明的药物组合物可以制成活性化合物在水中的溶液或悬浮液。可以包含适合的表面活性剂，例如羟丙基纤维素。还可以在甘油、液态聚乙二醇和它们在油中的混合物中制备分散液。此外，还可以包含防腐剂以防止微生物的有害生长。

适于注射用的本发明的药物组合物包括无菌的水溶液或分散液。此外，所述的组合物可以为用于临时制备这样的无菌可注射溶液或者分散液的无菌粉末的形式。在任何情况下，最终的可注射形式必须无菌且必须实际上为流体，以方便注射。药物组合物在制造和储存条件下必须是稳定的；因此，优选的贮存应防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、植物油及其合适的混合物。

本发明的药物组合物可为适于局部使用的形式，例如气雾剂、乳膏、软膏、洗剂、撒粉、漱口剂、含漱剂等。此外，所述组合物可为适用于透皮装置的形式。这些制剂可以通过常规加工方法，利用本发明的化合物或其药学上可接受的盐制备。举例来讲，乳膏或软膏通过以下方式制备：将亲水性物质和水以及约5％重量至约10％重量的化合物混合以产生具有所需稠度的乳膏或软膏。

本发明的药物组合物可以是适于直肠给药的形式，其中载体是固体。优选的是，混合物形成单位剂量栓剂。适合的载体包括可脂及本领域常用的其他物质。通过首先将组合物和软化或熔化的载体混合，然后在模具中冷却和成形，可方便地形成栓剂。

除了上述的载体成分外，视情况而定，上面描述的药物制剂可以包含一种或者多种另外的载体成分，例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等等。另外，可以包含其他的辅剂以使所述制剂与目标受体的血液等渗。含有本发明化合物和/或其药学上可接受的盐的组合物也可以制备成粉末或液体浓缩物形式。

本发明的化合物可作为唯一的活性药剂施用，或可与一种或多种可用于治疗或预防各种并发症(诸如炎症和其他炎症相关疾病)的其他组剂联合使用。当作为组合施用时，可将治疗剂配制为同时或不同时间给予的独立的组合物，或者治疗剂可作为单一组合物提供。

如本文所指出的，本发明的化合物可以固体形式(包括颗粒、粉末或栓剂)或以液体形式(例如溶液、混悬剂或乳液)制成。它们可应用于各种溶液中，并且可经受常规制药操作(诸如灭菌)，和/或可包含常规辅剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。

因此，对于施用，本发明的化合物通常与适于所指明的施用途径的一种或多种辅剂组合。例如，它们可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷和/或聚乙烯醇混合，并且压片或包封以用于常规施用。或者，它们可溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲剂。其他辅剂和施用方式在制药领域中是熟知的。载体或稀释剂可包括时间延迟材料，诸如单独的或含有蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本领域熟知的其他材料。

在治疗应用中，本发明的化合物可以足够减少或抑制所需适应症的量施用给哺乳类患者。该用途的有效量取决于这样的因素，包括但不限于施用途径、适应症的阶段和严重性、哺乳动物的一般健康状态和处方医师的判断。本发明的化合物在宽剂量范围内是安全且有效的。然而，应当理解，实际上施用的吡哆胺的量由内科医师根据以上相关情况确定。

适用于本发明方法的化合物的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的盐，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸的盐，诸如脂族单羧酸和二羧酸，苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。因此，这样的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还考虑氨基酸的盐(诸如精氨酸盐等)以及葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐、N-甲基谷氨酰胺等(参见例如Berge et al.,J.Pharmaceutical Science,66:1-19(1977)。

碱性化合物的酸加成盐可通过以常规方式将游离碱形式与足够量的所需酸接触以生成盐来制备。游离碱形式可通过使盐形式与碱接触并以常规方式分离游离碱而再生。游离碱形式与它们各自的盐形式在某些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解度)上不同，但对于本发明的目的而言，所述盐与它们各自的游离碱等同。

还公开了用于治疗或抑制个体中的动脉粥样硬化的方法，其包括以有效抑制血小板活化的剂量和量向哺乳动物联合施用至少一种化合物和具有治疗或抑制动脉粥样硬化的已知副作用的药物的步骤，所述化合物具有由下式化合物表示的结构：

其中：

R是C-R₂；

每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；

R₄是H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐。

因此，所公开的化合物可作为单一药剂或与一种或多种其他药物联合用于治疗、预防、控制、改善前述疾病、障碍或病症、或者降低前述疾病、障碍或病症的风险，本发明化合物或所述其他药物对这些疾病、障碍或病症具有效用，其中药物联合在一起比单独使用任一药物更安全或更有效。所述其他药物可以通过其常用途径和量与所公开的化合物同时或依次施用。当所公开的化合物与一种或多种其他药物同时使用时，优选含有此类药物和所述化合物的单位剂型形式的药物组合物。然而，联合治疗也可以在重叠的时间表上进行。还设想一种或多种活性成分和所公开的化合物的联合可以比作为单一药剂的任一种更有效。

在一个方面，所述化合物可以与抗动脉粥样硬化药剂联合施用。

实施例

通过以下实施例讨论本发明的实施方案。

结果

2-HOBA治疗在不改变Ldlr^-/-小鼠血浆胆固醇水平的情况下减轻动脉粥样硬化。

8周龄的雌性Ldlr^-/-小鼠饲喂西式饮食16周，并用单独的媒介物(水)或含有2-HOBA或4-HOBA(一种无效的二羰基化合物清除剂)的水连续治疗。与媒介物或4-HOBA治疗相比，2-HOBA治疗使近侧主动脉粥样硬化的程度分别减少了31.1％和31.5％(图1A和1B)。此外，对主动脉的正前分析证明，与施用媒介物和4-HOBA相比，用2-HOBA治疗雌性Ldlr^-/-小鼠使主动脉粥样硬化程度分别减少了60.3％和59.1％(图1C和1D)。与施用媒介物或4-HOBA相比，2-HOBA治疗不影响体重、水消耗量或饮食摄取(图8A-8C)。此外，血浆总胆固醇和甘油三酯水平无显著差异(图1E)，脂蛋白分布在3组小鼠之间相似(图8D)。与这些结果一致，在饲喂西式饮食16周的类似条件下，用1g/L 2-HOBA治疗雄性Ldlr^-/-小鼠，与用水治疗相比，近侧主动脉和整个主动脉动脉粥样硬化的程度分别减少了37％和45％(图9A-9D)，但不影响血浆总胆固醇水平(图9E)。当雄性Ldlr^-/-小鼠用3g/L的2-HOBA治疗时，观察到动脉粥样硬化的类似减少。因此，本发明人首次证明了2-HOBA治疗在FH的实验小鼠模型中显著降低动脉粥样硬化进展而不改变血浆胆固醇和甘油三酯水平。使用抗MDA-蛋白加合物的抗体(Abcam cat#ab6463)通过免疫荧光染色检查近侧主动脉MDA加合物含量，结果显示与用单独媒介物或4-HOBA治疗的小鼠相比，2-HOBA治疗的小鼠中的MDA加合物水平减少了68.5％和66.8％(图2A和2B)。本发明人确定抗MDA蛋白抗体不识别游离MDA或MDA-2-HOBA加合物(图10A和10B)。此外，2-HOBA不干扰MDA-白蛋白加合物的抗体识别(图10A和10B)。通过LC/MS/MS对整个主动脉MDA-赖氨酰和IsoLG-赖氨酰加合物的定量测量证明，与4-HOBA治疗相比，施用2-HOBA使MDA和IsoLG加合物的含量分别减少了59％和23％(图2C和2D)。本发明人通过LC/MS/MS确定，在用1g 2-HOBA/L水治疗16周后，雄性Ldlr^-/-小鼠中2-HOBA的血浆水平为469±38ng/mL，这与本发明人先前在接受1g/L 2-HOBA²²的C57BL6小鼠中报道的水平相似。此外，在最近的安全性试验²⁴中，这些水平与人类血浆2-HOBA水平在相同的范围内。在用1g 4-HOBA/L水治疗16周后，雄性Ldlr^-/-小鼠中4-HOBA的血浆水平为25±3ng/mL。然而，在雄性Ldlr^-/-小鼠中，口服管饲5mg后30分钟，2-HOBA与4-HOBA的血浆水平没有显著差异(图11A)。此外，口服管饲30分钟后，雄性Ldlr^-/-小鼠的主动脉和心脏中2-HOBA和4-HOBA的水平相似(图11B和11C)。虽然腹腔注射后4-HOBA的血浆水平最初略高于2-HOBA，但4-HOBA似乎经历了更快速的清除(图12A)。此外，腹腔注射后30分钟，2-HOBA与4-HOBA的肝、脾和肾水平没有显著差异(图12B-12D)。总的来说，雄性Ldlr^-/-小鼠在16周治疗后4-HOBA水平低于2-HOBA水平可能是由于清除率以及处死前水消耗时间的差异。有趣的是，IsoLG-2-HOBA加合物(质量与潜在的酮-吡咯、脱水-内酰胺、酮-内酰胺、吡咯和脱水-羟基内酰胺加合物一致)在西式饮食16周后出现在Ldlr^-/-小鼠的心脏和肝脏中，而检测不到IsoLG-4-HOBA加合物(图13和下表)。

表1：用西式饮食饲喂16周并用含有2-HOBA或4-HOBA的水连续治疗的Ldlr^-/-肝脏和心脏中IsoLG-HOBA代谢物的水平。代谢物1-3(M1、M2、M3)的结构如图13所示。在用4-HOBA处理的小鼠中没有检测到IsoLG-HOBA代谢物的信号。分析每组五只小鼠的肝脏和心脏(显示为平均值±SEM)。

重要的是，在对饲喂西式饮食16周的Ldlr^-/-小鼠进行口服管饲法(5mg)治疗后16小时内收集的尿液中，MDA-2-HOBA与MDA-4-HOBA加合物(质量与丙烯醛-HOBA加合物一致)相比增加了19倍(图14A)。此外，与4-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠相比，2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠的肝脏、肾脏和脾脏在口服管饲后16小时也含有3倍、5倍和11倍的丙烯醛-HOBA加合物(图14B-14D)。尿F2-异前列烷(isoprostane)(IsoP)水平是全身性脂质过氧化的量度，用抗氧化剂α生育酚治疗Apoe^-/-小鼠可降低动脉粥样硬化和尿F2-IsoP水平^25,26。本发明人发现，在用媒介物、4-HOBA和2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠中，尿F2-IsoP水平没有差异(图15)，表明2-HOBA对动脉粥样硬化的作用不是由于总体上抑制脂质过氧化或金属离子螯合。总之，这些结果支持2-HOBA对动脉粥样硬化的影响是由于活性脂质二羰基化合物清除的假设。

2-HOBA治疗在高胆固醇血的Ldlr^-/-小鼠中促进更稳定的动脉粥样硬化斑块的特征的形成。

由于在人类中易损斑块表现出更高的急性心血管事件的风险¹，因此本发明人通过定量动脉粥样硬化病变胶原含量、纤维帽厚度和坏死中心来检查2-HOBA治疗对斑块稳定性的特征的影响(图3A-3D)。与施用媒介物或4-HOBA相比，2-HOBA治疗将近侧主动脉的胶原含量分别增加了2.7和2.6倍(图3A和3B)。此外，相对于媒介物和4-HOBA治疗的小鼠，在2-HOBA治疗的小鼠的病变中纤维帽厚度是2.31倍和2.29倍高(图3A和3C)。重要的是，相对于媒介物和4-HOBA，在用2-HOBA治疗的小鼠中，近侧主动脉中的坏死面积％减少了74.8％和73.5％(图3A和3D)。总之，这些数据表明，2-HOBA抑制了高胆固醇血的Ldlr^-/-小鼠中的易损斑块的特征的形成。

2-HOBA治疗促进细胞存活和胞葬作用并减轻炎症。

由于增强的细胞死亡和不足的胞葬作用促进了坏死中心形成和动脉粥样硬化斑块的失稳，本发明人接下来检查了2-HOBA治疗对近侧主动脉中的动脉粥样硬化病变中的细胞死亡和胞葬作用的影响(图4A-4D)。与用媒介物或4-HOBA治疗相比，在2-HOBA治疗的小鼠的近侧主动脉病变中，TUNEL阳性细胞的数量减少了72.9％和72.4％(图4A和4C)。本发明人还检测了2-HOBA对动脉粥样硬化病变中胞葬作用的影响，与2-HOBA相比，在用媒介物和4-HOBA治疗的小鼠病变中，与巨噬细胞不相关的TUNEL阳性细胞的数量增加了1.9倍和2.0倍(图4B和4D)，支持活性脂质二羰基化合物清除维持有效胞葬作用的能力。与病变坏死和炎症增强相关相一致，相对于4-HOBA或媒介物处理的Ldlr^-/-小鼠，2-HOBA的血清IL-1β、IL-6、TNF-α和血清淀粉样蛋白A水平降低(图5)，表明活性二羰基化合物清除减少了全身性炎症。与饲喂西式饮食的Ldlr^-/-小鼠的结果相反，消耗普通饮食的Ldlr^-/-小鼠的血浆IL-1β、IL-6和TNF-α水平较低，并且2-HOBA治疗对普通饮食的小鼠的细胞因子水平没有影响(图16)。这些结果支持高脂肪西式饮食诱导Ldlr^-/-小鼠氧化应激和炎症的能力。由于研究已经证明细胞与H₂O₂ ^15,25,26或氧化的LDL^27,28,29的温育诱导脂质过氧化、炎症和死亡，本发明人接下来确定了活性二羰基化合物清除对于细胞对氧化应激反应的体外效应。对巨噬细胞和内皮细胞响应H₂O₂处理对凋亡的敏感性的检查表明，与用媒介物或4-HOBA温育相比，2-HOBA显著减少了巨噬细胞和内皮细胞培养物中凋亡细胞的数量(图6A和6B)。此外，2-HOBA治疗显著降低了巨噬细胞对氧化的LDL的炎症反应，其表现为IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平降低。(图6C-6E)。与媒介物或4-HOBA治疗相比，2-HOBA对用H₂O₂处理的巨噬细胞的炎性细胞因子反应的影响观察到类似的结果(图6F-6H)。此外，在H₂O₂存在下，仅用5μm 2-HOBA(615ng/mL)治疗的巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平显著降低(图17)。与2-HOBA清除活性二羰基化合物对细胞死亡和炎症的影响一致，在氧化的LDL和高达500μM 2-HOBA治疗的细胞中，MDA-2-HOBA(丙烯醛-2-HOBA)与MDA-4-HOBA加合物的水平相比有所增加(图18A)。即使在仅用5μM 2-HOBA温育的细胞中，也能形成显著水平的丙烯醛-2-HOBA以及DHP-MDA-2-HOBA，并检测到交联的MDA-2-HOBA加合物(图18B-D)。此外，在没有氧化应激的情况下，2-HOBA对促存活、抗炎信号没有直接影响，³⁰因为在不存在和存在胰岛素的情况下，用媒介物、4-HOBA和2-HOBA治疗的巨噬细胞中的pAKT水平没有差异(图16)。由于对体内炎性细胞因子的显著影响，本发明人还测量了尿前列腺素以评估2-HOBA是否可能抑制环氧化酶(COX)。用液相色谱/质谱法分析尿液中2,3-dinor-6-酮-PGF1、11-脱氢TxB2、PGE-M、PGD-M的含量。本发明人发现，与媒介物对照相比，用2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠的这些主要尿前列腺素代谢物的水平没有显著差异(图17)，表明2-HOBA在小鼠体内没有显著抑制COX。综上所述，这些数据表明2-HOBA治疗在体内维持有效的胞葬作用，并通过清除活性二羰基化合物来防止响应氧化应激的凋亡和炎症。

2-HOBA对脂蛋白MDA修饰和功能的影响以及家族性高胆固醇血症对脂蛋白MDA加合物含量和功能的影响。

与4-HOBA或媒介物相比，用2-HOBA或媒介物治疗饲喂16周西式饮食的Ldlr^-/-小鼠降低了MDA的血浆水平(图18A)。与用媒介物或4-HOBA治疗相比，在用2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠中，通过ELISA测量的分离的LDL中的MDA加合物含量分别降低了57％和54％(图18B)。通过比较，来自对照和FH个体的LDL包含相似量的MDA加合物，它们没有显著差异(图18C)。LDL的MDA修饰诱导泡沫细胞形成，并且检查来自2-HOBA的LDL与来自4-HOBA或媒介物治疗的Ldlr^-/-小鼠的LDL用胆固醇富集细胞的能力没有差异(图18D)。与对照LDL相比，FH观察到类似的结果。该观察结果是由于来自FH个体和高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠的血浆LDL未被MDA充分修饰以诱导胆固醇负荷，如本发明人通过LDL的体外修饰确定的那样，MDA含量必须为2500ng/mg LDL蛋白以用胆固醇富集细胞。由于HDL的氧化修饰损害其功能，本发明人接下来检查了2-HOBA治疗对HDL MDA含量和功能的影响。与用媒介物或4-HOBA治疗相比，用2-HOBA治疗Ldlr^-/-小鼠通过ELISA测量将分离的HDL的MDA加合物含量降低了57％和56％(图7A)。接下来，本发明人研究了2-HOBA对apoAI MDA加合物形成的影响。通过免疫沉淀从血浆中分离ApoAI，并用抗MDA-蛋白加合物的抗体通过蛋白质印迹检测MDA-apoAI。在西式饮食16周后，与消耗普通饮食的Ldlr^-/-小鼠相比，用媒介物或4-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠的MDA-apoAI血浆水平显著增加(图7B和7C)。相反，用2-HOBA治疗消耗西式饮食的Ldlr^-/-小鼠显著降低了血浆MDA-apoAI加合物(图7B和7C)。4组小鼠的apoAI水平相似(图7B)。重要的是，与媒介物和4-HOBA治疗的小鼠相比，从2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠中分离的HDL在降低Apoe^-/-巨噬细胞泡沫细胞中的胆固醇存储方面的效率高2.2倍和1.7倍(图7D)。此外，通过ELISA测量，与对照HDL相比，患有严重FH的人类个体在LDL分离(LA)前后的HDL具有5.9倍和5.6倍多的MDA加合物(图7E)。本发明人还发现，通过LC/MS/MS测量的二赖氨酰-MDA交联水平在来自FH的HDL中高于对照个体(图7F)。重要的是，与对照组个体相比，FH个体的HDL缺乏降低富含胆固醇的Apoe^-/-巨噬细胞的胆固醇含量的能力(图7G)。虽然无脂apoAI的MDA修饰对胆固醇流出的影响已经确定，³¹但关于HDL修饰的影响的研究存在争议^32,33。因此，本发明人测定了体外用MDA修饰HDL对HDL降低巨噬细胞泡沫细胞胆固醇含量的能力的影响，因为这与通过ELISA测量的MDA加合物含量有关(图19A和19B)。HDL的MDA修饰以剂量依赖的方式抑制净胆固醇流出能力，重要的是，影响胆固醇流出功能的MDA-HDL加合物水平与FH个体和高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠HDL中的MDA加合物水平在相同的范围内。总之，2-HOBA的二羰基化合物清除通过提高HDL净胆固醇流出能力来防止巨噬细胞泡沫细胞的形成。此外，本发明的实施方案表明，鉴于来自具有纯合型FH的个体的HDL含有增加的MDA和IsoLG和增强的泡沫细胞形成，清除活性脂质二羰基化合物可能是人类的相关治疗方法。

讨论

氧化应激诱导的脂质过氧化已经涉及动脉粥样硬化的形成。遗传缺陷和/或环境因素引起氧化应激和机体抵抗或解除氧化产物的有害影响的能力之间的不平衡^1,3,34。涉及脂质过氧化在动脉粥样硬化的发病机制中的重要作用的大量实验证据先前已经激发了对抗氧化剂预防动脉粥样硬化心血管疾病的潜力的兴趣。尽管人类中的饮食抗氧化剂的几个试验证明了动脉粥样硬化和心血管事件的减少，但是大多数利用抗氧化剂的大临床转归试验都未能显示在减少心血管事件方面的任何益处。这些试验未能减少心血管事件的可能原因包括在试验中使用的抗氧化剂的剂量不足^1,16和对可能是抗动脉粥样硬化的正常ROS信号转导的抑制³⁵。

组织/细胞或血液中脂质的过氧化产生众多活性脂质羰基和二羰基化合物，包括4-羟基壬烯醛、甲基乙二醛、丙二醛、4-氧代壬烯醛和isolevuglandin。这些亲电体可以与蛋白质、磷脂和DNA共价结合，引起脂蛋白和细胞功能的改变^1,10,11。用活性脂质羰基和二羰基物质的清除剂治疗代表了一种新的替代治疗策略，该策略会降低特定类别生物活性脂质的副作用，而不完全抑制ROS介导的正常信号转导³⁵。已经鉴定了众多具有清除羰基潜力的化合物，单个化合物优先与不同种类的羰基反应，因此清除化合物在减轻疾病中的有效性可以作为其目标种类的羰基有助于疾病进程的指标³⁵。先前的研究发现，甲基乙二醛和乙二醛的清除剂，如氨基胍和吡哆胺，可减少链脲霉素治疗的Apoe^-/-小鼠的动脉粥样硬化病变^36,37。类似地，α-β-不饱和羰基类(如HNE和丙烯醛)的清除剂，如肌肽及其衍生物，也能减少Apoe^-/-小鼠或链脲霉素治疗的Apoe^-/-小鼠的动脉粥样硬化^38,39,40。这些先前测试的清除剂化合物是脂质二羰基化合物如IsoLG和MDA35的不良体内清除剂。因此，本发明人试图检测2-HOBA(IsoLG和MDA的有效清除剂)预防Ldlr^-/-小鼠动脉粥样硬化进展的潜力。

本发明人最近报道了2-HOBA可以减少isolevuglandin介导的HDL修饰和功能障碍⁴¹。本发明首次检测了二羰基化合物清除剂对动脉粥样硬化的作用，并且本发明人证明了本发明的化合物，包括二羰基化合物清除剂2-HOBA，显著降低了高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠模型中动脉粥样硬化的形成(图1)。重要的是，本发明的实施方案表明，2-HOBA治疗显著改善了动脉粥样硬化斑块稳定性的特征，如减少坏死和增加纤维帽厚度和胶原含量所证明的(图3)。与活性二羰基化合物⁴¹的促炎作用和对病变坏死的影响一致，2-HOBA通过中和活性二羰基化合物减少了全身炎症(图5和6)。此外，二羰基化合物清除减少了HDL的体内MDA修饰，这与防止HDL的二羰基修饰提高其净胆固醇流出能力的概念一致(图7)。本发明人先前表明，来自家族性高胆固醇血症个体的HDL的IsoLG修饰增加⁴¹，并且当前的研究表明MDA修饰类似地增加(图7)，表明这些修饰有助于FH-HDL诱导的增强的泡沫细胞形成(图7)。总之，使用2-HOBA清除二羰基化合物在减少动脉粥样硬化形成和易损动脉粥样硬化斑块形成导致的临床事件风险方面提供了治疗潜力。

如本发明的实施方案所示，2-HOBA在不降低血浆胆固醇水平的情况下减少动脉粥样硬化的形成(图1)，不受理论或机制的约束，2-HOBA的抗动脉粥样硬化的治疗效果可能是由于清除生物活性二羰基化合物。与这一概念一致，在2-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠中，动脉粥样硬化病变MDA-赖氨酰和IsoLG-赖氨酰加合物减少(图2)。2-HOBA的作用是由它们作为二羰基化合物清除剂的作用介导的，这进一步得到了以下结果的支持：4-HOBA，一种2-HOBA的几何异构体，在体外不是有效的清除剂，不是抗动脉粥样硬化的，并且发现在高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠中MDA-和IsoLG-2-HOBA相对于-4-HOBA加合物大量形成(图12和13以及表1)。此外，2-HOBA和4-HOBA治疗的Ldlr^-/-小鼠的尿F2-异前列素水平没有显著差异，这表明抗动脉粥样硬化的治疗效果不是通过抑制脂质过氧化或螯合金属离子(图15)。比较中的一个可能因素是4-HOBA在体内比2-HOBA清除得更快，这增加了如下所述的可能性：4-HOBA二羰基加合物在体内非常低到检测不到这一发现可能部分归因于组织中4-HOBA的浓度较低。虽然口服或腹膜内分布后的初始血浆浓度没有显著差异，但4-HOBA从血浆室中的消除比2-HOBA发生得更快。这些清除率的差异增加了我们发现4-HOBA二羰基加合物在体内非常低甚至检测不到的可能性，这可能部分归因于组织中较低的4-HOBA浓度。然而，值得注意的是，腹膜内给药30分钟后，肝脏、脾脏和肾脏含有相似水平的2-HOBA和4-HOBA(图12)。此外，口服管饲Ldlr^-/-小鼠30分钟后，2-HOBA和4-HOBA的主动脉和心脏水平相似(图11)，表明在发展中的动脉粥样硬化病变中清除活性二羰基化合物的途径相同。先前的体外研究表明，与2-HOBA相比，4-HOBA与活性二羰基化合物的反应性较差²¹。与生物系统中4-HOBA与活性二羰基化合物缺乏反应性一致，当在2-HOBA或4-HOBA存在下用ox-LDL体外处理巨噬细胞时，2-HOBA-MDA加合物容易检测到，而4-HOBA-MDA加合物检测不到(图18)。与4-HOBA相比，2-HOBA是活性二羰基化合物的有效体内清除剂，这一概念得到了以下发现的证实：在Ldlr^-/-小鼠口服管饲后16小时内，尿液中积累了19倍多的MDA-2-HOBA加合物(图14A)。口服管饲Ldlr^-/-小鼠16小时后，肝脏、脾脏和肾脏中MDA-2-HOBA相对于MDA-4-HOBA加合物的水平增加，这也有力地支持了2-HOBA是有效的体内二羰基化合物清除剂，但4-HOBA不是。总之，本发明表明通过利用2-HOBA去除二羰基化合物可以预防动脉粥样硬化，这加强了活性二羰基化合物有助于动脉粥样硬化形成的发病机理的假设，并提高了动脉粥样硬化性心血管疾病中二羰基化合物清除的治疗潜力。在这方面，本发明人发现，在最近的人类安全性试验²⁴中，用1g 2-HOBA/L水治疗的Ldlr^-/-小鼠的血浆2-HOBA水平与接受口服剂量2-HOBA的人类相似。

HDL介导许多防止动脉粥样硬化的功能，并且证据表明HDL功能障碍(例如受损的胆固醇流出能力)的标记可以是比HDL-C水平更好的CAD风险指标^1,7,42,43,44。患有FH的患者先前已经显示出具有受损的HDL胆固醇流出能力(表示功能障碍的HDL)^45,46。本发明的实施方案表明，Ldlr^-/-小鼠消耗西式饮食导致增强的MDA-apoAI加合物形成(图7)，并且2-HOBA治疗显著减少了apoAI和HDL被MDA修饰。类似地，FH患者具有增加的MDA-HDL加合物的血浆水平。此外，用MDA对HDL的体外修饰导致净胆固醇流出能力的降低，类似于本发明人先前用IsoLG⁴¹所显示的，并且在与FH个体和高胆固醇血症小鼠相同的范围内用含有MDA加合物的HDL观察到这些效应(图7和图19)。结果与其他研究不一致，这些研究表明HDL的MDA修饰不会显著影响富含胆固醇的P388D₁巨噬细胞的胆固醇流出，这可能是由于修饰条件或细胞类型³²的差异。这一发现与Shao及其同事的研究一致，他们的研究表明，用MDA修饰无脂apoAI可阻断ABCA1介导的胆固醇流出³¹。此外，研究表明，长期吸烟导致MDA-HDL加合物形成增加，戒烟导致HDL功能改善，胆固醇流出能力增加⁴⁷。根据这些结果，本发明人发现，与媒介物和4-HOBA治疗的小鼠相比，从2-HOBA分离的HDL具有增强的减少巨噬细胞泡沫细胞中胆固醇存储的能力(图7)。此外，来自患有FH的人类个体的HDL在LDL分离前后显著增加MDA加合物，并严重损害减少巨噬细胞胆固醇存储的能力(图7)。因此，2-HOBA的动脉粥样硬化保护机制之一可能是通过阻止HDL蛋白的二羰基加合物的形成，从而保持HDL净胆固醇流出功能。除了减少HDL氧化修饰外，本发明的实施方案显示2-HOBA治疗减少血浆LDL的体内MDA修饰。研究表明，低密度脂蛋白的MDA修饰通过清除剂受体促进摄取，导致泡沫细胞形成和炎症反应^48,49。来自2-HOBA和4-HOBA治疗的小鼠的巨噬细胞与低密度脂蛋白温育导致相似的胆固醇含量的发现与低密度脂蛋白一致，低密度脂蛋白被足够量的MDA修饰，通过清除剂受体被快速清除。然而，研究表明，用抗体中和MDA-apoB加合物大大增强了人apoB100转基因Ldlr^-/-小鼠的动脉粥样硬化消退^50,51，使得2-HOBA治疗的动脉粥样硬化减少也可能部分是由于动脉粥样硬化病变内apoB的二羰基修饰减少。

越来越多的证据表明，动脉内膜细胞中氧化应激的增加是诱导内质网应激、炎症和动脉粥样硬化形成中细胞死亡的关键^52,53。特别是，有效的胞葬作用和有限的细胞死亡对于防止易损斑块的坏死和过度炎症至关重要^1,52,54。本发明的实施方案证明用2-HOBA治疗促进了Ldlr^-/-小鼠中更稳定的动脉粥样硬化斑块的特征(图3)。进一步的实施方案显示，2-HOBA治疗降低了动脉粥样硬化病变MDA和IsoLG加合物的含量(图2)，支持动脉内膜中二羰基化合物清除的能力，以限制氧化应激诱导的炎症、细胞死亡和斑块的不稳定。本发明的实施方案表明，体外用2-HOBA清除二羰基化合物限制了内皮细胞和巨噬细胞中氧化应激诱导的凋亡(图6)。细胞死亡的减少可能部分是由于2-HOBA清除二羰基化合物后对氧化应激的炎症反应大大减弱，包括IL-1β在内的血清炎性细胞因子的显著减少证明了这一点(图5)。鉴于CANTOS试验的最新结果显示，使用卡那单抗(canakinumab)(IL-1β中和单克隆抗体)减轻炎症可以降低既往有MI和hsCRP⁵⁵升高的人的心血管事件发生率，这些结果特别相关。重要的是，用2-HOBA治疗不影响环前列腺素、血栓素、PGE2和PGD2的尿前列腺素代谢物的水平，表明2-HOBA不会导致体内小鼠环氧化酶的显著抑制(图17)。此外，2-HOBA治疗维持了有效的胞葬作用，并减少了动脉粥样硬化病变中死亡细胞的数量(图4)。结果，用2-HOBA清除二羰基化合物促进了具有减少的坏死和增加的胶原含量和纤维帽厚度的稳定斑块的特征(图3)。因此，2-HOBA限制动脉细胞响应氧化应激的死亡和炎症以及促进动脉壁有效的胞葬作用的能力提供了一种新的抗动脉粥样硬化机制，由此二羰基化合物清除促进斑块稳定的特征并减少动脉粥样硬化病变的形成。最近的研究证实了这些结果，表明表达针对氧化磷脂的E06抗体的单链可变片段的Ldlr^-/-小鼠具有稳定的斑块特征，包括减少的坏死和全身炎症⁵⁶，这些效应可能部分是由于酯化的活性二羰基化合物的中和。鉴于在人类中CAD临床事件的显著残留炎症风险与胆固醇降低无关的发现^55,57，这些研究突出了活性二羰基化合物作为降低这种风险的靶标。预防动脉粥样硬化病变的形成显然是预防心血管事件的重要策略。

总之，2-HOBA治疗抑制高胆固醇血症Ldlr^-/-小鼠的动脉粥样硬化进展。2-HOBA的抗动脉粥样硬化的治疗效果可能源于阻止血浆载脂蛋白和内膜细胞成分形成二羰基加合物。用2-HOBA治疗减少了MDA-apoAI加合物的形成，从而维持了有效的HDL功能。此外，MDA-apoB加合物的预防减少了泡沫细胞的形成和炎症。最后，在动脉粥样硬化病变中，二羰基化合物清除剂限制了细胞死亡、炎症和坏死，从而有效地促进了稳定动脉粥样硬化斑块的特征。由于2-HOBA治疗的抗动脉粥样硬化的治疗效果不依赖于对血清胆固醇水平的任何作用，2-HOBA为降低使用HMG-CoA还原酶抑制剂治疗的患者中持续存在的残留CAD风险提供了真正的治疗潜力。

材料和方法

小鼠

Ldlr^-/-和WT的C57BL/6背景小鼠获自Jackson Laboratory。根据VanderbiltUniversity’s Institutional Animal Care and Usage Committee的规程进行动物方案。小鼠饲以普通饮食或含有21％乳脂和0.15％胆固醇(Teklad)的西式饮食。用单独的媒介物(水)或用含有1g/L的4-HOBA或1g/L的2-HOBA的媒介物(水)预治疗八周龄雌性Ldlr^-/-小鼠。如前所述²¹合成4-HOBA(盐酸盐)。2-HOBA(乙酸盐，CAS 1206675-01-5)由TSI Co.,Ltd.(Missoula，MT)制造，并从Metabolic Technologies,Inc.,Ames IA²⁴获得。使用商业生产批次(批号16120312)，并通过HPLC和NMR光谱²⁴验证商业批次的纯度>99％。两周后，小鼠继续接受这些治疗，但切换到西式饮食16周，以诱导高胆固醇血症和动脉粥样硬化。类似地，12周龄的雄性Ldlr^-/-小鼠用单独的媒介物(水)或含有1g/L的2-HOBA预治疗两周，然后切换到西式饮食16周以诱导高胆固醇血症和动脉粥样硬化，同时继续用单独的2-HOBA或水治疗^58,59,60。根据每只小鼠的平均体重和每日水消耗量，1g/L 2-HOBA的估计日剂量为200mg/Kg。本发明人没有观察到治疗组之间小鼠死亡率的差异。8周龄的雄性Ldlr^-/-小鼠饲喂西式饮食16周，并用含有2-HOBA或4-HOBA的水连续治疗。在用2-HOBA或4-HOBA(每只小鼠5mg)口服管饲后18小时内，使用代谢笼(2只小鼠在一个笼中)收集尿样。

细胞培养

在注射3％硫胶质72小时后从小鼠中分离腹膜巨噬细胞，并如前所述³⁰维持在加10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM中。人主动脉内皮细胞(HAECs)获自Lonza，并维持在加1％FBS和必需生长因子(Lonza)的内皮细胞基础培养基-2中。

血脂和脂蛋白分布分析

小鼠禁食6小时，并使用来自Cliniqa(San-Macros，CA)的试剂，通过酶分析法测定血浆总胆固醇和甘油三酯。使用Superose 6柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)在HPLC系统型号600(Waters，Milford，MA)上进行快速高效液相色谱(FPLC)。

从小鼠血浆中分离高密度脂蛋白及测定高密度脂蛋白降低巨噬细胞胆固醇的能力

按照制造商的方案，使用HDL纯化试剂盒(Cell BioLabs，Inc.)从小鼠血浆中分离HDL。简言之，含有脂蛋白和高密度脂蛋白的apoB依次用硫酸葡聚糖沉淀。然后将HDL重新悬浮并洗涤。除去硫酸葡聚糖后，将HDL用PBS透析。为了测量HDL降低巨噬细胞胆固醇的能力，通过在含有100μg蛋白/ml的乙酰化LDL的DMEM中温育48小时，对Apoe^-/-巨噬细胞进行胆固醇富集。然后洗涤细胞，并在DMEM单独温育24小时或与25μg HDL蛋白/ml温育24小时。使用如所述⁶¹的酶促胆固醇测定法，在与HDL温育之前和之后测量细胞胆固醇。

人血MDA-LDL、MDA-HDL和MDA-ApoAI的采集和测定

该研究获得了Vanderbilt University Institutional Review Board(IRB)的批准，并且所有参与者都给出了书面知情同意书。使用IRB批准的方案从正在接受LDL分离的重度FH患者和健康对照中获得人血样本。通过脂蛋白纯化试剂盒(Cell BioLabs，Inc.)从血清中制备HDL和LDL。按照制造商的说明(Cell BioLabs，Inc.)，使用夹心ELISA测量血浆MDA-LDL和MDA-HDL水平。简言之，将分离的LDL或HDL样品和MDA-脂蛋白标准品加入到抗MDA包被的板上，并且封闭后，将样品与生物素化的抗apoB或抗ApoAI第一抗体温育。然后将样品与链霉亲和素-酶缀合物温育1小时并且用底物溶液温育15分钟。在停止反应后，在450nm波长下测量O.D.。通过ApoAI的免疫沉淀和蛋白质印迹在小鼠血浆中检测MDA-ApoAI。简言之，用450μL的IP裂解缓冲液(Pierce)加0.5％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)制备50μl的小鼠血浆，并用10μg的抗小鼠ApoAI的多克隆抗体(Novus)进行免疫沉淀。然后加入25μL磁珠(Invitrogen)，将混合物在4℃旋转温育1小时。然后收集磁珠，洗涤三次，将含有β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液加入磁珠中。在70℃温育5分钟后，向磁分离架(New England)施加磁场，并将上清液用于检测小鼠ApoAI或MDA。对于蛋白质印迹，通过NuPAGE Bis-Tris电泳(Invitrogen)分辨30-60μg的蛋白质，并转移到硝化纤维素膜上(AmershamBioscience)。用对ApoAI(Novus NB600-609)或MDA-BSA(Abcam cat#ab6463)特异性的第一兔抗体和荧光标记的IRDye 680(LI-COR)第二抗体来探测膜。通过Odyssey 3.0定量软件(LI-COR)对蛋白质进行可视化和定量。

丙二醛修饰高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的研究

如所述³¹，在使用前立即通过丙二羰基双(二甲基缩醛)的快速酸水解制备MDA。简言之，将20μl的1M HCl加入到200μL丙二羰基双(二甲基缩醛)中，并将混合物在室温下温育45分钟。使用系数因子13,700M-1cm-1，通过245nm处的吸光度测定MDA浓度。将HDL(10mg蛋白/mL)和递增剂量的MDA(0、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM)在37℃下在含有DTPA 100μM的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中温育24小时。通过加入MDA引发反应，并通过在4℃下针对PBS透析样品来停止反应。在含有DTPA 100μM的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中，在37℃下，用MDA(10mM)或2-HOBA在体外修饰LDL(5mg/mL)24小时。通过加入MDA引发反应，并通过在4℃下针对PBS透析样品来停止反应。将LDL样品与巨噬细胞温育24小时，并使用如所述⁶¹的酶促胆固醇测定法测量细胞的胆固醇含量。

动脉粥样硬化分析和横切面免疫荧光染色

通过近侧主动脉的油红O染色横截面和正面分析³⁰进行检查动脉粥样硬化的程度。简言之，根据Paigen等人⁶²的方法，从主动脉窦末端开始，从近侧主动脉区域切下10微米厚的冷冻切片，向远侧切下300μm。使用从根部到升主动脉区域的15个连续切片的油红O染色来量化每只小鼠的油红O阳性染色面积。使用KS300成像系统(Kontron Elektronik GmbH)将15个连续切片的平均值应用于每只小鼠的主动脉根部动脉粥样硬化病变大小，如所述^63,64,65。所有其他染色均使用主动脉窦远端40至60μm的切片进行。对于每只小鼠，对4个切片进行染色，并对所有4个切片的整个横截面进行定量。对于免疫荧光染色，将近侧主动脉的5μm横截面固定在冷丙酮(Sigma)中，在背景去除剂(Background Buster)(Innovex)中封闭，与所示的第一抗体(MDA和CD68)在4℃下温育过夜。在37℃与荧光标记的第二抗体温育1小时后，用Hoechst对细胞核进行复染。用荧光显微镜(Olympus IX81)和SlideBook 6(智能图像)软件捕获图像，并使用ImageJ软件(NIH)进行定量⁶⁶。

体外细胞凋亡及病变凋亡和胞葬作用的分析。

如所述诱导细胞凋亡并通过荧光标记的膜联蛋白V染色进行检测，并通过流式细胞仪(BD 5LSRII)或在荧光显微镜下捕获的图像中的膜联蛋白V阳性细胞进行计数来定量。通过动脉粥样硬化近侧主动脉横切片的TUNEL染色来测量动脉粥样硬化病变中的凋亡细胞，如前所述³⁰。与活巨噬细胞不相关的TUNEL阳性细胞被认为是游离的凋亡细胞，并且巨噬细胞相关的凋亡细胞被认为是被吞噬的，作为病变胞葬作用的量度，如前所述³⁰。

Masson三色染色法

按照制造商的说明(Sigma)并如前所述³⁰进行Masson三色染色，用于测量动脉粥样硬化病变胶原含量、纤维帽厚度和坏死中心尺寸。简言之，用Bouin溶液固定近侧动脉粥样硬化主动脉根部的5m横切片，细胞核用苏木精染色(黑色)，细胞质用biebrich猩红色和磷钨/磷钼酸染色(红色)，并且胶原用苯胺蓝染色(蓝色)。如前所述³⁰，通过ImageJ软件捕获图像并分析胶原含量、动脉粥样硬化帽厚度和坏死中心。坏死面积标准化为总病变面积，并表示为％坏死面积。

RNA分离与实时RT-PCR

根据制造商的方案，使用Aurum总RNA试剂盒(Bio-Rad)提取并纯化总RNA。用iScript逆转录酶(Bio-Rad)合成互补DNA。如前所述，在IQ5热循环仪(Bio-Rad)上使用特异性引物、SYBR探针(Bio-Rad)和iTaqDNA聚合酶(Bio-Rad)进行目标mRNA的相对定量，并用18S标准化。所用的18S、IL-1β和TNF-α引物如之前所述⁶⁷。

尿前列腺素代谢物的液相色谱-质谱分析

在Vanderbilt University Medical Center的Eicosanoid Core Laboratory测量了尿液中PGE-M、tetranor PGD-M、11-脱氢-TxB2(TxB-M)和PGI-M的浓度。尿液(1mL)用HCl酸化至pH 3。加入[²H₄]-2,3-dinor-6-酮-PGF1a(PGI-M定量的内标)和[²H₄]-11-脱氢-TxB2，并用甲基肟HCl处理样品以将分析物转化为O-甲基肟衍生物。使用C-18Sep-Pak(Waters Corp.Milford，MA USA)提取衍生的分析物，并用乙酸乙酯洗脱，如前所述⁶⁸。然后加入[²H₆]-O-甲基肟PGE-M氘化内标用于PGE-M和PGD-M的定量。在37℃的干燥氮气流下干燥样品，然后在75μL流动相A中复溶，用于LC/MS分析。

使用Waters Acquity UPLC在2.0x 50mm、1.7μm的particle Acquity BEH C18柱(Waters Corporation，Milford，MA，USA)上进行LC。流动相A为95:4.9:0.1(v/v/v)5mM乙酸铵：乙腈：乙酸，流动相B为10.0:89.9:0.1(v/v/v)5mM乙酸铵：乙腈：乙酸。在输送至SCIEX6500+QTrap质谱仪之前，以375μL/min的流速，在14min内用85-5％的流动相A梯度分离样本。

使用Enzo Life Sciences的检测试剂盒测量尿肌酐水平。每个样品中的尿代谢物水平使用样品的尿肌酐水平进行标准化，并以ng/mg肌酐表示。

血浆和组织中2-HOBA和4-HOBA的测定

2-HOBA和4-HOBA的测量在用异硫氰酸苯酯(PITC)衍生后通过LC/MS进行，并使用[²H₄]-2-HOBA作为内标，如之前对2-HOBA⁷¹所述(见图23)。对于这些分析，在正离子多反应监测(MRM)模式下运行的Waters Xevo-TQ-Smicro三重四极质谱仪监测了以下跃迁：对于PITC-2-HOBA或PITC-4-HOBA，m/z 259→107@20eV(定量离子对)和m/z 259→153@20eV(定量离子对)；对于PITC-[²H₄]2-HOBA m/z 263→107@20eV(定量离子对)，m/z 263→111@20eV(定量离子对)。根据峰面积与PITC-[²H₄]2-HOBA的比值计算PITC-2-HOBA的丰度。由于PITC-4-HOBA的跃迁反应不如PITC-2-HOBA有效，当使用m/z 107和m/z 153母子离子对时，PITC-4-HOBA/PITC-[²H₄]2-HOBA的峰面积比分别乘以校正系数3.9和5.7(参见图24)。

主动脉IsoLG-Lys的测定

如前所述⁶⁹，使用Waters Xevo-TQ-Smicro三重四极质谱仪从2-HOBA和4-HOBA处理的Ldlr^-/-小鼠的主动脉中分离和LC/MS测量isolevuglandin-赖氨酰-内酰胺(IsoLG-Lys)加合物。

2-HOBA的IsoLG加合物的检测

为了产生用于定量的内标，10摩尔当量的重同位素标记的2-HOBA，[²H₄]2-HOBA，与合成的IsoLG⁶⁹在1mM乙酸三乙铵缓冲液中反应过夜，形成IsoLG-2-HOBA加合物，并通过固相萃取(Oasis HLB)将加合物与未反应的[²H₄]2-HOBA和IsoLG分离。用质谱仪(Waters Xevo-TQ-Smicro三重四极杆MS)在有限质量扫描模式下扫描分离的IsoLG-2-HOBA反应产物，以鉴定主要产物。此外，使用设定在m/z 111.1的产物离子的前体扫描来确认检测的产物是[²H₄]2-HOBA加合物。两种方法都表明，纯化的IsoLG-[²H₄]2-HOBA内标混合物中存在的主要加合物是IsoLG-[²H₄]2-HOBA羟基内酰胺加合物，尽管也存在其他加合物，包括吡咯、内酰胺和这些加合物中每一个的脱水物质。当IsoLG与未标记的2-HOBA反应并使用产物离子m/z 107.1进行前体扫描以鉴定治疗动物组织中潜在的2-HOBA加合物时，观察到类似的物质，本发明人首先得到了18种可能的IsoLG-HOBA物质的列表[基于IsoLG和2-HOBA的体外反应的吡咯、内酰胺、羟基内酰胺，然后基于先前与前列腺素和异前列腺素的代谢研究的这三种加合物中的每一种的脱水-、dinor-、dinor/脱水-、tetranor-和酮-(来自羟基氧化)代谢物]。然后，本发明人使用LC/MS分析来自2-HOBA处理的小鼠的肝匀浆，质谱仪在正离子前体扫描模式下操作，产物离子设置为m/z 107.1，碰撞能量为20eV，并寻找这些前体离子中任何一种的存在。基于这些数据，本发明人鉴定了三种潜在的代谢物：M1前体离子m/z 438.3，其质量与酮-吡咯加合物或脱水-内酰胺加合物一致(两者具有相同的质量)。M2 m/z 440.3，其质量与吡咯加合物一致，以及M3 m/z 454.3，其质量与脱水-羟基内酰胺加合物或酮-内酰胺加合物一致。当试图定量心脏和肝脏样品中推定的IsoLG-HOBA加合物的量时，因为没有足够的来自其他分析的主动脉样品可用于进行该分析。

对于这些实验，来自用2-HOBA或4-HOBA处理的Ldlr^-/-小鼠的肝脏或心脏样品在含有抗氧化剂(吡哆胺、吲哚美辛、BHT、TCEP)混合物的pH 7.5的0.5M Tris缓冲溶液中匀浆。测定匀浆中的蛋白质总量以进行标准化。然后将1pmol Isolg-[²H₄]2-HOBA加入到每个匀浆样品中作为内标，HOBA加合物用乙酸乙酯萃取，干燥，溶解在溶剂1(含0.1％乙酸的水)中，并使用Waters Xevo-TQ-Smicro三重四极质谱仪在正离子多反应监测(MRM)模式下操作，通过LC/MS进行分析，监测以下母子离子对：对于M1：m/z 438.3→107.1@20eV；对于M2：m/z440→107.1@20eV；对于M3：m/z454→107.1@20eV；以及对于IsoLG-[²H₄]2-HOBA羟基内酰胺，m/z476.3→111.1@20eV。去溶剂温度：500℃；源温度：150℃；毛细管电压：5kV，锥形电压：5V；锥形气流1L/h；去溶剂气流1000L/h。HPLC条件如下：溶剂1：含0.1％乙酸的水；溶剂2，含0.1％乙酸的甲醇；色谱柱：Phenomenex Kinetex C8 50x 2.1mm2.6u 100A，流速：0.4mL/min；梯度：开始条件10％ B，梯度渐升至100％ B超过3.5分钟，保持0.5分钟，并返回到开始条件超过0.5分钟。根据峰高与内标物的比值计算每种代谢物的丰度。

LC/ESI/MS/MS分析二赖氨酰-MDA交联物

样品(约1mg蛋白质)用蛋白酶消化，如先前对赖氨酰-内酰胺加合物所述⁷⁰。向每个细胞样品中加入5纳克¹³C6-二赖氨酰-MDA交联物标准品，如前所述纯化二赖氨酰-MDA交联物⁷¹。如前所述，通过LC-ESI/MS/MS同位素稀释对二赖氨酰-MDA交联物进行定量⁷¹。

清除剂-MDA加合物的LC/MS/MS定量。

用500μL乙酸乙酯提取清除剂-MDA加合物(1)从组织匀浆(相当于30mg)或(2)从细胞(1ml)中提取3次。将提取物干燥，重悬于100μL ACN-水中(1:1，v/v，0.1％甲酸)，涡旋，并通过0.22μm spin X柱过滤。使用column a Phenomenex Kinetex柱以0.1ml/min的流速通过LC-ESI/MS/MS分析反应。梯度由溶剂A、含0.2％甲酸的水和溶剂B、含0.2％甲酸的乙腈组成。梯度如下：0-2分钟99.9％ A，2-9分钟99.9-0.1％ A，9-12分钟99.9％ B。质谱仪在正离子模式下操作，喷雾电压保持在5,000V。氮气用于鞘气和辅助气体，压力分别为30和5个任意单位。优化的skimmer偏移设置为10，毛细管温度为300℃，管透镜电压对每种化合物都是特定的。用于前体离子的SRM特定母子离子对在m/z 178→107(丙烯醛-HOBA加合物)。

统计

连续数据总结为通过箱线图和条形图可视化的平均值±SEM。组间差异采用学生t检验(2组)和单因素方差分析(>2组，Bonferroni多重比较校正)进行评估。当不满足参数方法的假设时，使用非参数对应的Mann-Whitney检验(2组)和非参数Kruskal-Wallis检验(2组以上，Bunn多重比较校正)。Shapiro-Wilk-Wil检验用于评估正态性假设。在多重比较校正后，所有测试都被认为具有统计学显著性，双侧显著性水平为0.05。所有统计分析均在GraphPad PRISM版本5或7中进行。

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应理解，在不偏离本文所公开主题的范围的情况下，可以改变当前公开主题的各种细节。此外，上述描述仅用于说明的目的，而非限制的目的。

Claims (11)

1.治疗有需要的个体中的家族性高胆固醇血症加速的(accelerated)动脉粥样硬化的方法，其包括施用有效量的选自下式的化合物：

其中：

R是C-R₂；

每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；

R₄是H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1的方法，其中所述个体被诊断为患有家族性高胆固醇血症。

3.根据权利要求1的方法，其中所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求1的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺、乙基-2-羟基苄胺或甲基-2-羟基苄胺。

5.根据权利要求1的方法，其中所述化合物是2-羟基苄胺。

6.根据权利要求1的方法，其中所述化合物选自下式：

或其药学上可接受的盐。

7.根据权利要求1的方法，其中所述化合物选自：

其中R₅是H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH(CH₃)-CH₃。

8.降低有需要的个体的动脉粥样硬化主动脉中MDA-赖氨酰和IsoLG-赖氨酰含量的方法，其包括施用二羰基化合物清除有效量的可选自下式的化合物：

其中：

R是C-R₂；

每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；

R₄是H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求8的方法，其中所述个体被诊断为患有家族性高胆固醇血症。

10.治疗有需要的个体中的动脉粥样硬化的方法，其包括施用二羰基化合物清除有效量的下式化合物：

其中：

R是C-R₂；

每个R₂是独立的且选自H、取代或未取代的烷基、卤素、烷基、取代或未取代的烷氧基、羟基、硝基；

R₄是H、2H、取代或未取代的烷基、羧基；以及其药学上可接受的盐；

以及联合施用具有治疗动脉粥样硬化的已知副作用的药物。

11.根据权利要求10的方法，其中所述个体被诊断为患有家族性高胆固醇血症。

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