CN116068192A - 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及proteinL的应用。本发明应用proteinL和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体联合制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒能够快速而特异地检测血清中非洲猪瘟病毒抗体，且反应灵敏性极高，其操作简便、成本低廉、反应结果稳定，适于在大规模养殖中对猪群进行非洲猪瘟的监测、排查工作，易于大范围推广应用。
Description
本申请是申请日为2022年01月24日、申请号为202210078482.7、发明名称为《一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用》的分案申请。
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及proteinL的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)感染引起猪的一种急性、烈性传染病。该病在临床上可引起猪的高热、网状内皮系统出血、可视黏膜发红等症状，强毒株感染猪病程短，死亡率高达100％。
非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的双链DNA病毒，具有复杂的多层结构。其5层结构由内到外依次为类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。非洲猪瘟病毒可编码200多种蛋白质，其中衣壳的主要成分P72蛋白约占非洲猪瘟病毒总质量的33％。此前，已有报道基于P30、P54蛋白开发的间接ELISA抗体检测试剂盒。其中，由于P72全长三聚体蛋白制备困难，市售基于P72蛋白的间接ELISA试剂盒均应用P72截短体，尚无应用P72全长三聚体蛋白制备检测试剂盒的报道。此前，我们已成功在酿酒酵母表达系统中大量表达P72三聚体蛋白，且其结构与天然结构完全相同(专利号：202110522777.4)。
OIE推荐的非洲猪瘟病毒诊断技术包括病原学检测和血清学试验。其中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法。基于P72全长三聚体蛋白的间接ELISA方法具有特异性高、敏感性强的优势，同时ELISA多样品、高通量检测的特点也适于在大规模养殖场中推行。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，用于非洲猪瘟病毒抗体检测时具备较高的特异性、灵敏性和准确性；
本发明的另外一个目的在于提供protein L在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒中的应用，如制备酶结合物。
为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的酶标板和protein L酶结合物。
本发明在前期P72全长三聚体蛋白已有成果基础上进行非洲猪瘟病毒抗体ELISA检测产品的研制，经过本发明研究发现，以非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体作为包被抗原并结合protein L酶结合物，按照间接ELISA检测，灵敏度可以检测到64000倍稀释阳性血清，而常规的以P72无序折叠单体蛋白、P54蛋白和P30蛋白为包被抗原的灵敏度仅可以检测到16000倍、8000倍和8000倍稀释阳性血清；
而且，在相同的P72三聚体包被抗原前提下，使用protein L/A/G酶结合物和羊抗猪IgG酶结合物进行检测，结果显示使用protein L酶结合物可以检测到64000倍稀释阳性血清，其他三种酶结合物均只能检测到32000倍稀释阳性血清。鉴于上述的优异技术效果，本发明提出了protein L在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒中的应用，优选为protein L和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体联合在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒中的应用。在本发明具体实施方式中，所述protein L用于制备试剂盒中的酶结合物。
本发明试剂盒中所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体通过利用CRISPR-Cas9技术将非洲猪瘟病毒特异性P72蛋白基因插入酿酒酵母BY4743基因组中，实现P72三聚体蛋白高拷贝表达，相关内容已经全部记载在CN202110522777.4中，其全部记载同样可以作为本发明所记载的内容。本发明按照CN202110522777.4的制备方法制备获得无需依靠辅助蛋白B602L即可正确组装形成三聚体构型的重组P72蛋白。所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的序列如SEQ ID NO:1所示或在SEQ ID NO:1所示蛋白序列上添加蛋白标签序列。在本发明具体实施方式中，所述蛋白标签为Twin-Strep-tag，融合在P72蛋白的N端或者C端。
试剂盒中所述protein L酶结合物为酶标记的protein L；作为优选，所述酶为辣根过氧化物酶，所述protein L酶结合物工作浓度为1:5000～10000，在本发明具体实施方式中，工作浓度为1:8000。
同时，本发明所述试剂盒中还包括如下组分中的任意一种或两种以上：
酶结合物稀释液、洗涤液、底物、样本稀释液、终止液、阴性对照和阳性对照。其中，所述底物根据所选择的酶对应选择，在本发明具体实施方式中，所述酶选择为辣根过氧化物酶，则底物选择为底物A液3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液，以及底物B液过氧化物溶液。
作为优选，所述酶结合物稀释液为含有BSA的PBST；在本发明具体实施方式中，所述酶结合物稀释液为含有1％BSA的PBST。
作为优选，所述样本稀释液为含有胎牛血清(FBS)的PBST；在本发明具体实施方式中，所述样本稀释液为含1％胎牛血清的PBST。
作为优选，所述阳性对照为免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的正常猪血清，所述阴性对照为未免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的正常猪血清。
采用本发明试剂盒分别检测已验证的非洲猪瘟病毒抗体阳性血清、猪圆环病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和非洲猪瘟病毒抗体阴性血清，结果显示所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的特异性。
此外，取本发明同一批号间接ELISA试剂盒对92份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒ID VET间接ELISA试剂盒检测数据比较。ID VET间接ELISA试剂盒检测数据显示：在92份血清样品中，57份为阳性，35份为阴性；而本发明的阳性符合数60份，阴性符合数32份，阳性符合率100％(57/57)，阴性符合率91.4％(32/35)，总符合率96.7％(89/92)。表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的准确性。
由以上技术方案可知，本发明应用protein L酶结合物和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体包被抗原，两者联合制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒能够快速而特异地检测血清中非洲猪瘟病毒抗体，且反应灵敏性极高，其操作简便、成本低廉、反应结果稳定，适于在大规模养殖中对猪群进行非洲猪瘟的监测、排查工作，易于大范围推广应用。
具体实施方式
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品、工艺和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述产品、工艺和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”、“步骤1”和“步骤2”、“S1”和“S2”以及“(1)”和“(2)”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本发明具体提供了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包含：包被板、酶结合物、酶结合物稀释液、25×浓缩洗涤液、底物A液、底物B液、样本稀释液、终止液、阴性对照、阳性对照、血清稀释板、盖板膜和说明书；
其中，包被板包被有SEQ ID NO:1所示序列的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体，用于测定此重组蛋白与非洲猪瘟病毒抗体阳性血清的特异性结合；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的protein L，所使用浓度为1：5000～10000；
所述25×浓缩洗涤液为25X PBST，所述酶结合物稀释液为含有1％BSA的PBST；所述样本稀释液为含1％胎牛血清的PBST，所述终止液为2M H2SO4，所述底物A液为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液，底物B液为过氧化物溶液。
同时，本发明还提供了所述试剂盒的使用方法：
(1)用样本稀释液稀释待检血清，加入包被板中，每孔加入100μL；同时阴、阳性对照各加入100μL，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育30min。
(2)将25×浓缩洗涤液稀释为1×洗涤液，振荡洗涤包被板3次，每次拍干。
(3)用酶结合物稀释液以1:100稀释酶结合物，以100μL/孔加入包被板中，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育30min。
(4)利用1×洗涤液振荡洗涤包被板3次，每次拍干；
(5)1：1混合底物A液、底物B液，以100μL/孔加入包被板中，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育10min。将终止液以50μL/孔加入包被板中，在酶标仪上读取OD450nm的光吸收值；
(6)结果判定：当阳性对照OD450nm≥1.0，且阴性对照OD450nm＜0.2时结果有效；(样本OD450nm值-阴性对照OD450nm值)/(阳性对照OD450nm值-阴性对照OD450nm值)≥0.2时，判为阳性；(样本OD450nm值-阴性对照OD450nm值)/(阳性对照OD450nm值-阴性对照OD450nm值)＜0.1时，判为阴性，0.1≤(样本OD450nm值-阴性对照OD450nm值)/(阳性对照OD450nm值-阴性对照OD450nm值)＜0.2时，判为疑似。
在本发明提供的各组对比实验中，如未特别说明，除各组指出的区别外，其他实验条件、材料等均保持一致，以便具有可对比性。
以下就本发明所提供的一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒做进一步说明。
实施例1：非洲猪瘟病毒P72三聚体蛋白的制备
1.非洲猪瘟病毒P72三聚体重组表达菌株的制备
本发明通过生物信息学和结构生物学方法，基于P72蛋白三维构象，设计P72蛋白序列，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒的p72(strep-tag)基因序列。将p72基因与酵母GAL1启动子和ADH1终止子构建到质粒上形成P72蛋白基因表达盒。通过PCR扩增出带有同源重组臂的P72蛋白基因表达盒作为修复模板。利用CRISPR-Cas9技术，共表达识别GGATTTAGGAATCCATAAAA(SEQ ID NO:2)的gRNA，将P72蛋白基因表达盒通过同源重组的方式插入到酿酒酵母多拷贝的Ty2逆转录转座子中，实现基因多拷贝表达。将修复模板和pCas-ty2质粒共转化酿酒酵母BY4743中，利用缺URA的平板进行克隆筛选。筛选出单克隆，通过qPCR方法鉴定拷贝数，挑取高拷贝菌株进行表达检测。
2.重组非洲猪瘟病毒P72三聚体蛋白的表达
挑选高拷贝阳性单克隆酿酒酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于YPD+2％葡萄糖液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h至OD600达3.0，即得到所需蛋白。
3.重组蛋白的纯化
取1L酿酒酵母培养物，6000rpm，离心10min，收集沉淀。沉淀用50ml buffer W(IBA)重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，17000rpm 4℃离心60分钟，取上清用0.45μm滤膜过滤，进行纯化。应用Strep-Tactin XT gravity-flow柱(IBA)进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：
a.用10mL bufferW(IBA)平衡层析柱，取过滤后上清加到层析柱中。然后通过重力流缓慢流出，重复操作两次。
b.用20mL bufferW(IBA)洗涤，洗除杂蛋白。
c.用洗脱bufferBXT(IBA)洗脱所需目的蛋白，收集洗脱液，1mL/管。
d.将目的蛋白收集，并用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩蛋白。
e.在4℃条件下用FPLC平衡分子筛(Superdex S-200，GE)，流速为1ml/min。将蛋白分批上样至上样环，用分子筛进一步纯化P72蛋白。
f.收集的样品进行SDS-PAGE分析，纯化后SDS-PAGE结果中出现单一条带，大小约为73kD。将目的蛋白用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩，然后通过BCA方法测蛋白浓度。
实施例2：本发明的检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒的建立
1、最佳包被浓度的确定
将纯化的重组P72三聚体蛋白分别以1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL，按照100μL/孔4℃过夜包被96孔酶标板，次日用PBST洗涤3次，然后以1％BSA作封闭液，200μL/孔，37℃封闭2h，以ASFV抗体阳性血清样本作为一抗，并以ASFV抗体阴性血清样本作为阴性对照，37℃孵育30min，PBST洗板3次并拍干；加入1:8000稀释的酶结合物，37℃孵育30min，PBST洗板3次并拍干；每孔加入100μL TMB底物溶液37℃显色10min，用50μL终止液终止反应，酶标仪读取各孔OD450nm，计算P/N值，确定最佳包被浓度。
2、最佳封闭液的确定
将纯化的重组P72三聚体蛋白5μg/mL，按照100μL/孔4℃过夜包被96孔酶标板，次日用PBST洗涤3次，然后分别以1％BSA、1％OVA、1％明胶和5％脱脂奶粉作封闭液，200μL/孔，37℃封闭2h，以ASFV抗体阳性血清样本作为一抗，并以ASFV抗体阴性血清样本作为阴性对照，37℃孵育30min，PBST洗板3次并拍干；加入1:8000稀释的酶结合物，37℃孵育30min，PBST洗板3次并拍干；每孔加入100μL TMB底物溶液37℃显色10min，用50μL终止液终止反应，酶标仪读取各孔OD450nm，计算P/N值，确定最佳封闭液。
3、最佳血清稀释液的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，将样本血清分别以含1％BSA的PBST、含1％胎牛血清的PBST、PBST和含1％兔血清的PBST按1:100稀释，100μL/孔加入96孔酶标板反应，其他参照1中间接ELISA步骤，显色后酶标仪读取各孔OD450nm，计算P/N值，确定最佳血清稀释液。
4、最佳酶结合物稀释液的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，将酶结合物以含1％BSA的PBST、含1％胎牛血清的PBST、PBST和含1％兔血清的PBST稀释至效价为1:8000，其他参照1间接ELISA步骤，显色后酶标仪读取各孔OD450nm，计算P/N值，确定最佳酶结合物稀释液。
5、最佳酶结合物工作效价的确定
按上述已确定的最佳间接ELISA参数进行试验，稀释酶结合物至效价为1:8000、1:10000和1:12000，设置2个重复，其他参照1中间接ELISA步骤，显色后酶标仪读取各孔OD450nm，计算P/N值，确定最佳酶结合物工作效价。
6、临界值的确定
将5份经商品ELISA试剂盒检测为ASFV阴性的血清在最优反应条件下按间接ELISA程序进行试验，计算样本OD450nm的平均值
和标准差(SD)。
综上得到间接ELISA反应最佳参数见表1。
表1间接ELISA反应相关参数
实施例3：基于非洲猪瘟病毒P72三聚体检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒
1.间接ELISA检测试剂盒制备过程确定
通过以下步骤制备检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其步骤如下：
(1)包被：用重组非洲猪瘟病毒P72三聚体蛋白包被酶标板，包被浓度为5ug/ml，用量100μL/孔，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤3次，拍干。
(2)封闭：用1％BSA进行封闭，200μL/孔，37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，然后甩干。37℃干燥2h，然后真空封闭备用。
2.间接ELISA检测方法操作步骤的确定
(1)用血清稀释液稀释待检血清，加入包被板中，每孔加入100μL；同时阴、阳性对照各加入100μL，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育30min。
(2)将25×浓缩洗涤液稀释为1×洗涤液，振荡洗涤包被板3次，每次拍干。
(3)用酶结合物稀释液以1:100稀释protein L酶结合物，以100μL/孔加入包被板中，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育30min。
(4)利用1×洗涤液振荡洗涤包被板3次，每次拍干；
(5)1：1混合底物A液和底物B液，以100μL/孔加入包被板中，将包被板用盖板膜封好，置37℃孵育10min。将终止液以50μL/孔加入包被板中，在酶标仪上读取OD450nm的光吸收值；
结果判定：当阳性对照OD450nm≥1.0，且阴性对照OD450nm＜0.2时结果有效；S/P＝(样本OD450nm值-阴性对照OD450nm值)/(阳性对照OD450nm值-阴性对照OD450nm值)，当S/P≥0.2时，判为阳性；S/P＜0.1时，判为阴性，0.1≤S/P＜0.2时，判为疑似。
实施例4：灵敏度检测
1、不同包被抗原对比
将已知非洲猪瘟病毒抗体阳性血清分别做1:100、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1：64000和1:128000稀释，分别用本发明制备的基于P72三聚体蛋白的间接ELISA试剂盒和基于P30、P54及P72无序折叠单体蛋白的间接ELISA试剂盒进行检测，结果显示基于P72三聚体蛋白制备的非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA试剂盒灵敏性最高，可达1:64000倍，结果见表2。
表2不同试剂盒对不同稀释倍数非洲猪瘟病毒抗体阳性血清的灵敏性
| P72三聚体(S/P) | P72无序折叠单体蛋白(S/P) | P54(S/P) | P30(S/P) | |
| 1:100 | 1.33 | 0.932 | 0.905 | 0.939 |
| 1:1000 | 0.973 | 0.71 | 0.676 | 0.704 |
| 1:2000 | 0.922 | 0.642 | 0.598 | 0.622 |
| 1:4000 | 0.826 | 0.428 | 0.380 | 0.404 |
| 1:8000 | 0.744 | 0.302 | 0.223 | 0.257 |
| 1:16000 | 0.605 | 0.21 | 0.107 | 0.145 |
| 1:32000 | 0.403 | 0.083 | 0.036 | 0.073 |
| 1:64000 | 0.2 | 0.043 | 0.010 | 0.016 |
| 1:12800 | 0.131 | 0.007 | 0.003 | 0.004 |
| NegativeSerum | 0.005 | 0.002 | 0.000 | 0.002 |
2、不同酶结合物对比
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcalprotein A,SPA)、链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SPG)和大消化链球菌蛋白L(Peptostreptococcus proteinL,PPL)是典型的免疫球蛋白结合蛋白，它们能结合大多数哺乳动物的免疫球蛋白，但结合方式和结合谱不同。用本发明制备的基于P72三聚体蛋白的间接ELISA试剂盒和不同的酶标二抗(羊抗猪IgG-HRP、Protein A-HRP和Protein G-HRP)进行检测比较，结果显示基于Protein L-HRP的灵敏性最高，可达1:64000倍，结果见表3。
表3含不同酶标二抗的试剂盒对不同稀释倍数非洲猪瘟病毒抗体阳性血清的灵敏性
3、攻毒后检测
七周龄SPF长白猪由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，经验证无PCV、CSFV、PRRSV和PrV感染。对实验猪肌内接种低剂量非洲猪瘟病毒HLJ/HRB1/20株，接种剂量为103TCID50/头。分别在免疫后第0天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天，经前腔静脉采集血液，分离血清，用本发明制备的基于P72三聚体蛋白的间接ELISA试剂盒进行抗体检测，在第9天即可检出抗体阳性，其他不同包被抗原和酶结合物对照所能检测出抗体的时间均长于9天。
实施例5：特异性试验
用建立的间接ELISA检测方法检测已验证的非洲猪瘟病毒抗体阳性血清、猪圆环病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和非洲猪瘟病毒抗体阴性血清，所得试验结果数据进行统计学分析。除非洲猪瘟病毒抗体阳性血清外，试验结果均为阴性，这说明以重组P72三聚体蛋白为诊断抗原的ASFV间接ELISA方法特异性较好，结果见表4。
表4特异性试验结果
实施例6：重复性试验
取不同批次包被重组抗原的ELISA检测板，分别检测5份ASFV阳性血清和5份ASFV阴性血清，每份血清样品平行做5个重复孔，对结果进行统计学分析，结果显示批内重复性和批间重复性试验的检测结果均一致且与病毒中和试验结果保持一致，表明所述间接ELISA检测方法具有良好的重复性和准确性。
实施例7：与商品化ELISA试剂盒的符合性试验
取同一批号间接ELISA试剂盒对92份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒ID VET间接ELISA试剂盒检测数据比较。ID VET间接ELISA试剂盒检测数据显示92份血清样品57份阳性，35份阴性；而本发明制备的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡阳性符合数60份，阴性符合数32份，阳性符合率100％(57/57)，阴性符合率91.4％(32/35)，总符合率96.7％(89/92)。表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的准确性。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.protein L和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的序列如SEQ ID NO:1所示或在其基础上添加标签序列。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述protein L用于制备试剂盒中的酶结合物。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述protein L酶结合物为protein L辣根过氧化物酶结合物。
4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，所述试剂盒还包括酶结合物稀释液、洗涤液、底物、样本稀释液、终止液、阴性对照和阳性对照中的任意一种或两种以上。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述酶结合物稀释液为含有BSA的PBST。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述样本稀释液为含有胎牛血清的PBST。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述阳性对照为免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的正常猪血清。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述阴性对照为未免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的正常猪血清。
9.一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的酶标板和protein L酶结合物；所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体的序列如SEQ ID NO:1所示或在其基础上添加标签序列。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述protein L酶结合物为protein L辣根过氧化物酶结合物。
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Also Published As
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|---|---|
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