CN116103219B

CN116103219B - 一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂

Info

Publication number: CN116103219B
Application number: CN202211307694.4A
Authority: CN
Inventors: 孙绪丁; 杨红益; 赵延霞; 田小雪
Original assignee: Shandong Yihengyuan Health Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Yihengyuan Health Technology Co ltd
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN116103219A

Abstract

本发明涉及一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂,属于医疗卫生领域，该雪莲干细胞粉的制备方法，其制备步骤如下：选择天山雪莲未分化的根部末端作为外植体，先进行清洗、消毒预处理，之后在一定条件下对其进行初代培养和传代培养，之后在一定条件进行扩大培养，最后进行过滤、干燥等后处理步骤，可以制得具有较佳愈合作用的雪莲根部干细胞冻干粉。将其应用在抑菌剂中，可以使抑菌剂发挥较佳的愈合作用，且有助于获得抑菌和止痒效果更好的抑菌剂。

Description

一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂

技术领域

本发明涉及医疗卫生领域，尤其涉及一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂。

背景技术

天山雪莲是在唯一能够在海拔3000米以上生长的大型草本植物，雪线以上叫天山雪莲，雪线以下为普通石莲，成分、应用具有较大的差别。天山雪莲生命力极强，能在0度左右发芽生长，五到七年才可长成。《本草纲目拾遗》、《中华藏本草》、《藏药志》、《中华本草》、《实用藏药名库》、《晶珠本草》等多部传统医学名著均有记载，维吾尔医、藏医、中医均有广泛应用，主要用于补肾活血、温肾助阳、通络活血、清热解毒、消肿止痛的作用。

天山雪莲由于其独特而又广泛的药理作用，导致人为大量滥采滥挖，再加上其独特的生长环境，天山雪莲已经被列为三级濒危物种。

通过科学研究，现阶段雪莲已经可以离体培养，雪莲培养物多为雪莲离体植物器官例如幼叶进行分化、培养而来，虽然其在日化用品、保健食品、化妆品等方面得到了很好的应用，但是鉴于其良好的应用效果，其仍然有待于进一步研究应用。

本发明特别通过雪莲未分化的根部末端进行体外的离体培养，得到雪莲根干细胞粉末，其具有较佳的促愈作用，且其联合部分海洋产物和特色中药组分形成的抑菌剂在妇科方面有良好的应用前景。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种雪莲干细胞粉的制备方法及其制得的抑菌剂，其选择雪莲未分化根部基于本申请培养方法下，可以获得具有较好促愈效果的雪莲干细胞粉，其可以应用在抑菌剂中，使抑菌剂发挥良好的促愈效果、止痒效果和抑菌效果。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种雪莲干细胞粉的制备方法，制备步骤如下：

S1：选择天山雪莲未分化的根部末端作为外植体，进行清洗、消毒得预处理物；

S2：将预处理物切块后进行初代培养得初代培养物，初代培养条件为：采用MS基础培养基，并在其中添加0.05mg/l的a-萘乙酸、2mg/l的6-BA、3%重量百分比的蔗糖、0.5%重量百分比的琼脂、0.01mg/ml的吲哚乙酸，培养温度为26±1℃，培养pH值在5.8，培养时间为15-18天；

S3：从初代培养物中选取颗粒细小、形状一致、分散性好、生长旺盛、颜色鲜亮的B类黄白色愈伤组织，于无菌状态下先后用60、80目不锈钢筛网过滤，选择60-80目之间的愈伤组织以2g/30ml接种浓度接入MS基础培养基中，饥饿培养数天后转移到新的培养基上进行传代培养，传代培养条件为：采用MS基础培养基，并在其中添加5mg/l的a-萘乙酸、0.5mg/l的6-BA、3%重量百分比的蔗糖、0.45%重量百分比的琼脂；培养温度为24±1℃，光照周期为12 h/d，光照强度为80μmol·m^-2·s^-1，培养周期为16天；

S4：将传代培养物转移到新的传代培养基中，培养1-2天后过滤，去掉滤渣，重新加入到新的传代培养基中，并加入非生物诱导剂，进一步扩大培养，其中非生物诱导剂采用硝普钠、水杨酸中的至少一种；

S5：将扩大培养后的雪莲干细胞进行离心过滤，之后冻存并冷冻干燥，最后使用粉碎机进行粉碎、过筛，即得。

进一步的，S1的具体预处理过程为：（1）将外植体先用自来水浸泡10min，之后用自来水、纯水、超纯水各清洗三次，之后用滤纸吸干清洗好的外植体表面水分；（2）用75%酒精浸泡1min，无菌水清洗2次；（3）用2%的HgCl₂浸泡15min，无菌水清洗5次，之后将消毒后的材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用。

进一步的，非生物诱导剂采用质量比为1：1的硝普钠和水杨酸。

进一步的，传代培养方式采用半连续培养，其原有的培养基：新鲜培养基为1:3。

本申请还提供了一种抑菌剂，通过如下步骤制备：

A1：将刺柏、黄柏、连翘、山银花、苦参、蛇床子、海螵蛸分别以其自身10倍重量的水提取2次，每次提取1h，得到刺柏提取液、黄柏提取液、连翘提取液、山银花提取液、苦参提取液、蛇床子提取液、海螵蛸提取液；

A2：将上述提取液混合，过滤后浓缩得60℃时相对密度为1.10-1.15的清膏，放冷；

A3：加入乙醇使其含量为70%，低温静置48h，取上清液，回收乙醇至无醇味；

A4：加水至800ml，加入上述制备方法制得雪莲干细胞粉，加热搅拌至溶解，低温静置24h，取上清液过滤备用；

A5：将冰片、薄荷脑、醋酸氯已定加入到50ml丙二醇中，之后与5ml吐温-80混合，搅拌溶解后，与A4的备用溶液混合；

A6：按照规定计量加入海藻酸钠、鱼胶原蛋白、溶菌酶，并补水至1000ml，之后静置24h后取上清液，即得；

其中，按照重量份数计，雪莲干细胞粉采用0.8-1.2份，刺柏采用18-21份，黄柏采用14-16份，连翘采用14-16份，山银花采用8-12份，苦参采用15-16份，蛇床子采用9-12份，海螵蛸采用9-11份，冰片采用0.9-1.2份，薄荷脑采用0.8-1.2份，海藻酸钠采用0.8-1.2份，鱼胶原蛋白采用0.9-1.2份，醋酸氯已定采用1.8-2.1份，溶菌酶采用0.9-1.1份。

优选的，按照重量份数计，雪莲干细胞粉采用1份，刺柏采用20份，黄柏采用15份，连翘采用15份，山银花采用10份，苦参采用15份，蛇床子采用10份，海螵蛸采用10份，冰片采用1份，薄荷脑采用1份，海藻酸钠采用1份，鱼胶原蛋白采用1份，醋酸氯已定采用2份，溶菌酶采用1份。

本发明采用上述结构，所具有的优点是：选择雪莲未分化的根部作为外植体，并通过本申请制备方法来制备雪莲根部干细胞冻干粉，可以获得具有较佳促愈作用的雪莲根部干细胞冻干粉。

将制得雪莲根部干细胞冻干粉，应用在抑菌剂中，除了可以发挥较佳的促愈作用，还有助于发挥抑菌剂的抑菌和止痒的作用。

附图说明

图1为本发明空白组在0h和40h时的促愈实验结果；

图2为本发明实验样品在0h和40h时的促愈实验结果；

图3为本发明对比样品1在0h和40h时的促愈实验结果；

图4为本发明对比样品2在0h和40h时的促愈实验结果；

图5为本发明黄酮类化合物含量测定的标准曲线。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合附图，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

（一）样品

将本申请制备方法设为方法a，常规雪莲干细胞粉的制备方法设为方法b，进行如下样品的制备：

实验样品：通过方法a制得的雪莲根部干细胞冻干粉

对比样品1：通过方法a制得的雪莲幼芽干细胞冻干粉

对比样品2：雪莲粉

对比样品4：通过方法b制得的雪莲根部干细胞冻干粉

其中，方法a的制备步骤如下：S1：选择天山雪莲未分化的根部末端作为外植体，并进行如下处理：（1）将外植体先用自来水浸泡10min，之后用自来水、纯水、超纯水各清洗三次，之后用滤纸吸干清洗好的外植体表面水分；（2）用75%酒精浸泡1min，无菌水清洗2次；（3）用2%的HgCl₂浸泡15min，无菌水清洗5次，之后将消毒后的材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用；S2：将预处理物切块后进行初代培养得初代培养物，初代培养条件为：采用MS基础培养基，并在其中添加0.05mg/l的a-萘乙酸、2mg/l的6-BA、3%重量百分比的蔗糖、0.5%重量百分比的琼脂、0.01mg/ml的吲哚乙酸，培养温度为26±1℃，培养pH值在5.8，培养时间为15-18天；S3：从初代培养物中选取颗粒细小、形状一致、分散性好、生长旺盛、颜色鲜亮的B类黄白色愈伤组织，于无菌状态下先后用60、80目不锈钢筛网过滤，选择60-80目之间的愈伤组织以2g/30ml接种浓度接入MS基础培养基中中，饥饿培养数天后转移到新的培养基上进行传代培养，传代培养方式采用半连续培养，其原有培养基：新鲜培养基为1:3，传代培养条件为：采用MS基础培养基，并在其中添加5mg/l的a-萘乙酸、0.5mg/l的6-BA、3%重量百分比的蔗糖、0.45%重量百分比的琼脂；培养温度为24±1℃，光照周期为12 h/d，光照强度为80μmol·m^-2·s^-1，培养周期为16天；S4：将传代培养物转移到新的传代培养基中，培养1-2天后过滤，去掉滤渣，重新加入到新的传代培养基中，并加入非生物诱导剂，进一步扩大培养，其中非生物诱导剂采用质量比为1:1的硝普钠和水杨酸的混合液；S5：将扩大培养后的雪莲干细胞进行离心过滤，之后冻存并冷冻干燥，最后使用粉碎机进行粉碎、过筛，即得。

方法b的制备方法如下：（1）取样品,用自来水流水冲洗2h;用浓度70%酒精表面消毒10s,无菌水冲洗3次;用浓度0.1%升贡溶液分别消毒4、6、8、10min后，用无菌水冲洗3次，洗去植物表面的升贡残液，以构成不同的消毒处理;将消毒材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用。（2）无菌条件下,将消毒后雪莲幼根切成约0.5cm*0.5cm大小,接种在固体培养基上。接种时,背面与培养基接触,每瓶1块。培养温度为25℃,培养pH值6.0,培养时间为20天。（3）待培养至20天时，将形成层细胞转移至液态培养基的烧瓶中培养，并时刻在显微镜下观察细胞的聚集状态和程度。（4）将在烧瓶中培养的干细胞移入20L的生物反应器内放大培养，在 25℃不间断搅拌。在培养至第10d时,向生物反应器内注入蔗糖、甲基茉莉酮酸酯和无菌磁化水的混合液,以补充后期营养加速干细胞生长。（5）将培养液用1um过滤器过滤,去掉培养液,将截留的细胞系培养物取出,放入-80℃超低温速冻2h,取出解冻30min;再放入-80℃超低温速冻，依次3次;最后一次解冻后利用超声波破碎仪破碎细胞,过滤器过滤，收集滤液，旋转式真空蒸发器内浓缩，将浓缩液过滤除菌,然后进行冻于处理,冻干温度为-20℃，真空度为50Pa，冻干时间为48小时，即得。

（二）促愈实验

进行实验样品、对比样品1-3的促愈实验，实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

（1）先将样品加水溶解，之后吸取适量样品药物于10mlEP管中，使用微孔滤器在无菌操作台上过滤，之后将样品药物用含2%胎牛血清的1640培养液做10、40、160倍梯度稀释，编号后置4℃冰箱中备用。

（2）液氮冻存的3T3细胞加入离心管中，在37℃水浴于1min内迅速摇晃使其融化；取出冰箱中的冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；800r·min^-1， 5min离心后，弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；待长成单层后，用0.25%胰酶消化，以1：2传代，细胞长成单层时用于实验。此处10%的胎牛血清1640培养基是为了将离心的3T3细胞重悬，方便计数，并进行密度调整。

（3）将细胞密度为1×10⁵个/mL的3T3细胞悬液接种在96孔板(弃四周孔)，每孔100uL，四周加入等体积的无菌蒸馏水。37℃培养箱静置培养18 h后，弃去培养液用1000uL枪头在中央垂直划一均匀痕迹，PBS 缓冲液洗涤划落的细胞碎片，实验分四组即正常细胞组（只划痕不加药）、高浓度药物组、中浓度药物组、低浓度药物组，正常对照含2 %胎牛血清的1640培养基进行培养，每组均加样100uL，每组设6个复孔。分别在划痕后0h、40h时于倒置显微镜下观察并拍照，其中显微镜观察倍数如下，目镜：10x，物镜：10x。

2、实验结果

对照组的上皮细胞在生理状态下，形成单层或复层上皮，在病理状态下，如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，通过图1可知，对照组细胞划痕40h后并未出现明显的侧向迁移作用。

通过图2可知，对于实验样品来说，160倍稀释后作用于成纤维细胞，培养40h后，该浓度下的细胞发生明显迁移，这表明加入其具有显著促进成纤维细胞迁移的作用；另外，10倍和40倍稀释条件下，细胞也发生了明显迁移效果（图略），这说明实验样品具有显著促进成纤维细胞迁移的作用。

通过图3可知，对于对比样品1来说，160倍稀释后作用于成纤维细胞，培养40h后，发现该浓度下细胞发生了一定程度的迁移，迁移程度比对照组强，比实验组弱；另外，10倍和40倍稀释条件下，细胞也发生了一定程度的迁移效果（图略）。

通过图4可知，对于对比样品2来说，160倍稀释后作用于成纤维细胞，培养40h后，发现该浓度下细胞迁移程度较低，变化不明显，但强于对照组，这表明对比样品2具有促进成纤维细胞迁移的作用，但促迁移的能力较弱；另外，10倍和40倍稀释条件下，细胞对比样品2促进成纤维细胞迁移的能力也较弱（图略）。

对于对比样品3来说，160倍稀释后作用于成纤维细胞，发现该浓度下细胞发生了一定程度的迁移（图略），但是迁移程度较实验样品和对比样品1低，较对比样品2强，这说明培养方法对细胞迁移有一定的影响。

综上可知，促愈实验进行40h后，各样品对伤口促愈效果的影响程度为：实验样品的促愈效果最好，对比样品1次之，对比样品3再之，对比样品2最弱。这说明以天山雪莲未分化根部作为外植体，通过本申请制备方法制得的雪莲干细胞（根部）冻干粉，具有较好的愈合作用。

（三）有效成分含量的测定

由于黄酮类化合物、紫丁香苷、1,5-二咖啡酰奎尼酸是雪莲花中含有的具有消炎、消肿等作用的成分，而这些成分是有利于患部愈合的，因此对实验样品、对比样品1-3分别进行以上三种成分的含量测定。

1、测定方法

（1）黄酮类化合物的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取芦丁（属于黄酮类化合物）对照品适量，甲醇制定1mg/ml的对照品溶液。

标准曲线：分别量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、2.0、3.0ml于25ml容量瓶中，分别加入水至6ml，加10%硝酸铝1ml，摇匀，放置8分钟，加氢氧化钠试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白照紫外可见光分光光度法于500nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，具体见图5。

精密称取各样品0.25g，置锥形瓶中，加甲醇25ml，超声30分钟，用甲醇补足减失的重量，取续滤液5ml至25ml比色管中，自“加水至6ml”同法操作，测定吸光度，并在标准曲线读取芦丁的量，计算，即得。

通过上述测定方法测得的实验样品、对比样品1-3的芦丁含量见表1。

（2）紫丁香苷含量的测定

色谱条件：安捷伦1200液相系统，Agilent ODS C18色谱柱( 4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.02M磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱(0～20min，8%～10% A；20～50 min，10%～30% A)；柱温30℃；流速为1.0mL/min；检测波长265nm；进样量为20μL。

对照品溶液的制备：取紫丁香苷标准品适量，加10%乙腈溶液，配制含量分别为0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.025mg/mL的混合标准品溶液。

标准曲线：取标准品溶液，在进样量分别为4μL、10μL、16μL、20μL、40μL、60μL条件下测定峰面积，折算进样量20μL进行测定。以质量浓度(μg /mL)为纵坐标，峰面积(AU×S)为横坐标，绘制各成分标准曲线（省略视图）。

供试品溶液的制备:取样品0.1g，加10%乙腈水溶液100mL，超声提取30min，取上清液过滤膜，待测。精密量取供试品溶液、混合对照品溶液各 20μL，注入液相色谱仪，按预设的色谱条件进样检测。

通过上述测定方法测得的实验样品、对比样品1-3的紫丁香苷含量见表1。

（3）1,5-二咖啡酰奎尼酸含量的测定

色谱条件：安捷伦1200液相系统，Agilent ODS C18色谱柱( 4.6mm×250mm，5μm);以乙腈流动相为A，以0.02M磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱(0～20min，8%～10% A；20～50 min，10%～30% A)；柱温 30℃；流速为1.0mL/min；检测波长265nm；进样量为20μL。

对照品溶液的制备：取1,5-二咖啡酰奎尼酸标准品适量，加 10%乙腈溶液，配制含量分别为0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.025mg/mL的混合标准品溶液。

标准曲线：取标准品溶液，在进样量分别为4μL、10μL、16μL、20μL、40μL、60μL条件下测定峰面积，折算进样量20μL进行测定。以质量浓度(μg /mL) 为纵坐标，峰面积(AU×S)为横坐标，绘制各成分标准曲线（省略视图）。

供试品溶液的制备：取本品0.1g，加10%乙腈水溶液100mL，超声提取30min，取上清液过滤膜，待测。精密量取供试品溶液、混合对照品溶液各 20μL，注入液相色谱仪，按预设的色谱条件进样检测。

2、测定结果

通过上述测定方法测得的实验样品、对比样品1-3的黄酮类化合物的含量、紫丁香苷的含量、1,5-二咖啡酰奎尼酸的含量见表1。

表1 实验样品、对比样品1-3中三种成分的含量

通过表1可知，实验样品中黄酮类化合物（芦丁）、紫丁香苷、1,5-二咖啡酰奎尼酸三种成分的含量明显高于对比样品1和对比样品3，远远高于对比样品2。这表明以天山雪莲未分化的根部为外植体，通过本申请制备方法来制备雪莲干细胞冻干粉，利于获得以上三种高含量成分的天山雪莲根部干细胞冻干粉。结合愈合实验结果，可以推测上述三种成分的提高可能是影响愈合实验结果的因素。

（四）抑菌剂的相关实验

1、抑菌剂制备方法如下：

A1：将刺柏、黄柏、连翘、山银花、苦参、蛇床子、海螵蛸分别以其自身10倍重量的水提取2次，每次提取1h，得到刺柏提取液、黄柏提取液、连翘提取液、山银花提取液、苦参提取液、蛇床子提取液、海螵蛸提取液；A2：将上述提取液混合，过滤后浓缩得相对密度为1.10-1.15（60℃）的清膏，放冷；A3：加入乙醇使其含量为70%，低温静置48h，取上清液，回收乙醇至无醇味；A4：加水至800ml，加入雪莲根部干细胞冻干粉，加热搅拌至溶液，低温静置24h，取上清液过滤备用；A5：将冰片、薄荷脑、醋酸氯已定加入到50ml丙二醇中，之后与5ml吐温-80混合，搅拌溶解后，与A4的备用溶液混合；A6：按照规定计量加入海藻酸钠、鱼胶原蛋白、溶菌酶，并补水至1000ml，之后静置24h后取上清液，即得；其中，按照重量份数计，雪莲干细胞粉采用1份，刺柏采用20份，黄柏采用15份，连翘采用15份，山银花采用10份，苦参采用15份，蛇床子采用10份，海螵蛸采用10份，冰片采用1份，薄荷脑采用1份，海藻酸钠采用1份，鱼胶原蛋白采用1份，醋酸氯已定采用2份，溶菌酶采用1份。

将通过上述制备方法制得的抑菌剂1(含雪莲根部干细胞粉)、抑菌剂2(不含雪莲根部干细胞粉) 分别进行抑菌实验、止痒实验和愈合实验。

2、抑菌实验

选择白色念珠菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌3种易引起阴道炎的真菌及细菌进行抑菌试验，分别考察抑菌剂1和抑菌剂2供试品在体外对3种菌的抑菌效果，以及在加速试验条件下放置3个月的供试品抑菌效果。

（1）抑菌率实验

实验过程：将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌种接种于斜面营养培养基上，30 ℃培养24 h；白色念珠菌菌种接种于斜面沙氏培养基上，30 ℃培养 48 h。分别用无菌 PBS将菌苔冲洗下来，调整浓度为 3x10⁸CFU/ml，备用。取10 uL菌种悬浮液，稀释至10 mL，得到浓度约为 3.8x10⁵CFU/ml 的菌液。

分别取上述菌液0.1 mL，加至含5 mL抑菌剂1和抑菌剂2及无菌生理盐水对照液的试管内，充分反应2 min。取反应后的各溶液0.5mL 至含 5 mL PBS 的试管内，充分混匀。取混匀后的溶液，分别稀释至1、5 、10倍。取不同稀释倍数的各溶液0.5 mL 至培养皿中，分别倾入40 ℃左右的营养琼脂培养基或沙氏培养基20 mL，转动培养皿使之混合均匀，培养基凝固后翻转平皿，30 ℃培养24、48 h，作活菌菌落计数，计算抑菌率，结果见表2。

（2）抑菌性能稳定性试验

取3批供试品，置于加速试验条件(37-40 ℃、相对结果见表2湿度＞75%恒温箱内)3 个月，进行抑菌性能测试。抑菌率测定方法同上，结果见表2。

表2 洗液1和洗液2的抑菌实验结果

通过表2结果可知，抑菌剂1供试品对3种菌均抑菌率＞95%，抑菌剂2供试品对3种菌均抑菌率在90%左右，由此可知抑菌剂2具有较强的抑菌能力；加速实验放置3个月后，抑菌剂1供试品对 3种菌均抑菌率＞85%，抑菌剂2供试品对3种菌均抑菌率在85%左右，这表明2个样品均仍具有抑菌作用，且稳定性较好。

3、止痒实验

小鼠前处理：选用试验用小鼠，体质量26-28 g，24只，随机分组，每组6只，雌雄各半，用脱毛膏将小鼠腹部，脱毛4 cmx3 cm,以清水擦净。试验用洗液组于脱毛处分别涂扶样品0.2 mL，面积约12 cm，用无菌纱布覆盖,胶布绕腰部固定，松紧适度，每日给样2次，共5d，期间正常喂食饮水。

方法及统计：于末次给药40min后除去样品，除了空白组外其余各组给每只小鼠尾静脉注射 0.025%低分子右旋糖酐0.05 mL·10g(1.25mg·kg)。尾静脉注射右旋糖酐后小鼠可发生阵发性皮肤瘙痒,表现为前爪挠头部,后爪挠躯干,嘴巴咬身体各部位及尾巴。对30 min 内各组小鼠阵发性瘙痒发作次数及累计持续时间进行数据统计学处理,评价药物的止痒作用，评价结果见表3。

表3 抑菌剂1和抑菌剂2的止痒实验结果

组别	小鼠瘙痒（发作次数/s）	小鼠瘙痒（发作时间/min）
			抑菌剂1	9±3	15±3
抑菌剂2	22±4	30±4
			空白组	0	0

由表3可知,对30 min 内各组小鼠阵发性瘙痒发作次数及累计持续时间进行数据统计学处理，评价洗液的止痒作用。其中，抑菌剂1组小鼠瘙痒次数最少及发作时间最短,说明抑菌剂1组具有一定的止痒作用，且止痒效果优于抑菌剂2组。

4、促愈实验

促愈实验过程同雪莲根部干细胞粉末的促愈实验，样品选择抑菌剂1和抑菌剂2，实验结果表明，对于抑菌剂1，采用10，40，160倍稀释后作用于成纤维细胞，观察高、中、低浓度下的细胞均发生明显迁移，表明抑菌剂1具有显著的促进成纤维细胞迁移的作用；对于抑菌剂2，采用10，40，160倍稀释后作用于成纤维细胞，观察高、中、低浓度下的细胞迁移程度不明显，远低于抑菌剂1，这表明抑菌剂中起愈合作用的成分主要是雪莲根部干细胞冻干粉。

综上可知，抑菌剂1在抑菌、促愈、止痒各方面的效果要优于抑菌剂2，这说明抑菌剂中加入本申请制得的雪莲根部干细胞冻干粉，不仅能够发挥较佳的愈合作用，且在抑菌和止痒方面也有帮助，该抑菌剂联合部分海洋产物和特色中药组分形成，在妇科抑菌方面具有良好的应用前景。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本领域技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员公知技术。

Claims

1.一种雪莲干细胞粉的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

S3：从初代培养物中选取颗粒细小、形状一致、分散性好、生长旺盛、颜色鲜亮的B类黄白色愈伤组织，于无菌状态下先后用60、80目不锈钢筛网过滤，选择60-80目之间的愈伤组织以2g/30ml接种浓度接入MS基础培养基中，饥饿培养数天后转移到新的培养基上进行传代培养，传代培养条件为：采用MS基础培养基，并在其中添加5mg/l的a-萘乙酸、0.5mg/l的6-BA、3%重量百分比的蔗糖、0.45%重量百分比的琼脂；培养温度为24±1℃，光照周期12 h/d，光照强度80μmol·m^-2·s^-1，培养周期为16天；

2.根据权利要求1所述的雪莲干细胞粉的制备方法，其特征在于，S1的具体预处理过程为：（1）将外植体先用自来水浸泡10min，之后用自来水、纯水、超纯水各清洗三次，之后用滤纸吸干清洗好的外植体表面水分；（2）用75%酒精浸泡1min，无菌水清洗2次；（3）用2%的HgCl₂浸泡15min，无菌水清洗5次，之后将消毒后的材料放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分备用。

3.根据权利要求1所述的雪莲干细胞粉的制备方法，其特征在于，步骤S4中，非生物诱导剂采用质量比为1：1的硝普钠和水杨酸。

4.根据权利要求1所述的雪莲干细胞粉的制备方法，其特征在于，步骤S3中，传代培养方式采用半连续培养，其原有的培养基：新鲜培养基为1:3。

5.一种抑菌剂，其特征在于，通过如下步骤制备：

A1：将刺柏、黄柏、连翘、山银花、苦参、蛇床子、海螵蛸分别以其自身10倍重量的水水煮提取2次，每次提取1h，得到刺柏提取液、黄柏提取液、连翘提取液、山银花提取液、苦参提取液、蛇床子提取液、海螵蛸提取液；

A4：加水至800ml，加入权利要求1-4任一项制备方法制备的雪莲干细胞粉，加热搅拌至溶液，低温静置24h，取上清液过滤备用；

6.根据权利要求5所述的抑菌剂，其特征在于，按照重量份数计，雪莲干细胞粉采用1份，刺柏采用20份，黄柏采用15份，连翘采用15份，山银花采用10份，苦参采用15份，蛇床子采用10份，海螵蛸采用10份，冰片采用1份，薄荷脑采用1份，海藻酸钠采用1份，鱼胶原蛋白采用1份，醋酸氯已定采用2份，溶菌酶采用1份。