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CN116096890A - 使用工程化寡核苷酸的靶向抑制 - Google Patents

使用工程化寡核苷酸的靶向抑制 Download PDF

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CN116096890A
CN116096890A CN202180040335.4A CN202180040335A CN116096890A CN 116096890 A CN116096890 A CN 116096890A CN 202180040335 A CN202180040335 A CN 202180040335A CN 116096890 A CN116096890 A CN 116096890A
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rna
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罗伯特·普莱斯
安东尼·萨利赫
蒂尚·威廉姆斯
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Original Assignee
Mirecule Inc
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Abstract

本文公开了用于选择性抑制多肽表达和活性的工程化寡核苷酸。本文还公开了将工程化寡核苷酸与编码多肽的多核苷酸接触，选择性地抑制多肽表达和活性的方法。

Description

使用工程化寡核苷酸的靶向抑制
政府支持声明
本发明是在美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)授予的批准号U43CA221567的政府支持和美国国家过敏和感染疾病研究所(National Institute ofAllergy and Infection Disease)授予的SBIR合同号HHSN272201800034C的支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请针对两个申请共有的所有主题，要求于2020年4月2日提交的美国临时申请第63/004,045号的优先权和权益。所述临时申请的公开内容特此通过引用以其整体并入。
概述
本文公开了可包含多核苷酸序列的工程化寡核苷酸或其盐。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可以与源自与疾病或状况相关的两个遗传基因座的至少第一RNA和第二RNA的至少一部分至少部分地互补。在一些实施方案中，当工程化寡核苷酸或其盐与第一RNA至少部分地结合时：工程化寡核苷酸中的至少七个连续碱基的第一区域可以与包含在第一RNA内的连续核酸互补，并且工程化寡核苷酸中的至少五个连续碱基的第二区域可以与包含在第一RNA内的连续核酸互补。在一些实施方案中，当工程化寡核苷酸或其盐与第二RNA至少部分地结合时：工程化寡核苷酸中的至少七个连续碱基的第一区域可以与包含在第二RNA内的连续核苷酸互补，并且工程化寡核苷酸中的至少五个连续碱基的第二区域可以与包含在第二RNA内的连续核苷酸互补。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸与第一RNA和第二RNA结合的预测吉布斯自由能(ΔG)在约37摄氏度和约7.2至约7.6范围的pH范围，可单独地在约-17kcal mol-1至约-36kcal mol-1的范围。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可以是反义寡核苷酸、合成微RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中，相对于一种或更多种其他方面可比的非编码RNA(ncRNA)，工程化寡核苷酸或其盐可以包含一个或更多个核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸取代或其任何组合。在一些实施方案中，相对于其他方面可比的ncRNA与第一RNA或第二RNA在约37摄氏度和约7.2至约7.6的pH范围结合的结合ΔG，工程化寡核苷酸或其盐当与第一RNA或第二RNA至少部分地结合时在约37摄氏度和约7.2至约7.6范围的pH范围可以具有低至少约10％的结合吉布斯自由能(ΔG)。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约50个核苷酸。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可以包含核糖。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可以包含脱氧核糖。在一些实施方案中，ncRNA可以是miR-30微RNA(miRNA)、miR-29miRNA、miR-26miRNA、miR-27miRNA、miR-101miRNA、miR-145miRNA、miR-205miRNA、miR-338miRNA或miR-375miRNA。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐与SEQ ID NO:1、SEQID 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IDNO:949中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸在温度范围为约15摄氏度至约37摄氏度、pH范围为约6.5至约7.6的水性溶液中可以形成包含茎环的二级结构。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可包含相对于天然存在的碱基、糖、主链或磷酸酯连接而言化学修饰的碱基、化学修饰的糖、化学修饰的主链或磷酸酯连接，或其任何组合。在一些实施方案中，化学修饰可选自由以下组成的组：甲基基团、氟基团(fluoro group)、甲氧基乙基基团、乙基基团、羟甲基基团、甲酰基基团、桥接核酸、锁核酸(locked nucleic acid)、羧酸或其盐、硫代磷酸酯修饰的主链、甲基膦酸酯修饰的主链、氨基-烷基链修饰及其任何组合。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐，当化学修饰时，可包括下式：(N)a(mN)b(N)cNN；(N)a(mN)b(N)csfNsmN；或(fNmN)h(mN)i(fNmN)jsfNsmN；其中每个N可以独立地是尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或其它天然核苷酸；每个mN可以独立地是2'-O-甲基修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；每个s都可以独立地是硫代磷酸酯修饰的主链；每个fN可以独立地是2'氟修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；并且每个a可以是8-10，每个b可以是7-10，每个c可以是2-4，每个h可以是5-7，每个i可以是0或1，每个j可以是3-4。在一些实施方案中、工程化寡核苷酸或其盐可以与SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID 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NO:783、SEQID NO:784、SEQ ID NO:785、SEQ ID NO:786、SEQ ID NO:787、SEQ ID NO:788、SEQ ID NO:789、SEQ ID NO:790、SEQ ID NO:791、SEQ ID NO:792、SEQ ID NO:793、SEQ ID NO:794、SEQID NO:795、SEQ ID NO:796、SEQ ID NO:797、SEQ ID NO:798、SEQ ID NO:799、SEQ ID NO:800、SEQ ID NO:801、SEQ ID NO:802、SEQ ID NO:803、SEQ ID NO:804、SEQ ID NO:805、SEQID NO:806、SEQ ID NO:807、SEQ ID NO:808、SEQ ID NO:809、SEQ ID NO:810、SEQ ID NO:811、SEQ ID NO:812、SEQ ID NO:813、SEQ ID NO:814、SEQ ID NO:815、SEQ ID NO:816、SEQID NO:817、SEQ ID NO:818、SEQ ID NO:819、SEQ ID NO:820、SEQ ID NO:821、SEQ ID NO:822、SEQ ID NO:823、SEQ ID NO:824、SEQ ID NO:825、SEQ ID NO:835、SEQ ID NO:836、SEQID NO:837、SEQ ID NO:846、SEQ ID NO:847、SEQ ID NO:848、SEQ ID NO:849、SEQ ID NO:850、SEQ ID NO:851、SEQ ID NO:852、SEQ ID NO:853、SEQ ID NO:854、SEQ ID NO:855、SEQID NO:856、SEQ ID NO:857、SEQ ID NO:858、SEQ ID NO:859、SEQ ID NO:860、SEQ ID NO:861、SEQ ID NO:862、SEQ ID NO:863、SEQ ID NO:864、SEQ ID NO:865、SEQ ID NO:866、SEQID NO:867、SEQ ID NO:868、SEQ ID NO:869、SEQ ID NO:870、SEQ ID NO:871、SEQ ID NO:872、SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:874、SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:877、SEQID NO:878、SEQ ID NO:879、SEQ ID NO:880、SEQ ID NO:881、SEQ ID NO:882、SEQ ID NO:883、SEQ ID NO:884、SEQ ID NO:885、SEQ ID NO:886、SEQ ID NO:887、SEQ ID NO:888、SEQID NO:889、SEQ ID NO:890、SEQ ID NO:891、SEQ ID NO:892、SEQ ID NO:893、SEQ ID NO:894、SEQ ID NO:895、SEQ ID NO:896、SEQ ID NO:897、SEQ ID NO:898或SEQ ID NO:899中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸序列可以包含糖修饰、碱基修饰或主链修饰。在一些实施方案中，修饰可以包括接头。在一些实施方案中，接头可以是共价接头。在一些实施方案中，接头可以是可裂解接头。在一些实施方案中，接头可以进一步被修饰为包含缀合物。在一些实施方案中，缀合物可以是抗体、天然存在的配体、小分子或肽。在一些实施方案中，缀合物可以是药物或其盐。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸可以包含用聚糖糖基化的核苷酸碱基。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可至少部分地包含mRNA序列。在一些实施方案中，与将等量的ncRNA与mRNA序列接触相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可以产生由mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的表达；所述表达由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸或其盐转染到包含mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，(b)将ncRNA转染到包含mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，和(c)测量在第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞中表达的多肽的量，其中第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞是相同类型的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，与将等量的ncRNA与mRNA序列接触相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可以产生由mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的活性；所述活性由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸或其盐转染到包含mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，(b)将ncRNA转染到包含mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，和(c)测量来自第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞中表达的多肽的活性量，其中第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞是相同类型的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，与接触等量的ncRNA相比，工程化寡核苷酸或其盐与mRNA序列接触时可以产生由mRNA序列编码的多肽的低约1.2倍至约10倍的表达；所述表达由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸或其盐转染到包含mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，(b)将ncRNA转染到包含mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，和(c)测量在第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞中表达的多肽的量。在一些实施方案中，与接触等量的ncRNA相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可以产生由mRNA序列编码的多肽的低约1.2倍至约10倍的活性；所述活性由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸或其盐转染到包含mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，(b)将ncRNA转染到包含mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，和(c)测量来自第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞中表达的多肽的活性量。在一些实施方案中，第一分离的哺乳动物细胞和第二分离的哺乳动物细胞可以是人类细胞或小鼠细胞。在一些实施方案中，第一分离的哺乳动物细胞可以是人类细胞，其中人类细胞可以是癌细胞、成纤维细胞、白细胞、上皮细胞、鳞状细胞、成肌细胞、肌肉细胞。在一些实施方案中，当工程寡核苷酸或其盐被储存在封闭的容器中，在约23摄氏度和约50％的相对大气湿度储存至少约1个月的时间段时，可以保持工程化寡核苷酸或其盐的初始量的至少约80％。在一些实施方案中，时间段可以为约1个月到约1年。在一些实施方案中，疾病或状况可以包括癌症。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可以由癌基因编码。在一些实施方案中，癌基因可以包括ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、AKT3、ATF1、BCL11A、BCL2、BCL3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、BBIT3、BBX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ERBB3、E2F1、ZEB1、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGR2、FUS、GOLGA5、GOPC、HMGA1、HMGA2、HRAS、IRF4、ITGA6、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SETDB1、SERPINE1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、CDK6、ATG9A、TLX1、TPR、USP6、CSNK1G、KLF17、ARHGAP26、RAB11FIP1、RBJ、SERBP1、CTBP1、CRKL、ITGA3、ITGAV、LAMC1、G6PC2、PPP2R5E或其任何组合。在一些实施方案中，癌基因可包括ITGA6、BCL2、DEK、PLAG1、SERPINE1、MYCN、LMO2、PIM1、EGFR、IRS1、NT5E、GLDC、SOCS1、STAT1、LOX、PDGFRB、WNT5A、CD80、CCNA1、THBS2、IGF1R、AFAP1L2、CTHRC1、MET、FAP、IL1A、GJA1、MYBL2或其任何组合。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐对多于一种RNA序列中编码ITGA6、SERPINE1、EGFR、MDTH或其任何组合的RNA序列可以是选择性的。在一些实施方案中，疾病或状况可以包括纤维化。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由胶原超家族基因、血小板来源的生长因子基因、TGF-β信号传导基因、胶原重塑基因、细胞外基质重塑基因、Wnt信号传导基因、肝癌(hepatoma)来源的生长因子(HDGF)信号传导基因或其任何组合编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由胶原超家族基因编码，其中胶原超家族基因选自由以下组成的组：COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1及其任何组合。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分由血小板来源的生长因子基因编码，其中血小板来源的生长因子基因可选自由以下组成的组：PDGFB、PDGFC、PDGFRB及其任何组合。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由TGF-β信号传导基因编码，其中TGF-β信号传导基因是WISP1、TGFB2或其任何组合。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由胶原重塑基因编码，其中胶原重塑基因为LOXL2。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由细胞外基质重塑基因编码，其中细胞外基质重塑基因选自由以下组成的组：COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1、LOXL2、弹性蛋白及其任何组合。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由Wnt信号传导基因编码，其中Wnt信号传导基因包括WISP1。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由HDGF信号传导基因编码，其中HDGF信号传导基因包括HDGF。在一些实施方案中，疾病或状况可以包括病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染可以是HCV基因型1感染。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在HCV基因型1基因组中编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:587、SEQ IDNO:588或SEQ ID NO:589的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，病毒感染可以是冠状病毒感染。在一些实施方案中，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在SARS-CoV-2基因组中编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:500至SEQ ID NO:531、SEQ ID NO:829、SEQ ID NO:830或SEQ ID NO:831中任何一个的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513或SEQ IDNO:518的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，冠状病毒可以是SARS-CoV。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在SARS-CoV基因组中编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:474至SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:826、SEQ ID NO:827或SEQ ID NO:828中任何一个的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:476、SEQID NO:481或SEQ ID NO:495的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，冠状病毒可以是MERS-CoV。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在MERS-CoV基因组中编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:532至SEQ ID NO:554中任何一个的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，冠状病毒可以是CoV-HKU1。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在CoV-HKU1基因组中编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:555至SEQ ID NO:586中任何一个的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，病毒感染可以是HIV感染。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可由HIV基因组编码。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:470的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ IDNO:471、SEQ ID NO:472或SEQ ID NO:473的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，疾病或状况可以包括神经肌肉紊乱，包括肌营养不良或肌病。在一些实施方案中，疾病或状况可以是杜兴氏肌营养不良(DMD)、强直性肌营养不良(MD)、面肩肱型肌营养不良(FSHD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、贝克肌营养不良、眼咽型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良或远端肌营养不良。在一些实施方案中，疾病或状况可以由遗传或自发的常染色体显性突变引起。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA的至少一部分可在以下中编码：肌萎缩蛋白、DMPK、CLCN1、CNBP、D4Z4重复、DUX4、SMCHD1、DBET、SVIL、GAL3ST2、FRG1、CAPN3、DYSF、LMNA、PABPN1、PYGM、MYOD1、MYH7、HNRNPC、HNRNPA2B1、ACVR1、ASIC2、ATG14、ATP1A1、B3GTNL1、BANF1、BPTF、CASP8AP2、CDX4、CELF2、CHMP7、CKMT1B、CLASP1、CNOT3、COL15A1、CYP3A4、DCAF15、DCN、DLX5、DUSP7、DUX1、DUX5、EMILIN1、EPG5、FAM13A、FBX03、FBXL22、FMNL3、FREM2、FRMPD2、GADD45A、GID4、GJD3、GMPR、GNAT1、GOSR1、GPRC6A、HERC1、HGF、HOOK3、HOXC9、HSP40、IRF9、IRX5、ITGA10、ITGA3、ITGA9、KCNC3、KLHL3、KLK6、LARP6、MALT1、MAP3K4、MAPK10、MIR4661、MIR8078、MTSS1、NDUFAF6、NEBL、NKX2、NR2F1、PCID2、PDE10A、PKD1L2、PKHD1、PPP1R12B、PTPRN2、PYY、RABGAP1L、RBCK1、RFX3、RHBDF2、SCRIB、SEMA3B、SETD4、SHFL、SHH、SLC37A4、SLC9A8、SMAD1、SPEF1、SPRED3、ST3GAL6、STAG1、SUPV3L1、TBC1D26、TCEA2、TCF3、TM6SF1、TMEM108、TMEM259、TNFSF4、TNIP1、TRNP1、USH1G、WRNIP1、XIAP、ZNF574基因或其任何组合。在一些实施方案中，第一RNA或第二RNA可包括与SEQ ID NO:901至SEQ ID NO:949中任何一个的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸中的核苷酸的至少一个碱基可以不与第一RNA或第二RNA互补。
本文还公开了可包含约5个核苷酸至约50个核苷酸的多核苷酸序列的工程化寡核苷酸或其盐。在一些实施方案中，工程化寡核苷酸或其盐可包含：第一区域、与第一区域邻近的第二区域和与第二区域邻近的第三区域，其中区域按照以下顺序从5'到3'排列：第一区域、第二区域和第三区域；其中当工程化寡核苷酸或其盐与mRNA序列结合时，第一区域和第三区域与mRNA序列互补，并且第二区域包含至少一个与mRNA序列不互补的碱基。在一些实施方案中，相对于其他方面可比的寡核苷酸与mRNA序列在37摄氏度和约pH 7.2结合的结合ΔG，工程化寡核苷酸或其盐可以包含根据在约37摄氏度和约pH 7.2与mRNA序列结合所确定的低至少约10％的结合吉布斯自由能(ΔG)，其中其他方面可比的寡核苷酸缺乏在工程化寡核苷酸中与mRNA序列不互补的至少一个碱基。
本文还公开了工程化寡核苷酸或其盐，其可包含与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性的多核苷酸序列，其中与接触等量的人类细胞中天然存在的miR-29或miR-30寡核苷酸或其盐相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时产生由mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的表达；所述表达由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸或其盐转染到包含mRNA序列的第一分离的人类细胞中，(b)将miR-29或miR-30寡核苷酸转染到包含mRNA序列的第二分离的人类细胞中，和(c)测量在第一分离的人类细胞和分离的第二人类细胞中表达的多肽的量。在一些实施方案中，结构和化学可以被优化为赋予与未修饰序列或可比的ncRNA相比大于或等于100X的对天然核酸酶的稳定性。
本文还公开了工程化过客寡核苷酸(passenger oligonucleotide)或其盐，其可包含多核苷酸序列，其中工程化过客寡核苷酸或其盐可以与如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐的至少一部分至少部分地互补。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约50个核苷酸。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐可以包含核糖。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐可以包含脱氧核糖。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐可以与以下中的任何一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169或SEQ ID NO:466。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸可以形成包含茎环的二级结构。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐可包含相对于天然存在的碱基、糖、主链或磷酸酯连接而言化学修饰的碱基、化学修饰的糖、化学修饰的主链或磷酸酯连接，或其任何组合。在一些实施方案中，化学修饰可选自由以下组成的组：甲基基团、氟基团、甲氧基乙基基团、乙基基团、羟甲基基团、甲酰基基团、羧酸或其盐、硫代磷酸酯修饰的主链、甲基膦酸酯修饰的主链、氨基-烷基链修饰及其任何组合。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐，当化学修饰时，可包括下式：CAP–mNmNmN(N)kmNmNmN；其中CAP可选自5'-末端甲基基团(5'-O甲基)或烷基氨基基团，诸如氨基-碳6链(5'-氨基C6)；每个N可以独立地是尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；每个mN可以独立地是2'-O-甲基修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；并且每个k可以是12-19。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐与SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:202、SEQID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:454、SEQ ID NO:464、SEQ ID NO:838、SEQ ID NO:839或SEQ ID NO:900中的任何一个可以具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，工程化过客寡核苷酸或其盐可包含糖修饰。在一些实施方案中，糖修饰可包括糖基化碱基。在一些实施方案中，结构和化学可以被优化为赋予与未修饰序列或可比的ncRNA相比大于或等于100X的对天然核酸酶的稳定性。
本文还公开了核酸构建体，其可以包含：(a)包含如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐的第一链和(b)包含如本文描述的具有与第一链的至少一部分互补的序列的工程化过客寡核苷酸或其盐。
本文还公开了可包含如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐或者如本文描述的核酸构建体的载体。在一些实施方案中，载体可以以脂质体、纳米颗粒或其任何组合存在。在一些实施方案中，载体可以是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体。
本文还公开了分离的细胞，其可包含如本文描述的工程化寡核苷酸或盐、如本文描述的核酸构建体或如本文描述的载体。
本文还公开了药物组合物，其可包含：(a)如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐，如本文描述的核酸构建体，或如本文描述的载体；和(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。在一些实施方案中，药物组合物可以是单位剂量形式。在一些实施方案中，药物组合物可以是包封的。在一些实施方案中，药物组合物可以是液体形式的。
本文还公开了治疗有相应需要的受试者的方法，其可包括：向受试者施用治疗有效量的：如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐、如本文描述的核酸构建体、如本文描述的载体或如本文描述的药物组合物。在一些实施方案中，施用可以通过静脉内注射、肌内注射、鞘内注射、眶内注射、皮下注射或其任何组合。在一些实施方案中，施用可以是口服的、耳部的、眼部的、直肠的或其任何组合。在一些实施方案中，方法还可以包括第二施用，第二施用包括对受试者的第二疗法。在一些实施方案中，施用和第二施用可以是同时的。在一些实施方案中，施用和第二施用可以是顺序的。在一些实施方案中，受试者可以患有或可以处于发展疾病或状况的风险。在一些实施方案中，疾病或状况可以是癌症。在一些实施方案中，癌症可以是头癌、颈癌、皮肤癌、宫颈癌、前列腺癌或其任何组合。在一些实施方案中，疾病或状况可以是病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染可以是SARS-CoV感染、SARS-COV-2感染、MERS-CoV感染、CoV-HKU1感染、HIV感染或HCV感染。在一些实施方案中，疾病或状况可以是纤维化。在一些实施方案中，疾病或状况可以是肌营养不良。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人类。在一些实施方案中，受试者可以已通过诊断测试被诊断患有疾病或状况。在一些实施方案中，诊断测试可以包括成像程序、血细胞计数分析、组织病理学分析、生物标志物分析或其任何组合。
本文还公开了方法，其可以包括：将如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐、如本文描述的核酸构建体或如本文描述的载体与分离的细胞或分离的组织接触。
本文还公开了如本文描述的试剂盒，其可包含在容器中的如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐，在容器中的如本文描述的核酸构建体，在容器中的如本文描述的载体，或在容器中的如本文描述的药物组合物。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的本公开内容相矛盾的程度而言，本说明书意在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图说明
示例性实施方案的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用示例性实施方案的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1A示出了天然miR-30引导链序列和工程化家族成员的实例。
图1B示出了天然miR-30过客链序列和工程化家庭成员的实例。
图2A示出了天然miR-30a-5p序列与ITGA6、SERPINE1和EGFR转录物的3'UTR中的靶位点之间的自由能(ΔG)和杂交。
图2B示出了在第13位包含‘G’插入的工程化家族G007-30(SEQ ID NO:39)与ITGA6、SERPINE1和EGFR靶位点之间的自由能(ΔG)和杂交。
图2C示出了在位置13包含与G007-30中发现的相同‘G’插入的模拟物可以展示对选择的致癌靶的改善的敲低。
图3示出了MTDH 3'UTR中miR-30-5p靶位点的示意图。
图4A示出了miR-30模拟物在癌细胞系中的抗肿瘤活性。
图4B示出了通过miR-30模拟物对包含癌症相关miR-30靶位点及其3'UTR的萤光素酶报告物的敲低。
图4C示出了天然miR-30a和示例工程化模拟物在具有不同遗传背景的另外细胞系中的抗肿瘤活性。
图4D示出了一组工程化miR-30模拟物在具有不同组织学和遗传背景的另外的癌细胞系中的抗肿瘤活性。
图5A示出了解析核酸标记(M)和包含模拟双链体、引导链和降解片段(≤n-1)的样品的尿素-PAGE的实例。
图5B示出了工程化的miR-30miRNA模拟物在人类血清中的双链体稳定性。
图6A示出了具有过客链序列和改变模拟物结构的化学修饰的工程化模拟物双链体的结构。
图6B示出了工程化的miR-30miRNA模拟物在人类血清中的示例双链体稳定性。
图7A示出了具有过客链序列和改变模拟物结构的化学修饰的工程化模拟物双链体的示例结构。
图7B示出了示例工程化miR-30模拟物在癌细胞系中的抗肿瘤活性。
图7C示出了通过具有不同结构但相同引导链的工程化miR-30模拟物对萤光素酶报告物的敲低。
图8A示出了可以对引导链的5'末端进行的两种钝化(blunting)修饰的结构。图8B示出了具有5'修饰的引导链的模拟物的钝化的抗肿瘤活性(blunted anti-tumoractivity)。
图9A示出了示例工程化miR-30模拟物双链体的结构。
图9B示出了示例工程化miR-30模拟物在癌细胞系中的抗肿瘤活性。
图9C示出了具有不同结构但相同引导链的示例工程化miR-30模拟物对萤光素酶报告物的敲低。
图10A显示了示例工程化模拟物M30-043的改善的抗癌活性和沉默。图10B示出了示例工程化模拟物M30-043对萤光素酶活性的敲低。
图11A示出了PBMC暴露于工程化miR-30模拟物后固有TNFα产生的降低。
图11B示出了PBMC暴露于工程化miR-30模拟物后固有IFNα产生的降低。
图12A示出了顺铂抗性癌细胞系的产生。
图12B示出了工程化miR-30模拟物活性在顺铂抗性癌细胞系中的保存。
图12C示出了工程化miR-30模拟物处理对顺铂抗性细胞系的复敏。
图12D示出了工程化miR-30模拟物处理使癌细胞系对EGFR抑制剂西妥昔单敏感化。
图13A示出了工程化miR-30模拟物处理的原位HNSCC肿瘤中的抗肿瘤活性的萤光素酶图像。图13B示出了工程化的miR-30模拟物处理的原位HNSCC肿瘤中的萤光素酶活性的定量。
图13C示出了工程化的miR-30模拟物M30-040在皮下HNSCC小鼠模型中的抗肿瘤活性。
图14A示出了工程化miR-30模拟物M30-048局部处理的原位HNSCC肿瘤中的抗肿瘤活性的萤光素酶图像。图14B示出了工程化的miR-30模拟物M30-048局部处理的原位HNSCC肿瘤中的萤光素酶活性的定量。
图15示出了天然miR-29引导链序列和工程化家族成员的实例。
图16示出了人类宿主细胞基因TET-1的示意图和工程化的miR-29模拟物的改善的预测结合。
图17的图示出了在萤光素酶细胞系中，与天然miR-29b相比，工程化miR-29模拟物可以具有同等或更大的敲低活性。
图18A示出了天然miR-29b-1双链体和工程化miR-29模拟物的序列和结构。
图18B示出了天然和工程化miR-29miRNA模拟物在人类血清中的双链体稳定性。
图19A示出了示例工程化miR-29模拟物的序列和结构。
图19B示出了示例工程化miR-29miRNA模拟物在人类血清中的双链体稳定性。
图20A示出了天然miR-29a双链体和示例工程化miR-29a模拟物的序列和结构。
图20B示出了天然miR-29b双链体和示例工程化miR-29b模拟物的序列和结构。
图20C示出了miR-29a和miR-29b的示例工程化模拟物对萤光素酶敲低活性的改善。
图21示出miR-29的工程化模拟物显示降低的固有免疫刺激。
图22A示出了与HIV-1NEF RNA结合的天然和工程化miR-29-3p引导链的示意图。
图22B示出了示例工程化miR-29模拟物对HIV-1复制的抑制。
图23示出了miR-29的工程化模拟物对HIV-1相关宿主mRNA的改善的敲低。
图24A示出了天然和工程化miR-29-3p引导链与SARS-CoV病毒基因组中预测的靶位点结合的计算自由能。
图24B示出了天然和工程化miR-30-5p引导链与SARS-CoV病毒基因组中预测的靶位点结合的计算自由能。
图25A示出了天然和工程化miR-29-3p引导链与SARS-CoV-2病毒基因组中预测的靶位点结合的计算自由能。
图25B示出了天然和工程化miR-30-5p引导链与SARS-CoV-2病毒基因组中预测的靶位点结合的计算自由能。
图25C示出了示例工程化miR-29和miR-30模拟物对SARS-CoV-2病毒复制的抑制。
图26示出了天然和工程化miR-29-3p引导链与HCV-1病毒基因组中预测的靶位点结合的计算自由能。
图27示出了抗癌工程化人工miRNA模拟物ENG-miR-1在正常细胞系和癌细胞系中的细胞杀伤活性。
图28示出了多靶向ASO对FSHD患者成肌细胞中的DUX4和DBET RNA转录物的同时敲低。
图29是示出如本文所公开的方法和系统的图。
图30示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机控制系统。
序列表
本文或随附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列均使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写示出。
SEQ ID NO:1-37是示例性成熟miRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38-45、52-89和624-825是修饰的miR-30引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:46-51、90-99和900是修饰的miR-30过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:100-154、620和835-837是修饰的miR-29引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:155-183和838-839是修饰的miR-29过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:184-201是修饰的miR-26引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:202-204是修饰的miR-26过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:205-222是修饰的miR-27引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:223-224是修饰的miR-27过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:225-233是修饰的miR-101引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:234是修饰的miR-101过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:235-243是修饰的miR-145引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:244是修饰的miR-145过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:245-443和840-899是修饰的miR-205引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:444是修饰的miR-205过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:445-453是修饰的miR-338引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:454是修饰的miR-338过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:455-463是修饰的miR-375引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:464是修饰的miR-375过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:465是工程化引导链核苷酸序列。
SEQ ID NO:466是工程化过客链核苷酸序列。
SEQ ID NO:901-949是反义核苷酸序列。
SEQ ID NO:467-619、621-623、826-834、950-1120是靶核苷酸序列。
详述
定义
除非另有指示，开放术语例如“包含(contain)”、“包含(containing)”、“包括(include)”、“包括(including)”等意指包含(comprising)。
除非上下文另外清楚指明，否则本文使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，除非指示相反的情况，否则本申请中列出的数值参数是可以根据寻求获得的期望特性而变化的近似值。
如本文使用的，术语“约(about)”或“大约(approximately)”可以意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围之内(这将部分地取决于值如何被测量或确定)，例如，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指正负10％。可选地，“约”可以意指给定值的正负20％、正负10％、正负5％或正负1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的数量级以内，在值的5倍以内或在值的2倍以内。除非另有说明，否则当在本申请和权利要求书中描述特定值时，应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。此外，在提供值的范围和/或子范围的情况下，范围和/或子范围可以包括范围和/或子范围的端点。
如本文使用的术语“基本上”可以指接近给定值的100％的值。在一些情况下，该术语可指可以为总量的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％的量。在一些情况下，该术语可以指可以为总量的约100％的量。
术语“同源性”可以指序列与参考序列的％同一性。作为实际问题，无论任何特定的序列可以与本文描述的任何序列(可以与本文描述的特定核酸序列相对应的)是至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％还是99％同一的，这样的特定的多肽序列可以常规地使用已知的计算机程序诸如Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,UniversityResearch Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)来确定。当使用Bestfit或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与参考序列具有例如95％的同一性时，可以设置参数以使得在参考序列的整个长度上计算同一性百分比，并且允许高达总参考序列5％的同源性空位。
例如，在特定实施方案中，可以使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序来确定参考序列(查询序列，即，如本文描述的序列)和主题序列之间的同一性，也称为全局序列比对。在一些情况下，在FASTDB氨基酸比对中使用的特定实施方案(其中同一性被狭义地解释)的参数可以包括：评分方案＝PAM(接受的突变百分比)0，k-tuple＝2，错配罚分＝1，连接罚分＝20，随机分组长度＝0，截止得分＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或主题序列长度，以较短者为准。根据本实施方案，如果主题序列由于N末端或C末端缺失而不是由于内部缺失而比查询序列短，则可以对结果进行手动校正，以考虑FASTDB程序在计算全局同一性百分比时不考虑主题序列的N末端和C末端截短这一事实。对于在N-和C-末端截短的主题序列，相对于查询序列的同一性的百分比可以通过计算查询序列中在主题序列的N-和C-末端外侧的、与对应的主题残基不匹配/不对齐的残基的数量作为查询序列总碱基的百分比来校正。残基是否匹配/对齐的确定可以通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后，可以从FASTDB程序使用指定参数计算的同一性百分比中减去该百分比，以得到最终的同一性百分比得分。该最终同一性百分比得分可用于本实施方案的目的。在一些情况下，为了手动调整同一性百分比得分的目的，仅考虑与查询序列不匹配/对齐的主题序列的N-和C-末端的残基。也就是说，只有在主题序列的最远N-和C-末端残基之外的查询残基位置才被考虑用于此手动校正。例如，可以将90个残基的主题序列与100个残基的查询序列进行比对以确定同一性百分比。缺失发生在主题序列的N末端，并且因此，FASTDB比对不示出N末端前10个残基的匹配/对齐。10个未配对的残基代表序列的10％(N-和C-末端不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因此从FASTDB程序计算的同一性百分比得分中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，那么最终的同一性百分比将是90％。在另一个实例中，将90个残基的主题序列与100个残基的查询序列进行比较。这一次，缺失是内部缺失，因此在主题序列的N-或C-末端没有与查询序列不匹配/对齐的残基。在这种情况下，不手动校正通过FASTDB计算的同一性百分比。再次强调，只有主题序列的N-和C-末端之外的(如FASTDB比对中显示的)与查询序列不匹配/对齐的残基位置才被手动校正。
在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与本文描述的任何SEQ ID NO的寡核苷酸的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与本文描述SEQ ID NO中任何一个的寡核苷酸的至少10个连续碱基的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
表1-天然人类miRNA
Figure BDA0003979487010000251
Figure BDA0003979487010000261
表2-天然miRNA模拟物组合物
miRNA名称 引导链 过客链
miR-30a miR-30a-5p(SEQ ID NO.1) miR-30a-3p(SEQ ID NO.6)
miR-30b miR-30b-5p(SEQ ID NO.2) miR-30b-3p(SEQ ID NO.7)
miR-30c-1 miR-30c-5p(SEQ ID NO.3) miR-30c-1-3p(SEQ ID NO.8)
miR-30c-2 miR-30c-5p(SEQ ID NO.3) miR-30c-2-3p(SEQ ID NO.9)
miR-30d miR-30d-5p(SEQ ID NO.4) miR-30d-3p(SEQ ID NO.10)
miR-30e miR-30e-5p(SEQ ID NO.5) miR-30e-3p(SEQ ID NO.11)
miR-29a miR-29a-3p(SEQ ID NO.12) miR-29a-5p(SEQ ID NO.15)
miR-29b-1 miR-29b-3p(SEQ ID NO.13) miR-29b-1-5p(SEQ ID NO.16)
miR-29b-2 miR-29b-3p(SEQ ID NO.13) miR-29b-2-5p(SEQ ID NO.17)
miR-29c miR-29c-3p(SEQ ID NO.14) miR-29c-5p(SEQ ID NO.18)
miR-26a-1 miR-26a-5p(SEQ ID NO.19) miR-26a-1-3p(SEQ ID NO.21)
miR-26a-2 miR-26a-5p(SEQ ID NO.19) miR-26a-2-3p(SEQ ID NO.22)
miR-26b miR-26b-5p(SEQ ID NO.20) miR-26b-3p(SEQ ID NO.23)
miR-27a miR-27a-5p(SEQ ID NO.24) miR-27a-3p(SEQ ID NO.26)
miR-27b miR-27b-5p(SEQ ID NO.25) miR-27b-3p(SEQ ID NO.27)
miR-101 miR-101-3p(SEQ ID NO.28) miR-101-5p(SEQ ID NO.29)
miR-145 miR-145-5p(SEQ ID NO.30) miR-145-3p(SEQ ID NO.31)
miR-205 miR-205-5p(SEQ ID NO.32) miR-205-3p(SEQ ID NO.33)
miR-338 miR-338-3p(SEQ ID NO.34) miR-338-5p(SEQ ID NO.35)
miR-375 miR-375-3p(SEQ ID NO.36) miR-375-5p(SEQ ID NO.37)
表3-工程化miRNA
Figure BDA0003979487010000262
Figure BDA0003979487010000271
Figure BDA0003979487010000281
Figure BDA0003979487010000291
Figure BDA0003979487010000301
Figure BDA0003979487010000311
Figure BDA0003979487010000321
Figure BDA0003979487010000331
Figure BDA0003979487010000341
Figure BDA0003979487010000351
Figure BDA0003979487010000361
Figure BDA0003979487010000371
Figure BDA0003979487010000381
Figure BDA0003979487010000391
Figure BDA0003979487010000401
Figure BDA0003979487010000411
Figure BDA0003979487010000421
Figure BDA0003979487010000431
表4-模拟物/模拟组合物
Figure BDA0003979487010000432
Figure BDA0003979487010000441
Figure BDA0003979487010000451
例如，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的寡核苷酸的至少约80％的序列同一性。例如，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的寡核苷酸的至少约90％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的寡核苷酸的约80％至100％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的寡核苷酸的约85％至100％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的至少约10个连续碱基的至少80％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949中任何一个的至少约10个连续碱基的至少85％的序列同一性。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、100-126、245-263、465、624-643、840-845和901-949或其任何组合中任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。
在一些情况下，第二链可包括与SEQ ID NO:6-11、15-18、21-23、26-27、29、31、33、35、37、46-51、90-99、155-183、202-204、223-224、234-244、444、454、464、466、838-839或其任何组合中任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，第二链可包括与SEQ ID NO:51、95-99或其任何组合中任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。
例如，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ IDNO:589、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的寡核苷酸的至少约80％的序列同一性。例如，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:500、SEQID NO:513、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的寡核苷酸的至少约90％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513、SEQ IDNO:518、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的寡核苷酸的约80％至100％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:518、SEQ IDNO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的寡核苷酸的约85％至100％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:476、SEQ IDNO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的至少约10个连续碱基的至少80％的序列同一性。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588、SEQ ID NO:589、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495中任何一个的至少约10个连续碱基的至少85％的序列同一性。
在一些情况下，在约37摄氏度和约pH7.2，工程化寡核苷酸或其盐可包含至少约1％、2％、5％、7％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％更低的与RNA序列结合的吉布斯自由能(ΔG)。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可以在约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40摄氏度结合RNA序列。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐可以在约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8的pH结合RNA序列。
如本文使用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”及类似术语可指可以用于将化合物或组合物递送至期望的生物作用部位的方法。递送可以包括直接应用于受影响的身体的组织或区域。递送可以包括实质注射、鞘内注射、心室内注射或脑池内注射。本文提供的组合物可以通过任何方法施用。施用的方法可以是通过吸入、动脉内注射、脑室内注射、脑池内注射、肌内注射、眶内注射、脑实质内注射、腹膜内注射、椎管内注射、鞘内注射、静脉内注射、心室内注射、立体定向注射、皮下注射或其任何组合。递送可以包括肠胃外施用(包括静脉内、皮下、鞘内、腹膜内、肌内、血管内或输注)、口服施用、吸入施用、十二指肠内施用、直肠施用。递送可以包括表面(topical)施用(诸如洗剂、乳膏、软膏)到表面的外表面，诸如皮肤。在一些情况下，受试者可以在不存在监护的情况下施用组合物。在一些情况下，受试者可以在医学专业人员(例如，医师、护士、医师助理、护理员、临终关怀工作人员等)的监护下施用组合物。在一些情况下，医学专业人员可以施用组合物。在一些情况下，医美专业人员可以施用组合物。
术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文可以互换使用来指动物，通常是哺乳动物。任何合适的哺乳动物都可以被施用如本文描述的组合物(诸如工程化寡核苷酸)或通过如本文描述的方法治疗。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家畜(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段，例如哺乳动物可以是新生儿、婴儿、青少年、成年或在子宫内。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人类。人类可以是超过约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100岁。人类可以是小于约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100岁。哺乳动物可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，受试者可以是人类。在一些实施方案中，受试者可以被怀疑患有疾病或状况。受试者可以是患者，诸如正在治疗状况或疾病的患者，诸如癌症、纤维化状况或病毒感染的患者。受试者可以倾向于有发生状况或疾病(诸如癌症)的风险。受试者可以正在从状况或疾病中缓解，诸如癌症患者。受试者可以是健康的。
术语“哺乳动物细胞”可以指任何哺乳动物细胞，通常是人类细胞。在一些实施方案中，人类细胞可以是头或颈部组织的细胞、皮肤细胞、宫颈细胞、前列腺细胞、干细胞、骨细胞、血细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、精子细胞、卵细胞、癌细胞、屏障细胞、激素分泌细胞、外分泌细胞(exocrine-secretory cell)、上皮细胞、口腔细胞、感觉传感器细胞、自主神经元细胞、周围神经元细胞、中枢神经神经元细胞、分泌细胞、屏障细胞、肌细胞、心肌细胞、白细胞、生殖细胞、哺育细胞(nurse cell)、肾细胞或其任何组合。
如本文使用的，癌症是指由身体一部分的异常细胞不受控制的分裂引起的疾病。这些细胞可以是从美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)(https://www.cancer.gov/types)维护的列表中选择的不同类型的细胞。
如本文使用的，癌症的“治疗”可以包括以下中的一个或更多个：降低症状的频率和/或严重程度，消除症状和/或其潜在原因，以及改善或修复损伤。例如，癌症的治疗可以包括，例如，减轻患有癌症的哺乳动物经历的疼痛，和/或引起癌症的消退或消失。治疗还可以包括：减轻不适，停止癌症副作用，减少肿瘤，或其任何组合。治疗可以包括施用SEQ IDNO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837和840-899或其任何组合的工程化寡核苷酸。如本文使用的，纤维化、疤痕形成或两者的“治疗”可以包括以下中的一个或更多个：降低症状的频率和/或严重程度，消除症状和/或其潜在原因，以及改善或修复损伤。例如，纤维化的治疗可以包括，例如，减轻患有肺纤维化的哺乳动物经历的呼吸急促，和/或引起纤维化的消退或消失。治疗还可以包括：减轻不适，停止纤维化或疤痕形成副作用，减少纤维化组织，或其任何组合。治疗可以包括施用SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、38-45、52-89、100-154、184-201、620、624-825和835-837或其任何组合的工程化寡核苷酸。如本文使用的，病毒感染的“治疗”可以包括以下中的一个或更多个：降低症状的频率和/或严重程度、消除症状和/或其潜在原因、消除感染性疾病以及改善或修复损伤。例如，病毒感染的治疗可以包括，例如，减轻患有病毒感染的哺乳动物经历的咳嗽，和/或引起病毒感染的消退或消失。治疗还可以包括：减轻不适，停止病毒感染副作用，减少病毒感染，或其任何组合。治疗可以包括施用SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、38-45、52-89、100-154、184-201、620、624-825和835-837或其任何组合的工程化寡核苷酸。
如本文使用的，肌营养不良的“治疗”可以包括以下中的一个或更多个：降低症状的频率和/或严重程度，消除症状和/或其潜在原因，以及改善或修复损伤。例如，肌营养不良的治疗可以包括，例如，减轻患有肌营养不良的哺乳动物经历的肌无力，和/或引起肌无力的消退或消失。治疗还可以包括：减轻不适，停止肌强直，减少肌肉疼痛，或其任何组合。治疗可以包括施用SEQ ID NO:12-14、30、100-154、235-243、620、835-837和901-949或其任何组合的工程化寡核苷酸。
表5-ASO
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调节性非编码RNA(ncRNA)包括在基因组中表达的可调节哺乳动物细胞中其他生物分子的表达或功能的短的非编码RNA序列。ncRNA的长度一般<200个核苷酸，并且可以是单链的或双链的，并且可以形成非线性的二级或三级结构。ncRNA可以包括外源性来源的小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核小RNA(U-RNA)、核仁小RNA(snoRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)、重复相关的小干扰RNA(rasiRNA)、小rDNA来源的RNA(srRNA)、转移RNA来源的小RNA(tsRNA)、核糖体RNA来源的小RNA(rsRNA)、大的非编码RNA来源的小RNA(lncsRNA)或信使RNA来源的小RNA(msRNA)。
工程化寡核苷酸可以包括DNA或RNA。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含多于一种核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括人工核酸类似物。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括DNA，可以包括无细胞DNA、cDNA、胎儿DNA、病毒DNA或母体DNA。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括shRNA、或siRNA、ncRNA模拟物、短发夹RNA(shRNA)、依赖于dicer的siRNA(di-siRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、gapmer、mixmer、双链RNA(dsRNA)、单链RNAi(ssRNAi)、DNA定向RNA干扰(ddRNAi)、RNA激活寡核苷酸(RNAa)或外显子跳读寡核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括完全合成的miRNA。完全合成的miRNA是不来源于或基于ncRNA的miRNA。相反，完全合成的miRNA可以基于对多于一个潜在靶序列的分析，或者可以基于分离的非ncRNA的天然非编码序列。完全合成的miRNA的一个实例是E1-001(表4)。
诊断测试可以包括成像程序、血细胞计数分析、组织病理分析、生物标志物分析、活检、磁共振图像程序、身体检查、尿液测试、超声检查程序、遗传测试、肝功能测试、正电子发射断层扫描程序、X射线、血清学、血管造影程序、心电扫描程序、内窥镜检查、诊断性聚合酶链式反应测试(PCR)、巴氏涂片(pap smear)、血细胞比容测试、皮肤过敏测试、尿液测试、结肠镜检查、酶联免疫吸附测定(ELISA)、显微镜分析、骨髓检查、快速诊断测试、妊娠测试、器官功能测试、毒理学测试、感染性疾病测试、体液测试或其任何组合。
药物组合物可包含第一活性成分。第一活性成分可包含如本文描述的工程化寡核苷酸。药物组合物可以以单位剂量形式配制。药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。药物组合物可以包含第二、第三或第四活性成分，诸如第二工程化寡核苷酸。
本文描述的组合物可包含赋形剂。赋形剂可包括pH剂(以使组合物组分的氧化或降解最小化)、稳定剂(以防止组合物组分的改变或降解)、缓冲剂(以增强温度稳定性)、增溶剂(以增加蛋白质的溶解度)或其任何组合。赋形剂可以包括表面活性剂、糖、氨基酸、抗氧化剂、盐、非离子表面活性剂、增溶剂、甘油三酯、醇或其任何组合。赋形剂可以包括碳酸钠、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)、人类血清白蛋白(HSA)、山梨醇、蔗糖、海藻糖、聚山梨醇酯80、磷酸钠、蔗糖、磷酸氢二钠、甘露醇、聚山梨醇酯20、组氨酸、柠檬酸盐、白蛋白、氢氧化钠、甘氨酸、柠檬酸钠、海藻糖、精氨酸、乙酸钠、乙酸盐、HCl、依地酸二钠、卵磷脂、甘油、黄原胶(xanthan rubber)、大豆异黄酮、聚山梨醇酯80、乙醇、水、替普瑞酮(teprenone)或其任何组合。赋形剂可以是Handbook of Pharmaceutical Excipients,American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。
本文公开的组合物的施用或应用可以进行至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天或100天连续或非连续天的治疗持续时间。在一些情况下，治疗持续时间可以为约1天至约30天、约2天至约30天、约3天至约30天、约4天至约30天、约5天至约30天、约6天至约30天、约7天至约30天、约8天至约30天、约9天至约30天、约10天至约30天、约11天至约30天、约12天至约30天、约13天至约30天、约14天至约30天、约15天至约30天、约16天至约30天、约17天至约30天、约18天至约30天、约19天至约30天、约20天至约30天、约21天至约30天、约22天至约30天、约23天至约30天、约24天至约30天、约25天至约30天、约26天至约30天、约27天至约30天、约28天至约30天、或约29天至约30天。
本文公开的组合物的施用或应用可进行至少约1周、至少约1个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更长的治疗持续时间。施用可以在受试者的终身内重复进行，诸如在受试者的终身内每月一次或每年一次重复进行。施用可以在受试者生命的大部分时间内重复进行，诸如每月一次或每年一次，持续至少约1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年或更长时间。
本文公开的组合物的施用或应用每天可进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在一些情况下，本文公开的组合物的施用或应用每周可进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些情况下，本文公开的组合物的施用或应用每月可进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次。
在一些情况下，组合物可以作为单剂量或分剂量施用/应用。在一些情况下，本文描述的组合物可以在第一时间点和第二时间点施用。在一些情况下，可以施用组合物使得第一次施用在另一次之前施用，施用时间相差1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、4天、7天、2周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长。
在一些情况下，与将等量的缺乏修饰的其他方面可比的寡核苷酸与mRNA序列接触相比，包含修饰的工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可以产生由mRNA序列编码的多肽的较低活性。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约1.2倍。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约1.5倍。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约1.7倍。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约2.0倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2倍至约2.0倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.1倍至约1.5倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.1倍至约2.5倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2倍至约3.0倍。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约1.2倍至约至少10倍的表达。在一些情况下，较低的活性可以是低至少约14倍。在一些情况下，较低的表达可以是低至少约18倍的表达。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2倍至约14倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.1倍至约20倍。在一些情况下，较低的活性可以是低约1.2倍至约30倍。
在一些情况下，包含修饰的工程化寡核苷酸或其盐当储存在放置在房间中的封闭容器中一段时间时，将保持工程化寡核苷酸或其盐初始量的至少约80％。在一些情况下，工程化的寡核苷酸将保持至少约70％的初始量。在一些情况下，工程化的寡核苷酸将保持至少约90％的初始量。在一些情况下，工程化的寡核苷酸将保持至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％。在一些情况下，工程化核苷酸可以为至少约60％至约至少80％。在一些情况下，工程化核苷酸可以为至少约80％至至少约99％。在一些情况下，储存的时间段可以是至少1个月。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约3个月。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约1年。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约1、2、4、6、8、12、18、24、36、48或60个月。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约1个月至约至少1年。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约6个月至至少约2年。在一些情况下，储存的时间段可以是至少约1个月至至少约5年。
如本文使用的术语“组织”可以是任何组织样品。组织可以是被怀疑或被证实患有疾病或状况的组织。组织可以是基本上健康、基本上良性或基本上没有疾病或状况的样品。组织可以是从受试者取出的组织，诸如组织活检、组织切除、抽吸物(诸如细针抽吸物)、组织洗涤物、细胞学标本、体液或其任何组合。组织可包括癌性的细胞、肿瘤细胞、非癌性的细胞或其组合。组织可以包括血液样品(诸如无细胞DNA样品)。组织可以是可以被遗传修饰过的样品。
在一些情况下，疾病或状况可包括病毒感染、纤维化状况、癌症、肌营养不良或其任何组合。在一些情况下，疾病或状况可以包括病毒感染。病毒感染可包括SARS-CoV感染、SARS-CoV-2感染、MERS-CoV感染、CoV-HKU1感染、HIV感染、HCV感染或其任何组合。病毒感染可以包括冠状病毒感染。冠状病毒可以是SARS-CoV、SARS-CoV-2、CoV-HKU1或MERS-CoV。在一些情况下，病毒感染可包括HCV基因型1感染。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可由SARS-CoV基因组、MERS-CoV基因组、CoV-HKU1基因组、HIV基因组或其任何组合编码。在一些情况下，工程化寡核苷酸对RNA序列可以是选择性的。在一些情况下，RNA序列可以包括与SEQ ID NO:500-531、829-831(表6)、SEQ ID NO:474-499、826-828(表6)、SEQ ID NO:532-554(表6)、SEQ ID NO:555-586(表6)或其任何组合中的RNA序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，受试者可以患有SARS-CoV-2感染，并且RNA序列可以包括与SEQ ID NO:500-531、829-831(表6)中的RNA序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，受试者可以患有SARS-CoV感染，并且RNA序列可以包括与SEQ ID NO:474-499、826-828(表6)中的RNA序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，受试者可以患有MERS-CoV感染，并且RNA序列可以包括与SEQ ID NO:532-554(表6)中的RNA序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，受试者可以患有CoV-HKU1感染，并且RNA序列可以包括与SEQ ID NO:555-586(表6)中的RNA序列的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以在HIV基因组中编码。在一些情况下，RNA序列可以包括与SEQ ID NO:470的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。在一些情况下，病毒感染可以是HIV感染。在一些情况下，RNA序列可以包括与SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:472或SEQ ID NO:473的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。
表6-靶序列
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Figure BDA0003979487010000631
Figure BDA0003979487010000641
如本文所公开的，状况或疾病可以包括癌症、神经紊乱、纤维化疾病、疤痕形成疾病或自身免疫性疾病。
在一些情况下，疾病或状况可以包括神经紊乱。在一些情况下，神经紊乱可以包括获得性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、失认症、Aicardi综合征、亚历山大病、阿尔珀斯病、交替性偏瘫、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(参见运动神经元疾病)、无脑畸形、安格曼综合征(Angelman syndrome)、血管瘤病、缺氧、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿-基氏脑畸形(Arnold-Chiarimalformation)、动静脉畸形、阿斯伯格综合征、共济失调毛细血管扩张症、注意缺陷多动障碍、自闭症、听觉处理障碍、自主神经功能障碍、背痛、巴滕病、白塞病、贝尔麻痹、良性特发性眼睑痉挛、良性局灶性肌萎缩、良性颅内高压、双侧额顶多小脑回畸形、宾斯旺格病(Binswanger's disease)、眼睑痉挛、色素失禁症(Bloch-Sulzberger syndrome)、臂丛损伤、脑脓肿、脑损伤、脑损伤、脑瘤、布朗-塞卡综合症(Brown-Sequard syndrome)、卡纳万病、腕管综合征(CTS)、灼痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、中央核肌病、头部疾病(Cephalic disorder)、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑巨人症、脑性瘫痪、夏科-马里-图思病、Chiari畸形、舞蹈症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性疼痛、慢性局部疼痛综合征、科芬-劳里综合征、昏迷包括持续植物人状态、先天性双侧面瘫、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、劳损性创伤障碍(Cumulative trauma disorders)、库欣综合征、巨细胞包涵体病(CIBD)、巨细胞病毒感染、Dandy-Walker综合征、Dawson病、De Morsier综合征、Dejerine-Klumpke麻痹、德热里纳-索塔斯病、延迟睡眠期综合征、痴呆、皮肌炎、神经性运动障碍、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、自主神经功能障碍、计算障碍、书写困难、阅读障碍、肌张力障碍、早期婴儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病(Encephalotrigeminalangiomatosis)、大便失禁、癫痫、Erb麻痹、红斑性肢痛、特发性震颤、法布里病、Fahr综合征、昏厥、家族性痉挛性瘫痪(Familial spastic paralysis)、热性惊厥、Fisher综合征、Friedreich共济失调、FART综合征、戈谢病、格斯特曼综合征、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体病、球状细胞脑白质营养不良、灰质异位、格林-巴利综合征、HTLV-1相关脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病、头部损伤、头痛、偏侧面肌痉挛、遗传性痉挛性截瘫、遗传性共济失调性多发性神经炎样病(Heredopathia atactica polyneuritiformis)、耳带状疱疹(Herpes zosteroticus)、带状疱疹(Herpes zoster)、平山综合征、全前脑畸形(Holoprosencephaly)、亨廷顿病、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症(Incontinentia pigmenti)、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷夫叙姆病、婴儿痉挛、炎性肌病、颅内囊肿、颅内高压、Joubert综合征、卡恩斯-塞尔综合征、肯尼迪病、Kinsbourne综合征、克利佩尔-费尔综合征、克拉伯病、库格尔贝格-韦兰德病、库鲁病、拉福拉病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、Landau-Kleffner综合征、延髓外侧(Wallenberg)综合征、学习障碍、利氏病、Lennox-Gastaut综合征、Lesch-Nyhan综合征、脑白质营养不良、路易体痴呆、平脑症、闭锁综合症、葛雷克氏病(Lou Gehrig's disease)、腰椎间盘突出症(Lumbar discdisease)、莱姆病-神经系统后遗症、Macha-do-Joseph病(脊髓小脑共济失调3型)、巨脑(Macrencephaly)、枫糖尿病、巨脑畸形、梅克松-罗森塔尔综合征、梅尼埃病、脑膜炎、Menkes病、异染性脑白质营养不良、小头畸形、偏头痛、米-费综合征、小中风(Mini-Stroke)、线粒体肌病、莫比斯综合征(Mobius syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元疾病、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidoses)、多发性脑梗塞痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、肌肉营养不良、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、髓细胞性(Myelinoclastic)弥漫性硬化症、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌管性肌病、先天性肌强直、发作性睡病、神经纤维瘤病、神经阻滞剂恶性综合征、AIDS的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质沉积症、神经元迁移紊乱(Neuronal migration disorders)、尼曼-匹克病、非24小时睡眠-觉醒综合征、非言语学习紊乱、O’Sulli-van-McLeod综合征、枕神经痛、隐性椎管闭合不全序列症(Occult SpinalDysraphism Sequence)、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视性眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、直立性低血压、过用综合征、持续后像(Palinopsia)、感觉异常、帕金森病、先天性副肌强直、副肿瘤疾病(Paraneoplastic disease)、阵发性发作(Paroxysmalattacks)、Parry-Romberg综合征、Rombergs综合征、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacherdisease)、周期性麻痹、周围神经病变、持续性植物人状态、广泛性神经系统紊乱、光喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经受压(Pinched Nerve)、垂体瘤、PMG、脊髓灰质炎、多小脑回畸形、多发性肌炎、脑穿通畸形(Porencephaly)、脊髓灰质炎后综合征、疱疹后神经痛(PHN)、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、普拉德-威利综合征、原发性侧索硬化症、朊病毒病、进行性面偏侧萎缩也称为Rombergs综合征、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性灰质营养不良、进行性核上性麻痹、假脑瘤、拉姆齐-亨特综合征(I型和II型)、Rasmussen脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、重复性运动障碍、重复性压力损伤、不安腿综合征、逆转录病毒相关性脊髓病、Rett综合征、瑞氏综合症(Reye's syndrome)、Rombergs综合征、狂犬病、圣维特斯舞蹈症、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、精神分裂症、希尔德病(Schilder's disease)、脑裂畸形、感觉统合功能障碍、视隔发育不良、摇晃婴儿综合征(Shaken baby syndrome)、带状疱疹(Shingles)、Shy-Drager综合征、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、睡眠呼吸暂停、昏睡病(Sleeping sickness)、餐后喷嚏(Snatiation)、儿巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)、痉挛(Spasticity)、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、椎管狭窄、Steele-Richardson-Olszewski综合征参见进行性核上性麻痹、脊髓小脑共济失调、僵人综合征、中风、Sturge-Weber综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮质下动脉硬化性脑病、浅表铁质沉着症、Syden-ham舞蹈症、晕厥、联觉、脊髓空洞症、迟发性运动障碍、泰-萨克斯病、颞动脉炎、脊髓栓系脊髓综合征、汤姆森病、胸廓出口综合征、痛性痉挛(Tic Douloureux)、托德瘫痪、图雷特综合征、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、锥虫病、结节性硬化症、血管炎包括颞动脉炎、希佩尔-林道病(VHL)、威流斯科脑脊髓炎(ViliuiskEncephalomyelitis,VE)、Wallenberg综合征、Werdnig-Hoffman病、West综合征、挥鞭病、威廉姆斯综合征、威尔逊病、X连锁脊髓和延髓肌萎缩症和泽尔韦格综合征。神经系统状况可以包括运动紊乱，例如多系统萎缩(MSA)。
在一些情况下，疾病或条件可以包括自身免疫性疾病。在一些情况下、自身免疫性疾病可包括急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、阿狄森病、无丙种球蛋白血症、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经功能障碍、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、轴突和神经元神经病、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特曼病(Castlemen disease)、乳糜泻(非热带)、查加斯病(Chagas disease)、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、耳蜗前庭综合征(Cogan’s syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST病、特发性混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(Dressler'ssyndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维肌痛、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henock-Schoniein purpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、胰岛素依赖型糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎(ligneousconjunctivitis)、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病、美尼尔氏病、显微镜下多血管炎、混合结缔组织病(MCTD)、Mooren溃疡、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏病)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部睫状体炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II&III型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红细胞再生障碍、雷诺氏现象、交感反射性营养不良、赖特尔综合征(Reiter'ssyndrome)、复发性多发软骨炎、不安腿综合征、腹膜后纤维变性、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TPP)、托-亨二氏综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风或韦格纳肉芽肿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、扩张型心肌病、心肌炎、自身免疫性多内分泌综合征I型(APS-I)、囊性纤维化血管炎、获得性甲状旁腺功能减退、冠状动脉疾病、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、Rasmussen脑炎、自身免疫性胃炎、胰岛素低血糖症综合征(平田病(Hirata disease))、B型胰岛素抵抗、棘皮病、系统性红斑狼疮(SLE)、恶性贫血、治疗耐受性莱姆关节炎、多发性神经病、脱髓鞘疾病、特应性皮炎、自身免疫性甲状腺功能减退症、白癜风、甲状腺相关眼病、自身免疫性乳糜泻、ACTH缺乏、皮肌炎、舍格伦综合征、系统性硬化症、进行性系统性硬化症、硬斑病、原发性抗磷脂综合征、慢性特发性荨麻疹、结缔组织综合征、坏死性和新月体肾小球肾炎(NCGN)、系统性血管炎、雷诺综合征、慢性肝病、内脏利什曼病、自身免疫性C1缺乏症、膜增殖性肾小球肾炎(MPGN)、凝血时间延长、免疫缺陷、动脉粥样硬化、神经元病、副肿瘤性天疱疮、副肿瘤性僵人综合征、副肿瘤性脑脊髓炎、亚急性自主神经病、癌症相关性视网膜病、副肿瘤性斜视性眼阵挛肌阵挛性共济失调、下运动神经元综合征和兰伯特-伊顿肌无力综合征。
在一些情况下，疾病或状况可以包括AIDS、炭疽、肉毒中毒、布鲁氏菌病、软下疳、衣原体感染、霍乱、球孢子菌病、隐孢子虫病、环孢子虫病、白喉病、埃立克体病、虫媒病毒性脑炎、肠出血性大肠杆菌、贾第虫病、淋病、登革热、流感嗜血杆菌、汉森病(麻风病)、汉坦病毒肺综合征、溶血性尿毒症综合征、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒、军团杆菌病、李斯特菌病、莱姆病、疟疾、麻疹、脑膜炎球菌病、腮腺炎、百日咳(pertussis)(百日咳(whooping cough))、鼠疫、麻痹性脊髓灰质炎、鹦鹉热、Q热、狂犬病、落基山斑点热、风疹、先天性风疹综合征、志贺氏菌病、天花、链球菌病(侵袭性A组)、链球菌中毒性休克综合征、肺炎链球菌、梅毒、破伤风、中毒性休克综合征、旋毛虫病、结核病、兔热病、伤寒、万古霉素中等耐药金黄色葡萄球菌、水痘、黄热病、变异型克-雅氏病(vCJD)、埃博拉出血热、棘球蚴病、亨德拉病毒感染、人类猴痘、甲型流感、乙型流感、H5N1、拉沙热、马尔堡出血热、尼帕病毒、阿良良热(O’nyong-nyong fever)、裂谷热、疱疹、HIV、HCV基因型1、HCV基因型2、HCV基因型3、HCV基因型4、HCV基因型5、HCV基因型6、SARS-CoV-2(COVID-19)、SARS-CoV(SARS)、MERS-CoV(MERS)、229E冠状病毒、NL63冠状病毒、OC43冠状病毒、CoV-HKU1(HKU1)、甲型冠状病毒、乙型冠状病毒、委内瑞拉马脑炎和西尼罗病毒。
在一些情况下，疾病或状况可以包括纤维化疾病、疤痕形成疾病或两者。在一些情况下，纤维化疾病或疤痕形成疾病可包括肺纤维化、囊性纤维化、特发性肺纤维化、放射诱导的纤维化、心肌纤维化、桥接纤维化(bridging fibrosis)、肝硬化、胶质增生、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩病、迪皮特朗挛缩、疤痕疙瘩、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病(Peyronie’sdisease)、肾源性系统性纤维化、进行性大块纤维化(progressive massivefibrosis)、腹膜后纤维化、硬皮病/系统性硬化症和粘连性关节囊炎。
在一些情况下，疾病或状况可以包括癌症。在一些情况下，癌症可以包括甲状腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、中枢神经系统(CNS)癌、周围神经系统(PNS)癌、乳腺癌、卡斯特曼病、宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因氏家族肿瘤(例如，尤因肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、毛细胞白血病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、儿童白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性障碍、鼻腔及鼻旁癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(成人软组织癌)、黑色素瘤皮肤癌、非黑色素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、子宫癌(例如，子宫肉瘤)、阴道癌、外阴癌、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。在一些情况下，癌症可以从美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)(https://www.cancer.gov/types)维护的列表中选择。
如本文所公开的，状况或疾病可以包括过度增生性紊乱。恶性过度增生性紊乱可分为诸如低风险组和中高风险组的风险组。过度增生性紊乱可以包括但可不限于癌症、超常增生或瘤形成。在一些情况下，过度增生性癌症可以是乳腺癌，诸如乳腺导管组织中的导管癌、髓样癌、胶样癌、管状癌和炎性乳腺癌；卵巢癌，包括上皮性卵巢肿瘤，诸如卵巢中的腺癌和已从卵巢迁移到腹腔的腺癌；子宫癌；宫颈癌，诸如宫颈上皮中的腺癌，包括鳞状细胞癌和腺癌；前列腺癌，诸如选自以下的前列腺癌：腺癌或已迁移至骨的腺癌；胰腺癌，诸如胰管组织中的上皮样癌和胰管中的腺癌；膀胱癌，诸如膀胱中的移行细胞癌、尿路上皮癌(移行细胞癌)、膀胱内的尿道上皮细胞中的肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌；白血病诸如急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、骨髓发育不良、骨髓增生性紊乱、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、肥大细胞增多症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)；骨癌；肺癌，诸如非小细胞肺癌(NSCLC)，可分为鳞状细胞癌、腺癌、和大细胞未分化癌和小细胞肺癌；皮肤癌，诸如基底细胞癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、光化性角化病，其可以是有时发展为鳞状细胞癌的皮肤状况；眼视网膜母细胞瘤；皮肤(cutaneous)或眼内(眼)黑色素瘤；原发性肝癌(在肝脏中开始的癌症)；肾癌；自身免疫缺陷综合征(AIDS)相关的淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞免疫母细胞淋巴瘤和小非核裂细胞(non-cleaved cell)淋巴瘤；卡波西肉瘤；病毒诱导的癌症，包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和肝细胞癌；人类嗜淋巴病毒1型(HTLV-1)与成人T细胞白血病/淋巴瘤；以及人乳头状瘤病毒(HPV)和宫颈癌；中枢神经系统(CNS)癌，诸如原发性脑肿瘤，包括胶质瘤(星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤或多形胶质母细胞瘤)、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、神经鞘瘤和髓母细胞瘤；周围神经系统(PNS)癌，诸如听神经瘤和恶性周围神经鞘瘤(MPNST)，包括神经纤维瘤和神经鞘瘤、恶性纤维细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性间皮瘤和恶性混合米勒瘤(Müllerian’s tumor)；口腔和口咽癌，诸如下咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌；胃癌，诸如淋巴瘤、胃间质瘤、类癌瘤；睾丸癌，诸如生殖细胞肿瘤(GCT)，包括精原细胞瘤和非精原细胞瘤；以及性腺间质瘤，包括间质细胞(Leydigcell)瘤和支持细胞(Sertoli cell)瘤；胸腺癌，诸如胸腺瘤、胸腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、类癌或类癌瘤；直肠癌；和结肠癌。在一些情况下，通过本公开内容的方法分层、分类、表征或诊断的疾病包括但可不限于甲状腺紊乱，诸如例如良性甲状腺紊乱，包括但不限于滤泡腺瘤、Hurthle细胞腺瘤、淋巴细胞性甲状腺炎和甲状腺增生。在一些情况下，通过本公开内容的方法分层、分类、表征或诊断的疾病包括但可不限于恶性甲状腺紊乱，诸如例如滤泡癌、甲状腺乳头状癌的滤泡变异型、髓样癌和乳头状癌。
本公开内容的状况或疾病可以包括遗传紊乱。遗传紊乱可以是由基因或染色体异常引起的疾病。遗传性紊乱可分组为两类：单基因紊乱以及多因素和多基因(复合)紊乱。单基因紊乱可以是单个突变基因的结果。遗传单基因紊乱可以包括但不限于常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传、Y连锁遗传和线粒体遗传。在一些情况下，基因的一个突变拷贝可以是人受常染色体显性紊乱影响所必需的。常染色体显性类型紊乱的实例可包括但不限于亨廷顿病、神经纤维瘤病1、马方综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌或遗传性多发性外生骨疣。在常染色体隐性遗传紊乱中，基因的两个拷贝可以发生突变，从而使受试者受到常染色体隐性遗传紊乱的影响。这种类型的紊乱的实例可以包括但可不限于囊性纤维化、镰状细胞病(也是部分镰状细胞病)、泰-萨克斯病、尼曼-匹克病或脊髓性肌萎缩症。X连锁显性紊乱是由X染色体上的基因中的突变引起的，诸如X连锁低磷酸血症佝偻病。一些X连锁显性状况诸如Rett综合征、2型色素失调和Aicardi综合征可能是致命的。X连锁隐性紊乱也是由X染色体上的基因中的突变引起的。这种类型的紊乱的实例可以包括但不限于A型血友病、杜兴氏肌营养不良、红绿色盲、肌营养不良和雄激素性脱发。Y连锁紊乱是由Y染色体上的突变引起的。实例可以包括但不限于男性不育和耳廓多毛症。线粒体遗传(也称为母体遗传)的遗传紊乱可以应用于线粒体DNA中的基因，诸如Leber遗传性视神经病变。
遗传紊乱也可以是复杂的、多因素的或多基因的。多基因遗传紊乱可以与多于一种基因结合生活方式和环境因素的影响有关。尽管复杂的遗传紊乱可以在家族中簇生(cluster)，但它们没有明确的遗传模式。多因素或多基因紊乱可包括心脏病、糖尿病、哮喘、自闭症、自身免疫性疾病诸如多发性硬化症、癌症、纤毛病(ciliopathies)、腭裂、高血压、炎性肠病、智力低下或肥胖。
其他遗传紊乱可以包括但可不限于1p36缺失综合征、21-羟化酶缺乏症、22q11.2缺失综合征、无铜蓝蛋白血症、II型软骨成长不全(achondrogenesis)、软骨发育不全(achondroplasia)、急性间歇性卟啉症、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏症、肾上腺脑白质营养不良、亚历山大病、尿黑酸尿、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、Alstrom综合征、阿尔茨海默病(类型1、2、3和4)、牙釉质发育不全症、肌萎缩侧索硬化症、2型肌萎缩侧索硬化症、4型肌萎缩侧索硬化症、4型肌萎缩侧索硬化症、雄激素不敏感综合征、贫血、安格曼综合征、阿佩尔综合症、共济失调毛细血管扩张症、Beare-Stevenson cutis gyrata综合征、Benjamin综合征、β地中海贫血、生物素酶缺乏症、Birt-Hogg-Dube综合征、膀胱癌、布卢姆综合征、骨病、乳腺癌、躯干发育不良、卡纳万病、癌症、乳糜泻、慢性肉芽肿病(CGD)、夏科-马里-图思病、1型夏科-马里-图思病、4型夏科-马里-图思病、2型夏科-马里-图思病、4型夏科-马里-图思病、科凯恩综合征、科芬-劳里综合征、II型和XI型胶原病、结直肠癌、先天性输精管缺如、先天性双侧输精管缺如、先天性糖尿病、先天性红细胞生成性卟啉症、先天性心脏病、先天性甲状腺功能减退症、结缔组织病、Cowden综合征、猫叫综合征、克罗恩病、纤维狭窄、克鲁宗综合征、颅面发育不全黑棘皮综合征(Crouzonodermoskeletal syndrome)、囊性纤维化、德格罗乌稀综合征(De Grouchy Syndrome)、退行性神经疾病、Dent病、发育障碍、迪-格奥尔格综合征(Di-George syndrome)、V型远端脊髓性肌萎缩症、唐氏综合征、侏儒症、埃勒斯-当洛综合征、关节松弛型埃勒斯-当洛综合征、经典型埃勒斯-当洛综合征、皮肤脆裂型埃勒斯-当洛综合征、脊柱侧凸型埃勒斯-当洛综合征、血管型埃勒斯-当洛综合征、红细胞生成性原卟啉症、法布里病、面部损伤和紊乱、V因子Leiden易栓症、家族性腺瘤性息肉病、家族性自主神经功能障碍、范科尼贫血、FG综合征、脆性X综合征、Friedreich共济失调、Friedreich’s共济失调、G6PD缺乏症、半乳糖血症、戈谢病(1、2和3型)、遗传性脑紊乱、甘氨酸脑病、2型血色素沉着症、4型血色素沉着病、斑色鱼鳞癣、头部和脑部畸形、听力障碍和耳聋、儿童听力问题、血色素沉着病(新生儿型、2型和3型)、血友病、肝红细胞生成性卟啉症、遗传性粪卟啉症、遗传性多发性外生骨疣、遗传性压迫易感性神经病、遗传性非息肉病性结直肠癌、同型半胱氨酸尿症、亨廷顿氏病、Hutchinson-Gilford早老综合征、原发性高草酸尿症、高苯丙氨酸血症、软骨发育不良(hypochondrogenesis)、软骨发育欠全(hypochondroplasia)、idic15、色素失调症、婴儿戈谢病、婴儿发作的上行性遗传性痉挛性麻痹、不孕症、Jackson-Weiss综合征、Joubert综合征、青少年原发性侧索硬化症、肯尼迪病、克兰费尔特综合征(Klinefelter syndrome)、Kniest发育不良、克拉伯病、学习障碍、莱施-奈恩综合征、脑白质营养不良(Leukodystrophies)、利-弗劳梅尼综合征、脂蛋白脂肪酶缺乏症、家族性男性生殖障碍、马方综合征、McCune-Albright综合征、麦克劳德综合征、地中海热、家族性Menkes病、Menkes症候群、代谢紊乱、β-珠蛋白型高铁血红蛋白血症、高铁血红蛋白血症、先天性高铁血红蛋白血症、甲基丙二酸血症、Micro综合征、小头畸形、运动障碍、Mowat-Wilson综合征、粘多糖贮积症(MPSI)、Muenke综合征、肌营养不良、杜兴型和贝克型肌营养不良、杜兴型和贝克型肌营养不良、肌强直性营养不良、1型和2型肌强直性营养不良、新生儿血色素沉着症、神经纤维瘤病、神经纤维瘤病1、神经纤维瘤病2、I型神经纤维瘤病、II型神经纤维瘤病、神经系统疾病、神经肌肉紊乱、尼曼-皮克病、非酮症性高甘氨酸血症、非综合征性耳聋、常染色体隐性遗传型非综合征性耳聋、努南综合征、成骨不全症(I型和III型)、耳脊椎骨垢发育不良、泛酸激酶相关神经变性、帕托综合征(Patau Syndrome)(13三体综合征)、Pendred综合征、波伊茨-耶格综合征(Peutz-Jeghers syndrome)、Pfeiffer综合征、苯丙酮尿症、卟啉症、迟发性皮肤卟啉症、普拉德-威利综合征、原发性肺动脉高压、朊病毒病、早衰、丙酸血症、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、假戈谢病、弹性假黄瘤、视网膜病症、视网膜母细胞瘤、视网膜母细胞瘤FA-Friedreich共济失调、Rett综合征、Rubinstein-Taybi综合征、桑德霍夫病、III型感觉和自主神经病变、镰状细胞性贫血、骨骼肌再生、皮肤色素沉着症、Smith Lemli Opit综合征、言语和交流障碍、脊髓性肌萎缩症、脊髓-延髓肌萎缩症、脊髓小脑性共济失调、Strudwick型脊椎外干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良、Stickler综合征、COL2A1型Stickler综合征、泰-萨克斯病、四氢生物蝶呤缺乏症、致死性发育不良、硫胺素响应性巨幼细胞性贫血伴有糖尿病和感音神经性耳聋、甲状腺疾病、图雷特氏综合征(Tourette's Syndrome)、特雷彻-柯林斯综合征、三重X综合征、结节性硬化症、特纳综合征、Usher综合征、不定性卟啉症、希佩尔-林道病、瓦登伯革氏综合征(Waardenburgsyndrome)、Weissenbacher-Zweymüller综合征、威尔逊病、Wolf-Hirschhorn综合征、著色性干皮症、X-连锁严重联合免疫缺陷、X-连锁铁粒幼细胞性贫血或X-连锁脊髓-延髓肌萎缩。
如本文使用的，第二疗法可以包括化学疗法、放射、骨髓移植、免疫疗法、激素疗法、冷冻疗法、外科手术(诸如肿瘤切除)或其任何组合。第二疗法可以包括施用药物组合物，诸如小分子。第二疗法可以包括施用药物组合物，诸如一种或更多种抗病毒药，例如干扰素、奥司他韦、利巴韦林、达卡他韦、索菲布韦、维帕他韦、伏西拉普韦(voxilapresvir)、瑞德西韦、吲哚美辛(indomethacin)或其任何组合。第二疗法可以包括施用药物组合物，诸如一种或更多种抗生素。第二疗法可以包括施用肌肉松弛剂、抗抑郁剂、类固醇、阿片类药物、基于大麻的治疗剂、对乙酰氨基酚、非类固醇抗炎剂、神经病理剂、大麻、孕激素、孕酮或其任何组合。神经病理剂可包括加巴喷丁。非类固醇抗炎剂可包括萘普生、布洛芬、COX-2抑制剂或其任何组合。第二疗法可以包括施用生物剂、细胞疗法、再生药物疗法、组织工程方法、干细胞移植或其任何组合。第二疗法可以包括医学程序。医学程序可以包括硬膜外注射(诸如类固醇注射)、针灸、运动、物理疗法、超声、外科疗法、脊椎按摩操作、整骨操作、化学溶核或其任何组合。第二疗法可以包括使用呼吸辅助设备或呼吸机。第二疗法可以包括施用再生疗法或免疫疗法，诸如蛋白、干细胞、脐血细胞、脐带组织、组织或其任何组合。第二疗法可以包括生物仿制药(biosimilar)。
如本文使用的术语“片段”可以是序列的一部分，可以是比全长序列短的子集。片段可以是基因的一部分。片段可以是肽或蛋白的一部分。片段可以是氨基酸序列的一部分。片段可以是寡核苷酸序列的一部分。片段的长度可以是小于约20个、30个、40个、50个氨基酸。片段的长度可以是小于约2个、5个、10个、20个、30个、40个、50个寡核苷酸。
如本文描述的组合物和方法包括鉴定引导链的突变或修饰的方法，该突变或修饰可通过改善的对一个或更多个靶的敲低(至少部分或完全)来改善治疗效力。本文还描述了对过客链的序列修饰。本文还描述了对一个或更多个两条链的化学修饰。如本文描述的构建体或模拟物可包含引导链中的一个或更多个序列改变，该序列改变可抑制对多于一种mRNA靶中优选mRNA靶的靶识别。这种构建体或模拟物可增强稳定性，至少部分地减少或消除免疫刺激，改善药理学活性，保留一种或更多种多靶向效果，或其任何组合。
如本文描述的组合物和方法可以包括与可比的miR(诸如miR-30、miR-29、miR-26、miR-27、miR-101、miR-145、miR-205、miR-338和miR-375)相比具有改善的稳定性、安全性和/或活性的miR模拟物(诸如miR-30模拟物、miR-29模拟物、miR-26模拟物、miR-27模拟物、miR-101模拟物、miR-145模拟物、miR-205模拟物、miR-338模拟物和miR-375模拟物)。
可以使用智能设计、一种或更多种化学修饰模式的测试、过客链中可改善模拟互补性或改变模拟双链体结构的序列突变以及可以产生活性益处的对引导链的序列突变来鉴定模拟物。在一些情况下，引导链中的序列突变可以超越使用天然引导序列而使用模拟物。例如，序列改变可以针对优选的下游靶(诸如临床靶)定制引导链的活性。
由于miRNA基于序列相似性分组为家族，突变序列可以是“非-天然的”或“人工的”miRNA家族成员。
微RNA(miRNA)的miR-30家族在人类中可包含5个家族成员(即miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d和miR-30e)。这个家族可以在几种类型的癌症中具有肿瘤抑制活性，并抑制纤维化、疤痕形成或两者。例如，miR-30下调可能与复发性头颈癌患者的不良结果相联系。因此，miR-30家族是miRNA替代疗法的理想候选。然而，将miR-30模拟物开发成新的药物候选可能包括克服治疗应用的药理学障碍，诸如：(i)容易被生物体液中可见的多种核酸酶降解的固有的代谢不稳定性；(ii)包含可能是触发可导致体内毒性的固有免疫应答的细胞受体(即TLR家族、RIG-I样受体和其他RNA传感器)的天然配体的序列模式(例如CpG基序)和结构；(iii)在效用和/或效力方面药理学较差，因为天然miRNA序列可能不是固有地针对模拟物优化的；(iv)体内递送至病变的组织或靶组织；(v)或其任何组合。
微RNA(miRNA)的miR-29家族在人类中可包含4个家族成员(即miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2和miR-29c)。这个家族可以在几种类型的癌症中具有肿瘤抑制活性，抗病毒活性，并抑制纤维化、疤痕形成或两者。例如，miR-29过表达可能与降低细胞培养中的丙型肝炎病毒丰度相联系。因此，miR-29家族是miRNA替代疗法的理想候选。然而，将miR-29模拟物开发成新的药物候选可能包括克服治疗应用的药理学障碍，诸如：(i)容易被生物体液中可见的多种核酸酶降解的固有的代谢不稳定性；(ii)包含可能是触发可导致体内毒性的固有免疫应答的细胞受体(即TLR家族、RIG-I样受体和其他RNA传感器)的天然配体的序列模式(例如CpG基序)和结构；(iii)在效用和/或效力方面药理学较差，因为天然miRNA序列可能不是固有地针对模拟物优化的；(iv)体内递送至病变的组织或靶组织；(v)或其任何组合。
此外，高程度化学修饰和/或实施基于siRNA设计的常规修饰模式可能经常通过降低其沉默多于一种转录物的多效作用而对miRNA模拟物活性产生负面影响。化学修饰可以改变其他天然下游靶的序列识别。虽然对于通过降低siRNA的“类miRNA”脱靶效应来改善siRNA对其预期靶的特异性是期望的，但对于为故意靶向多于一种转录物而开发的miRNA模拟物来说，它可能是不期望的。
寡核苷酸可以包含糖修饰。寡核苷酸可以包含多于一个糖修饰。糖修饰可以包括葡萄糖或其衍生物。糖修饰可以包括核糖或脱氧核糖。糖修饰可以包括单糖、二糖、三糖或其任何组合。
寡核苷酸可以包含化学修饰。寡核苷酸可以包含多于一个化学修饰。寡核苷酸可以在寡核苷酸的一部分(诸如末端)内包含多于一个化学修饰。化学修饰可以包括甲基基团、氟基团、甲氧基乙基基团、乙基基团、酰胺基基团、酯基基团，任何这些基团中的超过一种，或其任何组合。化学修饰可以包括1-甲基-腺苷、1-甲基-鸟苷、1-甲基-肌苷、2,2-二甲基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧鸟苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷、2-氨基嘌呤-核糖苷、2'-阿糖腺苷、2'-阿糖胞苷、2'-阿糖尿苷、2'-叠氮-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮-2'-脱氧胞苷、2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷、2'-叠氮-2'-脱氧尿苷、2-氯腺苷、2'-氟-2'-脱氧腺苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、2'-氟胸苷、2-甲基-腺苷、2-甲基-鸟苷、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基-腺苷、2'-O-甲基-2-氨基腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-O-甲基-2'-脱氧鸟苷、2'-O-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基肌苷、2'-O-甲基假尿苷、2-硫胞苷、2-硫代-胞苷、3-甲基-胞苷、4-乙酰基-胞苷、4-硫尿苷、5-(羧基羟甲基)-尿苷、5,6-二氢尿苷、5-氨基烯丙基胞苷、5-氨基烯丙基-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-氯-阿糖-胞嘧啶、5-氟-尿苷、5-碘尿苷、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、6-氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、6-氯-7-脱氮-鸟苷、6-氯嘌呤核糖苷、6-巯基-鸟苷、6-甲基-巯基嘌呤-核糖苷、7-脱氮-2'-脱氧-鸟苷、7-脱氮腺苷、7-甲基-鸟苷、8-氮杂腺苷、8-溴-腺苷、8-溴-鸟苷、8-巯基-鸟苷、8-氧代鸟苷、苯并咪唑-核糖苷、β-D-甘露糖基-奎苷(queosine)、二氢-尿苷、肌苷、N1-甲基腺苷、N6-([6-氨基己基]氨基甲酰基甲基)-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N7-甲基-黄嘌呤核苷、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、嘌呤霉素、奎苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、wybutoxosine、黄嘌呤核苷、木糖-腺苷(xylo-adenosine)或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括相对于天然碱基或糖的化学修饰，诸如对工程化寡核苷酸的碱基或糖的化学修饰。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含超过一个化学修饰，诸如多于一个化学修饰。工程化寡核苷酸的部分碱基或部分糖可包含一个或更多个化学修饰。在一些情况下，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的工程化寡核苷酸中的碱基或糖可以被化学修饰。
在一些情况下，核糖核苷酸(或在一些情况下为脱氧核苷酸)可以通过如本文描述的化学修饰来修饰，诸如碱基组分、糖(核糖)组分、形成工程化寡核苷酸主链的磷酸酯组分或其任何组合。
在一些情况下，可以对工程化寡核苷酸进行工程化或修饰，以增加对多于一种RNA序列中的RNA序列的特异性。可以对工程化寡核苷酸进行修饰，以显著增加对多于一种RNA序列中的RNA序列的特异性。增加的特异性可以与可以未被工程化的可比寡核苷酸进行比较，或可以与可以以不同方式工程化或修饰的可比寡核苷酸进行比较。与可比寡核苷酸相比，特异性可增加至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。可以对工程化寡核苷酸进行工程化或修饰以增加第一RNA序列与第二RNA序列相比的特异性。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以对编码基因(诸如牵涉本文描述的疾病或状况的基因，诸如癌基因)的RNA序列是选择性的。在一些情况下，工程化的寡核苷酸可以对多于一个RNA序列中的编码癌基因的RNA序列是选择性的。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包括对多于一个RNA序列中编码基因(诸如癌基因)的RNA序列的增加的特异性。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以对多于一个RNA序列中编码ITGA6、SERPINE1、EGFR或其任何组合的RNA序列是选择性的。
如本文所用的化学修饰的核苷酸可以是鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷或胞嘧啶，包括但不暗示任何限制，已经例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等发生化学改变的任何天然存在的或非天然存在的鸟苷、尿苷、腺苷、胸苷或胞苷，包括1-甲基-腺苷、1-甲基-鸟苷、1-甲基-肌苷、2,2-二甲基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧鸟苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷、2-氨基嘌呤-核糖苷、2'-阿糖腺苷、2'-阿糖胞苷、2'-阿糖尿苷、2'-叠氮-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮-2'-脱氧胞苷、2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷、2'-叠氮-2'-脱氧尿苷、2-氯腺苷、2'-氟-2'-脱氧腺苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、2'-氟胸苷、2-甲基-腺苷、2-甲基-鸟苷、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基-腺苷、2'-O-甲基-2-氨基腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧腺苷、2'-O-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-O-甲基-2'-脱氧鸟苷、2'-O-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基肌苷、2'-O-甲基假尿苷、2-硫胞苷、2-硫代-胞苷、3-甲基-胞苷、4-乙酰基-胞苷、4-硫尿苷、5-(羧基羟甲基)-尿苷、5,6-二氢尿苷、5-氨基烯丙基胞苷、5-氨基烯丙基-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-氯-阿糖-胞嘧啶、5-氟-尿苷、5-碘尿苷、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷、6-氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、6-氯-7-脱氮-鸟苷、6-氯嘌呤核糖苷、6-巯基-鸟苷、6-甲基-巯基嘌呤-核糖苷、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、7-脱氮腺苷、7-甲基-鸟苷、8-氮杂腺苷、8-溴-腺苷、8-溴-鸟苷、8-巯基-鸟苷、8-氧代鸟苷、苯并咪唑-核糖苷、β-D-甘露糖基-奎苷、二氢尿苷、肌苷、N1-甲基腺苷、N6-([6-氨基己基]氨基甲酰基甲基)-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N7-甲基-黄嘌呤核苷、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、嘌呤霉素、奎苷、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、wybutoxosine、黄嘌呤核苷或木糖-腺苷。这些变体的制备对于本领域技术人员是已知的，例如根据美国专利US 4,373,071、US4,401,796、US 4,415,732、US 4,458,066、US 4,500,707、US 4,668,777、US 4,973,679、US5,047,524、US 5,132,418、US 5,153,319、US 5,262,530或5,700,642。
在一些情况下，工程化核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，诸如2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷-5'-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖苷-5'-三磷酸、2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸、4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核糖苷-5'-三磷酸、7-脱氮腺苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄嘌呤-5'-三磷酸或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸诸如吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，诸如5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代zebularine、2-硫代zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷，或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，诸如2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-甲氧基腺嘌呤或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，诸如肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，诸如6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘代-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含化学修饰的核苷酸，该核苷酸可以在2'位置进行化学修饰。化学修饰的寡核苷酸在2'碳原子处可包含取代基，其中取代基可包括卤素、烷氧基基团、氢、芳氧基基团、氨基基团或氨基烷氧基基团，诸如2'-氢(2'-脱氧基)、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基基乙基、2'-氟、2'甲氧基乙基、2'-氟、锁核酸或其任何组合。
另一化学修饰(诸如涉及核苷酸2'位置的化学修饰)可以是锁核酸(LNA)核苷酸、乙烯桥接核酸(ENA)核苷酸、(S)约束的乙基cEt核苷酸、桥接核酸(BNA)或其任何组合。主链修饰可以将修饰的核苷酸的糖锁定为优选的northern构象。在一些情况下，在工程化寡核苷酸的靶序列中存在该类型的修饰可以允许更强和更快地将靶向序列结合到靶位点。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可包含至少一个化学修饰的核苷酸，其中可掺入到工程化寡核苷酸中的磷酸酯主链可被修饰。主链的一个或更多个磷酸酯基团可以被修饰，例如，通过用不同的取代基替换一个或更多个氧原子。此外，修饰的核苷酸可以包括用如本文描述的修饰的磷酸完全替代未修饰的磷酸部分。修饰的磷酸基团的实例可以包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、硼酸磷酸、硼酸磷酸酯、膦酸氢酯(hydrogenphosphonate)、磷酰胺酯(phosphoroamidate)、烷基膦酸酯(alkyl phosphonate)、芳基膦酸酯或磷酸三酯。磷酸接头还可以通过用氮(桥接磷酰胺酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接氧来修饰。
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含糖修饰。糖修饰可以包括缀合物，诸如接头。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含一个或更多个接头基团。工程化寡核苷酸可以连接到抗体、蛋白质、脂质、适配体、小分子、药物或其任何组合。接头可以形成共价键。工程化寡核苷酸可以通过接头连接到一个或更多个工程化寡核苷酸，诸如第二工程化寡核苷酸。在一些情况下，接头可以是可裂解接头。在一些情况下，接头可以包括叠氮接头。工程化寡核苷酸可以包含用聚糖糖基化的核苷酸碱基。在一些情况下，工程化寡核苷酸可以包含无碱基位点，诸如缺乏有机碱基的核苷酸。在一些情况下，无碱基核苷酸可以包含如本文描述的化学修饰，诸如在核糖的2'位置。在一些情况下，核糖的2'C原子可以被取代基取代，取代基诸如卤素、烷氧基基团、氢、芳氧基基团、氨基基团或氨基烷氧基基团，在一些情况下可以被2'-氢(2'-脱氧基)、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基或2'-氟取代。在一些情况下，无碱基位点核苷酸可以包括结构1A或1B：
Figure BDA0003979487010000831
在一些情况下，工程化寡核苷酸可以通过添加“5'-CAP”结构来修饰。5'-帽可以是实体，诸如修饰的核苷酸实体，其可以在成熟的miRNA的5'-末端“加帽”。5'-帽通常可以由修饰的核苷酸形成，特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。在一些情况下，5'-帽可以通过5'-5'-三磷酸酯连接连接到工程化寡核苷酸的5'-末端。5'-帽可以甲基化，例如m7GpppN，其中N可以是携带5'-帽的核酸的末端5'核苷酸，诸如RNA的5'-末端。5'-帽结构可以包括甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-D-呋喃赤糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-无水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、苏-呋喃戊糖基核苷酸、无环3',4'-开环核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反向的核苷酸部分、3'-3'-反向的无碱基部分、3'-2'-反向的核苷酸部分、3'-2'-反向的无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸、3'-磷酰胺酯、己基磷酸、氨基己基磷酸、3'-磷酸、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸或桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。在一些情况下，修饰的5'-CAP结构可以包括CAP1(m7G邻近核苷酸的核糖甲基化)、CAP2(m7G下游第2个核苷酸的核糖甲基化)、CAP3(m7G下游第3个核苷酸的核糖甲基化)、CAP4(m7G下游第4个核苷酸的核糖甲基化)、ARCA(抗反向CAP类似物)、修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷或2-叠氮-鸟苷。
如本文使用的术语“表观遗传标志物”可以是核酸碱基的任何共价修饰。在一些情况下，共价修饰可以包括向核酸序列的一个或更多个碱基添加甲基基团、羟甲基基团、碳原子、氧原子或其任何组合。在一些情况下，共价修饰可以包括改变与核酸序列相关的分子的氧化态，诸如氧原子或其组合。共价修饰可以发生在任何碱基处，诸如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或其任何组合。在一些情况下，表观遗传修饰可以包括氧化或还原。核酸序列可以包含一种或更多种表观遗传修饰的碱基。表观遗传修饰的碱基可以包括任何碱基，诸如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。表观遗传修饰的碱基可以包括甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基或包含羧酸的碱基或其盐。表观遗传修饰的碱基可以包括5-甲基化碱基，诸如5-甲基化胞嘧啶(5-mC)。表观遗传修饰的碱基可以包括5-羟甲基化碱基，诸如5-羟甲基化胞嘧啶(5-hmC)。表观遗传修饰的碱基可以包括5-甲酰化碱基，诸如5-甲酰化胞嘧啶(5-fC)。表观遗传修饰的碱基可以包括5-羧基化碱基或其盐，诸如5-羧基化胞嘧啶(5-caC)。在一些情况下，表观遗传修饰的碱基可以包括甲基转移酶指导的活化基团的转移(mTAG)。
表观遗传修饰的碱基可以包括一种或更多种嘌呤碱基(诸如结构1)或一种或更多种嘧啶碱基(诸如结构2)。表观遗传修饰可以发生在任何位置中的一个或更多个位置。例如，表观遗传修饰可以发生在嘌呤的一个或更多个位置，包括如结构1中示出的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9。在一些情况下，表观遗传修饰可以发生在嘧啶的一个或更多个位置，包括如结构2中示出的位置1、2、3、4、5、6。
Figure BDA0003979487010000851
Figure BDA0003979487010000852
核酸序列可以包含表观遗传修饰的碱基。核酸序列可以包含多于一个表观遗传修饰的碱基。核酸序列可包含位于CG位点、CpG岛或其组合内的表观遗传修饰碱基。核酸序列可以包含不同的表观遗传修饰碱基，诸如甲基化碱基、羟甲基化碱基、甲酰化碱基、含羧酸碱基或其盐、多于一个这些中任何、或其任何组合。
在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐，当化学修饰时，可以是下式：如表7示出的，引导模式1、引导模式2或引导模式3。
表7-化学修饰模式
模式 序列(5′-3′)
引导模式1 (N)a(mN)b(N)cNN
引导模式2 (N)a(mN)b(N)csfNsmN
引导模式3 (fNmN)h(mN)i(fNmN)jsfNsmN
过客模式1 CAP–mNmNmN(N)kmNmNmN
N可以是任何天然或非天然核苷酸；mN可以是2'-O-甲基修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；s可以是硫代磷酸酯修饰的主链；fN可以是2'氟修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；CAP可以是5'-末端甲基基团(5'-O甲基)或烷基氨基基团，诸如氨基-碳6链(5'-氨基C6)；a可以是8-10；b可以是7-10；c可以是2-4；h可以是5-7；i可以是0或1；j可以是3-4；并且k可以是12-19。
工程化寡核苷酸或其盐，当化学修饰时，可与SEQ ID NO:52-89、127-154、184-201、205-222、225-233、235-243、264-443、445-453、455-463、620、644-825、835-837和846-899中的任何一个具有至少90％的序列同一性。
在一些情况下，载体可用于体外环境、体内环境或其任何组合中的miR递送。在一些情况下，载体可以靶向但可不限于哺乳动物，或特定器官，或特定细胞，或其任何组合。载体可以包含本文描述的任何组合物。在一些情况下，载体可以包含超过一个组合物，诸如miR-30家族构建体和第二miR-29家族构建体，或miR-30家族构建体和第二miR-30家族构建体，或miR-29家族构建体和第二miR-29家族构建体，或其任何组合。在一些情况下，载体可以包括脂质体、纳米颗粒或其任何组合。脂质体可以包括但可不限于单层脂质体、多层脂质体、古细菌脂质体(archaeosome)、类脂质体(niosome)、新星体(novasome)、隐核体(cryptosome)、乳化体、囊泡体，或这些中任一个的衍生物，或其任何组合。纳米颗粒可以包括但可不限于生物聚合物纳米颗粒、海藻酸盐纳米颗粒、黄原胶纳米颗粒、纤维素纳米颗粒、树状大分子、聚合物胶束、多聚复合的无机纳米颗粒、纳米晶体、金属纳米颗粒、量子点、蛋白质纳米颗粒、多糖纳米颗粒、或这些中任一个的衍生物，或其任何组合。在一些情况下，载体可以是RNA病毒载体，其可以包括但可不限于逆转录病毒、慢病毒、冠状病毒、α病毒、黄病毒、弹状病毒、麻疹病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒或小核糖核酸病毒或这些中任一病毒的部分，或这些中任一病毒的片段，或其任何组合。在一些情况下，载体可以是DNA病毒载体，其可以包括但可不限于腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒、杂合腺病毒系统、嗜肝DNA病毒肝炎(hepadnavirus)、细小病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、疱疹病毒、痘病毒、这些中任一病毒的部分、或这些中任一病毒的片段或其任何组合。
本文描述的组合物和方法可以包括miR模拟物。这样的miR模拟物可以包含一个或更多个序列修饰、一个或更多个化学修饰或其组合，其可以：增强miR模拟物的稳定性；基本上降低或消除免疫刺激(诸如通过固有免疫应答)；改善miR模拟物的药理活性；保留miR模拟物的多靶向效果；或其任何组合。在引导链中包含序列改变的工程化miR家族成员可以将靶识别偏向于两个或更多个临床靶。
如本文使用的，“生物仿制药”或“生物仿制药产品”可以指基于其与FDA批准的生物产品(称为参考产品)基本相似并且在安全性和有效性方面与参考产品没有临床上有意义的差异的表现而获得许可的生物产品。在生物仿制药产品中，只有在临床非活性组分中的微小差异可以是可允许的。已批准的参考产品/生物药物的“生物仿制药”是指基于来源于以下的数据与参考产品相似的生物产品：(a)证明尽管在临床非活性组分中存在微小差异，但该生物产品与参考产品高度相似的分析研究；(b)动物研究(包括毒性评估)；和/或(c)足以证明在一种或更多种适当的使用条件(参考产品已获得许可并打算使用的，以及该生物产品正在申请许可)下的安全性、纯度和效用的一项或更多项临床研究(包括免疫原性和药代动力学或药效学的评估)。在一些实施方案中，生物仿制药生物产品和参考产品对于拟议标签中规定的、推荐的或建议的一种或更多种使用条件利用相同的一种或更多种作用机制，但只限于参考产品已知的一种或更多种作用机制的程度。在一些实施方案中，在为生物产品拟议的标签中规定的、推荐的或建议的一种或更多种使用条件先前已被批准用于参考产品。在一些实施方案中，生物产品的施用途径、剂型和/或强度与参考产品的那些相同。在一些实施方案中，制造、加工、包装或保存生物产品的设施可以满足设计用于确保生物产品持续安全、纯净和有效的标准。参考产品可以在美国、欧洲或日本中的至少一个获得批准。在一些实施方案中，施用生物仿制药产品的人类受试者的响应率可以是施用参考产品的人类受试者的响应率的50％-150％。例如，施用生物仿制药产品的人类受试者的响应率可以是施用参考产品的人类受试者的响应率的50％-100％、50％-110％、50％-120％、50％-130％、50％-140％、50％-150％、60％-100％、60％-110％、60％-120％、60％-130％、60％-140％、60％-150％、70％-100％、70％-110％、70％-120％、70％-130％、70％-140％、70％-150％、80％-100％、80％-110％、80％-120％、80％-130％、80％-140％、80％-150％、90％-100％、90％-110％、90％-120％、90％-130％、90％-140％、90％-150％、100％-110％、100％-120％、100％-130％、100％-140％、100％-150％、110％-120％、110％-130％、110％-140％、110％-150％、120％-130％、120％-140％、120％-150％、130％-140％、130％-150％或140％-150％。在一些实施方案中，生物仿制药产品和参考产品对于拟议标签中规定的、推荐的或建议的一种或更多种使用条件可以利用相同的一种或更多种作用机制，但只限于参考产品已知的一种或更多种机制的程度。为了获得生物仿制药药物的批准，可能需要进行结构、功能、动物毒性、药代动力学、药效学、免疫原性、临床安全性和有效性的研究和数据。生物仿制药也可以称为后续生物制剂(follow-on biologic)或随后进入生物制剂(subsequent entry biologic)。在一些实施方案中，生物仿制药产品可以基本上与参考产品相似，尽管在临床非活性组分中存在微小差异。
如本文使用的，“可互换生物产品”可指FDA批准的参考产品的生物仿制药，并可满足可互换性的附加标准。在一些实施方案中，例如，可互换的生物产品可以在任何给定的受试者中产生与参考产品相同的临床结果。在一些实施方案中，可互换产品可包含相同量的相同活性成分，可具有可比的药代动力学特性，可具有相同的临床显著特征，并可以以与参考化合物相同的方式施用。在一些实施方案中，可互换产品可以是满足可互换性附加标准的生物仿制药产品。在一些实施方案中，在参考产品的所有许可使用条件下，可互换产品可以产生与参考产品相同的临床结果。在一些实施方案中，药剂师可以用可互换的产品取代参考产品，而不需要开处参考产品的健康保健提供者的干预。在一些实施方案中，当向个体施用超过一次时，在生物产品和参考产品之间交替或切换使用的安全性或降低效力的风险不大于在没有这种交替或切换的情况下使用参考产品的风险。在一些实施方案中，可互换产品可以是监管机构批准的产品。在一些实施方案中，施用可互换产品的人类受试者的响应率可以是施用参考产品的人类受试者的响应率的80％-120％。例如，施用可互换产品的人类受试者的响应率可以是施用参考产品的人类受试者的响应率的80％-100％、80％-110％、80％-120％、90％-100％、90％-110％、90％-120％、100％-110％、100％-120％或110％-120。
在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以由癌基因编码。癌基因可包括ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、AKT3、ATF1、BCL11A、BCL2、BCL3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、BBIT3、BBX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ERBB3、E2F1、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGR2、FUS、GOLGA5、GOPC、HMGA1、HMGA2、HRAS、IRF4、ITGA6、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SERPINE1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、TLX1、TPR、USP6或其任何组合。在一些情况下，癌基因可包括ITGA6、BCL2、DEK、PLAG1、SERPINE1、MYCN、LMO2、PIM1、EGFR、IRS1、NT5E、EGFR、GLDC、SOCS1、STAT1、LOX、PDGFRB、WNT5A、CD80、CCNA1、THBS2、IGF1R、AFAP1L2、CTHRC1、MET、FAP、SERPINE1、IL1A、GJA1、MYBL2、CDK6、ATG9A、SETDB1或其任何组合。在一些情况下，如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐可以对多于一个RNA序列中的一个或更多个特定RNA序列是选择性的。例如，相对于多于一个其他RNA序列，如本文描述的工程化寡核苷酸或其盐对ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、ATF1、BCL11A、BCL2、BCL3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、BBIT3、BBX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGR2、FUS、GOLGA5、GOPC、HMGA1、HMGA2、HRAS、IRF4、ITGA6、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SERPINE1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、TLX1、TPR、USP6中的一个或更多个可以是选择性的。
RNA序列的一部分可以是RNA序列的至少约：70％、75％、80％、85％、90％、95％的碱基。
在一些情况下，疾病或状况可以包括纤维化。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可由胶原超家族基因、血小板来源的生长因子基因、TGF-β信号传导基因、胶原重塑基因、细胞外基质重塑基因、Wnt信号传导基因、肝癌来源的生长因子(HDGF)信号传导基因或其任何组合编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可由COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1或其任何组合编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可由血小板来源的生长因子基因编码，诸如PDGFB、PDGFC或PDGFRB。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以由TGF-β信号传导基因(诸如WISP1或TGFB2)编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以由胶原重塑基因(诸如LOXL2)编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可由细胞外基质重塑基因(诸如COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1、LOXL2或弹性蛋白)编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以由Wnt信号传导基因(诸如WISP1)编码。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以由HDGF信号传导基因(诸如HDGF)编码。一部分可以是RNA序列上的至少约：60％、70％、80％、90％、95％的碱基。
在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约50个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约40个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约30个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约25个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约60个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约80个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约100个核苷酸。在一些情况下，工程化寡核苷酸或其盐的长度可为约5个至约200个核苷酸。
在一些情况下，与将等量的其他方面可比的寡核苷酸与mRNA序列接触相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可产生由mRNA序列编码的多肽的低至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍的表达。较低表达可以是低约1.2倍到约10倍的表达。
在一些情况下，与将等量的其他方面可比的寡核苷酸与mRNA序列接触相比，工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时可产生由mRNA序列编码的多肽的低至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍的活性。较低活性可以是低约1.2倍到约10倍的活性。
在一些情况下，当工程化寡核苷酸或其盐可以在约约21摄氏度至约25摄氏度(诸如约：21摄氏度、22摄氏度、23摄氏度、24摄氏度、25摄氏度)和约45％至约55％(诸如约：45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％)的相对大气湿度，储存在放置在房间中的封闭容器中至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月的时间段时，工程化寡核苷酸或其盐的初始量的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％被保持。在一些情况下，时间段可以是约1个月至约1年。在一些情况下，时间段可以是约1个月至约2年。在一些情况下，时间段可以是约1个月至约6个月。在一些情况下，时间段可以是约1个月至约3年。在一些情况下，时间段可以是约1个月至约9个月。
疾病或状况可包括病毒感染，诸如SARS病毒感染、Covid-19病毒感染或HCV基因型1感染。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以在冠状病毒基因组(例如SARS-CoV、SARS-CoV2、MERS-CoV或CoV-HKU1基因组)中编码。该RNA序列可包括与SEQ ID NO:500-531、829-831(表6)、SEQ ID NO:474-499、826-828(表6)、SEQ ID NO:532-554(表6)或SEQ ID NO:555-586(表6)中列出的序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。在一些情况下，RNA序列可以包括与SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。该RNA序列可包含具有与SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的至少约5个、10个、15个、20个连续碱基。在一些情况下，RNA序列的至少一部分可以在HCV基因型1基因组中编码。该RNA序列可包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588或SEQ ID NO:589的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。该RNA序列可包含具有与SEQID NO:587、SEQ ID NO:588或SEQ ID NO:589的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的至少约5个、10个、15个、20个连续碱基。在一些情况下，RNA序列的至少一部分在SARS-CoV-2病毒基因组中编码。该RNA序列可包括与SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513或SEQ ID NO:518的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。该RNA序列可包含具有与SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513或SEQ ID NO:518的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性的至少约5个、10个、15个、20个连续碱基。
工程化寡核苷酸或其盐可包括与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949或其任何组合中的任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。工程化寡核苷酸或其盐可包含具有与SEQ ID NO:1-5、12-14、19-20、24-25、28、30、32、34、36、38-45、52-89、100-154、184-201、205-222、225-233、235-243、245-443、445-453、455-463、465、620、624-825、835-837、840-899和901-949或其任何组合中的任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性的至少约5个、10个、15个、20个连续碱基。
多肽表达的改变，诸如更低倍或更高倍的表达，可以通过如本文描述的方法来确定。例如，工程化寡核苷酸或其盐可以与mRNA序列接触，并与等量的细胞中天然存在的miR-29或miR-30寡核苷酸的接触相比较。表达的改变可由以下确定：(a)将工程化寡核苷酸转染到包含mRNA序列的第一分离的细胞中，(b)将miR-29或miR-30寡核苷酸转染到包含mRNA序列的第二分离的细胞中，和(c)测量在第一分离的细胞和分离的第二细胞中表达的多肽的量。
核酸构建体可含有包含工程化寡核苷酸的第一链和包含与工程化寡核苷酸的至少一部分互补的序列的第二链。第二链可以与第一链的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多互补。第二链可以与第一链的至少约5个、10个、15个或20个连续碱基互补。核酸构建体可以包含末端突出端，诸如5'末端或3'末端。第一链、第二链或其组合可包含一个或更多个化学修饰。第一链、第二链或其组合的碱基的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％可包含化学修饰。第一链、第二链或其组合可包含一个或更多个糖修饰。第一链、第二链或其组合的碱基的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％可包含糖修饰。糖修饰可以包括糖基化碱基。在一些情况下，核苷酸碱基可以用聚糖糖基化。第一链、第二链或其组合可以包含具有化学修饰和糖修饰的碱基的组合。
在一些情况下，如本文描述的工程化过客寡核苷酸可以包括与SEQ ID NO:6-11、15-18、21-23、26-27、29、31、33、35、37、46-51、90-99、155-183、202-204、223-224、234、244、444、454、464、466、838-839和900或其任何组合中的任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性。如本文描述工程化过客寡核苷酸可包含具有与SEQID NO:6-11、15-18、21-23、26-27、29、31、33、35、37、46-51、90-99、155-183、202-204、223-224、234、244、444、454、464、466、838-839和900或其任何组合中的任何一个的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的序列同一性的至少约5个、10个、15个、20个连续碱基。
在一些情况下，第二链可以包含化学修饰的核苷酸碱基。在一些情况下，第二链的碱基的子集，诸如约1％至约5％的碱基、约1％至约10％的碱基、约1％至约20％的碱基、约1％至约30％的碱基、约1％至约40％的碱基、约1％至约50％的碱基、约1％至约60％的碱基、约1％至约70％的碱基、约1％至约80％的碱基、或约1％至约90％的碱基或更多，可以被化学修饰。
如本文描述的第二链可以以与如本文描述的对工程化寡核苷酸相同的方式进行化学修饰。在一些情况下，第二链，当化学修饰时，可以具有与SEQ ID NO:51、95-99中的任何一个的至少90％的序列同一性。
可以采用载体递送工程化寡核苷酸、核酸构建体或其任何组合。载体可以包含DNA，诸如双链DNA或单链DNA。载体可以包含RNA。在一些情况下，RNA可以包含碱基修饰。载体可以包括重组载体。载体可以是从天然存在的载体修饰而来的载体。载体可以包括非天然存在的载体的至少一部分。可以利用任何载体。在一些情况下，载体可以包括病毒载体、脂质体、纳米颗粒、外排体、细胞外囊泡或其任何组合。在一些情况下，病毒载体可以包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体、逆转录病毒载体、这些中任一载体的一部分或其任何组合。在一些情况下，纳米颗粒载体可以包括基于聚合物的纳米颗粒、基于氨基脂质的纳米颗粒、金属纳米颗粒(诸如基于金的纳米颗粒)、这些中任一颗粒的一部分或其任何组合。在一些情况下，载体可以包括AAV载体。载体可以被修饰以包含修饰的VP1蛋白(诸如AAV载体被修饰以包含VP1蛋白)。AAV可包括血清型——诸如AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、这些中任一血清型的衍生物或其任何组合。
药物组合物可包含工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或其任何组合。药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。药物组合物可以以单位剂量形式配制。药物组合物可以用单一活性成分配制。药物组合物可以被包封。药物组合物可以配制为液体或为半固体(诸如凝胶)或固体。药物组合物可以在溶液中配制。药物组合物可以配制为可注射的。药物组合物可以配制为皮下植入物。药物组合物可以是可植入的。药物组合物可以配制用于口服递送。
有相应需要的受试者可以因疾病或状况而接受治疗。治疗可以是预先治疗、预防性治疗或防止性治疗。治疗可包括向有相应需要的受试者施用如本文描述的工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物。施用可以包括通过一个或更多个递送途径递送，诸如口服的、耳部的、眼部的、直肠的或其任何组合。施用可以包括通过静脉内注射、肌内注射、鞘内注射、眶内注射、皮下注射或其任何组合的递送。治疗可以包括以单剂量递送的超过一种工程化寡核苷酸。递送可以是同时递送，诸如在单次注射中递送或同时在两个单独的注射中递送的超过一种工程化寡核苷酸。递送可以是顺序的，诸如可以间隔一段时间(诸如分钟、小时、天、周或月)的第一剂和第二剂的递送。
治疗可以包括第二疗法或共疗法。在癌症治疗的情况下，第二疗法可以包括放射、化学疗法、免疫疗法、手术或其任何组合。在治疗病毒感染的情况下，第二疗法可以包括免疫疗法、抗病毒或其任何组合。在治疗纤维化的情况下，第二疗法可以包括生活方式改变、器官移植、氧气疗法、器官康复、药物组合物或其任何组合。第二疗法的施用可以是同时的或顺序的，诸如间隔一段时间，诸如分钟、小时、天、周或月。
在一些情况下，受试者可以先前没有被诊断出患有疾病或状况。在一些情况下，受试者可以被诊断患有疾病或状况。在一些情况下，受试者可以没有接受疾病或状况的明确诊断。在一些情况下，受试者可以先前患有疾病或状况。受试者可以处于缓解中。受试者可以处于发展疾病或状况的风险(诸如至少部分基于先前的状况、生活方式因素、遗传变异或其任何组合)。受试者可以已经接受了诊断测试。诊断测试可以包括成像程序、血细胞计数分析、组织病理学分析、生物标志物分析或其任何组合。在一些情况下，疾病或状况可以是纤维化或相关的状况。在一些情况下，疾病或状况可以是病毒感染，诸如SARS-CoV感染、SARS-CoV2感染、MERS-CoV感染、CoV-HKU1感染、HIV感染、HCV感染或其任何组合。在一些情况下，疾病或状况可以是癌症，诸如头癌、颈癌、皮肤癌、宫颈癌、前列腺癌或其任何组合。
方法可以包括体内或体外递送方法。方法可以包括使细胞(诸如体内细胞)与如本文描述的工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物接触。方法可以包括使细胞，诸如分离的和纯化的细胞(诸如体外细胞)，与如本文描述的工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物接触。方法可以包括使组织，诸如体内组织或分离的体外组织，与如本文描述的工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物接触。
试剂盒可以包含在容器中的工程化寡核苷酸、在容器中的核酸构建体、在容器中的载体、在容器中的药物组合物。试剂盒可以包含在容器中的超过一种的工程化寡核苷酸、在容器中的超过一种的载体、在容器中的超过一种的核酸构建体或在容器中的超过一种的药物组合物。试剂盒可包含多于一个容器，每个容器包含一种或更多种工程化寡核苷酸、或核酸构建体、或载体或药物组合物。试剂盒可以包含赋形剂或稀释剂或缓冲液或液体或凝胶状介质，用于工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物的储存。试剂盒可以包含赋形剂或稀释剂或缓冲剂或液体或凝胶状介质，用于将工程化寡核苷酸、核酸构建体、载体或药物组合物体内递送至受试者。赋形剂或稀释剂或缓冲液或液体或凝胶状介质可以包含在容纳工程化寡核苷酸(或核酸构建体、载体或药物组合物)的容器中，或者容纳在单独的容器中。试剂盒可以包含递送媒介物，诸如注射器或针头。试剂盒可包含用于下游分析的一种或更多种试剂。
参考图1A-图1B，该图示出了天然miR-30引导链和过客链序列和工程化家族成员的实例。图1A示出了在人类中可见的所有天然miR-30家族成员(即miR-30a-e-5p)的序列，它们在HNSCC中可以具有肿瘤抑制活性。与miR-30a-5p相比，不同家族成员之间的序列变异以浅灰色突出显示。第13位的鸟嘌呤碱基(以深灰色突出显示)表示非天然序列添加，所述非天然序列添加包括在药物开发方面可能比天然序列具有益处的工程化家族成员的子集。我们已经在寡核苷酸的子集中实现了这种序列修饰。图1B示出了在人类miR-30a双链体中可见的成熟miR-30a-3p过客链的序列。列出了非天然过客链序列的实例(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:46至51)，其可与引导链组合使用，以部分地创建miR-30a模拟双链体的文库。来自miR-30a-3p的序列中的改变以灰色突出显示。可以实施工程化序列修饰以改变双链体结构和生化特征，包括对核酸酶的稳定性和效用。
参考图2A-图2C，该图示出了引导链与致癌mRNA的3'UTR中同源靶位点相互作用的示意图。图2A示出了可以使用软件RNA hybrid 2.2进行预测的天然miR-30a-5p序列与ITGA6、SERPINE1和EGFR转录物的3'UTR中的靶位点之间的自由能(ΔG)和杂交。图2B示出了在位置13包含‘G’插入的工程化家族G007-30(SEQ ID NO:39)与ITGA6、SERPINE1和EGFR靶位点之间的自由能(ΔG)和杂交。注意，较低的预测自由能和较大的互补性可以推断改善的靶识别。图2C示出了在位置13包含与G007-30中可见的相同‘G’插入的模拟物可以展示改善的对选择的致癌靶的敲低。M30-021和M30-037双链体分别由引导链G039-30(SEQ ID NO:68)和G011-30(SEQ ID NO:55)组成，并包含具有某些化学修饰的天然miR-30a序列。M30-040由工程化引导链G032-30(SEQ ID NO:65)组成并且M30-048由引导链G132-30(SEQ IDNO:88)组成，两者都具有G007-30‘G’插入，但具有不同的化学修饰模式。将UM-SCC-47细胞铺板在6孔板中，并用15nM指定的工程化miR-30模拟物转染72小时。处理后，从孔中收集总RNA，并进行RT-qPCR以确定ITGA6、SERPINE1和EGFR的表达。HPRT1作为内源性归一化对照，并且将表达水平针对阴性对照(Neg Con)转染进行归一化。在每种情况下，具有‘G’插入的M30-040展示出比M30-021和M30-037(天然引导链序列)更大的对靶向癌基因的敲低，并与同样具有‘G’插入的M30-048相比，展示出良好或更大的对靶向癌基因的敲低。
参考图3，该图示出了MTDH 3'UTR中miR-30-5p靶位点的示意图。示出的是包含其编码结构域和其3'UTR内的3个实验验证的miR-30-5p靶位点(以灰色指示)的MTDH mRNA的图示。使用软件RNAhybrid 2.2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)计算天然miR-30a-5p与MTDH靶位点之间的杂交，以及计算的miR-30-5p和所有指定的工程化引导链的自由能(ΔG)。还指示了所有三个靶位点自由能的净和(NET)及其平均ΔG(Avg)。注意，所有人工引导链具有比天然miR-30-5p家族成员更低的计算的净杂交自由能和平均杂交自由能，暗示改善的靶识别。
参考表8，这个表示出了计算的天然和模拟miR-30家族引导链对EGFR、IGF1R、MET和IRS1基因转录物中3'UTR位点的靶识别的自由能需求。指示miR-30模拟物示例性引导链构建体包含G007-30(SEQ ID NO:39)和G064-30(SEQ ID NO:43)，它们已预测了对这些癌基因的改善的碱基配对和更低的G靶向性。
表8：计算的miR-30下游转录物的模拟引导链的靶识别的自由能需求
Figure BDA0003979487010000981
*使用RNAhybrid 2.2计算指定的模拟引导链序列和EGFR(SEQ ID
NO:469)、IGF1R(SEQ ID NO:832)、MET(SEQ ID NO:833)和IRS2
(SEQ ID NO:834)基因转录物的3'UTR中的靶位点之间的自由能(Δ
G)。较低的预测自由能(ΔG)暗示改善的靶识别。
参考图4A-图4D，该图示出了杂交形成新颖的miR-30-5p模拟物的工程化寡核苷酸可以在癌细胞系中具有同等或改善的抗肿瘤活性。图4A示出了将UM-SCC-1、UM-SCC-47和UM-SCC-109细胞铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用15nM模拟物转染持续5天。处理后，通过XTT测定评估细胞活力。所有数据代表相对于在不存在模拟物的情况下处理的细胞(指定为100％活力)的平均值±SEM。所有模拟物都可以具有独特的化学修饰模式，并可以具有修饰的过客链中的一条。基于包含miR-30a-5p(天然的)或miR-G-30-5p衍生物(工程化的)的引导序列来分离模拟物。每种模拟物的抗肿瘤活性可以是降低细胞活力的统计学上(P<0.05)的改善，或等同于每个细胞系中的天然miR-30a双链体。图4B示出了在经遗传工程改造以在其3'非翻译区(UTR)内过表达包含癌症相关miR-30靶位点的萤光素酶报告物的UM-SCC-1亚系(UM-SCC-1luc)中处理后的萤光素酶活性。将UM-SCC-1luc细胞铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用15nM模拟物转染细胞3天，然后进行细胞裂解和萤光素酶测定。图4C显示了天然miR-30a和示例工程化模拟物M30-043和M30-046在具有不同遗传背景的另外细胞系中的抗肿瘤活性。将指定的癌细胞系铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用25nM模拟物转染持续5天。处理后，通过XTT测定评估细胞活力。指示了与Neg Con处理相比的统计学显著性(P<0.01)。图4D显示了一组工程化miR-30模拟物在具有不同组织学和遗传背景的另外的癌细胞系中的进一步抗肿瘤活性。将指定的癌细胞系铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用25nM模拟物转染持续5天。处理后，通过XTT测定评估细胞活力。指示了与Neg Con处理相比的统计学显著性(P<0.01)。所有数据代表了来自最少三个独立实验的平均±SEM。
参考图5A-图5B，该图示出了工程化模拟双链体的化学修饰和结构修饰可以改善引导链和双链体对生物核酸酶的稳定性。图5A示出了解析核酸标志物(M)和包含模拟双链体、引导链和降解片段(≤n-1)的样品的尿素-PAGE的实例。图5B示出了工程化的10uM miR-30-5p模拟物在10％人类血清中于37℃孵育指定的时间长度。在每个时间点的双链体稳定性通过变性尿素-PAGE可视化。一个例外的实例显示，M30-040中单核苷酸内部凸起(bulge)的去除使M30-044模拟双链体对生物核酸酶的稳定性达到7天(168hr)。
参考图6A-图6B，该图示出了模拟物序列和结构的修饰可以改善稳定性。图6A示出了工程化模拟物；M30-025、M30-040和M30-044；其具有相同的高度稳定的工程化引导链，G032-30(SEQ ID NO:65)，该引导链与具有改变模拟物结构的序列和化学修饰的过客链成双链体。指示的是针对M30-044的掺入可以进一步增强模拟物稳定性的设计特征的设计示意图。粗体的碱基包含2'-O-甲基修饰，小写碱基具有2'-氟取代，‘ps’表示硫代磷酸酯主链，并且(氨基C6)指示氨基-碳6链的添加。图6B示出了模拟物在10％人类血清中于37℃孵育指定的时间长度。在每个时间点的双链体稳定性通过变性尿素-PAGE可视化。具有增强的稳定性的模拟物可优选地与基于缀合的递送系统(其中模拟物可以直接暴露于生物流体中的核酸酶，并且递送不提供任何另外的屏蔽益处)一起使用。如先前在图4B中展示的，与M30-025或M30-044相比，M30-040显示出更好的抗肿瘤活性。
参考图7A-图7C，该图示出了序列改变对模拟物结构和活性的作用。图7A显示了模拟物的序列；M30-033，M30-034和M30-040。所有引导链都具有相似的化学修饰(未示出)。对于过客链也是如此。M30-033和M30-034包含含有天然miR-30a-5p引导序列的高度稳定的引导链G042-30(SEQ ID NO:69)。M30-040包含与G042-30具有相同的化学修饰，但在位置13处具有插入的“G”(以灰色突出显示)的G032-30(SEQ ID NO:65)。M30-033保留了与M30-040相似的结构(即内部凸起)并且M30-034具有与M30-040相同的过客链。图7B示出了一组6个HNSCC细胞系，所述细胞系如以上描述的用M30-033、M30-034、M30-040或阴性对照(NegCon)以15nM转染，持续5天。通过XTT测定评估细胞活力。模拟(Mock)处理在不存在模拟物情况下转染。所有数据代表了来自三个独立实验的平均±SEM。通过双因素t检验确定与M30-033(*)和M30-043(#)相比M30-040细胞活力降低的统计学改善(P<0.01)。图7C示出了15nM处理UM-SCC-1luc(遗传工程化为过表达在其3'UTR内包含miR-30靶位点的萤光素酶报告物)后的萤光素酶活性。所有数据代表了来自三个独立实验的平均±SEM。总的来说，M30-040展示了细胞活力和萤光素酶敲低活性的更大降低。
参考图8A-图8B，该图示出miR-30模拟物M30-040的抗肿瘤活性取决于RNA诱导的沉默复合物(RISC)中的引导链掺入。图8A示出了可以对引导链的5'末端进行的两种修饰的结构。在该实验中，合成了具有引导链的5'-末端甲基基团(5'-O甲基)或氨基-碳6链(5'-氨基C6)修饰的M30-040的两种变体，分别称为模拟物5'OMe M30-040和5'氨基C6 M30-040。引导链中5'-羟基末端的化学修饰至少在对siRNA双链体的背景下，可以通过阻断细胞内磷酸化和RISC效应物(RISC effector)的随后识别来减弱活性。图8B示出了用15nM的每种模拟物处理的UM-SCC-1和A431癌细胞，并且如以上描述的在第5天通过XTT测定评估细胞活力。两种5'-末端修饰都会干扰M30-040的体外抗癌细胞活性。
参考图9A-图9C，该图显示了具有改善的活性的工程化miR-30模拟物的实例开发路径。在图9A中，模拟物M30-037和M30-043的序列和结构分别包含引导链G011-30(SEQ IDNO:55)和G129-30(SEQ ID NO:86)，并包含如示出的具有化学修饰的天然miR-30a序列。还显示了工程化模拟物M30-046和M30-048的序列和结构，它们分别包含引导链G130-30(SEQID NO:87)和G132-30(SEQ ID NO:88)，并包含工程化序列。其化学修饰被设计为保留下游转录物的多靶向活性。指示的是针对M30-048的掺入导致改善的活性的特征积累(包括3'末端修饰模式和模拟物凸起结构)的设计示意图。粗体的碱基包含2'-O-甲基修饰，小写碱基具有2'-氟取代，‘ps’表示硫代磷酸酯主链，并且(氨基C6)指示氨基-碳6链的添加。图9B显示了用指定的模拟物或阴性对照(Neg Con)以15nM转染一组癌细胞系5天的抗肿瘤活性。通过XTT测定评估细胞活力。模拟处理在不存在模拟物的情况下转染。所有数据代表至少三个独立实验的平均±SEM。图9C显示了如以上描述的对UM-SCC-1luc进行15nM处理后的萤光素酶活性。所有数据代表了来自三个独立实验的平均±SEM。
参考图10A-图10B，图10A显示了由引导链G129-30(SEQ ID NO:86)组成的工程化模拟物M30-043的改善的抗癌活性和沉默，该工程化模拟物M30-043是包含具有化学修饰的天然miR-30a序列的miR-30模拟物。与未修饰的天然miR-30a相比，M30-043在体外一组7个HNSCC细胞系中，以7.5nM对细胞活力具有改善的活性。指示了与miR-30a处理相比的统计学显著性(P<0.05)。图10B示出了在经基因工程改造以在其3'UTR内过表达包含miR-30靶位点的萤光素酶报告物的UM-SCC-1亚系(UM-SCC-1luc)中以15nM处理后的萤光素酶活性。模拟样品在不存在API的情况下转染。所有数据代表了来自三个独立实验的平均±SEM。
参考图11A-图11B，该图显示了工程化miR-30模拟物的固有免疫刺激降低。将人类外周血单个核细胞(～2-6x105个细胞)铺板在圆底96孔板中，并用RNAiMAX试剂以133nM浓度的指定模拟物转染48小时。通过ELISA定量上清培养基中的TNF-α(图11A)和IFN-α(图11B)的水平。聚(dA:dT)寡核苷酸作为免疫刺激的阳性对照。用非化学修饰的RNA双链体(Non-mod)的转染展示了模拟物免疫刺激的潜力。在不存在模拟物的情况下处理的细胞用于建立基线。
参考图12A-图12D，该图显示了在体外用工程化模拟物M30-040组合治疗时，癌细胞对已批准的治疗(顺铂和西妥昔单抗)的敏感化。图12A示出了UM-SCC-1和UM-SCC-46癌细胞在存在递增的微剂量顺铂的情况下培养≥3个月以产生对顺铂有抗性的亚系。与亲本细胞系相比，评价细胞毒性的剂量响应曲线展示了对顺铂的增强的抗性。图12B示出了如以上描述的用15nM M30-040或非特异性对照模拟物(Neg Con)转染亲本和顺铂抗性细胞系5天。通过XTT定量相对细胞数量。数据针对模拟转染处理进行归一化。图12C示出了用15nM的M30-040转染持续48小时，并且随后用它们各自的IC50浓度(Cis IC50)的顺铂处理的亲本UM-SCC-1和UM-SCC-46细胞的组合处理。在转染后第5天通过XTT对相对细胞数量进行定量。图12D示出了用15nM M30-040转染另一种癌细胞系UM-SCC-47，持续48小时，并且随后用指定浓度的西妥昔单抗处理。M30-040预处理可以使UM-SCC-47细胞对西妥昔单敏感。
参考图13A-图13C，该图示出了原位HNSCC肿瘤中的抗肿瘤活性。图13A示出了雌性SCID小鼠在其口腔左侧的口底(floor-of-mouth)植入UM-SCC-1Luc亚系。肿瘤植入后14天，通过经由IP注射进行150mg/kg的D-萤光素给药，使用体内成像系统(IVIS)对活体动物进行生物发光监测。动物用NOV340(PMID:24832107)LNP配制的模拟物M30-037和M30-040或空NOV340 LNP对照通过静脉内注射(IV)以3mg/kg的3剂BIW来治疗。图像示出了在第一次给药前第0天和研究的第13天，每个治疗组的一对麻醉动物的肿瘤生物发光。图13B示出在指定时间点对每只动物的生物发光进行定量，并以平均辐射亮度±SEM进行绘制以产生肿瘤生长曲线。指示的是3个顺序BIW剂量的配制的模拟物。图13C雌性SCID小鼠在右肋植入UM-SCC-109肿瘤，使其生长至～150mm3，并且随后通过静脉内注射(IV)3mg/kg的用NOV340配制的M30-040或空NOV340 LNP对照按BIW时间表进行6剂治疗。通过计算每个时间点的肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。对于M30-040治疗观察到显著的生长延迟。
参考图14A-图14B，该图示出了用工程化模拟物M30-048进行的局部肿瘤治疗。图14A示出了雌性SCID小鼠在其口腔左侧的口底植入UM-SCC-1Luc亚系。肿瘤植入后14天，通过经由IP注射进行150mg/kg的D-萤光素给药，使用体内成像系统(IVIS)对活体动物进行生物发光监测。使用
Figure BDA0003979487010001031
局部试剂盒(koken)将工程化模拟物M30-048或阴性对照模拟物(Neg.Con.)配制到Atelocolagen凝胶中。动物用1.5mg/kg或3mg/kg的M30-048或3mg/kg的Neg.Con模拟物的单次治疗来治疗，并监测萤光素酶的沉默96小时。图14B显示萤光素酶信号的定量，该信号在两种剂量下被完全沉默96小时
参考图15，该图示出天然miR-29引导链序列和工程化家族成员的实例。示出的是在人类中可见的天然miR-29家族成员(即miR-29a-c-3p)的序列。与miR-29c-3p相比，不同家族成员之间的序列变异以灰色突出显示。包括工程化家族成员子集的非天然序列的实例可以包括(i)将miR-29a-3p和miR-29b-3p之间的天然差异组合成杂合序列(杂合体)；(ii)分别在位置14和/或位置15处进行A到G和/或U到G碱基突变(突变)；(iii)在位置15处进行鸟嘌呤碱基插入(插入)；和(iv)将突变与碱基插入组合到miR-29b-3p的序列(突变+插入)或杂合体序列(杂合体+突变+插入)。非天然序列改变以浅灰色突出显示。还指示了将3'末端微调1-2nt以包括另外的变体。
参考图16，该图示出了人类宿主细胞基因的示意图，该基因是表观遗传修饰因子(epigenetic modifier)，并涉及癌症和潜伏的HIV病毒的再激活。示出的是包含其编码结构域和其3'UTR内的三个实验验证的miR-29靶位点(以灰色表示)的TET1 mRNA的图示。使用软件RNAhybrid 2.2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)计算天然miR-29b-3p与TET1靶位点之间的杂交，以及计算的miR-29-3p和指定的人工引导链的自由能(ΔG)。还指示了所有三个靶位点自由能的净和(NET)及其平均ΔG(Avg.)。注意，所有人工引导链可以具有比天然miR-29b-3p更低的计算的净杂交自由能和平均杂交自由能，暗示改善的靶识别。与图22中描绘的NEF实例一样，图16中描绘的工程化miR-29引导链可用于结合和抑制表达TET1宿主蛋白的mRNA，与缺乏本文描述的修饰的对应的天然miRNA序列相比，其具有更低的预测自由能(ΔG)，更大的特异性，和更大的互补性。由于TET1在包括癌症和病毒感染的许多紊乱中是重要的，这证明工程化miR-29引导链可以通过改善对TET1的靶向性而具有作为治疗剂的改善的特性。
参考图17，该图示出了与天然miR-29b-1相比，miR-29模拟物可以具有同等或更大的敲低活性。被遗传工程化以过度表达在其3'UTR内包含miR-29靶位点的萤光素酶报告物的HEK细胞的稳定亚系(HEKluc)的萤光素酶活性。将HEKluc细胞铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用15nM模拟物转染细胞持续3天，然后进行细胞裂解和萤光素酶测定。模拟处理在不存在模拟物的情况下转染。所有数据代表来自转染后72小时的三个独立实验的平均±SEM。
参考图18A-图18B，该图示出了在不存在对引导链的化学修饰的情况下，过客链修饰影响模拟物的稳定性。图18A示出了天然miR-29b-1双链体与模拟物M29-004和M29-012(其中它们的过客链(顶链)在两个末端均包含三个末端2'O-甲基核苷酸(粗体)和氨基-碳6链(氨基C6)5'-帽)的序列比较。通过M29-012中的序列改变增强了双链体互补性。在一些情况下，可以对任何引导链进行化学修饰。图18B示出了双链体中凸起的减少与过客链的化学修饰模式的组合有助于在不存在引导链的另外的化学修饰的情况下改善双链体的稳定性。5μM的miR-29b-1和miR-29模拟物在10％的人类血清中于37℃孵育指定的时间长度。通过变性尿素-PAGE将指定的时间点的双链体稳定性可视化。
参考图19A-图19B，该图示出了化学修饰可以改善miR-29模拟物的稳定性。图19A示出了具有使其对人类核酸酶稳定的化学修饰的示例工程化miR-29模拟物的序列和结构。图19B示出了miR-29模拟物在10％人类血清中于37℃孵育指定的时间长度。在每个时间点的双链体稳定性通过变性尿素-PAGE可视化。没有条带或有明显拖尾(smear)的时间点分别是缺少样品时间点或用户上样错误。
参考图20A-图20C，该图示出了可以改善天然miR-29a-3p和miR-29b-3p敲低活性的过客链修饰。图20A示出了天然miR-29a双链体与模拟物M29-023和M29-002的序列比较，它们因过客链组成而不同。所有三个双链体都包含未修饰的天然miR-29a-3p引导链序列。粗体的碱基包含2'-O-甲基。也示出了指定的过客链的5'末端的氨基-碳6链(氨基C6)修饰。图20B示出了天然miR-29b双链体与模拟物M29-007和M29-008的序列比较。所有三个双链体都包含相同的未修饰的天然miR-29b-3p引导链序列。图20C示出了经遗传工程化以过表达在其3'UTR内包含miR-29靶位点的萤光素酶报告物的HEK细胞的稳定亚系(HEKluc)用15nM的天然miR-29a、天然miR-29b和miR-29模拟物处理后的萤光素酶活性。所有数据代表来自三个独立实验的平均±SEM，其中细胞在转染后72小时进行测定。与天然miR-29a和miR-29b双链体相比，包含天然miR-29a-3p(29a-3p)或miR-29b-3p(29b-3p)的模拟物的敲低活性可以通过将引导链与修饰的过客链杂交来改善。
参考图21，该图显示了工程化miR-29模拟物的固有免疫刺激降低。将人类外周血单个核细胞(PBMC)(～2x105个细胞)铺板在圆底96孔板中，并用RNAiMAX试剂以133nM浓度的指定模拟物转染48小时。通过ELISA定量上清液中的IFN-α和TNF-α的水平。具有已知强刺激效果(Pos Con)的聚(dA:dT)寡核苷酸和未修饰的RNA双链体作为免疫刺激的阳性对照。用非化学修饰的miR-29a和miR-29b双链体(Non-mod)的转染作为包含化学修饰的指定实例模拟物的对比对照。在不存在模拟物的情况下处理的细胞用于建立基线。
参考图22A-图22B，该图示出了HIV病毒RNA转录物的示意图，该转录物编码病毒蛋白(NEF)，并且可以是针对HIV的抗病毒靶。图22A示出了使用软件RNAhybrid 2.2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)计算的天然miR-29b-3p与其在NEF病毒转录物中的同源靶位点之间的自由能(ΔG)和杂交。例如，由杂交序列(G003-29)和/或其他非天然变化(G004-29、G020-29、G027-29和G031-29)组成的人工miR-29引导链可以具有更低的预测自由能(ΔG)和更大的互补性，暗示改善的靶识别。如本文展示的，改善的靶识别可导致针对靶RNA的工程化寡核苷酸的结合的吉布斯自由能的降低，可导致工程化寡核苷酸在多于一种其它RNA序列中针对靶RNA的增加的特异性，或这些特征的组合。因此，图22A中描绘的工程化miR-29引导链可用于结合和抑制表达NEF病毒蛋白的mRNA，与缺乏本文描述的修饰的相应天然miRNA序列相比，其具有更低的预测自由能(ΔG)，更大的特异性，和更大的互补性。因此，如图22B中展示的，工程化的miR-29引导链可以显示出对HIV病毒或展示NEF病毒蛋白的其他病毒的强抗病毒活性。3*104个CD4+人类t细胞用100nM的对照、M29-012或M29-028模拟物转染。转染后24小时，细胞被pNL4-HIV感染，pNL4-HIV包含巢式克隆到NEF基因的GFP报告物。在感染后36小时通过流式细胞术测量的相对GFP表达在用M29-012和M29-028预处理的细胞中显著降低。
参考图23A-图23C，该图示出miR-29a-3p、miR-29b-3p、M29-002、M29-023和M29-028对与HIV复制和潜伏期相关的mRNA的敲低。将1x105个Jurkat t细胞铺板在6孔板中的1mL培养基中，并立即用配制成转染剂的100nM对照、天然miR-29a、天然miR-29b或miR-29模拟物处理72小时。收集细胞，并用directzol试剂盒纯化总RNA。逆转录后miR-29靶基因Tet3(图23A)、细胞周期蛋白T1(图23B)和DNMT3A(图23C)的相对表达通过定量RT-PCR进行评估。值代表三个生物重复的平均值，并且误差条代表SEM。*表示通过2尾student’s T检验的p值<0.05。在所有情况下，与天然miRNA相比，miR-29的工程化模拟物都改善了靶向mRNA的敲低。
参考图24A-图24B，该图示出了计算的模拟物miR-29(图24A)和miR-30(图24B)家族引导链对SARS病毒转录物的靶识别的自由能需求。指示了miR-29模拟物示例性引导链构建体。miR-29引导序列(例如SEQ.ID.NO.12或SEQ.ID.NO.103)和miR-30引导序列(例如SEQ.ID.NO.86或SEQ.ID.NO.88)，可以具有针对SARS病毒的抗病毒活性。
参考图25A-图25C，该图示出了计算的模拟物miR-29(图25A)和miR-30(图25B)家族引导链对SARS-CoV-2病毒转录物的靶识别的自由能需求。使用软件RNAhybrid 2.2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)计算选择的引导链和三个预测靶之间的杂交和结合自由能(ΔG)。还指示了所有三个靶位点自由能的净和(NET)及其平均ΔG(Avg.)。图25C展示了示例工程化miR-29(M29-028)和miR-30模拟物(M30-043和M30-48)对SARS-CoV-2诱导的细胞死亡的保护效果。将5x103个Vero细胞铺板在29孔板中，并且铺板后6h分别用25nM对照、M29-028、M30-043或M30-048模拟物转染，并且然后24h后用SARS-CoV-2(MOI 0.03)感染。再过72小时后，使用病毒toxglo测定(Promega)测定细胞的病毒诱导的细胞病变效果。用M29-028、M30-43或M30-048任一的预处理导致～30-40％更少的病毒诱导的细胞死亡。miR-29引导序列(例如SEQ.ID.NO.102或SEQ.ID.NO.109)以及miR-30引导序列(例如SEQ.ID.NO.86或SEQ.ID.NO.88)可具有针对SARS-CoV-2的抗病毒活性。
参考图26，该图示出了计算的模拟物miR-29家族引导链对HCV基因型1转录物的靶识别的自由能需求。指示了miR-29模拟物示例性引导链构建体。miR-29引导序列(例如SEQ.ID.NO 12、13、102、103、112、115、119、117、105、110、109、100)可以具有针对HCV基因型1的抗病毒活性。
miR-29、miR-30或miR-26家族的抗病毒特性也可以在基因组内包含靶位点或依赖于相似宿主基因转录物(例如TET1、TET2、TET3等)的其他基于RNA的病毒中保留。基于种子序列的互补性，在SARS和SARS-CoV-2冠状病毒的基因组转录物中分别有26个和32个候选靶位点。计算的对于三个实例靶向位点的自由能(ΔG)指示，与天然miR-29a-3p、miR-29b-3p或miR-30a-5p相比，许多人工家族成员都可以在SARS(图24)和SARS-CoV-2(图25)基因组转录物中具有改善的结合潜力。类似地，人工家族成员也展示了跨丙型肝炎病毒(HCV)基因组中三个候选靶位点的改善的计算的结合(图26)。这些模拟物，包括人工家族成员，可以在治疗或预防基于RNA的病毒的感染方面具有广泛的有作用的抗病毒特性。
SEQ ID NO:500-531、829-831(表6)示出了COVID-19冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组RNA中的miR-29靶序列。例如，由SEQ.ID.NO.500或SEQ.ID.NO.502指示的COVID-19基因组中的靶序列可以被如本文描述的一种或更多种构建体(诸如一种或更多种miR-29构建体)靶向。
SEQ ID NO:474-499、826-828(表6)示出了SARS冠状病毒(SARS-CoV)基因组RNA中的miR-29靶序列。例如，由SEQ.ID.NO.474或SEQ.ID.NO.475指示的SARS基因组中的靶序列可以被如本文描述的一种或更多种构建体(诸如一种或更多种miR-29构建体)靶向。
SEQ ID NO:532-554(表6)示出了MERS冠状病毒(MERS-CoV)基因组RNA中的miR-29靶序列。例如由SEQ.ID.NO.535或SEQ.ID.NO.537指示的MERS基因组中的靶序列可以被如本文描述的一种或更多种构建体(诸如一种或更多种miR-29构建体)靶向。
SEQ ID NO:555-586(表6)示出了HKU1冠状病毒(CoV-HKU1)基因组RNA中的miR-29靶序列。例如由SEQ.ID.NO.556或SEQ.ID.NO.566指示的HKU1基因组中的靶序列可以被如本文描述的一种或更多种构建体(诸如一种或更多种miR-29构建体)靶向。
参考表9和图27，该图示出了工程化人工抗癌miRNA模拟物E1-001，它没有类似的天然ncRNA。E1-001、G001-E1的引导链被工程化以靶向几个致癌mRNA的3'UTR中的单个和多于一个位点。表9示出了计算的G001-E1引导链对致癌mRNA中靶向位点的靶识别的自由能需求。使用软件RNAhybrid 2.2(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)计算杂交和结合自由能(ΔG)。图27显示了工程化人工miRNAE1-001在正常非癌细胞(包括成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞系(RPE-1)或人类口腔角质形成细胞(HOK)细胞)中的活性。还对具有不同遗传背景的各种癌细胞系进行了处理。将指定的细胞系铺板在96孔板中，并在铺板后6小时使用RNAimax剂用7.5nM E1-001转染，持续5天。处理后，通过XTT测定评估细胞活力。指示了与Neg Con miRNA处理相比的统计学显著性(P<0.01)。所有数据代表来自最少三个独立实验的平均值±SEM。癌细胞系比非癌细胞显著更敏感。
表9：计算的ENG-miR-1引导链与各种靶之间的结合自由能。
Figure BDA0003979487010001091
参考表10，该表示出了工程化miR-205引导链和预测的与ZEB1(SEQ ID NO:590)、E2F1(SEQ ID NO:591)、HER3(SEQ ID NO:592)和SHIP2(SEQ ID NO:593)基因转录物的3'UTR中的癌症相关RNA结合的自由能。较低的预测自由能(ΔG)暗示改善的靶识别。靶HER3(PMID:19276373)是刺激癌症生长的癌基因，而SHIP2(PMID:19033458)是抑制癌症生长的肿瘤阻抑基因。示例工程化引导链G016-205(SEQ ID NO:260)和G011-205(SEQ ID NO:255)被预测具有更强的HER3靶向性和更弱的SHIP2靶向性。
表10.计算的miR-205下游转录物的模拟引导链的靶识别的自由能需求
Figure BDA0003979487010001101
*使用RNAhybrid 2.2计算指定的模拟物引导链序列和ZEB1(SEQ ID NO:590)、E2F1(SEQ ID NO:591)、HER3(SEQ ID NO:592)和SHIP2(SEQ ID NO:593)基因转录物的3'UTR中的靶位点之间的自由能(ΔG)。较低的预测自由能(ΔG)暗示改善的靶识别。
参考表11，该表示出了可能与组织疤痕形成和纤维化相联系的miR-29模拟物靶基因。对人类基因组内候选的下游靶基因的分析鉴定了许多可以参与组织疤痕形成和纤维化的基因(包括胶原超家族中的大多数成员)的富集。miR-29模拟物可以在纤维化/疤痕形成病理中具有进一步的治疗潜力。
表11–与组织疤痕形成和纤维化相联系的miR-29模拟靶基因
Figure BDA0003979487010001111
参考图28，该图示出了FSHD患者成肌细胞中DUX4和DBET RNA转录物被多靶向反义寡核苷酸(ASO)的同时敲低。AS-DX-10只靶向DUX4转录物，而AS-DX-25、AS-DX-37和AS-DX-55靶向DUX4和DBET转录物两者。将永生化的15Abic成肌细胞铺板在12孔板中，并且第二天使用转染剂RNAimax用50nM的对照或靶向ASO转染。铺板后一天添加分化培养基以诱导成肌细胞形成和DUX4表达。转染后72小时裂解细胞，并从孔中收集总RNA，并进行RT-qPCR以确定DUX4或DBET转录物的表达。ASO AS-DX-25、AS-DX-37和AS-DX-55敲低DUX4和DBET转录物两者，而AS-DX-10只敲低DUX4。
在一些情况下，如图30中示出，包含遗传物质的样品202可以从受试者201(诸如人类受试者)获得。样品202可以经受如本文描述的一种或更多种方法，诸如进行测定。在一些情况下，测定可以包括测序(诸如纳米孔测序)、基因分型、杂交、扩增、标记或其任何组合。来自方法的一个或更多个结果可以输入到处理器204中。一个或更多个输入参数，诸如样品标识、受试者标识、样品类型、参考或其他信息，可以被输入到处理器204中。来自测定的一个或更多个度量(metrics)可以输入到处理器204中，使得处理器可以产生结果，诸如退行性椎间盘疾病(disc disease)的诊断或治疗建议。处理器可以将结果、输入参数、度量、参考或其任何组合发送到显示器205诸如可视化显示或图形用户界面。处理器204可以(i)向服务器207发送结果、输入参数、度量或其任何组合，(ii)从服务器207接收结果、输入参数、度量或其任何组合，(iii)或其组合。
计算机控制系统
本公开内容提供了被编程为实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图29示出了计算机系统101，其被编程或以其他方式配置为预测或确认各种构建体在治疗效果方面(诸如在癌症治疗或抗病毒治疗中)的效力。计算机系统101可以调节本公开内容的各个方面，诸如，例如，建模或鉴定用于各种治疗靶的构建体，构建体的建模效率或稳定性，或其任何组合。计算机系统101可以是用户的电子设备或相对于该电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统101包括中央处理单元(CPU，本文也被称为“处理器”和“计算机处理器”)105，其可以是单核或多核处理器或用于并行处理的多于一个处理器。计算机系统101还包括存储器或存储器位置110(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元115(例如，硬盘)、用于与一个或更多个其他系统通信的通信接口120(例如，网络适配器)和外围设备125，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器110、储存单元115、接口120和外围设备125与CPU 105通过通信总线(实线)，诸如主板(motherboard)通信。存储单元115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统101可以借助于通信接口120被可操作地耦合至计算机网络(“网络”)130。网络130可以是互联网、内联网和/或外联网、或与互联网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络130为电信和/或数据网络。网络130可以包括一个或更多个计算机服务器，其可以支持分布式计算，诸如云计算。网络130(在一些情况下借助于计算机系统101)可以实现对等网络(peer-to-peer network)，其可使耦合至计算机系统101的设备能够作为客户端或服务器运行。
CPU 105可以执行一系列的机器可读指令，该机器可读指令可以以程序或软件来体现。指令可以被存储于存储器位置，诸如存储器110中。指令可以被导向CPU 105，其可随后对CPU 105编程或以其他方式配置CPU 105，以实现本公开内容的方法。由CPU 105进行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和写回。
CPU 105可以是电路诸如集成电路的一部分。系统101的一个或更多个其他组件可以被包括在电路中。在一些情况下，电路为专用集成电路(ASIC)。
存储单元115可以存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元115可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统101可以包括一个或更多个另外的数据存储单元，该另外的数据存储单元在计算机系统101的外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统101通信的远程服务器上。
计算机系统101可以与一个或更多个远程计算机系统通过网络130进行通信。例如，计算机系统101可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板型或平板PC(例如，
Figure BDA0003979487010001131
iPad、
Figure BDA0003979487010001132
Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，
Figure BDA0003979487010001133
iPhone、Android支持的设备、
Figure BDA0003979487010001134
)或个人数字助理。用户可以通过网络130访问计算机系统101。
如本文描述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式实现，该机器可执行代码被存储在计算机系统101的电子存储位置，诸如，例如存储器110或电子存储单元115上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器105执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1115检索并存储在存储器110上，以便于处理器105即时访问(ready access)。在一些情况下，可以不包括电子存储单元115，而将机器可执行指令存储于存储器110上。
代码可以被预编译并配置成用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可以在运行时间期间被编译。代码可以以编程语言的形式提供，该编程语言可以被选择使得代码能够以预编译的方式或经编译(as-compiled)的方式被执行。
本文所提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统101，可以以编程实现。技术的多个方面可以被认为是通常呈一种机器可读介质进行或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品(articles of manufacture)”。机器可执行代码可以被存储于电子存储单元诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块，诸如多种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等的任一种或全部有形存储器，其可以在任何时间为软件编程提供非瞬时性存储。软件的全部或一部分有时可以通过互联网或多种其他通信网络进行通信。例如，此类通信可以使得将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以具有软件元件的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨越本地设备之间的物理接口、通过有线和光纤陆线网络以及通过空中链路(air-link)使用的光波、电波和电磁波。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可被认为是携带软件的介质。如本文使用的，除非被限制为非瞬时性的、有形的“储存”介质，否则术语诸如计算机或机器“可读介质”指参与将指令提供至处理器用于执行的任何介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如光盘或磁盘，诸如附图中示出的在任何计算机等中的任何存储设备，诸如可以用于实现数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形的传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘(floppy disk)、软磁盘(flexible disk)、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片、纸带、具有孔模式的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输此类载波的缆线或链路，或者计算机可以从其读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可以参与将一个或更多个指令的一个序列或更多个序列运送至处理器以便执行。
计算机系统101可以包括电子显示器135或与电子显示器135通信，电子显示器135包括用户界面(UI)140，用于提供例如一个或更多个结果(来自先前方法的即时结果或归档结果)、一个或更多个用户输入、来自库或数据库的参考值或其衍生物、或其任何组合。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开内容的方法和系统可以通过一个或更多个算法来实施。算法可以在由中央处理器105执行后通过软件的方式来实现。该算法可以，例如，通过监督学习来确定优化的构建体，以优化一个或更多个构建体的治疗效力、稳定性或其他属性。
尽管本文已经示出和描述了示例性实施方案，但是这样的实施方案仅作为示例。可以在示例性实施方案上进行许多变化、改变和取代。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的多种替代选择。

Claims (119)

1.一种工程化寡核苷酸或其盐，所述工程化寡核苷酸或其盐包含多核苷酸序列，其中所述工程化寡核苷酸或其盐与源自与疾病或状况相关的两个遗传基因座的至少第一RNA和第二RNA的至少一部分至少部分地互补，其中当所述工程化寡核苷酸或其盐至少部分地与所述第一RNA结合时，所述工程化寡核苷酸中的至少七个连续碱基的第一区域与所述第一RNA内包含的连续核酸互补，并且所述工程化寡核苷酸中的至少五个连续碱基的第二区域与所述第一RNA内包含的连续核酸互补，并且其中当所述工程化寡核苷酸或其盐至少部分地与所述第二RNA结合时，所述工程化寡核苷酸中的至少七个连续碱基的第一区域与所述第二RNA内包含的连续核苷酸互补，并且所述工程化寡核苷酸中的至少五个连续碱基的第二区域与所述第二RNA内包含的连续核苷酸互补，并且其中所述工程化寡核苷酸与所述第一RNA和所述第二RNA结合的预测吉布斯自由能(ΔG)在约37摄氏度和约7.2至约7.6的pH范围，单独地在约-17kcal mol-1至约-36kcal mol-1的范围。
2.根据权利要求1所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐是反义寡核苷酸、合成微RNA(miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。
3.根据权利要求1所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中相对于一种或更多种其他方面可比的非编码RNA(ncRNA)，所述工程化寡核苷酸或其盐包含一个或更多个核苷酸插入、核苷酸缺失、核苷酸取代或其任何组合。
4.根据权利要求3所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中相对于其他方面可比的ncRNA与所述第一RNA或所述第二RNA在约37摄氏度和约7.2至约7.6的pH范围结合的结合ΔG，所述工程化寡核苷酸或其盐当与所述第一RNA或所述第二RNA至少部分地结合时在约37摄氏度和约7.2至约7.6范围的pH范围具有低至少约10％的结合吉布斯自由能(ΔG)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐的长度为约5个至约50个核苷酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐包含核糖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐包含脱氧核糖。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述ncRNA是miR-30微RNA(miRNA)、miR-29miRNA、miR-26miRNA、miR-27miRNA、miR-101miRNA、miR-145miRNA、miR-205miRNA、miR-338miRNA或miR-375miRNA。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐与以下中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ IDNO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ IDNO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248、SEQ IDNO:249、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259、SEQ IDNO:260、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:465、SEQ ID NO:624、SEQ ID NO:625、SEQ ID NO:626、SEQ ID NO:627、SEQ ID NO:628、SEQ ID NO:629、SEQ IDNO:630、SEQ ID NO:631、SEQ ID NO:632、SEQ ID NO:633、SEQ ID NO:634、SEQ ID NO:635、SEQ ID NO:636、SEQ ID NO:637、SEQ ID NO:638、SEQ ID NO:639、SEQ ID NO:640、SEQ IDNO:641、SEQ ID NO:642、SEQ ID NO:643、SEQ ID NO:840、SEQ ID NO:841、SEQ ID NO:842、SEQ ID NO:843、SEQ ID NO:844、SEQ ID NO:845、SEQ ID NO:901、SEQ ID NO:902、SEQ IDNO:903、SEQ ID NO:904、SEQ ID NO:905、SEQ ID NO:906、SEQ ID NO:907、SEQ ID NO:908、SEQ ID NO:909、SEQ ID NO:910、SEQ ID NO:911、SEQ ID NO:912、SEQ ID NO:913、SEQ IDNO:914、SEQ ID NO:915、SEQ ID NO:916、SEQ ID NO:917、SEQ ID NO:918、SEQ ID NO:919、SEQ ID NO:920、SEQ ID NO:921、SEQ ID NO:922、SEQ ID NO:923、SEQ ID NO:924、SEQ IDNO:925、SEQ ID NO:926、SEQ ID NO:927、SEQ ID NO:928、SEQ ID NO:929、SEQ ID NO:930、SEQ ID NO:931、SEQ ID NO:932、SEQ ID NO:933、SEQ ID NO:934、SEQ ID NO:935、SEQ IDNO:936、SEQ ID NO:937、SEQ ID NO:938、SEQ ID NO:939、SEQ ID NO:940、SEQ ID NO:941、SEQ ID NO:942、SEQ ID NO:943、SEQ ID NO:944、SEQ ID NO:945、SEQ ID NO:946、SEQ IDNO:947、SEQ ID NO:948或SEQ ID NO:949。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸在温度范围为约15摄氏度至约37摄氏度、pH范围为约6.5至约7.6的水性溶液中形成包含茎环的二级结构。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐包含相对于天然存在的碱基、糖、主链或磷酸酯连接而言化学修饰的碱基、化学修饰的糖、化学修饰的主链或磷酸酯连接，或其任何组合。
12.根据权利要求11所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：甲基基团、氟基团、甲氧基乙基基团、乙基基团、羟甲基基团、甲酰基基团、桥接核酸、锁核酸、羧酸或其盐、硫代磷酸酯修饰的主链、甲基膦酸酯修饰的主链、氨基-烷基链修饰及其任何组合。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐当化学修饰时包括下式：
(N)a(mN)b(N)cNN；
(N)a(mN)b(N)csfNsmN；或
(fNmN)h(mN)i(fNmN)jsfNsmN；其中
每个N独立地是尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或其他天然核苷酸；
每个mN独立地是2'-O-甲基修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；
每个s独立地是硫代磷酸酯修饰的主链；
每个fN独立地是2'氟修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；并且
每个a是8-10，每个b是7-10，每个c是2-4，每个h是5-7，每个i是0或1，以及每个j是3-4。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐与以下中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID 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15.根据权利要求11所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸序列包含糖修饰、碱基修饰或主链修饰。
16.根据权利要求15所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述修饰包括接头。
17.根据权利要求16所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述接头是共价接头。
18.根据权利要求16所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述接头是可裂解接头。
19.根据权利要求16-18所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述接头进一步被修饰为包含缀合物。
20.根据权利要求19所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述缀合物是抗体、天然存在的配体、小分子或肽。
21.根据权利要求19所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述缀合物是药物或其盐。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸包含用聚糖糖基化的核苷酸碱基。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA至少部分地包含mRNA序列。
24.根据权利要求23所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中与将等量的所述ncRNA与所述mRNA序列接触相比，所述工程化寡核苷酸或其盐当与所述mRNA序列接触时产生由所述mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的表达；所述表达由以下确定：
a.将所述工程化寡核苷酸或其盐转染到包含所述mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，
b.将所述ncRNA转染到包含所述mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，以及
c.测量在所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞中表达的所述多肽的量，其中所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞是相同类型的哺乳动物细胞。
25.根据权利要求23所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中与将等量的所述ncRNA与所述mRNA序列接触相比，所述工程化寡核苷酸或其盐当与所述mRNA序列接触时产生由所述mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的活性；所述活性由以下确定：
a.将所述工程化寡核苷酸或其盐转染到包含所述mRNA序列的第一分离的哺乳动物细胞中，
b.将所述ncRNA转染到包含所述mRNA序列的第二分离的哺乳动物细胞中，以及
c.测量来自所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞中表达的所述多肽的活性量，其中所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞是相同类型的哺乳动物细胞。
26.根据权利要求24所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中与接触等量的所述ncRNA相比，所述工程化寡核苷酸或其盐当与所述mRNA序列接触时产生由所述mRNA序列编码的多肽的低约1.2倍至约10倍的表达；所述表达由以下确定：
a.将所述工程化寡核苷酸或其盐转染到包含所述mRNA序列的所述第一分离的哺乳动物细胞中，
b.将所述ncRNA转染到包含所述mRNA序列的所述第二分离的哺乳动物细胞中，以及
c.测量在所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞中表达的所述多肽的量。
27.根据权利要求25所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中与接触等量的所述ncRNA相比，所述工程化寡核苷酸或其盐当与所述mRNA序列接触时产生由所述mRNA序列编码的多肽的低约1.2倍至约10倍的活性；所述活性由以下确定：
a.将所述工程化寡核苷酸或其盐转染到包含所述mRNA序列的所述第一分离的哺乳动物细胞中，
b.将所述ncRNA转染到包含所述mRNA序列的所述第二分离的哺乳动物细胞中，以及
c.测量来自所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞中表达的所述多肽的活性量。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一分离的哺乳动物细胞和所述第二分离的哺乳动物细胞是人类细胞或小鼠细胞。
29.根据权利要求28所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一分离的哺乳动物细胞是人类细胞，并且其中所述人类细胞是癌细胞、成纤维细胞、白细胞、上皮细胞、鳞状细胞、成肌细胞、肌肉细胞。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中当所述工程寡核苷酸或其盐被储存在封闭的容器中，在约23摄氏度和约50％的相对大气湿度储存至少约1个月的时间段时，保持所述工程化寡核苷酸或其盐的初始量的至少约80％。
31.根据权利要求30所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述时间段为约1个月至约1年。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况包括癌症。
33.根据权利要求32所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分是由癌基因编码的。
34.根据权利要求33所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述癌基因包括ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、AKT3、ATF1、BCL11A、BCL2、BCL3、BCL6、BCR、BRAF、CARD11、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CDX2、CTNNB1、DDB2、BBIT3、BBX6、DEK、EGFR、ELK4、ERBB2、ERBB3、E2F1、ZEB1、ETV4、ETV6、EVI1、EWSR1、FEV、FGFR1、FGFR1OP、FGR2、FUS、GOLGA5、GOPC、HMGA1、HMGA2、HRAS、IRF4、ITGA6、JUN、KIT、KRAS、LCK、LMO2、MAF、MAFB、MAML2、MDM2、MET、MITF、MLL、MPL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NCOA4、NFKB2、NRAS、NTRK1、NUP214、PAX8、PDGFB、PIK3CA、PIM1、PLAG1、PPARG、PTPN11、RAF1、REL、RET、ROS1、SETDB1、SERPINE1、SMO、SS18、TCL1A、TET2、TFG、CDK6、ATG9A、TLX1、TPR、USP6、CSNK1G、KLF17、ARHGAP26、RAB11FIP1、RBJ、SERBP1、CTBP1、CRKL、ITGA3、ITGAV、LAMC1、G6PC2、PPP2R5E或其任何组合。
35.根据权利要求33所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述癌基因包括ITGA6、BCL2、DEK、PLAG1、SERPINE1、MYCN、LMO2、PIM1、EGFR、IRS1、NT5E、GLDC、SOCS1、STAT1、LOX、PDGFRB、WNT5A、CD80、CCNA1、THBS2、IGF1R、AFAP1L2、CTHRC1、MET、FAP、IL1A、GJA1、MYBL2或其任何组合。
36.根据权利要求33所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述工程化寡核苷酸或其盐对多于一种RNA序列中编码ITGA6、SERPINE1、EGFR、MDTH或其任何组合的RNA序列是选择性的。
37.根据权利要求1-31中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况包括纤维化。
38.根据权利要求37所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由胶原超家族基因、血小板来源的生长因子基因、TGF-β信号传导基因、胶原重塑基因、细胞外基质重塑基因、Wnt信号传导基因、肝癌来源的生长因子(HDGF)信号传导基因或其任何组合编码。
39.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述胶原超家族基因编码，其中所述胶原超家族基因选自由以下组成的组：COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1及其任何组合。
40.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述血小板来源的生长因子基因编码，其中所述血小板来源的生长因子基因选自由以下组成的组：PDGFB、PDGFC、PDGFRB及其任何组合。
41.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述TGF-β信号传导基因编码，其中所述TGF-β信号传导基因为WISP1、TGFB2或其任何组合。
42.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述胶原重塑基因编码，其中所述胶原重塑基因为LOXL2。
43.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述细胞外基质重塑基因编码，其中所述细胞外基质重塑基因选自由以下组成的组：COL1A1、COL11A1、COL2A1、COL5A3、COL5A2、COL4A4、COL21A1、COL7A1、COL9A1、COL19A1、COL5A1、COL22A1、COL8A1、COL4A2、COL6A2、COL24A1、COL4A3、COL4A6、COL25A1、COL16A1、COL15A1、LOXL2、弹性蛋白及其任何组合。
44.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述Wnt信号传导基因编码，其中所述Wnt信号传导基因包括WISP1。
45.根据权利要求38所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分由所述HDGF信号传导基因编码，其中所述HDGF信号传导基因包括HDGF。
46.根据权利要求1-31中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况包括病毒感染。
47.根据权利要求46所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述病毒感染是HCV基因型1感染。
48.根据权利要求47所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在HCV基因型1基因组中编码。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:587、SEQ ID NO:588或SEQ ID NO:589的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
50.根据权利要求46所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述病毒感染是冠状病毒感染。
51.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
52.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在SARS-CoV-2基因组中编码。
53.根据权利要求51-52所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:500至SEQ ID NO:531、SEQ ID NO:829、SEQ ID NO:830或SEQ ID NO:831中任何一个的至少约90％的序列同一性。
54.根据权利要求51-52所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:513或SEQ ID NO:518的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
55.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述冠状病毒是SARS-CoV。
56.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在SARS-CoV基因组中编码。
57.根据权利要求55-56所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:474至SEQ ID NO:499、SEQ ID NO:826、SEQ ID NO:827或SEQ ID NO:828中任何一个的至少约90％的序列同一性。
58.根据权利要求55-56所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:476、SEQ ID NO:481或SEQ ID NO:495的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
59.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述冠状病毒是MERS-CoV。
60.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在MERS-CoV基因组中编码。
61.根据权利要求59-60所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:532至SEQ ID NO:554中任何一个的至少约90％的序列同一性。
62.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述冠状病毒是CoV-HKU1。
63.根据权利要求50所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在CoV-HKU1基因组中编码。
64.根据权利要求62-63所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:555至SEQ ID NO:586中任何一个的至少约90％的序列同一性。
65.根据权利要求46所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述病毒感染是HIV感染。
66.根据权利要求46所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分是由HIV基因组编码的。
67.根据权利要求65-66所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:470的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
68.根据权利要求65-66所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:471、SEQ ID NO:472或SEQ ID NO:473的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
69.根据权利要求1-31中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况包括神经肌肉紊乱，所述神经肌肉紊乱包括肌营养不良或肌病。
70.根据权利要求69所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况为杜兴氏肌营养不良(DMD)、强直性肌营养不良(MD)、面肩肱型肌营养不良(FSHD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、贝克肌营养不良、眼咽型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良或远端肌营养不良。
71.根据权利要求69-70所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述疾病或状况是由遗传或自发的常染色体显性突变引起的。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA的至少一部分在以下中编码：肌萎缩蛋白、DMPK、CLCN1、CNBP、D4Z4重复、DUX4、SMCHD1、DBET、SVIL、GAL3ST2、FRG1、CAPN3、DYSF、LMNA、PABPN1、PYGM、MYOD1、MYH7、HNRNPC、HNRNPA2B1、ACVR1、ASIC2、ATG14、ATP1A1、B3GTNL1、BANF1、BPTF、CASP8AP2、CDX4、CELF2、CHMP7、CKMT1B、CLASP1、CNOT3、COL15A1、CYP3A4、DCAF15、DCN、DLX5、DUSP7、DUX1、DUX5、EMILIN1、EPG5、FAM13A、FBX03、FBXL22、FMNL3、FREM2、FRMPD2、GADD45A、GID4、GJD3、GMPR、GNAT1、GOSR1、GPRC6A、HERC1、HGF、HOOK3、HOXC9、HSP40、IRF9、IRX5、ITGA10、ITGA3、ITGA9、KCNC3、KLHL3、KLK6、LARP6、MALT1、MAP3K4、MAPK10、MIR4661、MIR8078、MTSS1、NDUFAF6、NEBL、NKX2、NR2F1、PCID2、PDE10A、PKD1L2、PKHD1、PPP1R12B、PTPRN2、PYY、RABGAP1L、RBCK1、RFX3、RHBDF2、SCRIB、SEMA3B、SETD4、SHFL、SHH、SLC37A4、SLC9A8、SMAD1、SPEF1、SPRED3、ST3GAL6、STAG1、SUPV3L1、TBC1D26、TCEA2、TCF3、TM6SF1、TMEM108、TMEM259、TNFSF4、TNIP1、TRNP1、USH1G、WRNIP1、XIAP、ZNF574基因或其任何组合。
73.根据权利要求69-72所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中所述第一RNA或所述第二RNA包括与SEQ ID NO:901至SEQ ID NO:949中任何一个的根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性。
74.一种工程化寡核苷酸或其盐，所述工程化寡核苷酸或其盐包含约5个核苷酸至约50个核苷酸的多核苷酸序列，其中所述工程化寡核苷酸或其盐包含：
第一区域、与所述第一区域邻近的第二区域和与所述第二区域邻近的第三区域，其中所述区域按照以下顺序从5'到3'排列：所述第一区域、所述第二区域和所述第三区域；
其中当所述工程化寡核苷酸或其盐与mRNA序列结合时，所述第一区域和所述第三区域与所述mRNA序列互补，并且所述第二区域包含至少一个与所述mRNA序列不互补的碱基，并且
其中相对于其他方面可比的寡核苷酸与所述mRNA序列在37摄氏度和约pH 7.2结合的结合ΔG，所述工程化寡核苷酸或其盐包含根据在约37摄氏度和约pH 7.2与所述mRNA序列结合确定的低至少约10％的结合吉布斯自由能(ΔG)，并且其中所述其他方面可比的寡核苷酸缺乏在所述工程化寡核苷酸中与所述mRNA序列不互补的所述至少一个碱基。
75.一种工程化寡核苷酸或其盐，所述工程化寡核苷酸或其盐包含与以下中任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少约90％的序列同一性的多核苷酸序列：SEQ IDNO:1-5、SEQ ID NO:12-14、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:24-25、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38-45、SEQ ID NO:52-89、SEQ ID NO:100-154、SEQ ID NO:184-201、SEQ ID NO:205-222、SEQ ID NO:225-233、SEQID NO:235-243、SEQ ID NO:245-443、SEQ ID NO:445-453、SEQ ID NO:455-463、SEQ IDNO:465、SEQ ID NO:620、SEQ ID NO:624-825、SEQ ID NO:835-837、SEQ ID NO:840-899和SEQ ID NO:901-949，其中与接触等量的人类细胞中天然存在的miR-29或miR-30寡核苷酸或其盐相比，所述工程化寡核苷酸或其盐当与mRNA序列接触时产生由所述mRNA序列编码的多肽的低至少约1.2倍的表达；所述表达根据以下确定：
a.将所述工程化寡核苷酸或其盐转染到包含所述mRNA序列的第一分离的人类细胞中，
b.将所述miR-29或miR-30寡核苷酸转染到包含所述mRNA序列的第二分离的人类细胞中，以及
c.测量在所述第一分离的人类细胞和所述第二分离的人类细胞中表达的多肽的量。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐，其中结构和化学被优化为赋予与未修饰序列或可比的ncRNA相比大于或等于100X的对天然核酸酶的稳定性。
77.一种工程化过客寡核苷酸或其盐，所述工程化过客寡核苷酸或其盐包含多核苷酸序列，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐与权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐的至少一部分至少部分地互补。
78.根据权利要求77所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐的长度为约5个至约50个核苷酸。
79.根据权利要求77-78中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐包含核糖。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐包含脱氧核糖。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐与以下中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ IDNO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169或SEQ ID NO:466。
82.根据权利要求77-81中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸形成包含茎环的二级结构。
83.根据权利要求77-82中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐包含相对于天然存在的碱基、糖、主链或磷酸酯连接而言化学修饰的碱基、化学修饰的糖、化学修饰的主链或磷酸酯连接，或其任何组合。
84.根据权利要求83所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：甲基基团、氟基团、甲氧基乙基基团、乙基基团、羟甲基基团、甲酰基基团、羧酸或其盐、硫代磷酸酯修饰的主链、甲基膦酸酯修饰的主链、氨基-烷基链修饰及其任何组合。
85.根据权利要求83或84中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐当化学修饰时包括下式：
CAP–mNmNmN(N)kmNmNmN；其中
CAP选自5'-末端甲基基团(5'-O甲基)或烷基氨基基团，诸如氨基-碳6链(5'-氨基C6)；
每个N独立地是尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；
每个mN独立地是2'-O-甲基修饰的尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶；和
每个k是12-19。
86.根据权利要求83-85中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐与以下中的任一个具有根据BLAST成对序列比对算法确定的至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ IDNO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:444、SEQ IDNO:454、SEQ ID NO:464、SEQ ID NO:838、SEQ ID NO:839或SEQ ID NO:900。
87.根据权利要求77-86中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述工程化过客寡核苷酸或其盐包含糖修饰。
88.根据权利要求87所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中所述糖修饰包括糖基化碱基。
89.根据权利要求77-88中任一项所述的工程化过客寡核苷酸或其盐，其中结构和化学被优化为赋予与未修饰序列或可比的ncRNA相比大于或等于100X的对天然核酸酶的稳定性。
90.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含：(a)第一链，所述第一链包含权利要求1-75中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐；和(b)第二链，所述第二链包含权利要求77-89中任一项所述的具有与所述第一链的至少一部分互补的序列的工程化过客寡核苷酸或其盐。
91.一种载体，所述载体包含权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐或权利要求90所述的核酸构建体。
92.根据权利要求91所述的载体，其中所述载体以脂质体、纳米颗粒或其任何组合存在。
93.根据权利要求91所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
94.根据权利要求93所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
95.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐、权利要求90所述的核酸构建体或权利要求91-94中任一项所述的载体。
96.一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐、权利要求90所述的核酸构建体或权利要求91-94中任一项所述的载体；和(b)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。
97.根据权利要求96所述的药物组合物，所述药物组合物为单位剂量形式。
98.根据权利要求96或97所述的药物组合物，其中所述药物组合物是包封的。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为液体形式。
100.一种治疗有相应需要的受试者的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的：权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐、权利要求90所述的核酸构建体、权利要求91-94中任一项所述的载体或权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述施用是通过静脉内注射、肌内注射、鞘内注射、眶内注射、皮下注射或其任何组合。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述施用是口服的、耳部的、眼部的、直肠的或其任何组合。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的方法，所述方法还包括第二施用，所述第二施用包括向所述受试者的第二疗法。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述施用和所述第二施用是同时的。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述施用和所述第二施用是顺序的。
106.根据权利要求100-105中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或处于发展疾病或状况的风险。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述癌症是头癌、颈癌、皮肤癌、宫颈癌、前列腺癌或其任何组合。
109.根据权利要求106所述的方法，其中所述疾病或状况是病毒感染。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述病毒感染是SARS-CoV感染、SARS-COV-2感染、MERS-CoV感染、CoV-HKU1感染、HIV感染或HCV感染。
111.根据权利要求106所述的方法，其中所述疾病或状况是纤维化。
112.根据权利要求106所述的方法，其中所述疾病或状况是肌营养不良。
113.根据权利要求100-112中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
115.根据权利要求100-114中任一项所述的方法，其中所述受试者已通过诊断测试被诊断患有疾病或状况。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述诊断测试包括成像程序、血细胞计数分析、组织病理学分析、生物标志物分析或其任何组合。
117.一种方法，所述方法包括：使权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐、权利要求90所述的核酸构建体或权利要求91-94中任一项所述的载体与分离的细胞或分离的组织接触。
118.一种试剂盒，所述试剂盒包含在容器中的权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸或其盐、在容器中的权利要求90所述的核酸构建体、在容器中的权利要求91-94中任一项所述的载体或在容器中的权利要求96-99中任一项所述的药物组合物。
119.根据权利要求1-76中任一项所述的工程化寡核苷酸，其中所述工程化寡核苷酸中的核苷酸的至少一个碱基不与所述第一RNA或所述第二RNA互补。
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