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CN116082497B - 抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents

抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体及其应用 Download PDF

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CN116082497B CN202210866959.8A CN202210866959A CN116082497B CN 116082497 B CN116082497 B CN 116082497B CN 202210866959 A CN202210866959 A CN 202210866959A CN 116082497 B CN116082497 B CN 116082497B
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Abstract

本发明属于病毒诊断以及治疗药物技术领域,具体涉及一种抗ASFV‑CD2v蛋白的纳米抗体及其应用。该抗ASFV‑CD2v蛋白的纳米抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列,该抗ASFV‑CD2v蛋白的纳米抗体用于检测猪血清中ASFV‑CD2v抗体时,检测方法简单,检测样品耗时短,且不需要使用酶标二抗。

Description

抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于病毒诊断以及治疗药物技术领域,具体涉及一种抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus,ASFV)感染引起的猪的急性、高度接触性、热性传染病,各品种和各年龄段的家猪及野猪均易感。猪一旦感染死亡率可达100%,是我国重点防范的一类动物疫病,同时也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病。该病的特征是发病时间短,其中最急性和急性感染病例死亡率高达100%,临床症状为发热,呼吸困难,皮肤发绀,有的发病猪咳嗽,眼、鼻有分泌物,多处粘膜出血明显。最近在我国ASF常态化防控政策下,疫情报告次数呈现大幅下降趋势,疫情流行趋势逐渐放缓,但不少地区出现了发病猪临床症状不典型,死亡率降低,病毒感染不易察觉等情况。流行病学调查发现,该类临床表现可能与ASF自然变异株的感染或非法基因缺失疫苗株的使用相关。通过对基因组结构分析发现,该类毒株大多数在CD2v功能区发生基因丢失,导致其无红细胞吸附活性。相比典型或野生型ASFV毒株,该类毒株的致病力明显降低,感染猪临床表现不典型,病猪间歇性排毒等特点。上述特点导致原有的生物安防加快速拔牙清除发病猪的防疫政策失效。但该类毒株仍具有很强的水平传播能力,并且病毒感染后具有一定的隐蔽性,增加了早期诊断的难度,为我国ASF的防控带来全新挑战。
目前为止,国内针对ASFV变异株的诊断方案主要有三重荧光PCR和测序鉴别,虽然敏感性和灵敏度较高,但成本和适用条件高,基层适用性较差;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具有操作简便、敏感性高、特异性强和能够定量测定等优点。同时,国外成功根除ASF的国家在最后阶段都使用血清学方法进行筛查,但目前国内市面上用于非洲猪瘟抗体检测的ELISA方法,大多数依托于传统的酶标二抗或酶标单克隆抗体进行开发,导致商品化试剂盒的生产成本高,操作复杂等。此外,目前国内关于ASFV野生和变异型毒株的鉴别诊断ELISA报道也仍较少。
综上,一种操作简单,且检测灵敏度比较高的检测非洲猪瘟病毒的方法是有必要的。
发明内容
针对以上问题,本发明目的之一在于提供一种抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体,其可以特异性识别ASFV-CD2v蛋白,可以用于检测猪血中ASFV-CD2v抗体,灵敏度高。
为了达到上述目的,可以采用以下技术方案:
本发明一方面提供了一种抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体,其氨基酸序列包含如SEQID No.1所示序列。
具体地,纳米抗体(Nanobody,Nb)是骆驼科动物体内产生的天然缺失轻链,只含有重链抗体可变区(VHH)的单域抗体。纳米抗体具有分子量小,稳定性强、亲和力高、可溶性好、易表达、免疫原性较低、穿透性强,易识别抗原的凹形抗原表位等特点。基于上述优点,可以将纳米抗体应用于免疫学检测及科学研究等领域。已有研究报道将纳米抗体与辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)融合应用于鸡新城疫,猪流感,猪细小病毒病等动物疫病的诊断技术研发中,并且与传统的诊断技术相比,无需抗体标记和使用二抗,简化了生产工艺,极大的降低了后续商品化试剂盒的生产成本。因此,利用纳米抗体建立动物疫病的检测技术具有很好的市场应用前景。
本发明另一方面提供了一种融合蛋白,其包含上述的抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体。
进一步地,在某些具体实施例中,上述融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.3所示序列。
具体地,上述融合蛋白的制备方法包括:(1)将上述抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体与HRP融合蛋白重组真核表达载体的构建:通过双酶切,连接和转化等基本的分子生物学技术,将编码上述抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体的基因序列连接至pCMV-N1-HRP真核表达载体中,测序后获得阳性质粒;(2)将步骤(1)中阳性质粒通过商品化的PEI转染试剂,转染HEK293T细胞,转染后96小时收集上清即为上述融合蛋白。
进一步,上述制备方法中,双酶切的酶为Pst I和Not I。
本发明再一方面提供了一种核酸序列,其编码上述的抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体。
进一步地,在一些实施例中,上述核酸序列,包含如SEQ ID No.2所示序列。
本发明再一方面提供了一种核酸序列,编码上述的融合蛋白。
进一步地,在一些实施例中,编码上述融合蛋白的核酸序列包含如SEQ ID No.4所示序列。
本发明再一方面提供了一种检测试剂或检测试剂盒,其包含上述的融合蛋白;该融合蛋白包含上述抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体,在某些具体实施例中,该融合蛋白主要由上述的抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体融合辣根过氧化物酶制备。
本发明再一方面提供了一种上述融合蛋白在检测ASFV-CD2v抗体中的应用。
本发明再一方面提供了一种检测猪血清中ASFV-CD2v抗体的方法,包括:(1)将ASFV-CD2v蛋白包被于ELISA酶标板上,得到已包被ASFV-CD2v蛋白的ELISA板;(2)将上述的融合蛋与待检测猪血清混合,得到混合物;(3)将步骤(2)所述混合物加至步骤(1)中已包被ASFV-CD2v蛋白的ELISA板上孵育、显色得OD450nm值;(4)根据公式竞争率(PI)=(1-待检样品/阴性样品)×100%,若样品PI值>22%,结果判定为阳性,反之判定为阴性。
进一步地,上述检测猪血清中ASFV-CD2v抗体的方法中,ASFV-CD2v蛋白通过原核化表达得到,包括:(1)将编码ASFV-CD2v蛋白的EP402R基因序列合成重组质粒pUC-CD2v。(2)以重组质粒pUC-CD2v为模板进行PCR扩增,将PCR回收产物与商品化载体pET-28a同时进行双酶切,用T4连接酶连接;(3)连接产物转化至Trans(5α)感受态细胞中,挑取单克隆菌落接种液体培养基,经菌液PCR鉴定后,将阳性菌液送测序;(4)将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,通过SDS-PAGE进行鉴定;(5)将(4)中的表达菌超声破碎后与适量的Ni Resin 4℃孵育4h。用低密度咪唑洗脱杂蛋白,高密度咪唑洗脱目的蛋白。
进一步地,还可以在上述检测猪血清中ASFV-CD2v抗体的方法的基础上鉴定野生型和CD2v基因缺失型ASFV毒株,具体可以按照以下方法进行:(1)先利用商品化ASF抗体检测试剂盒进行猪血清中抗ASFV抗体检测;(2)将商品化试剂盒检测阳性的样品利用上述的方法进行抗ASFV-CD2v蛋白抗体的检测,若商品化试剂盒和建立的方法检测均为阳性,则猪为野生型ASFV感染;若商品化试剂盒为阳性,而建立的检测方法为阴性,则猪为CD2v基因缺失ASFV感染。
本发明有益效果至少包括:(1)本发明提供的融合蛋白可以鉴别野生型和CD2v基因缺失型ASFV毒株;(2)本发明提供的抗ASFV-CD2v蛋白纳米抗体或融合蛋白用于检测猪血清中ASFV-CD2v抗体,检测方法简单,检测样品耗时短,不需要使用酶标二抗。
附图说明
图1为PCR扩增编码ASFV-CD2v蛋白基因;
图2为编码ASFV-CD2v蛋白的基因和pET-28a空载体双酶切结果;
图3为菌液PCR鉴定重组原核表达载体pET-28a-ASFV-CD2v阳性单克隆;
图4为SDS-PAGE分析原核表达和纯化的重组ASFV-CD2v蛋白;
图5为通过Ficoll淋巴细胞分离液分离获免疫骆驼外周血的淋巴细胞;
图6为琼脂糖凝胶电泳检测分析第一轮PCR扩增VHH基因产物;
图7为琼脂糖凝胶电泳检测分析巢式PCR第二轮PCR扩增VHH基因产物;
图8为琼脂糖凝胶电泳分析VHH与pMECS噬菌体展示载体的双酶切;
图9为琼脂糖凝胶电泳分析菌液PCR扩增构建的噬菌体文库插入的VHH基因;
图10为噬菌体ELISA检测筛选过程中特异性噬菌体的富集;
图11为经3轮富集后特异性噬菌体和阴性对照PBS滴度的测定;
图12为间接ELISA方法检测重组纳米抗体粗提物与ASFV-CD2v蛋白的反应性;
图13为琼脂糖凝胶电泳分析包含纳米抗体基因序列的重组质粒pMECS-ASFV-CD2v-Nb6和重组载体pEGFP-N1-HRP双酶切产物结果;
图14为将构建的纳米抗体重组表达质粒转染HEK293T细胞后,免疫荧光分析ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白在HEK293T细胞中的表达;
图15为ELISA分析ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白分泌表达至HEK293T细胞培养上清中及上清中融合蛋白结合ASFV-CD2v蛋白的效价;
图中,图1中,M为核酸Marker,1为扩增的目的片段,2为阴性对照;图2中,M为核酸Marker,1,2为pET-28a空载体双酶切结果,3为编码CD2v蛋白的基因双酶切结果;图3中,M为核酸Marker,1-9为阳性克隆;图4中,M为蛋白Marker,1为超声后全菌,2为超声后沉淀,3为超声后上清,4-6为洗脱的杂蛋白,7-10为镍柱亲和层析纯化后的蛋白;图6中,M为核酸Marker,1-3为扩增产物;图7中,M为核酸Marker,1-3为扩增产物;图8中,M为核酸Marker,1-4为VHH片段,5-11为pMECS载体;图13中,M为核酸Marker,1-2为pCMV-N1-HRP,3-6为pMECS-ASFV-CD2v-Nb6;图14中,A为pCMV-N1-HRP空载体对照,B为ASFV-CD2v-Nb6-HRP。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明,但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例,并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义,否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的,应当理解,诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语,并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的,根据情况,“/”可以被解释为“和”或“或”。
以下实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
实施例1ASFV-CD2v蛋白原核表达载体的构建及其表达、纯化
(1)非洲猪瘟病毒CD2v蛋白原核表达载体的构建
根据GenBank上中国非洲猪瘟分离株编码CD2v蛋白的基因序列(GenBank登录号:MK128995),由金唯智公司合成基因序列,并构建重组克隆质粒pUC-56-CD2v;依据编码基因序列,设计特异性引物:ASFV-CD2v-F1:CCCGGATCCATGATAATACTTATTTTTTTAATA,其中引入了保护碱基(CCC)和酶切位点BamH I(GGATCC);ASFV-CD2v-R1:CCCCTCGAGTTAAATAATTCTATCTACGTG,其中引入了保护碱基(CCC)和酶切位点Xho I(CTCGAG);以上述重组克隆质粒pUC-56-CD2v为模板进行PCR扩增,扩增体系如表1所示;PCR扩增反应条件为:98℃预变性2min;98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸1min,共30个循环;循环完成后72℃继续延伸7min;
表1 PCR扩增CD2v基因序列的PCR反应体系
扩增体系 体积(μL)
Template 1
Mix 25
ASFV-CD2v-F1 1
ASFV-CD2v-R1 1
ddH2O 22
将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,获得预期大小1000bp的片段(如图1所示);然后将商品化载体pET-28a与回收产物同时用QuickCutTM BamH I(1010A,TaKaRa)和QuickCutTM Xho I(1093A,TaKaRa)进行双酶切,反应体系如下表2所示;
表2商品化载体pET-28a和扩增PCR产物的双酶切反应体系
酶切体系 体积(μL)
pET-28a(或PCR产物) 6.5(或1)
BamH I 1.5
Xho I 2
10×K Buffer 4
ddH20 26(或31.5)
经1%琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示,获得了大小分别约为5300bp和1000bp的酶切片段;将酶切的片段,利用T4连接酶连接(16℃过夜),连接体系如下表3所示;
表3 pET-28a载体与PCR酶切产物连接体系
连接体系 体积(μL)
T4连接酶 1
10×Buffer 1
pET-28a 2
CD2v 1
ddH2O 5
将连接产物转化至Trans(5α)感受态细胞中,37℃培养12h后,挑取单个菌落,接种于10mL的卡那霉素LB液体培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,去离子水补充至1000mL),37℃振荡培养12h后,经菌液PCR鉴定,结果如图3所示,显示9个为阳性,将阳性菌液送测序,阳性质粒命名为pET-28a-ASFV-CD2v。
(2)非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的原核表达
将上述(1)中制备的重组阳性质粒pET-28a-ASFV-CD2v转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于卡纳抗性的LB平板上,37℃过夜培养;次日,挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中,37℃振荡过夜培养;然后将过夜培养菌液接种于新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,待菌液OD600nm值达到0.6-0.8后,加入终浓度为0.5mM的IPTG,37℃诱导表达6h。然后,8000r/min离心5min后收集菌体,PBS重悬菌体并进行超声裂解(20kHz频率,35W功率,工作时间3s,停3s,超声时间30min)。超声完后,12000r/min离心30min,取上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白的表达情况,结果如图4所示,重组ASFV-CD2v在沉淀中以包涵体形式表达,预期大小为46kDa。
(3)非洲猪瘟病毒重组ASFV-CD2v蛋白的纯化
将上述(2)中获得的沉淀与Lysis Buffer(含8M Urea,100mM NaH2PO4,100mMTris·HCl,pH=8.0)孵育过夜后,离心取上清。取适量的Ni Resin(亲和层析介质)装入柱子,然后将ASFV-CD2v蛋白与Lysis Buffer的混合液加入柱中,4℃孵育4h。用低密度咪唑(10mM)洗脱杂蛋白,然后用高密度咪唑(50mM)洗脱目的蛋白。收集洗脱下的杂蛋白与目的蛋白进行SDS-PAGE,结果显示利用镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的ASFV-CD2v蛋白(图4),其浓度为1.2mg/mL。
实施例2抗ASFV-CD2v蛋白纳米抗体的筛选与制备
(1)重组蛋白的乳化与动物免疫
将1mL纯化的ASFV-CD2v蛋白与等体积的完全弗氏佐剂乳化后,颈部皮下注射阿拉善双峰驼;剩余4次将重组蛋白与不完全弗氏佐剂进行乳化,每隔两周免疫1次,总共免疫5次。最后一次免疫后7天采取骆驼外周血150mL。
(2)VHH噬菌体文库的构建及淘选
1)外周血淋巴细胞的分离
利用Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液(Greiner bio-one公司)分离采集的外周血的淋巴细胞。离心后,血浆与白色透明淋巴细胞分离液之间的一层环状乳白色物质即为淋巴细胞(图5)。吸取淋巴细胞,反复用PBS进行清洗,离心后重悬细胞并进行计数,按1×107个细胞/支分装,-80℃保存备用。
2)外周血淋巴细胞中VHH基因片段的扩增
按照Plus Mini RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)抽提淋巴细胞总RNA(大于200bp的RNA)。用III反转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA,然后利用巢式PCR扩增VHH基因。首先配制RNA/primer混合物,其体系如表4所示。
表4 RNA反转录体系
RNA/primer体系 体积(μL)
RNA模板 8(4.5μg)
Oligo(dT)20引物 1
10mM dNTP mix 1
将RNA/primer在65℃孵育5min后,立刻置于冰水浴中1min。随后,配制cDNA合成混合物,其体系如表5所示。
表5 cDNA合成混合物体系
将上述cDNA合成混合物(10μL)加入上述RNA/primer混合物中,混匀,50℃孵育50min,85℃孵育5min后终止反应。
以反转录的cDNA为模板,巢式PCR扩增VHH基因,所用的引物序列如下表6所示。
表6巢式PCR扩增VHH基因的引物序列
名称 引物序列(5’-3’)
CALL001 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002 GGTACG TGCTGTTGAACTGTTCC
VHH-FOR CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGR
VHH-REV CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
首先利用引物CALL001和CALL002进行第一轮PCR的扩增,其反应体系如表7所示。
表7第一轮PCR扩增反应体系
1st PCR体系 体积(μL)
10×HiFi bufferⅡ 5
dNTP mixture(2.5mM) 4
CALL001 2
CALL002 2
cDNA 5
HiFi polymerase 1
ddH2O 31
反应条件为94℃预变性5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,28个循环;72℃延伸7min。
PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示在700bp和900bp位置各有一条条带(图6)。用胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit按照说明书操作回收700bp的PCR产物。随后以回收的产物为模板,利用上述VHH-FOR和VHH-REV引物进行第二轮PCR的扩增,其反应体系如表8所示。
表8第二轮PCR扩增反应体系
反应条件为94℃预变性5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,18个循环;72℃延伸5min。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,结果显示扩增获得了400bp的目的条带(图7)。然后采用试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR产物,该PCR产物即VHH基因。
3)VHH噬菌体展示载体的构建
将上述回收的PCR产物和pMECS噬菌体展示载体同时利用Pst I和Not I进行双酶切,具体酶切体系如下表(表9,表10)所示。
表9 pMECS噬菌体展示载体双酶切体系
酶切pMECS载体体系 体积(μL)
CutSmart Buffer 36.5
Not I-HF 15.85
Pst I-HF 15.85
pMECS载体 70(32μg)
ddH2O 177
表10 PCR产物双酶切体系
酶切VHH体系 体积(μL)
CutSmart Buffer 13
Not I-HF 5.75
Pst I-HF 5.75
VHH 30
ddH2O 60.5
酶切条件为37℃,16h。酶切后利用商品化用试剂盒EasyPure Quick GelExtraction Kit回收酶切产物,琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果,获得了预期大小的酶切片段(图8)。
用T4 DNA连接酶将上述回收的PCR酶切产物连入酶切的噬菌体展示载体pMECS中,16℃连接16h,连接体系如表11所示。
表11 VHH酶切产物与载体pMECS连接体系
连接体系 体积(μL)
10× T4 DNA Ligase Buffer 60
pMECS酶切产物 55
VHH酶切产物 55
T4 DNA Ligase 10
ddH2O 420
4)制备大肠杆菌TG1感受态细胞
将大肠杆菌TG1培养至OD600nm为0.4-0.6后,冰浴冷却,离心后用预冷的10%甘油反复洗三次,最后用10%甘油重悬菌体,即为制备的TG1感受态细胞。
5)连接产物转化TG1感受态细胞及噬菌体抗体文库的收获
将连接产物加入到新鲜制备的大肠杆菌TG1感受态细胞中,混匀后加入到电转杯中,用Eppendorf电穿孔仪,电转化感受态细胞(1.8kV,25μF,200Ω,1mm)。电转化完成后立即加入SOC培养基重悬细胞。37℃120r/min振荡培养1h后,涂布于LB/AMP-GLU大平板,37℃培养6-8h后,用细胞刮刀收集菌苔,加入1/3体积的50%甘油,即为制备的噬菌体文库。
6)噬菌体文库多样性和库容的测定。
取电转化产物进行10倍稀释,稀释至10-5,然后涂布于LB/AMP-GLU平板,37℃培养12h后,计算转化子数量,最终得到库容为8.0×108的噬菌体文库。随机挑取48个单克隆,利用表6所述VHH-FOR和VHH-REV引物进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆,目的大小400bp左右(图9)。
(3)抗ASFV-CD2v蛋白的特异性纳米抗体的筛选
1)噬菌体文库的救援
将获得的噬菌体抗体文库接种于2×YT/AMP-GLU培养基中,37℃200r/min,培养至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体,37℃静置30min。2800r/min离心10min,弃上清,沉淀菌体用200mL 2×YT/AMP-KAN培养基重悬,37℃200r/min培养14h。3800r/min,4℃离心30min后,收集上清,加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液。3800r/min 4℃离心30min,加入1mLPBS重悬噬菌体沉淀,使其充分溶解,即为救援的噬菌体文库。
取少量噬菌体文库溶液进行10倍梯度稀释,然后取稀释度为10-2、10-4、10-6、10-8、10-10的样品,加入对数生长期的TG1细胞,37℃静置浸染15min后,均匀的涂布于LB/AMP-GLU平板,37℃培养8h,计算重组噬菌体滴度为6.5×1012PFU/mL。
2)抗ASFV-CD2v蛋白特异性重组噬菌体的淘选
将纯化的ASFV-CD2v重组蛋白包被于ELISA板中,PBS为对照。取上述救援的噬菌体文库,加入ELISA板中,室温孵育1h,弃去噬菌体样品。然后,每孔中加入新鲜配制的0.1M三乙胺,室温静置10min,将洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH=7.4)中和。
取洗脱液浸染4mL对数期的TG1细胞,37℃静置30min,然后加入2×YT/AMP-GLU培养基,37℃200r/min培养至OD600nm达到0.6-0.8。重复上述2.3.1的操作,进行噬菌体文库的救援。得到救援的噬菌体文库后,利用上述相同的方法进行第二轮和第三轮的筛淘,每轮通过测定噬菌体滴度(图10、图11),结果显示,抗ASFV-CD2v蛋白的噬菌体得到了富集(表12)。
表12抗ASFV-CD2v蛋白特异性噬菌体的富集情况
(4)重组纳米抗体粗提物的制备
从第三轮洗脱的噬菌体测滴度的平板上随机挑选96个单菌落,依次标记1#-96#,接种于96孔板,每孔加入LB/AMP-GLU培养基,37℃ 200r/min培养8h。
每个克隆吸取培养液10μL,分别接种于1mL TB培养基,在24孔培养板中培养,37℃200r/min培养至对数期后,每孔加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达。表达后的细菌离心沉淀,反复冻融3次,3500g 4℃离心15min,收集上清即为可溶性重组纳米抗体粗提物。
(5)间接ELISA检测重组纳米抗体粗提物与ASFV-CD2v蛋白的特异性结合
将纯化的ASFV-CD2v重组蛋白包被ELISA板,同时用无关蛋白做阴性对照。取可溶性重组纳米抗体粗提物,用2.5%脱脂奶粉1:1稀释后加入酶标板中,室温孵育1h。用PBS’T洗酶标板后,加入商品化鼠抗HA-tag抗体(北京全式金生物技术有限公司),室温孵育1h。然后加入商品化的HRP标记的羊抗鼠二抗(北京博奥森生物技术有限公司),室温孵育1h。加入TMB显色液室温避光显色15min后,3M浓硫酸终止反应,使用自动酶标仪读数OD450nm的值。结果显示67个粗提物可以与ASFV-CD2v蛋白特异性结合(图12)。将阳性的菌株进行测序,结果显示成功筛选获得了1株抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体,命名为ASFV-CD2v-Nb6。
实施例3一株抗ASFV-CD2v蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的表达和制备方法
(1)纳米抗体与HRP融合蛋白重组真核表达载体的构建
利用Pst I和Not I内切酶对真核表达载体pCMV-N1-HRP(《Nanobody-horseradishperoxidase fusion protein as an ultrasensitive probe to detect antibodiesagainst Newcastle disease virus in the immunoassay》,《Journal ofnanobiotechnology》2019年17卷1期)以及获得的包含纳米抗体基因的pMECS重组质粒进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳结果显示,成功获得了预期大小的目的条带(图13)。然后将酶切获得的VHH基因,利用T4连接酶将其连接至pCMV-N1-HRP载体中获得表达纳米抗体与HRP融合蛋白表达的重组阳性质粒,命名为pCMV-N1-ASFV-CD2v-Nb6-HRP。
(2)ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白的表达和制备
将构建成功的pCMV-N1-ASFV-CD2v-Nb6-HRP阳性质粒与Medium和Lipo8000TM转染试剂混和均匀后,加入状态良好的HEK293T细胞中,置于37℃,5%CO2培养。转染96h后,选取部分转染的HEK293T细胞,4%多聚甲醛固定后,室温孵育商品化的抗His单抗(全式金生物技术有限公司),然后孵育FITC标记的羊抗鼠二抗,免疫荧光检测重组融合蛋白是否在HEK293T细胞中表达;结果显示转染阳性质粒的HEK293T细胞发出绿色荧光,证明ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白正确表达(图14)。此外,利用直接ELISA检测表达的重组融合蛋白是否分泌到HEK293T细胞上清中,结果显示转染质粒的上清可特异性结合ASFV-CD2v蛋白,证明ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋成功分泌表达(图15)。转染96h后,收集上述转染细胞的培养上清,即为ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白。
实施例4ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白在检测猪血清中抗ASFV-CD2v蛋白抗体中的应用
(1)以ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白为检测探针,检测感染猪血清中的抗ASFV-CD2v抗体竞争ELISA的建立
1)最佳抗原包被量和融合蛋白最佳稀释比例的确定
①将ASFV-CD2v蛋白稀释后按10ng、20ng、40ng、80ng、160ng、320ng,100μL/孔包被酶标板,4℃包过夜;
②PBS’T洗板4次,用2.5%的奶粉室温封闭1h;
③将ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白上清按1:10、1:102、1:103、1:104稀释后,加入抗原包被孔中室温孵育30min;
④加TMB底物显色液避光显色15min,3M H2SO4终止,读OD450nm值,确定最佳抗原包被量为80ng,融合蛋白最佳稀释比例为1:1000。
2)待检猪血清最佳稀释比例的确定
①使用4.1.1确定的最佳抗原包被浓度将ASFV-CD2v蛋白包被于ELISA板上,4℃过夜;
②PBS’T洗板4次,2.5%的脱脂奶粉室温封闭1h;
③选取4份ASFV野生型感染阳性血清和4份CD2v基因缺失型感染血清,将血清按1:1、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640做不同稀释,加入酶标板中,室温孵育30min;
④按4.1.1中确定的最佳稀释度稀释ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白后,100μL/孔,加入酶标板中,室温孵育30min;
⑤加TMB底物显色液避光显色15min,3M H2SO4终止,读值OD450nm,确定血清的最佳稀释比例为1:20。
(3)竞争ELISA的操作规程
优化确定竞争ELISA的反应条件后,该方法的操作规程:
①将ASFV-CD2v蛋白80ng/孔包被酶标板,4℃包过夜;
②PBS’T洗板4次,用2.5%的脱脂奶粉室温封闭1h;
③利用封闭液将ASFV-CD2v-Nb6-HRP融合蛋白按1:1000稀释后,将待检血清按1:20稀释在上述融合蛋白中,将混合液100μL/孔加入酶标板中,室温孵育30min;
④加TMB底物显色液避光显色15min,3M H2SO4终止,读OD450nm值,根据数值对结果进行判定。
(4)竞争ELISA检测猪血清阳性和阴性结果临界值的判定
选取80份已知阴性血清和基因缺失型感染血清确定竞争ELISA的Cut-off值。按照之前摸索好的最佳反应条件,计算被检血清的竞争率(PI值)。计算方式:竞争率(PI%)=(1-待检血清样品/阴性样品)×100%。Cut-off值=PI平均值+3×方差(SD);计算该竞争ELISA的临界值为22%,若样品PI值>22%,结果判定为阳性,即为野生型ASFV感染,反之为阴性。
(5)竞争ELISA敏感性的确定
选取20份已知阳性猪血清稀释不同倍数,用已建立的ELISA方法进行检测,直到阳性血清反应结果为阴性为止,对结果进行统计分析。结果显示该ELISA方法在血清120倍稀释还显示为阳性,表明建立的方法具有很好的敏感性。
(6)竞争ELISA特异性的确定
对70份已知阴性血清和CD2v基因缺失ASFV感染血清用该ELISA方法进行检测,70份均显示为阴性。对猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)、猪轮状病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)阳性对照血清进行检测,对结果进行统计分析。结果表明,该方法对于以上阳性对照血清并未出现交叉反应情况。
(7)竞争ELISA与已有的ASFV抗体检测试剂盒符合率
使用建立的竞争ELISA方法与北京明日达科技发展有限责任公司非洲猪瘟病毒CD2vELISA抗体检测试剂盒同时检测80份临床样品,并统计二者符合率。结果显示,本实验建立的方法与商品化试剂盒符合率为100%。
(8)竞争ELISA与已有ASF抗体检测试剂盒配合使用鉴别诊断野生型和CD2v基因缺失型ASFV感染
按已有的ASF抗体检测试剂盒说明书操作检测200份临床血清,试剂盒Cut-Off值小于0.15,结果判为阴性;Cut-Off值大于0.15,结果判为阳性。结果显示有52份血清为阳性。利用竞争ELISA方法按4.1.3操作对52份阳性血清进行检测,结果显示有14份阳性血清为野生型ASFV感染,38份为CD2v基因缺失型ASFV感染。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (9)

1.抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体,其特征在于,其氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列。
2.融合蛋白,其特征在于,由权利要求1所述的抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体和HRP制备而成。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.核酸,其特征在于,编码权利要求1所述的抗ASFV-CD2v蛋白的纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸,其特征在于,包含如SEQ ID No.2所示序列。
6.核酸,其特征在于,编码权利要求2所述的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的核酸,其特征在于,包含如SEQ ID No.4所示序列。
8.检测试剂或检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求2或3所述的融合蛋白。
9.权利要求2或3所述的融合蛋白在制备检测ASFV-CD2v抗体的产品中的应用。
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