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CN116120409B - 一种imp生物传感器及其构建方法与应用 - Google Patents

一种imp生物传感器及其构建方法与应用 Download PDF

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CN116120409B CN202211373674.7A CN202211373674A CN116120409B CN 116120409 B CN116120409 B CN 116120409B CN 202211373674 A CN202211373674 A CN 202211373674A CN 116120409 B CN116120409 B CN 116120409B
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Abstract

本发明提供了一种IMP生物传感器及其构建方法与应用。该生物传感器含有GlxR‑MUT1编码基因及其控制序列Ptrc启动子，以及报告基因及其控制序列Pcg3195启动子，其中GlxR‑MUT1转录调节因子能够特异性结合Pcg3195启动子区域，抑制报告蛋白的表达。该生物传感器对IMP表现出优良的响应关系，通过与高通量筛选体系等相结合，可以用于高效选育IMP高产菌株，具有操作简单、检测效率高等优势。

Description

一种IMP生物传感器及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种IMP生物传感器及其构建方法与应用。
背景技术
5’-肌苷酸(以下称为IMP)，是一种核酸物质，是核酸代谢途径的中间体，并且用于许多领域如食品、药品和各种医疗应用等。IMP及其盐类能够产生鲜味，是肉品中重要的风味物质之一，它还能够与谷氨酸钠协同作用，使鲜味成倍增加，是一种常用的调味剂。除此之外，肌苷酸也是国际公认的衡量肉类新鲜程度的重要指标。
IMP的生产方法有:化学合成法、RNA酶解法、微生物发酵法以及生物催化法。而微生物发酵法是现在工业化生产最为常用的方法，主要是利用微生物菌株的生物合成途径来生产IMP。所使用的菌种多为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。前者主要用于生产核苷和嘌呤核苷酸。而后者，是目前利用微生物工业化合成核苷酸及其高级衍生物的主要菌种。停滞棒状杆菌是一种革兰氏阳性、非致病性土壤细菌，高GC含量的DNA，具有较强的ATP再生活性，有足够的5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)供应。其中停滞棒状杆菌ATCC 6872用于核苷酸和核苷的生产的出发菌株，它的衍生菌株广泛用于生产工业上有用的核苷酸和核苷。
传统诱变方式是选育IMP高产菌株的主要方法，IMP并不赋予生产细胞易于检测的表型。传统上诱变生成多样性突变库，每种遗传变异体的生产率必须通过发酵和产品分析这种耗时、费力且昂贵的分析方法来分析，例如色谱法和质谱法，这导致筛选过程的低效率，严重影响了菌株开发的速度。
在自然界中，化学物质的浓度通常可以被不同的分子装置感知，例如变构酶、转录因子和核糖开关。使用这种设备开发的人工生物传感器可以对化学信号做出反应，并将它们转换成易于检测的信号，如荧光，可由荧光激活细胞分选仪(FACS)检测。基于生物传感器的高通量筛选平台可用于克服筛选瓶颈，从而能够在大量的途径/菌株变异文库中进行搜索，找到适合的生产菌株。构建高效的目标生物传感器，可以为实现菌株快速进化、代谢途径的动态调节及突变体高通量筛选提供新方法。因此，需要建立一种将IMP转换成易于检测的信号的人工生物传感器以提高选育效率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种IMP生物传感器，并使用该生物传感器建立IMP高产菌株及其高通量筛选方法。
本发明的另一目的在于，提供上述IMP生物传感器的构建方法。
本发明的再一目的在于，提供上述IMP生物传感器的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种GlxR转录因子突变体，能够响应IMP，是如下突变体中的至少一种：
GlxR-MUT1，相对于野生型GlxR存在D18H/R68H/N195S/P221T/L222S突变；
GlxR-MUT2，相对于野生型GlxR存在I53N/E69G/F87I/R163L/L172P/E192G/R208H突变；
GlxR-MUT3，相对于野生型GlxR存在F87I/R163L/R208H突变；
GlxR-MUT4，相对于野生型GlxR存在M29T/N70Y/S94S/E182E/I216F突变。
所述的GlxR转录因子突变体，其中：
GlxR-MUT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
GlxR-MUT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
GlxR-MUT3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
GlxR-MUT4的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述的GlxR转录因子突变体的编码基因，其核苷酸序列依据密码子编码规律得到；优选的，GlxR-MUT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、GlxR-MUT2的核苷酸序列如SEQID NO.9所示、GlxR-MUT3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、GlxR-MUT4的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
一种IMP生物传感器，是包括权利要求1或2所述的GlxR转录因子突变体中的至少一种的编码基因及控制GlxR转录因子突变体表达的启动子，以及报告蛋白的编码基因及控制报告蛋白表达的启动子的表达载体。
所述的控制GlxR转录因子突变体表达的启动子为Ptrc启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述的报告蛋白为荧光蛋白；优选为EGFP蛋白。
所述的控制报告蛋白表达的启动子为Pcg3195启动子或Pcg3195启动子突变体；其中Pcg3195启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述的Pcg3195启动子突变体为Pcg3195启动子野生型Poom的核苷酸序列上的GlxR结合位点经修改后得到；优选为包括Pmom，Pomm，Pmmm中的至少一种；更优选为Pmmm。
所述的Pcg3195启动子突变体，其中：
Pmom的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
Pomm核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
Pmmm核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
所述的IMP生物传感器，还包括质粒骨架；优选为pEC-T18-mob2质粒骨架。
所述的IMP生物传感器，其中Ptrc启动子和Pcg3195启动子方向相反。
一种重组菌株，含有上述IMP生物传感器。
上述IMP生物传感器在筛选IMP高产菌株中的应用。
上述的应用，具体步骤如下：
诱变获得突变体菌株，将IMP生物传感器转入突变体菌株，进行发酵培养后，使用流式细胞仪分选，选取报告蛋白信号获得下降的细胞，即为IMP高产菌株。
一种IMP生物传感器的构建方法，包括如下步骤：
将上述GlxR转录因子突变体中的至少一种的编码基因及控制其表达的启动子，以及报告蛋白的编码基因及控制其表达的启动子按顺序进行组装，得到IMP生物传感器；优选为将上述GlxR转录因子突变体的编码基因、Ptrc启动子、EGFP编码基因、Pcg3195启动子和pEC-T18-mob2质粒骨架按顺序进行组装，得到IMP生物传感器。
所述的组装为利用一步法高效无缝克隆技术进行组装。
所述的构建方法，其中控制GlxR转录因子突变体表达的启动子与控制标记蛋白表达的启动子方向相反。
含有上述GlxR转录因子突变体的载体，以及含有上述生物传感器的工程菌也属于本发明的保护范围。
本发明提供一种IMP生物传感器，其含有GlxR转录因子突变体的编码基因及其控制序列Ptrc启动子，以及报告蛋白的编码基因及其控制序列Pcg3195启动子，其中GlxR转录调节因子能够特异性结合Pcg3195启动子区域，进而诱导激活报告标记蛋白的表达。其中进一步地，GlxR-MUT1相对于野生型GlxR而言，存在D18H，R68H，N195S，P221T，R222P突变，其中野生型GlxR的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，由于Ptrc启动子控制GlxR编码基因表达，Pcg3195启动子控制GFP编码基因表达，优选地Ptrc启动子和Pcg3195启动子方向相反。
本发明是通过易错PCR等方法对转录调控因子GlxR进行分子改造，以期改变GlxR的响应分子从cAMP到IMP，最终筛选获得四个高效GlxR转录因子突变体(D18H/R68H/N195S/P221T/L222S、I53N/E69G/F87I/R163L/L172P/E192G/R208H、F87I/R163L/R208H、M29T/N70Y/S94S/E182E/I216F)。基于上述GlxR转录因子突变体构建的IMP生物传感器，与野生型相比具有响应分子已经改为IMP，在0～100mM IMP浓度下表现出优良的响应关系。
在本发明的一个具体实施方案中，其中携带的报告蛋白为荧光蛋白，更优选为绿色荧光蛋白EGFP。在一个具体实施方式，质粒骨架优选为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18-mob2。本发明还提供了含有所述生物传感器的重组菌株。
进而，本发明还提供所述生物传感器或含有所述生物传感器的重组菌株在筛选IMP高产菌株中的应用。在本发明的一个具体实施方案中，通过将purA或/和guaB基因的起始密码子ATG突变为TTG(GTG)降低相关酶的表达，通过突变组合获得六株Corynebacteriumstationis ATCC 6872重组菌株purATTGguaBTTG，purAGTG guaBGTG，purATTG，guaBTTG，purAGTG，guaBGTG。将6株菌株电击转入肌苷酸生物传感器再进行发酵培养后，等比例混合使用流式细胞仪分选，选取绿色荧光信号获得明显降低的细胞，53.33％为高产的purATTG guaBTTG。上述实践表明，基于改进型生物传感器与高通量筛选系统偶联，可以高效快速省力的筛选出IMP高产菌株。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明依据IMP及类似物cAMP的结构特性，选择能够响应cAMP的来源于棒状杆菌属(Corynebacterium)，具体来源于停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)中转录调控因子GlxR进行突变，通过突变改造其响应的效应分子为IMP，构建一种高效的IMP生物传感器，进而将IMP浓度与荧光强度信号相偶联，实现菌株IMP产量的监测。
本发明的有益之处在于提供了一种IMP生物传感器，利用转录调控因子GlxR及其控制的Ptrc启动子和报告基因作为基本生物元件，将IMP浓度与荧光信号偶联起来，使IMP浓度变得可视化。该生物传感器可以与高通量诱变和筛选体系相结合，有助于快速进化和高效筛选IMP高产工程菌株，为通过微生物发酵生产IMP及衍生物提供了技术保障。构建基于转录因子的IMP全细胞生物传感器，可为实现高通量筛选高产IMP菌株提供新的策略。
附图说明
图1为IMP生物传感器的结构示意图。
图2为pSen生物传感器的在添加cAMP或IMP后相对荧光信号响应曲线图。
图3为IMP生物传感器MUT1，MUT2，MUT3和MUT4的相对荧光信号响应曲线图。
图4为IMP生物传感器Poom，Pomm，Pmom，Pmmm的相对荧光信号响应曲线图。
图5为重组菌株相对荧光信号响应结果图。
图6为重组菌株等比例混合后流式细胞仪筛选结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中使用的菌株停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6872购自ATCC，大肠Top10感受态购自上海生工生物公司。
实施例1：生物传感器质粒的构建
本实施例通过PCR方法扩增获得IMP生物传感器中的各组分生物元件，并通过一步法高效无缝克隆(NEB Builder HiFi DNA Assembly Master Mix kit New EnglandBioLabs，Boston，MA)等分子组装技术将各片段按一定顺序连接，完成IMP生物传感器质粒的构建。
以停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC6872基因组为模板，使用引物F1和R1，采用普通PCR方法扩增获得生物传感器响应模块，GlxR编码基因(SEQ ID No.2)；以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032基因组为模板，使用引物F2和R2，PCR方法获得Pcg3195启动子控制序列(SEQ ID No.3)；以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18-mob2-EGFP为模板(pEC-T18-mob2购自Addgene，添加EGFP基因后得到pEC-T18-mob2-EGFP，已在文献Development of a Transcription Factor-Based DiamineBiosensor in Corynebacterium glutamicum中公开)，使用引物F3和R3，F4和R4，以及F5和R5，采用普通PCR方法扩增获得pEC-T18-mob2质粒骨架，Ptr启动子控制序列(SEQ ID No.4)和荧光报告EGFP编码基因(SEQ ID No.5)。利用一步法高效无缝克隆(NEB Builder HiFiDNA Assembly Master Mix kit New England BioLabs，Boston，MA)技术，将上述获得的核苷酸片段和质粒骨架按照顺序进行组装(图1)，其中Ptrc启动子控制GlxR编码基因表达，Pcg3195启动子控制EGFP编码基因表达，Ptrc启动子和Pcg3195启动子方向相反。筛选验证后，最终获得初步的生物传感器质粒pSen，并进行公司测序确认。质粒构建过程所使用的引物序列如下：
F1:5’-TCTCATCCGCCAAAACAGCCTTAACGGGCGCGCTTGGCGA-3’
R1:5’-CACACAGGAAACAGACCATGGAAGGCGTACAGGAAAT-3’
F2:5’-GGCAGTGAGCGCAACGCAATGGATCCATCCAGTTTTCC-3’
R2:5’-AGCTCCTCGCCCTTGCTCATAGCATCCTCCTTTAAAAAG-3’
F3:5’-ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCT-3’
R3:5’-CCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCC-3’
F4:5’-CATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3’
R4:5’-ATTTTGCCAAAGGGTTCGTTGACAATTAATCATCCGGCTCG-3’
F5:5’-ATGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’
R5:5’-TTCCCTACTCTCGCATGGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’。
为了保证扩增中的序列正确性，采用目前商用的高效超保真DNA聚合酶进行PCR反应。PCR 50μL扩增体系为：0.5μL KOD FX高保真聚合酶，10μL dNTP，1.5μL Primer-F(10μM)，1.5μL Primer-R(10μM)，DNA模板50ng，ddH2O补齐到50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸10min。注:退火温度根据引物进行适当调整；延伸时间根据扩增片段的长度按照1kb/min进行调整。
采用商用的基于重组酶的高效无缝克隆NEB Builder HiFi DNA AssemblyMaster Mix kit(New England BioLabs，Boston，MA)技术进行质粒组装，重组反应体系为：5μL 2xNEB Builder HiFi DNA Assembly Master Mix，100pmol载体骨架，300pmol目的基因插入片段，补足ddH2O至10μL体系。重组反应条件为：冰上配置重组反应体系，37℃反应20min，降至4℃或立即置于冰上冷却。然后将上述获得的重组质粒按照常规的大肠杆菌热激转化法，导入大肠杆菌Top10感受态细胞中(NEB试剂盒购买自中国NEB公司)。
实施例2
CRP/FNR转录因子家族的GlxR是一种全局调控转录因子，它调控上百个基因并且需要cAMP作为效应分子参与，而IMP是cAMP的类似物，我们通过易错PCR将GlxR的效应分子突变改为IMP。进一步将Pcg3195启动子进行工程化改造提高响应灵敏度。
先检测实施例1中pSen对cAMP和IMP的响应情况，将pSen质粒电转化进入停滞棒杆菌ATCC6872中，用BHISG液体培养基接种，接入25mL添加了cAMP或IMP的FMAC基本培养基，最终OD600为1，cAMP终浓度为0～10mM，IMP终浓度为0～100mM，控制温度为30℃，转速为250rpm振荡孵育44小时后，检测相对荧光值；实验结果显示，pSen只对cAMP有响应，传感器IMP没有产生响应反而促进了荧光蛋白的表达(图2)。
BHISG液体培养基的配方为：
每1000mL中，加入37g/L脑心浸液(Becton，Dickinson and Co.)，10g/L葡萄糖，9.1g/L L-山梨醇，余量为水。
FMAC基本培养基的配方为：
每1000mL中，加入20g/L葡萄糖，3g/L尿素，2g/L NH4Cl，1g/L KH2PO4，3g/L K2HPO4，5g/L L-天冬酰胺，0.04g/L L-半胱氨酸，0.001g/L MnSO4·4H2O，0.001g/L ZnSO4·7H2O，2×10-4g/L CuSO4·2H2O，0.02g/L泛酸钙，0.01g/L CaCl2，0.3g/L硫酸镁，0.01g/L FeSO4·7H2O，6×10-5g/L生物素，0.01g/L盐酸硫胺素，余量为水。
实施例3生物传感器的突变改造
以停滞棒杆菌ATCC6872基因组为模板，使用引物F6和R6，采用易错PCR随机突变方法扩增获得GlxR编码基因突变文库。使用易错PCR试剂盒Instant Error-prone PCR Kit(Ybio，Shanghai，China)，通过在PCR反应体系中调整镁离子和锰离子，进一步降低PCR扩增过程中的保真性，控制获得的编码基因中含有3～8个点突变。以实施例1中获得的生物传感器质粒pSen为模板，使用引物F7和R7，采用高效超保真KOD FX DNA聚合酶进行PCR反应获得质粒骨架。利用基于重组酶的高效无缝克隆NEB Builder HiFi DNA Assembly Master Mixkit(New England BioLabs，Boston，MA)技术进行质粒组装，将突变PCR获得的GlxR编码基因核苷酸片段和质粒骨架按照顺序进行组装，获得含有多样化GlxR编码基因点突变的重组质粒文库，参照实施例1的方法将获得的重组质粒文库转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中。
本发明采用的易错PCR体系为：3μL 10x易错PCR Mix，3μL 10x易错PCR专用dNTP，3μL易错PCR专用MnCl2，自备1μL DNA模板(10ng/μL)，1μL PCR引物(10μM each)，1μL DNA聚合酶(5U/μL)，补超纯水到30μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。
本实施例中所用引物为：
F6:5’-CTCATCCGCCAAAACAGCC-3’
R6:5’-ACACAGGAAACAGACCATG-3’
F7:5’-GGTCTGTTTCCTGTGTGAAA-3’
R7:5’-GGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATT-3’。
在10mg/L四环素抗性LB平板上获得重组质粒文库后，利用LB液体培养基(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，10g/L NaCl)将所有菌落冲洗下来中，37℃200rpm振荡孵育1小时后，离心收集菌体，使用质粒微型试剂盒(Meiji Biological Co.，Ltd.Guangzhou)进行质粒DNA分离和DNA提取得到质粒文库，再将所得质粒文库电击转化停滞棒杆菌ATCC6872。在平板上获得停滞棒杆菌ATCC6872重组质粒文库后，利用BHISG液体培养基将所有菌落冲洗下来中，温度为30℃，转速为250rpm振荡孵育2小时后。进行第一轮正向筛选，按照初始OD600＝1接入含有10mM IMP的FMAC基本培养基中温度为30℃，转速为250rpm振荡孵育44小时后。利用pH7.4 PBS缓冲液(8.005g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.42g/L Na2HPO4，0.2g/LKH2PO4)洗涤菌体后重悬至OD＝0.1。利用流式细胞仪根据荧光强度对菌体细胞进行分选，选取低荧光的0.4％的细胞。在平板上获得单菌落后，利用BHISG液体培养基冲洗下来，孵育后再进行第二轮流式细胞仪负向筛选，即在添加10mM cAMP的FAMC基本培养基中发酵，上到流式细胞仪根据荧光强度对菌体细胞进行分选，选取高荧光的0.4％细胞。在平板上获得单菌落后，利用BHISG液体培养基冲洗下来，孵育后再进行第三轮流式细胞仪正向筛选，即在添加10mM IMP的FAMC基本培养基中发酵，上到流式细胞仪根据荧光强度对菌体细胞进行分选，选取低荧光的0.4％细胞最后在平板上的到572个单菌落，参照实施例2的方法检测挑选对IMP响应最好的8个单菌落进行测序，测序显示一共获得四种GlxR转录因子突变体。
最终确定了四株对IMP有良好响应的GlxR转录因子突变体，分别是：
GlxR-MUT1(D18H/R68H/N195S/P221T/L222S)、
GlxR-MUT2(I53N/E69G/F87I/R163L/L172P/E192G/R208H)、
GlxR-MUT3(F87I/R163L/R208H)、
GlxR-MUT4(M29T/N70Y/S94S/E182E/I216F)。
其中，GlxR-MUT1氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，GlxR-MUT1核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，GlxR-MUT2氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，GlxR-MUT2核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，GlxR-MUT3氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，GlxR-MUT3核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，GlxR-MUT4氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，GlxR-MUT4核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
基于上述四种GlxR转录因子突变体，参照实施例1的方法构建获得的改进型IMP生物传感器分别命名为pSenIMP-MUT1，pSenIMP-MUT2，pSenIMP-MUT3和pSenIMP-MUT4，并电击转化停滞棒杆菌ATCC6872得到含有生物传感器的停滞棒杆菌ATCC6872。
参照实施例2中检测IMP响应的实验方法，测试上述筛选得到的含有生物传感器pSenIMP-MUT1，pSenIMP-MUT2，pSenIMP-MUT3和pSenIMP-MUT4的停滞棒杆菌ATCC6872对IMP的响应程度。根据实验结果，以外源IMP浓度为横坐标，以相对荧光强度为纵坐标，绘制含有不同生物传感器重组菌株具有的相对荧光强度与IMP浓度间相关性。结果如图3所示，证明本发明通过对GlxR转录调节因子进行分子改造，获得了对IMP响应的IMP生物传感器，其中pSenIMP-MUT1是效果最优的。
实施例4生物传感器的优化
为了进一步提高pSenIMP-MUT1的响应动态范围，本发明对Pcg3195启动子进行工程化改造，通过改变Pcg3195上GlxR结合位点的数量和位置，并通过修改启动子内的-10和-35位点来改变转录水平。考虑了三个潜在的GlxR结合位点，一个在-35位点的上游，一个在-35和-10位点之间，一个在-10位点的下游，以“m”表示存在，“o”表示不存在GlxR结合位点命名系统来描述启动子类别，分别构建了Pmom，Pomm，Pmmm，Pcg3195为野生型Poom。例如，Pomm是在-10位点下游以及-35和-10中间各有一个GlxR结合位点的启动子。其中，Pmom核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，Pomm核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，Pmmm核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。
基于实施例3得到的pSenIMP-MUT1，对其质粒上的Pcg3195启动子进行改造(具体方法参照文献Design and Selection of a Synthetic Feedback Loop for OptimizingBiofuel Tolerance[J].ACS Synth.Biol.2018,7,1,16–23)，得到3种改造后的生物传感器pSenIMP-MUT1-Pmom、pSenIMP-MUT1-Pomm和pSenIMP-MUT1-Pmmm。将四个启动子类型的生物传感器分别在BHISG液体培养基接种，过夜摇菌后再以初始OD600＝1接入25mL含有0～100mMIMP的FMAC基本培养基中，30℃，250rpm培养44h后检测相对荧光值，可知Pomm和Pmmm相比于野生型Poom动态范围都提高了，分别提高了34.30％和63.91％，实验结果证明，在启动子区域-10区和-35区中间多添加一个转录因子结合位点可以较好提高转录因子的调控效率。而Pmom响应范围相比于Poom响应极差范围提高了11.35％，说明在-35区左侧添加一个转录因子结合位点对基因的调控改善较小，实验结果如图4所示，其中pSenIMP-MUT1-Pmmm动态范围最大也是最优的。
实施例5：基于改进型生物传感器的IMP高产菌株筛选
基于改进后的生物传感器可以感应的IMP浓度变化并输出为荧光信号，通过偶联流式细胞仪(FACS)等高通量筛选设备，可以在荧光水平进行快速分选，将很大程度提升高产菌株选育的速度。
为了证实pSenIMP-MUT1-Pmmm的筛选效果，将停滞棒杆菌ATCC 6872中IMP降解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和IMP脱氢酶的活性进行削弱。通过将purA或/和guaB基因的起始密码子ATG突变为TTG(或GTG)降低相关酶的表达，通过突变组合获得六株停滞棒杆菌ATCC6872重组菌株purATTG guaBTTG，purAGTG guaBGTG，purATTG，guaBTTG，purAGTG，guaBGTG(突变菌株的制备方法参照文献Improved fermentative production of gamma-aminobutyric acidvia the putrescine route:Systems metabolic engineering for production fromglucose,amino sugars，and xylose[J].Biotechnology and Bioengineering，Vol.114，No.4，April，2017)。
通过发酵实验评价野生型ATCC 6872与purATTG guaBTTG，purAGTG guaBGTG，purATTG，guaBTTG，purAGTG，guaBGTG的IMP生产率。发酵培养后，提取上清使用HPLC检测IMP产量。
发酵培养基配方为：
每1000mL中，葡萄糖80g，NH4Cl 10g，MgSO4 3g，KH2PO4 5g，K2HPO4 5g，尿素3g，L-半胱氨酸0.1g，CaCl2.2H2O 0.1g，MnSO4 0.002g，FeSO4.7H2O 0.01g，盐酸硫胺素0.005g，d-生物素30μg。
以BHISG为种子液，接种后30℃，250rpm过夜摇菌。以终OD600为1，接入50mL的发酵培养基，30℃，250rpm，72h后提取上清使用HPLC检测IMP产量，产量如下表1。
表1野生型与重组菌株的IMP产量比较
菌株 IMP(g/L)
野生型 0
purATTGguaBTTG 0.38
purAGTGguaBGTG 0.09
purATTG 0.31
guaBTTG 0.11
purAGTG 0.05
guaBGTG 0.04
使用电击转化法将实施例3得到的pSenIMP-MUT1-Pmmm转入上述菌株purATTGguaBTTG，purAGTG guaBGTG，purATTG，guaBTTG，purAGTG，guaBGTG。参照实施例2的实验步骤检测IMP响应相对荧光值，实验结果如图5所示。实验结果证明，IMP产量越高菌株相对荧光越低，两者之间呈显著相关关系。
再将含有pSenIMP-MUT1-Pmmm的野生型和purATTG guaBTTG，purAGTG guaBGTG，purATTG，guaBTTG，purAGTG，guaBGTG七株菌等比例混合后在流式细胞仪中筛选低荧光的0.1％细胞(图6)，随机挑选三十个单菌落经过测序分析。结果证明，上述筛选方法得到的菌落中，有53.33％为高产IMP的purATTG guaBTTG，还有16.67％为次高产的purATTG，30％为其他菌株。
上述实施例表明，经改良后的生物传感器在高产IMP菌株的筛选上具有优良的应用性，利用转录调控因子GlxR及其控制的Ptrc启动子和报告基因作为基本生物元件，将IMP浓度与荧光信号偶联起来，使IMP浓度变得可视化。该生物传感器可以与高通量诱变和筛选体系相结合，有助于快速进化和高效筛选IMP高产工程菌株，为通过微生物发酵生产IMP及衍生物提供了技术保障。构建基于转录因子的IMP全细胞生物传感器，可为实现高通量筛选高产IMP菌株提供新的策略。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种GlxR转录因子突变体，能够响应IMP，其特征在于：
GlxR-MUT2，相对于野生型GlxR存在I53N/E69G/F87I/R163L/L172P/E192G/R208H突变，其中，野生型GlxR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种IMP生物传感器，其特征在于：
所述IMP生物传感器是包括权利要求1所述的GlxR转录因子突变体的编码基因及控制GlxR转录因子突变体表达的启动子，以及报告蛋白的编码基因及控制报告蛋白表达的启动子的表达载体；
所述的控制GlxR转录因子突变体表达的启动子为Ptrc启动子；
所述的报告蛋白为荧光蛋白；
所述的控制报告蛋白表达的启动子为Pcg3195启动子或Pcg3195启动子突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14～16所示；
其中Ptrc启动子和Pcg3195启动子方向相反。
3.根据权利要求2所述的IMP生物传感器，其特征在于：
所述的Pcg3195启动子突变体为Pcg3195启动子野生型Poom的核苷酸序列上的GlxR结合位点经修改后得到。
4.一种重组菌株，其特征在于：
含有权利要求2～3任一所述的IMP生物传感器。
5.权利要求2～3任一所述的IMP生物传感器在筛选IMP高产菌株中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于具体步骤如下：
诱变获得突变体菌株，将权利要求2～3任一所述的IMP生物传感器转入突变体菌株，进行发酵培养后，使用流式细胞仪分选，选取报告蛋白信号获得下降的细胞，即为IMP高产菌株。
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