[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN116059404A - 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化 - Google Patents

用以治疗眼睛疾病的脱甲基化 Download PDF

Info

Publication number
CN116059404A
CN116059404A CN202210822951.1A CN202210822951A CN116059404A CN 116059404 A CN116059404 A CN 116059404A CN 202210822951 A CN202210822951 A CN 202210822951A CN 116059404 A CN116059404 A CN 116059404A
Authority
CN
China
Prior art keywords
elovl2
age
eye
amd
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210822951.1A
Other languages
English (en)
Inventor
D·斯科沃隆斯卡-克拉夫奇克
D·L·赵
D·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California San Diego UCSD filed Critical University of California San Diego UCSD
Publication of CN116059404A publication Critical patent/CN116059404A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及用以治疗眼睛疾病的脱甲基化。提供了用于治疗年龄相关性眼睛疾病或病状的方法。提供了通过施用一种或多种脱甲基化合物或作用剂来治疗受试者中的年龄相关性眼睛疾病或病状的方法。

Description

用以治疗眼睛疾病的脱甲基化
本申请是申请日为2019年5月29日，申请号为201980039446.6，发明名称为“用以治疗眼睛疾病的脱甲基化”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求分别于2018年6月11日和2018年8月9日提交的美国临时申请号62/683,292和62/716,554的优先权，这些临时申请以引用方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，该序列表采用ASCII格式以电子方式提交，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2019年5月20日，被命名为24978-0488_SL.txt并且大小为17,271字节。
技术领域
本发明涉及眼科领域和细胞生物学领域。具体地，本发明涉及年龄相关性黄斑变性(AMD)和其他眼睛疾病的治疗。
背景技术A
从人群的角度来看，实足年龄可以说是预测年龄相关性疾病风险、精神和身体机能以及死亡率的最重要的生物学特征[1]。然而，在解释相似年龄的个体之间大的生物学差异时，使用实足年龄受到限制。生物学年龄是试图量化受生活方式、遗传、疾病和环境影响的不同老化状态的概念。对环境和生活方式的选择诸如吸烟和饮食对于年龄相关性疾病也有明确的影响[2]。尽管流行病学研究已经成功地提供了针对它们对人类寿命的影响的定量评估，但是分子生物学的进展现在使得能够不将目光局限于人群死亡率问题，并且能够深入研究疾病和其他因素对单一生物体内老化的特定影响。
已经开发了基于全基因组DNA甲基化模式的老化定量模型，该模型使用来自跨广泛年龄范围的一大群人类个体的全血样本中的470000个CpG标志物处的测量结果[3]。该方法预测年龄的准确性高，并且还可以区分老化相关因素，包括性别、遗传变异和疾病[3，4]。该模型在多种组织中起作用，提示存在共同分子钟的可能性，该共同分子钟部分地通过甲基化组中的变化进行调节。此外，这些甲基化模式与细胞衰老和老化密切相关。观察到几个基因随着实足年龄的增长而逐渐变得更加甲基化。特别地，ELOVL2(延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2)非常可靠地显示随着人类年龄的增长甲基化增加，如由老化模型揭示的[3]。
ELOVL2编码参与长(C22和C24)ω3和ω6多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA)合成的跨膜蛋白[5]。具体地讲，ELOVL2能够将二十二碳五烯酸(DPA)(22：5n-3)转变为24：5n-3，这是22：6n-3即二十二碳六烯酸(DHA)的前体[6]。DHA是视网膜和脑中的主要多不饱和脂肪酸(PUFA)。DHA在光感受器中的存在促进健康的视网膜功能，并避免受到强光和氧化应激的损害。低ELOVL2表达已与低水平的DHA联系在一起[7]，而低水平的DHA又与年龄相关性黄斑变性(AMD)等许多其他视网膜变性疾病相关联[8]。一般来讲，PUFA参与关键的生物学功能，包括产生能量、调节炎症和维持细胞膜完整性。因此，ELOVL2甲基化可能通过调节不同的生物学途径而在老化过程中发挥作用。
AMD是黄斑变性疾病，是发达国家老年人失明的首要原因。它是涉及遗传因素、环境因素和代谢因素的多因素疾病，目前尚无治愈方法或有效的预防方法。许多基因已被鉴定为危险因素，但很多仍然是未知的。随着AMD的进展，视觉中心变得模糊，最终可能出现盲点。AMD以两种形式出现：湿性AMD和干性AMD。在影响约90％AMD患者的干性AMD中，无细胞多形碎片(称为玻璃疣)的病灶沉积通常是最先观察到的该疾病的临床特征。ELOVL4是另一种参与VLC-PUFA合成的脂肪酸延伸酶，它涉及斯塔加特(Stargardt)黄斑营养不良，这是一种导致视力丧失的青少年型黄斑变性[9，10]。
AMD与视网膜中的氧化应激相关联[11]。氧化应激可导致炎症并促进巨噬细胞活化的发展[12]。氧化的磷脂已被证明是氧化应激的可靠标志物，它们通过与视网膜色素上皮(RPE)和巨噬细胞结合、激活下游炎症级联反应而引发炎症[13]。在玻璃疣和布鲁赫膜(Bruch’s membrane)中也已发现了氧化修饰的蛋白质和脂质[14]。磷脂酰胆碱是在视网膜中高度富集的磷脂，它含有头部基团磷酸胆碱。磷酸胆碱的氧化表位可以被磷酸胆碱的天然抗体TEPC-15识别[15]，并且已被证明在人AMD眼中与玻璃疣共定位[16]。HTRA1是与AMD相关联的主要蛋白质之一，也被发现在AMD眼中与玻璃疣共定位[17]。此外，在玻璃疣内已发现了补体级联的几种组分，这些组分包括C3补体片段、C5和膜攻击复合物C5b-9[18]。
需要治疗年龄相关性黄斑变性的新方法。
发明内容
本公开提供了用于治疗年龄相关性眼睛疾病和病状的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种核酸脱甲基化合物。本发明提供了用于治疗年龄相关性眼睛疾病的方法。
在一些实施方案中，本发明规定，年龄相关性眼睛疾病或病状是年龄相关性黄斑变性。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化合物选自由以下项组成的组：5-氮杂胞苷、地西他滨、折布拉林(zebularine)、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因、肼屈嗪、丙戊酸和EGCG。
在一些实施方案中，本发明规定，将组合物配制用于眼科施用。
在一些实施方案中，本发明规定，施用是经非肠道途径进入眼睛。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗年龄相关性眼睛疾病或病状的方法，该方法包括在有需要的患者中增加ELOVL2的表达。
在一些实施方案中，本发明规定，通过ELOVL2启动子的脱甲基化来增加表达。
在一些实施方案中，本发明规定，通过使用腺相关病毒递送向有需要的患者施用有效量的ELOVL2 mRNA来增加表达。
在一些实施方案中，本发明提供了眼科药物组合物，该眼科药物组合物包含在眼科可接受的制剂中的核酸脱甲基化合物。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化合物选自由以下项组成的组：5-氮杂胞苷、地西他滨、折布拉林、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因和EGCG。
在另一些实施方案中，该方法包括使用腺相关病毒递送向有需要的受试者施用有效量的ELOVL2 mRNA。
具体地，本申请提供了以下内容：
1.一种用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病或病状的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的至少一种脱甲基化剂。
2.根据项目1所述的方法，其中所述脱甲基化剂增加延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2基因(ELOVL2)的表达并且/或者增加ELOVL2酶的水平并且/或者增加视网膜22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
3.根据项目1或2所述的方法，其中所述脱甲基化剂选自5-氮杂胞苷、地西他滨、折布拉林、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因、肼屈嗪、丙戊酸和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
4.根据项目1至3所述的方法，其中所述脱甲基化剂被施用于所述眼睛。
5.根据项目1至4所述的方法，其中所述脱甲基化剂通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用于所述眼睛。
6.根据项目1至5所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
7.根据项目6所述的方法，其中所述AMD是干性AMD或湿性AMD。
8.根据项目7所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
9.根据项目1至8所述的方法，其中所述脱甲基化剂作为时释性制剂施用。
10.根据项目1至9所述的方法，其中所述脱甲基化剂是地西他滨。
11.一种用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病或病状的方法，所述方法包括通过向所述眼睛施用有效量的编码ELOVL2的mRNA来增加所述眼睛中的ELOVL2酶和/或22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
12.根据项目11所述的方法，其中所述mRNA使用病毒载体来递送。
13.根据项目12所述的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
14.根据项目11所述的方法，其中所述mRNA使用非病毒载体诸如脂质体或微米粒子/纳米粒子来递送。
15.根据项目11至14所述的方法，其中所述作用剂通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用于所述眼睛。
16.根据项目11至15所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
17.根据项目16所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
18.一种用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病和病状的方法，所述方法包括通过使用ELOVL2表达载体的基因疗法来增加所述眼睛中的ELOVL2酶和/或所述眼睛中的22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
19.根据项目18所述的方法，其中所述载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
20.根据项目18至19所述的方法，其中所述ELOVL2表达载体通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用。
21.根据项目18至20所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
22.根据项目21所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
23.一种方法，所述方法包括选择需要治疗年龄相关性眼睛疾病的患者，以及向所述患者的所述眼睛施用有效量的一种或多种脱甲基化剂和/或编码ELOVL2的mRNA和/或ELOVL2表达载体，由此治疗所述年龄相关性疾病。
24.根据项目23所述的方法，其中通过确定所述患者的所述眼睛中的ELOVL2甲基化和/或ELOVL2表达来选择所述患者。
25.根据项目23至24所述的方法，其中所述脱甲基化剂是地西他滨。
26.根据项目23至25所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
27.根据项目26所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
28.一种方法，所述方法包括使用脱甲基化剂来治疗年龄相关性眼睛疾病，任选地干性AMD。
29.根据项目28所述的方法，其中所述脱甲基化剂是地西他滨。
30.一种方法，所述方法包括使用编码ELOVL2的mRNA来治疗年龄相关性眼睛疾病，任选地干性AMD。
31.一种方法，所述方法包括使用ELOVL2表达载体来治疗年龄相关性眼睛疾病，任选地干性AMD。
32.一种含有一定浓度的在项目3中列出的脱甲基化剂的制剂，其玻璃体内施用1uL至100uL构成介于5ng与500ng之间的有效量。
33.一种含有一定浓度的在项目3中列出的脱甲基化剂的制剂，其玻璃体内施用1ul至100uL构成介于500ng与1500ng之间的有效量。
34.一种含有一定浓度的在项目3中列出的脱甲基化剂的制剂，其玻璃体内施用1ul至100uL构成介于1500ng与4500ng之间的有效量。
35.根据项目32至34所述的制剂，其中所述制剂基本上是水性的。
36.根据项目32至34所述的制剂，其中所述制剂基本上是无水的。
37.根据项目32至36所述的制剂，其中所述制剂是立即释放制剂和/或延长释放制剂。
38.根据项目32至37所述的制剂，其中所述脱甲基化剂是地西他滨。
39.一种治疗年龄相关性眼睛疾病的方法，所述方法包括玻璃体内施用项目32至38所述的制剂。
40.根据项目39所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
41.根据项目39至40所述的方法，其中所述年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
42.一种制备用于根据项目1至31所述的方法施用的药物的方法。
附图说明
图1A至图1D示出了WI-38细胞中的ELOVL2表达和甲基化。图1A示出了通过qPCR测定的WI-38细胞在PD35、45、55时的ELOVL2表达。输入％越高表示DNA甲基化越高。(**p＜0.005ANOVA，*p＜0.05，t检验)。图1B示出了通过甲基化DNA免疫沉淀之后是qPCR测定的WI-38细胞的ELOVL2启动子区域中的甲基化水平。引物扩增了含有CpG标志物cg16867657、cg24724428和cg21572722的区域。图1C示出了WI-38敲低细胞和荧光素酶敲低对照的增殖，如通过随时间推移所覆盖的表面积来测量。图1D示出了通过β-半乳糖苷酶染色测定的WI-38敲低细胞中的衰老百分比。(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.005，t检验)。
图2A至图2C示出了在PD52 WI-38细胞中操纵DNA甲基化。图2A示出了如通过MeDIP之后是qPCR测得的在未经处理的对照和经5-Aza-dc处理的WI-38细胞中的ELOVL2启动子甲基化。图2B示出了通过qPCR测定的在未经处理的对照和经5-Aza-dc处理的WI-38细胞中的ELOVL2表达。图2C示出了通过β-半乳糖苷酶染色测定的在用2μM 5-Aza-dc处理的WI-38细胞中的衰老百分比。(n＝3，*p＜0.05，t检验)。
图3A至图3E示出了ELOVL2和视网膜。图3A示出了通过qPCR测定的在不同年龄小鼠的小鼠视网膜中的ELOVL2表达。图3B示出了不同年龄小鼠视网膜中的ELOVL2的蛋白质印迹；星号表示非特异性条带。图3C示出了不同年龄小鼠视网膜中的ELOVL2启动子甲基化。图3D示出了野生型小鼠在2月龄、6月龄、12月龄和24月龄时的自发荧光成像。暗视反应的代表性ERG曲线在图像下方示出。图3E通过ERG b-波振幅示出了不同年龄小鼠中的暗视反应。(n＝4，**p＜0.005，ANOVA)。
图4A至图4E示出了ELOVL2命运开关(fate-switch)小鼠中的视网膜表型。图4A示出了CRISPR-Cas9介导的改变ELOVL2的底物特异性的策略。图4A按出现顺序分别公开了SEQID NO 17-20。图4B示出了野生型和纯合命运开关小鼠眼底的自发荧光成像。暗视ERG反应在图像下方以曲线示出。图4C示出了6个月的野生型小鼠和移码突变小鼠中来自ERG的暗视b-波振幅。图4D示出了WT和C217W小鼠视网膜中Htral和T-15的免疫染色。箭头指示玻璃疣样聚集体。图4E示出了对HTRA1和T-15阳性的玻璃疣样聚集体的定量。(n＝4，*p＜0.05，**p<0.005，t检验)。
图5A至图5D示出了小鼠眼中的5-Aza-dc注射。图5A示出了用PBS或5-Aza-dc眼内注射后通过MeDIP测定的小鼠视网膜中的ELOVL2甲基化。图5B示出了用PBS或5-Aza-dc眼内注射后通过qPCR测定的小鼠视网膜中的ELOVL2表达。图5C示出了用PBS或5-Aza-dc眼内注射后小鼠眼中的暗视ERG反应。图5D示出了来自ERG的暗视b-波振幅。(n＝4，*p<0.05，t检验)。
图6A至图6E示出了WI-38细胞的老化特征。图6A示出了WI-38细胞的增殖，如通过在群体倍增数(PD)35、45、55时所覆盖的表面积来测量。图6B示出了通过β-半乳糖苷酶染色测定的WI-38细胞中的衰老百分比。图6C示出了WI-38细胞的细胞形态和β-半乳糖苷酶染色的代表性图像。图6D示出了与荧光素酶敲低对照相比，ELOVL2敲低WI38细胞的细胞形态和β-半乳糖苷酶染色的代表性图像。图6E示出了通过qPCR测定的WI-38细胞中的ELOVL2敲低效率。(n＝3，**p＜0.005，t检验)。
图7A至图7E示出了IMR-90细胞的老化特征。图7A示出了IMR-90细胞的增殖，如通过在群体倍增数(PD)35、45、55时所覆盖的表面积来测量。图7B示出了通过β-半乳糖苷酶染色测定的IMR-90细胞中的衰老百分比。图7C示出了通过qPCR测定的IMR-90细胞中的ELOVL2表达。图7D示出了通过qPCR测定的IMR-90细胞中的ELOVL2敲低效率。图7E示出了在IMR90细胞中使用荧光素酶敲低对照时，ELOVL2敲低形态的代表性图像。(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.005，t检验)。
图8A至图8D示出了WT小鼠视网膜的老化特征。图8A示出了在2月龄、6月龄、1岁和2岁时WT小鼠视网膜的自发荧光图像。图8B示出了2月龄、6月龄、1岁和2岁的WT小鼠中ERG的暗视反应。图8C示出了3月龄和2岁的野生型小鼠中来自ERG的振荡电位。图8D示出了3月龄和2岁的野生型小鼠中来自ERG的10Hz闪烁光反应。
图9A至图9B。图9A示出了艾姆斯(Ames)小鼠的小鼠视网膜MeDIP。输入％越高表示DNA甲基化越高。Y＝3月龄WT，O＝2岁WT，AY＝3月龄艾姆斯，AO＝2岁艾姆斯。图9B示出了通过qPCR测定的艾姆斯小鼠中的ELOVL2表达。(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.005，t检验)。
图10A至图10E示出了ELOVL2-ELOVL5命运开关小鼠。图10A示出了人与小鼠之间的ELOVL2和ELOVL5氨基酸序列相似性。红色箭头代表靶向的C217W突变。图10A按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 21-24。图10B示出了CAS9的靶向切割位点。图10C示出了ELOVL2修复寡核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。图10D示出了WT和C217W的蛋白质序列比对。突变以蓝色突出显示。图10D按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 26-29。图10E示出了ELOVL2突变型小鼠的脱靶分析。图10E按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 30、31、30和32。
图11A至图11D示出了C217W小鼠视网膜的老化特征。图11A示出了在4月龄、6月龄、8月龄和1岁时WT小鼠视网膜与C217W小鼠视网膜的自发荧光图像。图11B示出了4月龄、6月龄和8月龄的WT小鼠与C217W小鼠中ERG的暗视反应。图11C示出了野生型小鼠和移码突变小鼠中来自ERG的振荡电位。图11D示出了野生型小鼠和移码突变小鼠中来自ERG的10Hz闪烁光反应。
图12A至图12D示出了玻璃疣样聚集体的表征。图12A示出了WT和C217W小鼠视网膜中Htral、C3和C5b-9的免疫染色。箭头指示玻璃疣样聚集体。图12B示出了对C3和C5b-9阳性的玻璃疣样聚集体的定量。图12C示出了WT和C217W小鼠视网膜中C3的免疫染色。箭头指示玻璃疣样聚集体。图12D示出了对C3阳性的玻璃疣样聚集体的定量。(n＝4，**p＜0.005，t检验)。
图13示出了在用PBS和5-Aza-dc注射的小鼠眼中ERG的暗视反应。
具体实施方式
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特定地并且单独地指示以引用的方式并入一般。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。此类技术在诸如下列文献中有充分的解释：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Animal CellCulture(R.I.Freshney编辑，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987，和定期更新)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编辑，1994)；Remington，The Scienceand Practice of Pharmacy，第20版，(Lippincott，Williams&Wilkins 2003)和Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第22版，(Pharmaceutical Pressand Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences 2012)。
当介绍本发明或其优选的实施方案的要素时，不使用数量词修饰时旨在表示存在所述要素中的一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的并且意指可以存在除所列要素之外的附加要素。
当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一个可以单独使用或与所列出的项目中的任何一个或多个组合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一个或两个，即单独的A、单独的B或组合的A和B。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C或组合的A、B和C。
应理解，本文所述的本发明的各方面和实施方案包括“由各方面和实施方案组成”和“基本上由各方面和实施方案组成”。
应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应当认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围诸如从1至6的描述应当被认为已经具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及所述范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。值或范围在本文中还可以表达为“约”、从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这类值或范围时，所公开的其他实施方案包括叙述的具体值，从一个特定值和/或至其他特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施方案。还将理解，存在其中公开的多个值，并且每个值在本文中还被公开为除所述特定值本身之外的“约”所述特定值。在一些实施方案中，“约”可以用于意指例如在所叙述值的10％内、在所叙述值的5％内或在所叙述值的2％内。
如本文所用，“患者”或“受试者”意指待治疗的人类或动物受试者。
如本文所用，术语“药物组合物”是指药物可接受的组合物，其中该组合物包含脱甲基化合物，并且在一些实施方案中还包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物可以是组合。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指除动物中(并且更特别地说人类和/或非人类哺乳动物中)安全使用的其他制剂之外的，由联邦或州政府的监管机构批准的，或者在美国药典、其他普遍认可的药典中列出的。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指与脱甲基化合物一起施用的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或媒介物。此类载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。抗菌剂诸如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；和用于调节张力的作用剂诸如氯化钠或右旋糖也可以是载剂。用于生产组合物与载剂的组合的方法是本领域的技术人员已知的。在一些实施方案中，措辞“药学上可接受的载剂”旨在包括任何和所有的与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和作用剂用于药学活性物质在本领域中是众所周知的。参见例如Remington，The Science and Practice ofPharmacy，第20版，(Lippincott，Williams&Wilkins 2003)。除非到任何常规介质或作用剂与活性化合物不相容的程度，否则设想在组合物中使用此类物质。
如本文所用，“治疗有效的”是指脱甲基化合物的足以治疗或改善、或者以某种方式减轻与年龄相关性眼睛疾病(诸如但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD))相关联的症状的量。当关于一种方法使用时，该方法足以有效地治疗或改善、或者以某种方式减轻与年龄相关性眼睛疾病相关联的症状。例如，关于年龄相关性眼睛疾病的有效量是足以阻止或预防发作的量；或者如果疾病病理已开始，则是足以缓和、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展，或者以其他方式减轻疾病的病理后果的量。在任何情况下，有效量可以以单剂量或分剂量给予。
如本文所用，术语“治疗”至少涵盖与患者的年龄相关性眼睛疾病相关联的症状的改善，其中改善在广义上用于指至少参数(例如，与所治疗的疾病或病状相关联的症状)大小的降低。因此，“治疗”还包括以下情况：疾病、病症或病理状况、或者至少与之相关联的症状被完全抑制(例如，防止发生)或停止(例如，终止)，使得患者不再患有所述病状，或至少是表征所述病状的症状。
术语“组合”是指一种剂量单位形式的固定组合，或指用于联合施用的部分的套件，其中一种或多种脱甲基化合物和组合伴侣(例如，下文所解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共作用剂”)可以同时独立施用或在时间间隔内分别施用。在一些情况下，组合伴侣表现出配合作用，例如协同效应。如本文所用，术语“共同施用”或“联合施用”等意在涵盖将所选择的组合伴侣施用于对其有需要的单个受试者(例如，患者)，并且旨在包括其中不一定通过相同的施用途径或在同一时间施用的治疗方案。如本文所用，术语“药物组合”意指通过混合或组合多于一种活性成分得到的产品，并且包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”意指活性成分(例如，化合物和组合伴侣)均以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，化合物和组合伴侣)均作为单独的实体同时地、合并地或相继地以无特定时间限制的形式施用于患者，其中此类施用在患者体内提供了治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如，施用三种或更多种活性成分。
黄斑变性是用于描述以与布鲁赫膜、脉络膜、神经视网膜和/或视网膜色素上皮异常相关联的中央视力逐渐丧失为特征的一族疾病的临床术语。黄斑在视网膜的中央，其直径为约1/3cm至1/2cm。黄斑提供详细的视觉，尤其是在中央(中央凹)，因为视锥细胞密度较高。血管、神经节细胞、内核层和细胞以及丛状层都移位到一侧(而不是停留在一侧上方)，从而允许光线以更直接的路径到达视锥细胞。视网膜下方是脉络膜(一组嵌入纤维组织内的血管)，和覆盖脉络膜层的色素上皮(PE)。脉络膜血管为视网膜(尤其是其视觉细胞)提供营养。脉络膜和PE在眼睛的后部发现。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是最普遍的黄斑变性，与视野中央部分视敏度的逐渐丧失、色觉变化以及异常的暗适应和敏感性相关联。AMD的两种主要临床表现被称为干性或萎缩性形式，以及湿性或渗出性形式。干性形式与中央视网膜或黄斑的萎缩性细胞死亡相关联，而中央视网膜或黄斑是用于诸如阅读、驾驶或识别面部等活动的精细视觉所必需的。这些干性AMD患者中约10％至20％进展成称为湿性AMD的第二种形式的AMD。
湿性(新生血管/渗出性)AMD是由黄斑下方视网膜后面的血管异常生长和血管渗漏引起的，导致视网膜移位、出血和疤痕形成。这导致在几个月到几年的时期内视力退化。然而，患者可能遭受视力的快速丧失。所有湿性AMD病例均来源于晚期干性AMD。湿性形式占AMD所致失明的85％。在湿性AMD中，随着血管渗漏流体和血液，形成破坏中央视网膜的疤痕组织。
青光眼是失明的首要原因。尽管术语“青光眼”应用于大量不同的眼睛病症，但是所有类型的青光眼所共有的现象是眼内压力升高而导致的视神经破坏。在大多数形式的青光眼中，直到出现明显的视力丧失之前，个体也不会感觉到压力升高，诸如疼痛或视敏度下降。在健康的眼睛中，流体(房水)从前房经过过滤器状的组织块(小梁网)，并从那里到达巩膜中相连的一系列静脉。在最常遇到的青光眼形式(开角型青光眼)中，压力升高因通过小梁网的流出通道受阻而引起。青光眼的治疗方法已采取两种一般的形式，即药物治疗和手术。
糖尿病是导致近1600万美国人死亡的第四大死因，其中三分之一未被诊断，每年花费超过1000亿美元，占美国医疗保健费用的15％。每年新发的糖尿病病例约有80万例。到2030年，这个数字可能达到5000万，而全世界至少达到3亿。在美国，糖尿病是20岁至74岁人群中新发失明的首要原因。在诊断为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)后不久，视网膜病就开始发展，并且在15年后，患病率几乎为100％。美国有100万人患有IDDM或I型糖尿病。在非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)或II型糖尿病(目前有1500万)中，约21％的患者在诊断时患有视网膜病，而60％的患者在20年后出现视网膜病。II型糖尿病患者在过去的30年中已增至三倍，涉及一半的65岁以上的美国人。增生性视网膜病在10％至20％的NIDDM中出现。BrechnerRJ等人，JAMA 1993；270：1714-1718。
黄斑变性或年龄相关性黄斑变性(AMD)影响视网膜的中央部分，并且是美国65岁以上人群失明的首要原因。AMD影响1300万人并在约120万人中引起损伤。75岁以上的患者中约有30％患有AMD，其余23％的患者将在五年内患上AMD。随着年龄的增长，AMD的患病率从55岁至64岁患者的16.8％上升到65岁至74岁患者的25.6％，而75岁以上的患者高达42％。目前对于干性或萎缩性AMD尚无已知的治愈方法，这种形式的AMD的特征在于硬或软的玻璃疣(细胞碎片的沉积物)、视网膜色素上皮(RPE)的变化，或者光感受器和RPE的萎缩。这种形式占所有病例的大约90％。其余AMD病例具有“湿性”形式，其特征在于新血管形成和渗出。Pratt S G，Review of Ophthalmology，1998年8月：42-50。
本发明涉及用于治疗眼相关性病状或疾病的脱甲基化剂，所述病状或疾病诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病、眼血管生成(诸如影响脉络膜、角膜或视网膜组织的眼新血管形成)和涉及基因(诸如ELOVL2)甲基化的其他眼睛病状。AMD的治疗包括干性和湿性这两种形式的AMD。
本公开提供了用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病或病状的方法，该方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的至少一种脱甲基化剂。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂增加延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2基因(ELOVL2)的表达并且/或者增加ELOVL2酶的水平并且/或者增加视网膜22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂选自5-氮杂胞苷、地西他滨、折布拉林、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因、肼屈嗪、丙戊酸和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下(subtenon)或后部近巩膜(posterior juxtascleral)途径施用于眼睛。
在一些实施方案中，本发明规定，年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂作为时释性(time-released)制剂施用。
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病或病状的方法，该方法包括通过向眼睛施用有效量的编码ELOVL2的mRNA来增加眼睛中的ELOVL2酶和/或22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平；其中该mRNA使用病毒载体来递送。
在一些实施方案中，本发明规定，病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，本发明规定，该mRNA使用非病毒载体诸如脂质体或微米粒子/纳米粒子来递送。
在一些实施方案中，本发明规定，作用剂通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用于眼睛。
在一些实施方案中，本发明规定，年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗、改善或预防年龄相关性眼睛疾病和病状的方法，该方法包括通过使用ELOVL2表达载体的基因疗法来增加眼睛中的ELOVL2酶和/或眼睛中的22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
在一些实施方案中，本发明规定，载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，本发明规定，ELOVL2表达载体通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用。
在一些实施方案中，本发明规定，年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症；并且其中年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括选择需要治疗年龄相关性眼睛疾病的患者，并且向该患者的眼睛施用有效量的一种或多种脱甲基化剂和/或编码ELOVL2的mRNA和/或ELOVL2表达载体，由此治疗年龄相关性疾病。
在一些实施方案中，本发明规定，通过确定患者眼睛中ELOVL2的甲基化和/或ELOVL2表达来选择患者。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂是地西他滨。
在一些实施方案中，本发明规定，年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症；并且其中年龄相关性眼睛疾病是干性AMD。
在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括使用编码ELOVL2的mRNA来治疗年龄相关性眼睛疾病，任选地干性AMD。
在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括使用ELOVL2表达载体来治疗年龄相关性眼睛疾病，任选地干性AMD。
在一些实施方案中，本发明提供了含有一定浓度的所列出的脱甲基化剂的制剂，由此玻璃体内施用1uL至100uL构成介于5ng与500ng之间的有效量。
在一些实施方案中，本发明提供了含有一定浓度的所列出的脱甲基化剂的制剂，由此玻璃体内施用1ul至100uL构成介于500ng与1500ng之间的有效量。
在一些实施方案中，本发明提供了含有一定浓度的所列出的脱甲基化剂的制剂，由此玻璃体内施用1ul至100uL构成介于1500ng与4500ng之间的有效量。
在一些实施方案中，本发明规定，制剂基本上是水性的。在一些实施方案中，本发明规定，制剂基本上是无水的。在一些实施方案中，本发明规定，制剂是立即释放制剂和/或延长释放制剂。
在一些实施方案中，本发明规定，脱甲基化剂是地西他滨。
在一些实施方案中，本发明提供了制备用于施用的药物的方法。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语以及任何首字母缩略词均具有与本发明领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践中，但是本文描述了示例性的方法、装置和材料。
如本文所用，并且除非另外指明，否则术语“预防”是指预防疾病或病症或者其一种或多种症状的发作、复发或传播。在某些实施方案中，该术语是指在症状发作之前，尤其是针对具有本文所提供的疾病或病症的风险的受试者，在有或没有一种或多种其他附加的活性剂的情况下，用本文所提供的化合物或剂型治疗或者施用本文所提供的化合物或剂型。该术语涵盖抑制或减轻特定疾病的症状。在某些实施方案中，具有家族病史的受试者是预防方案的潜在候选者。在某些实施方案中，具有复发症状史的受试者也是预防方案的潜在候选者。就这一点而言，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换使用。
如本文所用，并且除非另外指明，否则化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或病症、或者防止其复发的量。化合物的预防有效量意指单独的或者与一种或多种其他作用剂组合使用的治疗剂的量，该量在疾病的预防中提供预防益处。术语“预防有效量”可以涵盖改善总体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。如本文所用，并且除非另外指明，否则术语“受试者”在本文中被定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等。在具体实施方案中，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中提到例如哺乳动物受试者(诸如人)时可互换使用。在特定实施方案中，患有AMD的受试者是先前已被诊断患有年龄相关性黄斑变性的受试者。
如本文所用，并且除非另外指明，否则本文所述的化合物旨在涵盖所有可能的立体异构体，除非指定了特定的立体化学。当化合物的结构异构体可经由低能量垫垒相互转化时，该化合物可以作为单一互变异构体或互变异构体的混合物存在。这可以呈质子互变异构的形式；或在例如含有芳族部分的化合物中呈所谓的价互变异构的形式。
如本文所用，并且除非另外指明，否则本文所提及的类似物诸如胞苷旨在涵盖胞苷类似物的游离碱，或其盐、溶剂化物、水合物、共晶体、复合物、前药、前体、代谢物和/或衍生物。在某些实施方案中，本文所提及的胞苷类似物涵盖胞苷类似物的游离碱，或其盐、溶剂化物、水合物、共晶体或复合物。在某些实施方案中，本文所提及的胞苷类似物涵盖胞苷类似物的游离碱，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
本发明的特征在于使用作用剂将ELOVL2的启动子脱甲基化，以诱导该基因的表达和改善哺乳动物的视觉功能，其中使用某些化合物诸如5-氮杂胞苷、地西他滨、折布拉林、普鲁卡因酰胺、普鲁卡因、普鲁卡因、表没食子儿茶素没食子酸酯、丙戊酸、肼屈嗪以及类似的化合物和衍生物。这些物质在本文中统称为“脱甲基化剂”。
在一个实施方案中，脱甲基化剂例如通过结膜下、玻璃体内、视网膜下或眼球后注射而眼内注射。对于结膜下注射，可以使用在约1ng/ml至约500μg/ml范围内的浓度。对于玻璃体内注射，可以使用在约1μg/0.1ml至约1000μg/0.1ml范围内的浓度；可以使用的一种浓度为约50μg/0.1ml。对于视网膜下注射，可以使用在约1μg/0.1ml至约100μg/0.1ml范围内的浓度。对于眼球后注射，可以使用在约20μg/ml至约1000μg/ml范围内的浓度。脱甲基化剂可以在例如与脂质体结合的水基溶液中施用，或者可以溶解在有机溶剂中。在另一个替代性实施方案中，脱甲基化剂也可以在惰性的生理上可接受的载剂(诸如微球、脂质体、胶囊或聚合物基体)中提供，通过注射或通过手术植入眼睛中或眼睛上。可以使用的水性溶剂包括但不限于0.9％盐水和5％右旋糖。可以使用的有机溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)或醇。植入物可以提供脱甲基化剂的时释性形式，以获得恒定剂量的药物。本发明还公开了通过眼内施用含有脱甲基化剂的组合物来减少糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和/或视网膜色素变性的发作或进展的方法，该脱甲基化剂单独地或与同脱甲基化剂有关的其他化合物一起作为活性剂，该活性剂为药学上可接受的制剂的形式并且其量为不引起显著毒性的有效量。该组合物可以含有脱甲基化剂作为唯一的活性剂，其他作用剂是那些不会在实质上影响脱甲基化剂的基本特性的物质。替代性地，该组合物除脱甲基化剂之外还可以含有其他活性剂。该组合物可以被注射在眼睛中或植入眼睛中。本发明涵盖通过眼内施用含有脱甲基化剂作为活性剂的组合物来治疗患者的方法，该活性剂为药学上可接受的制剂的形式并且其量有效地治疗黄斑变性、视网膜病或视网膜色素变性而没有显著眼毒性。该组合物被注射在眼睛中或植入眼睛中，并且可以以时释性制剂的形式施用。持续释放制剂(诸如基体)可以负载有一定量的脱甲基化剂，该脱甲基化剂如果以非受控速率或超治疗量释放可能是有毒的，但是被配制为在一段时间内释放无毒治疗量的脱甲基化剂。例如，基体可以含有从约1微克至超过10微克的脱甲基化剂。脱甲基化剂可以持续释放无毒维持剂量的脱甲基化剂。这样的基体可以是可扩散的具有壁的储库，并且可以是脂质、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己内酯、聚(乙醇酸)和/或聚(乳酸)。
脱甲基化剂可以使用玻璃体内注射(进入玻璃体)、结膜下注射(进入结膜下)、视网膜下注射(在视网膜下)或眼球后注射(在眼球后方)而眼内注射。对于结膜下注射，可以使用在约1ng/ml至约500μg/ml范围内的脱甲基化剂浓度。对于玻璃体内注射，可以使用在约10.0ng/0.1ml至约1000μg/0.1ml范围内的脱甲基化剂剂量。对于眼球后注射，可以使用在约20μg/ml至约1000μg/ml范围内的脱甲基化剂剂量。对于视网膜下注射，可以使用在约1μg/0.1ml至约100μg/0.1ml范围内的脱甲基化剂剂量。但是这些剂量与速释制剂有关，而对于更为缓释的制剂，则将需要更高浓度的脱甲基化剂。脱甲基化剂可以以其中它是唯一活性剂的组合物的形式眼内施用。替代性地，脱甲基化剂可以与相关化合物一起以组合物的形式眼内施用。相关化合物可以包括免疫抑制剂，其包括但不限于他克莫司、环磷酰胺、西罗莫司、阿托泊苷(atoposide)、噻替哌(thioepa)、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(依木兰)、干扰素、英夫利昔单抗、依那西普、麦考酚酸莫酯、15-脱氧精胍菌素、沙利度胺、格拉默、来氟米特、长春新碱、阿糖胞苷等。在一个实施方案中，所述含有脱甲基化剂的组合物以不会对眼睛产生显著毒性的量或剂量施用。如本文所用，没有显著毒性既涵盖不存在任何毒性表现，也涵盖本领域技术人员认为其危害不足以导致需要减少或停止治疗的毒性表现。可以使用0.9％NaCI或5％右旋糖、或者有机溶剂(诸如二甲基亚砜(DMSO)或醇)来稀释静脉内溶液形式的脱甲基化剂，以实现指定浓度。眼内施用可以通过先前描述的任何途径和制剂来进行。对于注射，可以使用溶液剂、乳剂、混悬剂、微球或脂质体的胶囊制剂等。脱甲基化剂可以作为眼植入物通过外科手术施用。作为一个示例，具有聚乙烯醇或聚乙酸乙烯酯的可扩散壁并且含有毫克量脱甲基化剂的储库容器可以被植入巩膜中或巩膜上。作为另一个示例，毫克量的脱甲基化剂可以被掺入到尺寸为约2mm×4mm并且由聚合物(诸如聚己内酯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)或聚酸酐)或者脂质(诸如癸二酸)制成的聚合物基体中，并且可以被植入巩膜上或眼睛中。这通常是在患者接受表面或局部麻醉并且在角膜后方开一个小切口(3mm至4mm)的情况下完成的。然后将含有脱甲基化剂的基体穿过切口插入，并使用9-0尼龙缝合到巩膜上。脱甲基化剂可以被包含在用于注射到眼睛中的惰性基体内。作为惰性基体的一个示例，脂质体可以由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)诸如卵磷脂酰胆碱(PC)(一种具有低热转变的脂质)来制备。脂质体使用本领域技术人员已知的标准规程来制备。将量在从纳克量至微克量至毫克量范围内的脱甲基化剂添加到卵PC溶液中，然后亲脂性药物与脂质体结合。可以在眼内植入时释性的药物递送系统，以导致活性剂在一段时间内持续释放。可植入结构可以是先前公开的聚合物(例如，聚己内酯、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚酸酐)或可以被配制为微球的脂质中的任一者的胶囊的形式。作为一个说明性示例，可以将脱甲基化剂与聚乙烯醇(PVA)混合，然后干燥该混合物并用乙烯乙酸乙烯酯包衣，然后再次用PVA冷却。在用于眼内注射的制剂中，脂质体胶囊由于细胞消化而降解，并且可以是缓释药物递送系统，从而允许患者随时间推移不断地暴露于药物。在时释性制剂中，微球、胶囊、脂质体等可以含有一定浓度的脱甲基化剂，该脱甲基化剂如果以单次剂量(bolus dose)施用可能是有毒的。然而，配制时释性制剂，使得在任何时间段内释放的浓度都不超过毒性量。这例如通过媒介物的各种制剂(包衣或未包衣的微球、包衣或未包衣的胶囊、脂质或聚合物组分、单层或多层结构，以及上述形式的组合等)来实现。其他变量可以包括患者的药代动力学-药效动力学参数(例如，体重、性别、血浆清除率、肝功能等)。根据制剂中提供的脱甲基化剂的量，可以从单次植入或注射开始在几年的时期内向患者给药。作为说明性而非限制性的示例，胶囊可以装有1mg至2mg的脱甲基化剂；如果胶囊被配制成每天释放几微克药物，则可以向患者给药约1000天，或将近三年。作为另一个示例，如果胶囊装有5mg的药物，则可以向患者给药约十五年。这样的制剂提供的益处包括精确给药和患者便利性提高，因为在一些情况下，十年仅需要干预一次或两次或甚至更低的频率。微球、微囊、脂质体等的形成和装载以及它们的眼植入是本领域技术人员已知的标准技术，例如，使用更昔洛韦持续释放植入物来治疗巨细胞病毒性视网膜炎，这些标准技术公开于下列文献中：VitreoretinalSurgical Techniques，Peyman等人编辑(Martin Dunitz.London 2001，第45章)；Handbookof Pharmaceutical Controlled Release Technology，Wise编辑(Marcel Dekker，NewYork 2000)，这些文献的相关章节以引用方式整体并入本文中。可以使用前述方法和制剂，将脱甲基化剂单独地或与其他作用剂组合地眼内施用而没有显著毒性，以治疗视网膜病(诸如在糖尿病患者中发生的视网膜病)、黄斑变性和视网膜色素变性。
本文提供了使用胞苷类似物或其盐、溶剂化物、水合物、前体和/或衍生物来治疗眼睛疾病(包括AMD)的方法。本文提供的某些方法包括使用两种或更多种活性剂(包括5-氮杂胞苷)的组合来治疗眼睛疾病。
已在临床上测试了核苷类似物用于治疗某些癌症，但未用于眼睛疾病。核苷类似物5-氮杂胞苷(也称为4-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1，3，5-三嗪-2(1H)-酮；国家服务中心(National Service Center)名称NSC-102816；CAS登记号320-67-2；阿扎胞苷；Aza和AZA；并且目前以
Figure BDA0003739297250000231
出售)和2′-脱氧-5-氮杂胞苷(也称为5-氮杂-2′-脱氧胞苷、地西他滨、Dae和DAC，并且目前以
Figure BDA0003739297250000232
出售)是DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂，已被美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)。阿扎胞苷和地西他滨是胞苷类似物；这些胞苷类似物及其相关的天然核苷之间的结构差异是在胞嘧啶环的5位存在取代碳的氮。阿扎胞苷可以被定义为具有分子式C8Hi2N4O5、244.21克/摩尔的分子量和如下所示的结构。地西他滨可以被定义为具有分子式C8Hi2N4O4和228.21克/摩尔的分子量。
在一个实施方案中，本文提供的方法包括施用或共同施用一种或多种胞苷类似物。在某些实施方案中，胞苷类似物是5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。在某些实施方案中，胞苷类似物是5-氮杂-2′-脱氧胞苷(地西他滨)。在某些实施方案中，胞苷类似物是5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)或5-氮杂-2′-脱氧胞苷(地西他滨)。在某些实施方案中，胞苷类似物是例如：1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(阿糖胞苷或ara-C)、假异胞苷(psi ICR)、5-氟-2′-脱氧胞苷(FCdR)、2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷(吉西他滨)、5-氮杂-2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷、5-氮杂-2′-脱氧-2′-氟胞苷、l-β-D-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮(折布拉林)、2′，3′-二脱氧-5-氟-3′-硫代胞苷(恩曲他滨)、2′-环胞苷(安西他滨)、1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-氮杂胞嘧啶(法扎拉滨或ara-AC)、6-氮杂胞苷(6-aza-CR)、5，6-二氢-5-氮杂胞苷(dH-aza-CR)、N4-戊氧基-羰基-5′-脱氧-5-氟胞苷(卡培他滨)、N4-十八烷基-阿糖胞苷或反油酸阿糖胞苷。在某些实施方案中，本文提供的胞苷类似物包括在结构上与胞苷或脱氧胞苷相关并且在功能上模拟和/或拮抗胞苷或脱氧胞苷的作用的任何化合物。
本文的某些实施方案提供了本文所提供的胞苷类似物的盐、共晶体、溶剂化物(例如，水合物)、复合物、前药、前体、代谢物和/或其他衍生物。例如，特定实施方案提供了5-氮杂胞苷的盐、共晶体、溶剂化物(例如，水合物)、复合物、前体、代谢物和/或其他衍生物。本文的某些实施方案提供了本文所提供的胞苷类似物的盐、共晶体和/或溶剂化物(例如，水合物)。本文的某些实施方案提供了本文所提供的胞苷类似物的盐和/或溶剂化物(例如，水合物)。某些实施方案提供的胞苷类似物不是本文所提供的胞苷类似物的盐、共晶体、溶剂化物(例如，水合物)或复合物。例如，特定实施方案提供了非离子化、非溶剂化(例如，无水的)、非复合形式的5-氮杂胞苷。本文的某些实施方案提供了本文所提供的两种或更多种胞苷类似物的混合物。本文提供的胞苷类似物可以使用本文提到的或以其他方式在文献中可获得的合成方法和规程来制备。例如，用于合成5-氮杂胞苷的特定方法公开于例如美国专利号7,038,038及其中讨论的参考文献中，它们中的每一者均以引用方式并入本文中。本文提供的其他胞苷类似物可以例如使用本领域已知的规程来制备，或者可以从商业来源购买。在一个实施方案中，本文提供的方法中所使用的化合物是游离碱，或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一个实施方案中，所述游离碱或者药学上可接受的盐或溶剂化物是固体。在另一个实施方案中，所述游离碱或者药学上可接受的盐或溶剂化物是非结晶形式的固体。在又一个实施方案中，所述游离碱或者药学上可接受的盐或溶剂化物是结晶形式的固体。例如，特定实施方案提供了固体形式的5-氮杂胞苷，其可以例如根据美国专利号6,943,249、6,887,855和7,078,518以及美国专利申请公布号2005/0276752006/247189和WO2010/093435中所述的方法来制备，这些专利中的每一者均全文以引用方式并入本文中。在其他实施方案中，可以使用本领域已知的其他方法制备固体形式的5-氮杂胞苷。
在一个实施方案中，本文提供的方法中所使用的化合物是胞苷类似物的药学上可接受的盐，这些盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate，besylate)、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、1，2-乙二磺酸盐(1,2-ethanedisulfonate，edisylate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate，esylate)、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate，mesylate)、2-萘磺酸盐(2-naphthalenesulfonate，napsylate)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐或十一酸盐。
药物组合物：在一个实施方案中，本文提供了药物组合物，其包含一种或多种胞苷类似物、或者其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成分，以及与该活性成分组合的一种或多种药学上可接受的载剂。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种非控释赋形剂或载剂。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种控释赋形剂或载剂和至少一种非控释赋形剂或载剂。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物中所使用的胞苷类似物为固体形式。合适的固体形式包括但不限于包含胞苷类似物的游离碱的固体形式，和包含胞苷类似物的盐的固体形式。在某些实施方案中，本文提供的固体形式包括多晶型物、溶剂化物(包括水合物)，以及包含胞苷类似物和/或其盐的共晶体。在某些实施方案中，固体形式是胞苷类似物、或者其药学上可接受的盐或溶剂化物的晶体形式。
在一个实施方案中，本文提供的药物组合物可以以各种剂型配制用于眼睛、玻璃体内、肠胃外和局部施用。所述药物组合物也可以被配制成改良释放剂型，包括延迟释放剂型、缓释剂型、延长释放剂型、持续释放剂型、脉冲释放剂型、控释剂型、加速释放剂型和快速释放剂型、靶向释放剂型、程序化释放剂型和胃滞留剂型。这些剂型可以根据本领域技术人员已知的常规方法和技术来制备(参见例如Remington，The Science and Practice ofPharmacy，第21版；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2005；Modified-Release Drug Delivery Technology，Rathbone等人编辑，Drugs and thePharmaceutical Science，Marcel Dekker，Inc.：New York，NY，2003；第126卷)。在一个实施方案中，所述药物组合物以用于玻璃体内施用的剂型提供。在另一个实施方案中，所述药物组合物以用于肠胃外施用的剂型提供。在又一个实施方案中，所述药物组合物以用于局部施用的剂型提供。
在一个实施方案中，本文提供的药物组合物可以局部施用于眼睛，或者以插入物、注射剂、植入物、糊剂、粉末、敷料、乳膏、硬膏剂、软膏剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、凝胶、泡沫或喷雾剂的形式玻璃体内施用。这些剂型可以使用如例如Remington，The Science andPractice of Pharmacy(同上)中所述的常规方法来制造。本文提供的用于局部施用的药物组合物可以被配制成立即释放或改良释放，包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控释、靶向释放和程序化释放。
地西他滨目前被开发为用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非小细胞肺癌(NSCL)、镰刀状细胞贫血和急性骨髓性白血病(AML)的药物。
地西他滨可以包括包含以下成分的制剂：(a)具有WO2013033176的图imgf000003_0001中所示的式的化合物，或其药学上可接受的盐；其溶于(b)基本上无水的溶剂，该溶剂包含约45％至约85％的丙二醇、约5％至约45％的甘油和0％至约30％的乙醇。在一些实施方案中，所述溶剂包含约65％至约70％的丙二醇、约25％至约30％的甘油和0％至约10％的乙醇。
本发明提供了包含脱甲基化剂和药学上可接受的赋形剂或载剂的组合物。术语“药学上可接受的赋形剂或载剂”是指用于制备化合物的期望剂型的介质。药学上可接受的赋形剂或载剂可以包括一种或多种溶剂、稀释剂或其他液体媒介物，分散助剂或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘结剂，润滑剂等等。Remington′sPharmaceutical Sciences，第十五版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1975)和Handbook of Pharmaceutical Excipients，第三版，A.H.Kibbe编辑(美国药学协会2000)公开了用于配制药物组合物的各种载剂和用于制备这些药物组合物的已知技术。在一个实施方案中，如果药学上可接受的赋形剂被施用于眼睛(例如，通过眼内注射)，则该赋形剂对哺乳动物(例如，人类患者)无害。对于眼内施用，例如但不限于，所述治疗剂可以在平衡盐溶液(BSS)或平衡盐溶液Plus(BSS Plus)(Alcon Laboratories，FortWorth，Tex.，USA)中施用。在一个相关方面，本发明提供了容纳治疗上可接受的脱甲基化剂(任选地冻干制备物)的无菌容器(例如小瓶)。
本发明的另一个实施方案涉及施用能够通过基因疗法实现甲基化抑制的核酸构建体。
WO 2001/58494涉及通过使眼细胞与包含编码血管生成抑制剂和神经营养剂的核酸序列的表达载体接触，来治疗或预防眼疾病，诸如年龄相关性黄斑变性。在具体实施方案中，血管生成抑制剂和神经营养剂是同一种，诸如色素上皮衍生因子(PEDF)。WO 2002/13812涉及胰岛素增敏剂，优选地过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)激动剂用于治疗炎性疾病(诸如眼科疾病)的用途。WO 200/52479涉及诊断、治疗和预防与玻璃疣相关联的病症(任何涉及玻璃疣形成的病症)，包括AMD。在具体实施方案中，存在与提供有效量的抑制免疫细胞增殖或分化的作用剂(诸如TNF-α拮抗剂)有关的方法。
在一个方面，本发明提供了治疗患有AMD的个体(例如，其中检测到指示患上有症状的AMD的风险升高的多态性或单倍型的个体)或涉及变体ELOVL2甲基化基因的其他疾病的个体的方法。在一个实施方案中，该方法包括以有效地减轻患者疾病症状的量向患者施用减少变体ELOVL2甲基化的量或编码ELOVL2甲基化的基因的表达的作用剂。在一个相关实施方案中，在个体中施用治疗量的变体ELOVL2甲基化多肽的抑制剂(例如，灭活剂)。
在一个实施方案中，在个体中施用抑制性核酸(例如，与变体ELOVL2甲基化多肽的核苷酸序列的至少一部分互补的RNA)。在一个实施方案中，施用与编码变体ELOVL2甲基化多肽的RNA互补的经纯化的反义RNA。
在另一个实施方案中，在个体中施用足以使变体ELOVL2甲基化多肽部分失活的治疗量的抗ELOVL-2甲基化抗体。
在一个方面，本发明提供了基因疗法载体，其包含编码ELOVL2甲基化多肽的核酸。该载体可以包括在多种细胞类型中驱动ELOVL2甲基化基因表达的启动子。替代性地，该载体可以包括仅在特定细胞类型中(例如，在视网膜细胞中)驱动ELOVL2甲基化基因表达的启动子。在一个方面，提供了含有编码ELOVL2甲基化蛋白的基因疗法载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含病原体并且适合施用于人类患者。在一个实施方案中，编码的ELOVL2甲基化多肽是保护性变体。
在一个方面，本发明提供了含有重组或经纯化的ELOVL2甲基化多肽的组合物，其中所述多肽是保护性变体。
在一个相关方面，本发明提供了含有重组或经纯化的ELOVL2甲基化多肽和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含病原体并且适合施用于人类患者。在一个实施方案中，编码的ELOVL2甲基化多肽具有野生型序列。在一个实施方案中，编码的ELOVL2甲基化多肽是保护性变体。
在一个方面，本发明提供了与变体ELOVL2甲基化多肽特异性地相互作用但不与野生型ELOVL2甲基化多肽特异性地相互作用的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆的，并且可以通过消减技术获得。这些抗体可能足以灭活变体ELOVL2甲基化多肽。在一个相关方面，本发明提供了含有抗ELOVL2甲基化抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述组合物不含病原体并且适合施用于人类患者。
在一个方面，本发明提供了用于鉴定与患上AMD的风险升高或降低相关联的变体ELOVL2甲基化蛋白的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过以下方式鉴定保护性ELOVL2甲基化蛋白的方法：(a)将个体鉴定为具有保护性单倍型，以及(b)确定在个体的基因组中编码的ELOVL2甲基化的氨基酸序列，其中保护性ELOVL2甲基化蛋白由具有保护性单倍型的等位基因编码。在一个实施方案中，本发明提供了通过以下方式鉴定中性ELOVL2甲基化蛋白的方法：(a)将个体鉴定为具有中性单倍型，以及(b)确定在个体的基因组中编码的ELOVL2甲基化的氨基酸序列，其中中性ELOVL2甲基化蛋白由具有中性单倍型的等位基因编码。在一个相关实施方案中，本发明提供了鉴定与患上AMD的风险降低相关联的ELOVL2甲基化的变体形式的方法，该方法包括：(a)将个体鉴定为具有与患上AMD的风险降低相关联的单倍型或双倍型；(b)从该个体获得基因组DNA或RNA；以及(c)确定在该个体的基因组中编码的ELOVL2甲基化的氨基酸序列，其中保护性ELOVL2甲基化蛋白由具有与患上AMD的风险降低相关联的单倍型的等位基因编码。在一个实施方案中，保护性或中性ELOVL2甲基化蛋白不具有野生型ELOVL2甲基化多肽的氨基酸序列。
如本领域技术人员将理解的，基因疗法载体含有用于所插入的编码序列的转录和翻译的必需元件(并且可以包括例如启动子、增强子、其他调节元件)。启动子可以是组成型的或诱导型的。可以选择启动子以靶向靶组织(诸如RPE)中的优先基因表达(有关最近的综述，参见Sutanto等人，2005，“Development and evaluation of the specificity of acathepsin D proximal promoter in the eye”Curr Eye Res.30：53-61；Zhang等人，2004，“Concurrent enhancement of transcriptional activity and specificity of aretinal pigment epithelial cell-preferential promoter”Mol Vis.10：208-14；Esumi等人，2004，“Analysis ofthe VMD2 promoter and implication of E-box bindingfactors in its regulation”J Biol Chem 279：19064-73；Camacho-Hubner等人，2000，“The Fugu rubripes tyrosinase gene promoter targets transgene expression topigment cells in the mouse”Genesis.28：99-105；以及其中的参考文献)。
合适的病毒载体包括DNA病毒载体(诸如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和痘苗病毒载体)以及RNA病毒载体(诸如逆转录病毒载体)。在一个实施方案中，使用腺相关病毒(AAV)载体。有关最近的综述，参见Auricchio等人，2005，“Adeno-associatedviral vectors for retinal gene transfer and treatment of retinal diseases”Curr Gene Ther.5：339-48；Martin等人，2004，Gene therapy for optic nerve disease，Eye 18：1049-55；Ali，2004，“Prospects for gene therapy”Novartis Found Symp.255：165-72；Hennig等人，2004，“AAV-mediated intravitreal gene therapy reduceslysosomal storage in the retinal pigmented epithelium and improves retinalfunction in adult MPS VII mice”Mol Ther.10：106-16；Smith等人，2003，“AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS rat model ofretinitis pigmentosa”Mol Ther.8：188-95；Broderick等人，2005，“Localadministration of an adeno-associated viral vector expressing IL-10reduces monocyte infiltration and subsequent photoreceptor damage duringexperimental autoimmune uveitis”Mol Ther.12：369-73；Cheng等人，2005，“Efficientgene transfer to retinal pigment epithelium cells with long-termexpression.Retina 25：193-201；Rex等人，“Adenovirus-mediated delivery ofcatalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboringphotoreceptors from photo-oxidative stress.Hum Gene Ther.15：960-7；以及其中引用的参考文献)。
基因疗法载体必须按照良好生产规范(GMP)的要求生产，以使产品适合施用于患者。本发明提供了适合施用于患者的基因疗法载体，包括按照GMP要求生产和检测的基因疗法载体。接受FDA批准的基因疗法载体必须进行功效和特性的检测，必须是无菌的、不含外来物质，并且产品中的所有成分(即，防腐剂、稀释剂、佐剂等)必须符合纯度、质量标准，且对患者无害。例如，证明该核酸制备物不含支原体。参见例如Islam等人，1997，An academiccentre for gene therapy research and clinical grade manufacturing capability，Ann Med 29，579-583。
用于施用基因疗法载体的方法是已知的。在一个实施方案中，ELOVL2表达载体被全身性引入(例如，静脉内或通过输注)。在一个实施方案中，ELOVL2表达载体被局部引入(即，直接引入特定的组织或器官，例如眼睛)。在一个优选的实施方案中，ELOVL2表达载体被直接引入眼睛中(例如，通过眼注射)。有关最近的综述，参见例如Dinculescu等人，2005，“Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease”Hum GeneTher.16：649-63；Rex等人，2004，“Adenovirus-mediated delivery Of catalase toretinal pigment epithelial cells protects neighboring photoreceptors fromphoto-oxidative stress”Hum Gene Ther.15：960-7；Bennett，2004，“Gene therapy forLeber congenital amaurosis”Novartis Found Symp.255：195-202；Hauswirth等人，“Range of retinal diseases potentially treatable by AAV-vectored genetherapy”Novartis Found Symp.255：179-188，以及其中引用的参考文献)。
因此，在一个方面，本发明提供了包含编码ELOVL2蛋白或ELOVL2多肽的基因疗法载体(任选地病毒载体)的制备物，其中所述基因疗法载体适合施用于人类受试者，并且在适合施用于人类受试者的赋形剂中(例如，使用GLP技术生产)。任选地，所述基因疗法载体包含在视网膜色素上皮细胞中优先或特异性表达的启动子。
用于预防和治疗哺乳动物中与眼睛老化相关联的眼窝病症的方法可以包括施加局部用组合物，所述局部用组合物包含渗透增强量的一种或多种渗透增强剂，和一种或多种生物影响剂，所述生物影响剂渗透到下层组织中和眼眶的血管网络中。该方法的一个目的是由此预防和治疗眼睛疾病，不仅是黄斑变性，而且还有白内障形成、青光眼和糖尿病性视网膜病。
药物向眼睛的递送可以通过渗透增强剂(penetration enhancer或permeationenhancer)来促进，以增加皮肤对药理活性剂的渗透性，从而增加药物扩散通过皮肤并进入组织和血流的速率。化学皮肤渗透增强剂通过可逆地改变角质层的理化性质以降低其扩散阻力来增加皮肤渗透性。
已知许多化合物是皮肤渗透增强剂。大多数化合物是公认为安全的(GRAS)成分，这些成分通常被配方设计师视为惰性的。Osborne D W，Henke J J，PharmaceuticalTechnology，1997年11月，第58至86页。该文章中引用的化合物以引用方式并入本文中。渗透增强剂的示例包括：醇，诸如乙醇和异丙醇；多元醇，诸如正链烷醇、柠檬烯、萜烯、二氧戊环、丙二醇、乙二醇、其他二醇和甘油；亚砜，诸如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、甲基十二烷基亚砜、二甲基乙酰胺；酯，诸如肉豆蔻酸异丙酯/棕榈酸异丙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯和癸酸/辛酸甘油三酯；酮；酰胺，诸如乙酰胺；油酸酯，诸如三油酸甘油酯；各种表面活性剂，诸如十二烷基硫酸钠；各种链烷酸，诸如辛酸；内酰胺化合物，诸如氮酮；链烷醇，诸如油醇；二烷基氨基乙酸酯，以及它们的掺和物。
许多专利公开了使用渗透增强剂来透皮递送药物。美国专利号5,837,289公开了在乳膏中使用至少两种单独的渗透增强剂来递送各种各样的药物。美国专利号5,238,933公开了一种皮肤渗透增强剂组合物，该组合物包含低级脂族羧酸的低级脂族酯与低级链烷醇的组合，用于施用活性剂。美国专利号5,229,130公开了一种基于植物油的皮肤渗透增强剂，用于递送活性剂通过皮肤。美国专利号4,933,184公开了一种透皮组合物，该透皮组合物相继地或同时地使用甲醇来递送药物。美国专利号4,342,784公开了一种局部施用具有DMSO和羧基聚亚甲基树脂的凝胶以及中和剂以使皮肤盐能够分解所述凝胶而释放DMSO的方法。美国专利号5,482,965公开了一种含有二噁烷的透皮组合物。美国专利号5,620,980、5,807,957公开了使用二氧戊环和尿烷来治疗脱发。
在一个方面，脱甲基化剂与治疗剂、药物、生物化学剂和生物作用剂或化合物的经结膜渗透可以由增强剂促进，所述增强剂可以用于进一步加速这些作用剂进入前房、小梁网、睫状体、脉络膜和视网膜。这些渗透增强剂不仅有效地穿透膜，而且还使其他生物活性剂能够更有效地跨过特定的膜。渗透增强剂通过各种方式产生其作用，诸如破坏与细胞内蛋白质和脂质相互作用的结膜囊表面的细胞层，或在生物活性剂与粘膜接触时改善生物活性剂的分配。
使用这些增强剂，高达10kDa的大分子能够穿过眼睛的结膜囊层到达青光眼的部位，血管和视网膜在该部位发生病理变化。这些增强剂应当是无毒、药理惰性、非过敏性的物质。一般来讲，这些增强剂可以包括阴离子表面活性剂、脲、脂肪酸、脂肪醇、萜烯、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、多元醇、酰胺、内酰胺、丙酮、醇和糖。在一个方面，该10渗透增强剂包括二烷基亚砜，诸如二甲基亚砜(DMSO)、癸基甲基亚砜、十二烷基二甲基氧化膦、辛基甲基亚砜、壬基甲基亚砜、十一烷基甲基亚砜、十二烷基硫酸钠和苯基哌嗪，或者它们的任何组合。在另一个方面，该渗透增强剂可以包括月桂醇、癸二酸二异丙酯、油醇、癸二酸二乙酯、癸二酸二辛酯、壬二酸二辛酯、月桂酸己酯、癸酸乙酯、硬脂酸丁酯、癸二酸二丁酯、己二酸二辛酯、二壬酸丙二醇酯、月桂酸乙酯、月桂酸丁酯、肉豆蔻酸乙酯、肉豆蔻酸丁酯、棕榈酸异丙酯、异硬脂酸异丙酯、壬酸2-乙基己酯、苯甲酸丁酯、苯甲酸苄酯、水杨酸苄酯、邻苯二甲酸二丁酯，或它们的任何组合。在一个方面，皮肤渗透性增强剂为至少大于1％的重量/体积、重量/重量或摩尔％。
在另一个方面，粘膜渗透性增强剂可以为至少大于1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、最多50％的重量/体积、重量/重量或摩尔％。在一个方面，粘膜渗透性增强剂是二甲基亚砜。在这方面，二甲基亚砜的量可以在以下范围内：从2％至10％、2％至9.5％、3％至8％、3％至7％或4％至6％重量/体积、重量/重量、摩尔％，或任何有效治疗量。
该治疗制备物还可以含有无毒的乳化剂、防腐剂、润湿剂、增稠剂(例如，聚乙二醇200、300、400和600，碳蜡1000、1500、4000、6000和10000)、抗菌组分(诸如季铵化合物)、已知具有冷灭菌特性并且在使用中无害的苯基汞盐、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇、苯乙醇、缓冲成分(诸如硼酸钠、乙酸钠、葡萄糖酸盐缓冲剂)，以及其他常规成分(诸如脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺、油酸盐、聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯、二辛基磺基琥珀酸钠、单硫代甘油、硫代山梨醇、乙二胺四乙酸)。此外，适当的眼科媒介物可以用作用于当前目的的载剂介质，这些媒介物包括常规的磷酸盐缓冲剂媒介物体系、等渗硼酸媒介物、等渗氯化钠媒介物、等渗硼酸钠媒介物等。
脱甲基化剂治疗剂制备物还可以含有表面活性剂，诸如可商购获得的聚山梨酯表面活性剂、聚氧乙烯表面活性剂(BASF Cremaphor)、膦酸盐、皂苷和聚乙氧基化蓖麻油和聚乙氧基化蓖麻油。
该药物制备物也可以含有眼科溶液中已经使用的润湿剂(诸如羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甘油、甘露醇、聚乙烯醇或羟乙基纤维素)，并且稀释剂可以是水、蒸馏水、无菌水或人造泪液。润湿剂以约0.001％至约10％的量存在。
本发明的眼科制剂可以包含：用于调节pH的酸和碱；张力赋予剂，诸如山梨糖醇、甘油和右旋糖；其他粘度赋予剂，诸如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和其他树胶；合适的吸收增强剂，诸如表面活性剂、胆汁酸；稳定剂，诸如抗氧化剂，如亚硫酸氢盐和抗坏血酸盐；金属螯合剂，诸如EDTA钠；以及药物溶解度增强剂，诸如聚乙二醇。这些附加成分有助于使商业溶液具有稳定性，使得它们在需要时可以不用进行配混。
眼科药物组合物将被配制为以便与眼睛和/或接触镜片相容。滴眼剂制备物应当与血液等渗。旨在用于直接施加于眼睛的眼科组合物将被配制为以便具有与眼睛相容的pH和张力。这通常会需要缓冲剂以将该组合物的pH维持在生理pH或接近生理pH(即，7.4)，并且可能需要张力剂以使该组合物的克分子渗透压浓度达到或接近210毫摩尔/千克(mOsm/kg)至320毫摩尔/千克(mOsm/kg)的水平。
实施例
之前已将WI-38细胞系和IMR-90细胞系描述为广泛用于研究细胞老化的模型。已经证明，这两种细胞系均示出表型随时间推移和群体倍增(PD)数的显著变化[19，20]。它们的生长速率(通过成像软件以汇合度来测量)从较低的PD到较高的PD显著降低(图6A和图7A)。衰老阳性细胞的百分比(如通过与衰老相关联的β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)测量的)随着PD的增加而增大(图6B和图7B)，并且它们的形态从更细长的形状变为更宽、更平坦的形状(图6C)。
关于人体老化的甲基化特征的研究表明，迄今为止，ELOVL2的启动子区域的甲基化与年龄最明显地相关[3]。为了研究正在老化的WI38细胞和IMR90细胞中ELOVL2启动子甲基化水平的变化，使用了甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)。设计了涵盖表1中所述的特定CpG的引物。使用这种方法，发现启动子甲基化随着细胞群体倍增数增大而增加(图1A)。由于之前已证明启动子区域的甲基化对转录具有抑制作用[21]，所以研究了ELOVL2的表达水平是否与ELOVL2启动子甲基化负相关。使用qRT-PCR，发现该基因的表达水平随PD数增加而降低(图1B和图7C)，从而得出结论：正在老化的细胞中的ELOVL2表达下调，并伴随着ELOVL2启动子甲基化的增加和培养物中的衰老细胞的百分比增加。
研究了调控ELOVL2的表达是否可以影响细胞老化。首先，使用慢病毒shRNA，敲低了WI-38细胞和IMR-90细胞中的ELOVL2表达(图6E和图8D)，然后观察到增殖率显著下降(图1C)，以及培养物中衰老细胞的数量增加(如通过SA-β-Gal染色所检测)(图1D)，并且形态变化与高PD细胞相符(图6D)。所有观察结果一起表明成纤维细胞的表观年龄增加。
测试了ELOVL2启动子甲基化水平对ELOVL2表达的影响。用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)对WI-38成纤维细胞进行处理，5-Aza-dc是抑制DNA甲基转移酶的胞苷类似物[22]。用2μM5-Aza-dc将细胞处理2天，之后在无该化合物的情况下培养5天。在实验结束时，通过qRT-PCR测量ELOVL2的表达。据发现在用5-Aza-dc处理时，ELOVL2启动子甲基化减少(图2A)，而ELOVL2表达上调(图2B)。此外，在用5-Aza-dc处理时，在培养物中观察到较低百分比的衰老细胞(图2C)。这些数据表明，减少ELOVL2启动子甲基化对ELOVL2表达和成纤维细胞的表观年龄有积极影响。
视力是老化的首要预测指标之一。相对于所评估的377个变量，视觉对比敏感度评分是年龄的排名前5的个体预测指标之一[23]。ELOVL蛋白在眼睛中高度表达，并且其中有几种与眼睛疾病有牵连[9，24]。然而，在甲基化模型中，只有ELOVL2包含与年龄高度相关的甲基化标记[3]。因此，研究了野生型(C57BL/6)小鼠视网膜中ELOVL2的表达水平是否随年龄变化。通过qRT-PCR和蛋白质印迹发现，与来自老化的人类成纤维细胞的数据相似，ELOVL2的表达水平与动物的年龄负相关(图3A和图3B)。最重要的是，MeDIP分析表明，视网膜中的ELOVL2启动子甲基化随动物的年龄而增加(图3C)。
与此同时，研究了从艾姆斯矮小(Ames dwarf)小鼠(Propldf)解剖的视网膜中的ELOVL2启动子甲基化水平和mRNA表达水平，这类小鼠与野生型小鼠相比，寿命明显更长，并且表现出许多老化延迟的征兆[25，26]。据发现当与老龄野生型小鼠相比时，老龄艾姆斯矮小视网膜显示较低的ELOVL2启动子甲基化和增加的表达(图9)。这表明ELOVL2的表达和甲基化可指示动物的健康状况。
评估了在研究的动物年龄跨度期间视觉功能和眼睛结构是否发生了变化。首先，使用2月龄、6月龄、1岁和2岁的野生型C57BL/6小鼠的眼底自发荧光成像评估结构变化。据观察，自发荧光点状聚集体在1岁时开始出现在眼底，并且在2岁时非常明显(图3D和图8A)。然后，为了评估老化小鼠的视觉功能，执行了视网膜电图(ERG)分析。随着小鼠年龄增长，视杆的数量和敏感度都在下降[27]。实际上，老龄小鼠通过ERG显示出暗视反应幅度下降(图3D和图3E)。
为了研究ELOVL2是否在眼睛老化和视觉功能中发挥作用，使用与同源重组配对的CRISPR-Cas9产生了ELOVL2突变型C57BL/6小鼠。由于ELOVL2敲除小鼠显示出生育力降低[28]，因此取而代之产生了编码半胱氨酸-色氨酸取代(C217W)的ELOVL2突变型小鼠，该取代已被证明将ELOVL2的底物特异性改变为ELOVL5的底物特异性，从而有效地破坏ELOVL2的将C22ω-3PUFA二十二碳五烯酸(DPA)(22：5n-3)转变为24：5n-3的独特能力[6]。设计了两个在第217位密码子附近靶向ELOVL2的gRNA和一个修复供体寡核苷酸，它们具有碱基对突变以产生突变C217W，同时具有沉默突变以破坏引导序列和前间区序列邻近基序序列，从而防止编辑后的再切割。将gRNA、修复寡核苷酸和Cas9 mRNA注射到C57BL/6N小鼠受精卵中(图4A和图10A至图10D)。从其中一个gRNA中鉴定出一个正确靶向的纯合起始者。没有发现脱靶突变(图10E)。C217W纯合小鼠正常发育，未显示任何明显的表型。
然后研究了C217W突变体中的眼睛结构和视觉功能是否发生了变化。有趣的是，在ELOVL2突变型小鼠中，刚6月龄时就在眼底中出现了自发荧光聚集体，比野生型小鼠出现得早得多(图4B和图3D)，这证明正常的ELOVL2活性对于维持健康的视网膜至关重要。在4月龄、6月龄、8月龄和12月龄的突变动物中一致地观察到该表型(图11A)。
然后使用ERG测试了这些突变型小鼠的光感受器功能。与野生型同窝出生的小鼠相比，观察到C217W突变型小鼠中的暗视反应幅度下降(图4B和图4C)。这种反应降低在其他年龄段一致地重现(图11B)。尽管受影响最大的信号是暗视反应，但是ELOVL2突变体中的其他类型的ERG测量结果(包括振荡电位和闪烁光反应)也受到了影响(图11C和图11D)。
对C217W和WT小鼠的视网膜进行了免疫染色，以研究在自发荧光眼底成像中观察到的点状聚集体是否与玻璃疣相似，玻璃疣在人类中是患上AMD的危险因素[14]。实际上，免疫染色仅在C217W视网膜中检测到了HTRA1、T-15、C3和C5b-9阳性聚集体(图4D、图4E和图12)。考虑到突变型小鼠中玻璃疣样聚集体的突出和早期出现，它们可以是AMD的模型。
最后，研究了是否可以通过DNA脱甲基化(包括ELOVL2启动子)来逆转小鼠眼睛中的老化特征。为此，在从10月龄时开始的2个月期间，每隔一周，在每只小鼠的一只眼睛中注射1μL的2μM 5-Aza-dc，并在另一只眼睛中注射1μL的PBS。据发现，在使用MeDIP方法的情况下，治疗后ELOVL2启动子的甲基化下降(图5A)。还发现在经治疗的眼睛中ELOVL2表达上调(图5B)。最后，通过ERG检查了光感受器功能，并且发现经注射的眼睛中的暗视反应得到改善(图5C和图13)。这些数据进一步支持ELOVL2甲基化状态作为老化的靶标，以及使用DNA甲基转移酶抑制剂来影响正在老化的眼睛特征。
人类临床应用实施例：在患有干性AMD的患者中，在三个月内每两周施用一次(20uM)
在眼科门诊中见到一名75岁的患有双侧干性年龄相关性黄斑变性(AMD)的女性。她在其他方面是健康的。她同意进行一项比较脱甲基化疗法与对照的实验研究。基线时，两只眼睛均示出相似的AMD水平，这通过对视敏度、地图样萎缩的大小(如通过自发荧光所测量的)、光学相干断层扫描和视网膜电图上的暗视反应进行的临床评估得到证实。用100uL的地西他滨(20uM)治疗该患者，其中地西他滨被配制成无菌等渗的pH缓冲溶液，通过在她的左眼中进行玻璃体内注射来施用(积极治疗)。她在右眼中通过玻璃体内注射接受100ul相同的无菌等渗pH缓冲溶液，但并未施用地西他滨(对照治疗)。在施用积极治疗和对照治疗后立即从每只眼睛中取出玻璃体内流体的样品，以进行ELOVL2表达和甲基化水平的基线测量。观察到在两只眼睛中ELOVL2被过度甲基化到相似的程度。ELOVL2表达水平也相似，在两只眼睛中都观察到低表达水平。每隔一周，分别在左眼和右眼中继续施用积极治疗和对照治疗，持续3个月。在施用期间，积极治疗和对照治疗同样耐受良好。在最后一次施用后立即从两只眼睛中获取玻璃体内流体的样品，以测量ELOVL2基因表达和甲基化。对每只眼睛重复在基线时进行的对地图样萎缩的相同临床评估。观察到，用地西他滨治疗的眼睛相比于对照存在显著差异。在用地西他滨治疗的眼睛中，与基线相比，ELOVL2甲基化减少了近30％，并且ELOVL2基因表达也增加了约30％。而且，暗视反应比基线增加了约30％。此外，与基线相比，地图样萎缩的生长没有进展，如通过眼底自发荧光测量的。与之形成鲜明对比的是，对照眼中的任何其他参数都没有可观察到的变化。基因甲基化和基因表达以及暗视反应的值保持与在基线值处观察到的那些相似。患者在6个月时返回门诊进行随访。临床评估揭示，用地西他滨治疗的眼睛中的暗视反应持续改善，显示比基线改善约20％至30％。对照眼中的暗视反应保持与基线值类似。
人类临床应用实施例：在具有地图样萎缩的患者中，每月施用一次(15uM)，持续12个月
在眼科门诊中见到一名65岁的患有干性年龄相关性黄斑变性(AMD)伴有地图样萎缩的男性。如通过暗视反应所评估的，他的视力正在下降。在过去的两年中，如通过眼底自发荧光所测量的，他的地图样萎缩区域示出稳定的进展。他在其他方面是健康的。用100uL的地西他滨(15uM)治疗该患者，其中地西他滨被配制成无菌等渗的pH缓冲溶液，通过玻璃体内注射来施用。在施用地西他滨后立即取出的玻璃体内样品揭示ELOVL2启动子的过度甲基化和低水平的ELOVL2表达。在12个月的时期内，通过每5周施用相同的剂量，继续进行地西他滨治疗。这些施用耐受良好，并且未观察到不良反应。在最后一次施用地西他滨后，获得玻璃体流体样品并测试ELOVL2基因甲基化和ELOVL2基因表达。研究揭示，ELOVL2甲基化降低了近60％(相对于基线)，并且ELOVL2基因表达增加了约50％(高于基线值)。该患者的暗视反应明显改善，比基线增加了约30％。如通过眼底自发荧光所测量的，地图样萎缩没有生长。
人类临床应用实施例：ELOVL2基因疗法
在眼科门诊中见到一名70岁的患有干性年龄相关性黄斑变性(AMD)伴有地图样萎缩的男性。如通过暗视反应所评估的，他的视力一直在稳定下降。如通过眼底自发荧光所测量的，他的地图样萎缩区域示出稳定的进展。他在其他方面是健康的，并且同意使用ELOVL2基因疗法进行治疗。在基因疗法规程前一周，他开始口服泼尼松(0.5mg/kg)。根据良好的医学实践指南，构建并包装了具有ELOVL2编码序列的重组腺相关病毒载体。将其按0.3ml的等分试样以1.5×1011个基因组的滴度悬浮在缓冲盐水溶液中。口服泼尼松一周后，在全身麻醉下使用标准的玻璃体视网膜技术进行标准的玻璃体切除术，以除去玻璃体皮质纤维。然后使用恰好在黄斑外部的专用视网膜下套管向该患者施用0.3ml含有1.5×1011个基因组滴度的缓冲盐水溶液，方式为将该溶液完全注射到视网膜下空间中。进行空气流体交换并且以标准方式缝合伤口。患者继续口服泼尼松(0.5mg/kg)，并在手术后4周逐渐减量，最后停药。对从玻璃体样品中获得的细胞的分析揭示，ELOVL2表达水平低。在基因疗法规程后6个月和1年的随访表明，地图样萎缩区域没有明显进展(如通过眼底自发荧光所测量的)，并且视力改善了约20％至约30％(如通过暗视反应所评估的)。
讨论
先前的研究已揭示了ELOVL2启动子甲基化与人类年龄之间的高度显著相关性[3，29，30]。在当前的研究中，研究了ELOVL2甲基化和表达是否在人类成纤维细胞和小鼠视网膜模型的老化表型中发挥作用。
WI-38成纤维细胞在1960年代由Hayflick和Moorhead分离，并且被观察到随着它们分裂逐渐出现衰老迹象，首先在50+/-10群体倍增数处减慢分裂然后停止分裂，这种现象后来被称为Hayflick极限[31]。此外，发现细胞随着年龄增长而在体内衰老[32]，并且发现来自不同物种的原代细胞具有与该物种的最大寿命相关的最大体外寿命[33]。据发现，除了这些变化之外，ELOVL2的表达随着人类成纤维细胞中传代数的增加而降低。因为启动子甲基化通常与表达负相关，所以预期启动子甲基化将随着细胞老化而增加，并且发现确实如此。由于随着年龄增长，细胞中的表达减少并且在细胞和人体两者中的启动子甲基化都增加，因此假定敲低ELOVL2将导致提前老化表型。实际上，与对照细胞相比，用针对ELOVL2的shRNA处理的细胞示出ELOVL2表达降低、增殖能力下降、衰老增加以及年龄相关性形态变化。
为了进一步研究老化表型，构建了ELOVL2突变型小鼠。使用CRISPR-Cas9，产生了C217W突变，如前所示，该突变将ELOVL2催化位点的底物特异性转换为ELOVL5的等同物，从而有效地破坏ELOVL2的将C22ω-3 PUFA二十二碳五烯酸(DPA)(22：5n-3)转变为24：5n-36的独特能力。已发现ELOVL2和ELOVL5都将二十碳五烯酸(EPA；20：5n-3)延长为二十二碳五烯酸(DPA；22：5n-3)，但是已知只有ELOVL2进一步将DPA延长为24：5n-3，即DHA的倒数第二个前体[6]。因此，研究了ELOVL2突变型小鼠的眼睛的健康状况。
通过自发荧光成像观察到，6月龄时在视网膜上存在蛋白质聚集体，与之相比，野生型小鼠在1岁时才出现。对视网膜切片中的氧化磷酸胆碱(用T一15抗体)、HTRAl、C3和C5b-9进行染色，所有这些蛋白质均存在于玻璃疣中，是通常在患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的患者中发现的蛋白质。
通过ERG评估光感受器功能。ERG测量视网膜响应光刺激而产生的电信号，因此可以检测光感受器的功能异常。由于小鼠视网膜主要包含视杆光感受器，因此它们的电信号(暗视反应)的功能差异与评估视觉功能最相关。除了暗视反应之外，还研究了视锥细胞响应和10Hz闪烁光。与年龄匹配的同窝出生的小鼠相比，所有这些信号，但最显著的是暗视反应，在野生型小鼠和突变型小鼠中随着年龄增长，其幅度均下降。连同存在玻璃疣样聚集体，光感受器功能降低的这些指标是AMD的迹象。因此，得出结论，ELOVL2功能对于预防小鼠玻璃疣样聚集体的早期发作和维持小鼠健康的光感受器功能是至关重要的。与玻璃疣样聚集体的加速出现相结合，ELOVL2突变型小鼠中光感受器功能的丧失表明ELOVL2是小鼠维持健康的视网膜直到老龄的重要部分。此外，据发现ELOVL2在影响人类细胞的老化表型中发挥重要作用，并且可能在更广泛的水平上潜在地影响老化过程。
据发现，ELOVL2 C217W小鼠在比同窝出生的任一对照小鼠明显更早的阶段呈现玻璃疣样聚集体和降低的光感受器敏感性。得出结论，ELOVL2C217W突变是加速眼睛老化表型的原因。综上所述，本研究示出了ELOVL2在老化特征(并且尤其是眼睛功能)中发挥作用的证据。此外，ELOVL2启动子区域处的甲基化水平与其表达相关，并且可以被改变以潜在地影响老化特征。
方法
细胞培养和处理。
将WI-38和IMR-90人类成纤维细胞在补充了10％胎牛血清(Omega)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的EMEM(ATCC)中培养，并在5％CO2和37℃下保持在加湿的培养箱中。经由ImageJ成像软件计算汇合度，每个样品包括3个视野(10x)。在汇合后，将细胞分开并以1∶3的比率接种。经由细胞计数来计算群体倍增数(PD)。使用MISSION shRNA(Sigma)，根据制造商的说明产生敲低的慢病毒。5-氮杂-2’-脱氧胞苷购自TSZ Chem(CAS号2353-33-5)，并以2μM的浓度溶解在细胞培养基中。将细胞处理48小时。然后用常规的细胞培养基替换该培养基，并将细胞再培养5天。
与衰老相关联的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性。
使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signaling Technology)，根据制造商的说明测定培养细胞中的SA-β-gal活性。之后用DAPI对细胞进行染色，并用成像软件(Keyence)计算染色阳性细胞的百分比，包括3个视野(10x)。
核酸分析。
使用TRIzol(Ambion)，根据制造商的说明从人类成纤维细胞和小鼠组织中分离出DNA和RNA。用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将RNA转变为cDNA。使用SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)执行qPCR。
通过Bioruptor(Diagenode)在高设置下将1μg DNA剪切8个循环来执行甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)，每个循环由30秒的开启和30秒的关闭组成。使剪切的DNA变性，与1μg5mC抗体MABE146(Millipore)一起温育2小时，然后与SureBeads蛋白G珠(Bio-Rad)一起温育1小时。洗涤后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA。然后如上所述执行qPCR。
蛋白质印迹。
取10μg用TRIzol(Ambion)从不同发育阶段的WT小鼠的视网膜中分离出的总蛋白进行SDS-PAGE。使用被广泛接受的方案执行蛋白质印迹(有关该研究中使用的抗体，参见表2)。将ELOVL2蛋白表达水平归一化为H3。
CRISPR-Cas9设计。
基本上如先前所述产生了CRISPR-Cas9试剂[34]。通过PCR扩增将T7启动子添加至克隆的Cas9编码序列。然后对T7-Cas9产物进行凝胶纯化，并且将该产物用作在使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Life Technologies)进行体外转录(IVT)时的模板。将T7启动子和sgRNA序列合成为长寡核苷酸(Ultramer，IDT)，并且通过PCR扩增。对T7-sgRNA PCR产物进行凝胶纯化，并且将该产物用作在使用MEGAshortscript T7试剂盒(LifeTechnologies)进行IVT时的模板。将编码C217W变体的修复模板合成为单链寡核苷酸(Ultramer，IDT)，并且不经纯化便使用。使用Cas-OFFinder35鉴定潜在的脱靶，选择具有最少错配的靶标(http：//www.rgenome.net/cas-offinder/)。对起始小鼠和所有F1小鼠的脱靶进行测序。
动物注射和分析。
所有动物规程均在加利福尼亚大学圣地亚哥分校动物护理机构委员会的批准下进行。向C57BL/6N小鼠受精卵注射CRISPR-Cas9构建体。在原核阶段将寡核苷酸注射到受精卵的细胞质中。将小鼠关在常规动物设施中的静态架子上，并随意饲喂Teklad Global2020X饮食。对于5-Aza-dc注射研究，通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100mg/kg和10mg/kg)麻醉小鼠，并给予丙美卡因止痛滴眼剂(0.5％，Bausch&Lomb)。在2个月的时期内，每隔一周，在一只眼睛中向动物眼内注射1μL PBS，并且在对侧眼睛中眼内注射1μL溶于PBS的2μM 5-Aza-dc。
视网膜电图(ERG)按照先前报道的方案进行[36]。简言之，使小鼠适应黑暗12小时，通过基于体重腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪来麻醉，然后给予一滴托吡卡胺(1.5％，Alcon)扩瞳，以及一滴丙美卡因(0.5％，Bausch&Lomb)止痛。用全视野Ganzfeld碗装置(Diagnosys LLC)检查小鼠，其中将电极置于每个角膜上，皮下接地针电极置于尾中，参比电极置于口中(Grass Telefactor，F-E2)。使用润滑剂(Goniovisc 2.5％，HUBPharmaceuticals)来提供电极与眼睛的接触。使用UTAS-E 3000系统(LKC Technologies)对放大(以1Hz至1000Hz带通，无陷波滤波)、刺激呈现和数据采集进行编程以及执行前述操作。对于暗视ERG，用氙灯以-2log cd·s/m2和-0.5log cd·s/m2刺激视网膜。对于明视ERG，使小鼠适应1log cd·s/m2的背景光，并将光刺激设定在1.5log cd·s/m2。收集记录值并在制造商的软件(Veris，EDI)中取平均值，然后在Excel中处理。
小鼠视网膜分析。
处死小鼠后立即收集视网膜，在4％多聚甲醛中固定1小时，然后在4℃的PBS中保存。为了进行免疫染色，将视网膜切片，固定在载玻片上，然后与5％BSA、0.1％Triton-XPBS封闭溶液一起温育1小时。将一抗(有关该研究中使用的抗体，参见表2)以1∶50添加到5％BSA PBS中，并且在4℃下温育16小时。用PBS洗涤3次后，在室温下将二抗以1∶1000添加到5％BSA PBS中，持续30分钟。然后用PBS将样品洗涤3次，在室温下用DAPI染色5分钟，固定并成像(Keyence BZ-X700)。
表1.研究中所使用的引物的列表。
Figure BDA0003739297250000441
Figure BDA0003739297250000451
表2.研究中所使用的抗体的列表。
Figure BDA0003739297250000452
Figure BDA0003739297250000461
参考文献
1.Glei，D.A.et al.Predicting Survival from Telomere Length versusConventional Predictors：A Multinational Population-Based Cohort Study.PloSOne 11，e0152486(2016).
2.Health，C.O.on S.and.Smoking and Tobacco Use；Surgeon General’sReports；2004.Smoking and Tobacco Use Available at：http：//www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/sgr/2004/.(Accessed：14th November 2014)
3.Hannum，G.et al.Genome-wide Methylation PFofiles Reveal QuantitativeVieWs of Human Aging Rates.M0l.Cell 49，359-367(2013).
4.Gross，A.M.et al.Methylome-wide Analysis of Chronic HIV InfectionReveals FiVe-Year Increase in Biological Age and Epigenetic Targeting ofHLA.Mol.Cell 62，157-168(2016).
5.Leonard，A.E.et al.Identification and expression of mammalian long-chain PUFA elongation enzymes.Lipids 37，733-740(2002).
6.Gregory，M.K.，Cleland，L G.&James，M.J.Molecular basisfor differentialelongation of omega-3 docosapentaenoic acid by the rat ELOVL5 andELOVL2.J.Lipid Res.54，2851-2857(2013).
7.Tikhonenko，M.et al.Remodeling of Retinal Fatty Acids in an AnimalModel of Diabetes：A Decrease in Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids IsAssociated With a Decrease in Fatty Acid Elongases ELOVL2 and ELOVL4.Diabetes59，219-227(2010).
8.Bazan，N.G.，Molina，M.F.&Gordon，W.C.Docosahexaenoic AcidSignalolipidomics in Nutrition：Significance in Aging，Neuroinflammation，Macular Degeneration，Alzheimer’s，and Other NeurodegenerativeDiseases.Annu.Rev.Nutr.31，321-351(2011).
9.Agbaga，M.-P.et al.Role of Stargardt-3macular dystrophy protein(ELOVLL4)in the biosynthesis of very long chain fattyacids.Proc.Natl.Acad.Sci.105，12843-12848(2008).
10.Harkewicz，R.et al.Essential Role of ELOVLL4 Protein in Very LongChain Fatty Acid Synthesis and Retinal Function.J.Biol.Chem.287，11469-11480(2012).
11.Beatty，S.，Koh，H.，Phil，M.，Henson，D.&Boulton，M.The role of oxidativestress in the pathogenesis of age-related maculardegeneration.Surv.Ophthalmol.45，115-134(2000).
12.Hollyfield，J.G.et al.Oxidative damage-induced inflammationinitiates age-related macular degeneration.Nat.Med.14，194-198(2008).
13.Curcio，C.A.，Johnson，M.，Huang，J.-D.&Rudolf，M.Apolipoprotein B-containing lipoproteins in retinal aging and age-related maculardegeneration.J.Lipid Res.51，451-467(2010).
14.Crabb，J.W.et al.Drusen proteome analysis：An approach to theetiology of age-related macular degeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.99，14682-14687(2002).
15.Shaw，P.X.et al.Natural antibodies with the T15idiotype may act inatherosclerosis，apoptotic clearance，and protectiveimmunity.J.Clin.Invest.105，1731-1740(2000).
16.Shaw，P.X.et al.Complement factor H genotypes impact risk of age-related macular degeneration by interaction with oxidized phospholipids.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109，13757-13762(2012).
17.Cameron，D.J.et al.HTRA1 variant confers similar risks togeographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration.CellCycle Georget.Tex 6，1122-1125(2007).
18.Sivaprasad，S.&Chong，N.V.The complement system and age-relatedmacular degeneration.Eye 20，867(2006).
19.Pignolo，R.J.，Rotenberg，M.O.&Cristofalo，V.J.Alterations in contactand density-dependent arrest state in senescent WI-38 cells.In VitroCell.Dev.Biol.Anim.30A，471-476(1994).
20.
Figure BDA0003739297250000481
，S.et al.QuantitatiVe Model of Cell Cycle Arrest andCellular Senescence in Primary Human Fibroblasts.PLoS ONE 7，e42150(2012).
21.Jones，P.L.et al.Methylated DNA and MeCP2 recruit histonedeacetylase to repress transcription.Nat.Genet.19，187-191(1998).
22.Momparler，R.L.Pharmacology of 5-Aza-2’-deoxycytidine(decitabine).Semin.Hematol.42，S9-16(2005).
23.Swindell，W.R.et al.Indicators of‘Healthy Aging’in older women(65-69years of age).A data-mining approach based on prediction of long-termsurvival.BMC Geriatr.10，55(2010).
24.Xue，X.et al.Characterization of the fatty acyl elongase(ELOVL)genefamily，and hepatic ELOVL and delta-6 fatty acyl desaturase transcriptexpression and fatty acid responses to diets containing camelina oil inAtlantic cod(Gadus morhua).Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.175，9-22(2014).
25.Bartke，A.&Brown-Borg，H.Life extension in the dwarfmouse.Curr.Top.Dev.Biol.63，189-225(2004).
26.Wang，T.et al.Epigenetic aging signatures in mice livers are slowedby dwarfism，calorie restriction and rapamycin treatment.Genome Biol.18，57(2017).
27.Kolesnikov，A.V.，Fan，J.，Crouch，R.K.&Kefalov，V.J.Age-RelatedDeterioration ofRod Vision in Mice.J.Neurosci.Off.J.Soc.Neurosci.30，11222-11231(2010).
28.Zadravec，D.et al.ELOVL2 controls the level of n-628：5and 30：5fattyacids in testis，a prerequisite for male fertility and sperm maturation inmice.J.Lipid Res.52，245-255(2011).
29.Garagnani，P.et al.Methylation of ELOVL2 gene as a new epigeneticmarker ofage.Aging Cell 11，1132-1134(2012).
30.Bacalini，M.G.et al.A meta-analysis on age-associated changes inblood DNA methylation：results from an original analysis pipeline for Infinium450k data.Aging 7，97-109(2015).
31.Hayflick，L.The limited in vitro lifetime of human diploid cellstrains.Exp.Cell Res.37，614-636(1965).
32.Herbig，U.，Ferreira，M.，Condel，L.，Carey，D.&Sedivy，J.M.Cellularsenescence in aging primates.Science 311，1257(2006).
33.
Figure BDA0003739297250000491
，D.Evidence for a relationship between longevity ofmammalian species and life spans of normal fibroblasts in Vitro anderythrocytes in viVo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，5009-5013(1981).
34.Wang，H.et al.One-Step Generation of Mice Carrying Mutations inMultiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.Cell 153，910-918(2013).
35.Bae，S.，Park，J.&Kim，J.-S.Cas-OFFinder：a fast and versatilealgorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases.Bioinformatics 30，1473-1475(2014).
36.Luo，J.et al.Human retinal progenitor cell transplantationpreserves vision.J.Biol.Chem.289，6362-6371(2014).

Claims (10)

1.脱甲基化剂在制备用于治疗、改善或预防受试者中年龄相关性眼睛疾病或病状的药物中的用途，其中所述脱甲基化剂是表达延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2基因(ELOVL2)的表达载体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述脱甲基化剂增加延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2基因(ELOVL2)的表达并且/或者增加ELOVL2酶的水平并且/或者增加视网膜22：6(n-3)二十二碳六烯酸(DHA)和22：5(n-6)二十二碳五烯酸(DPA)的水平。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为通过玻璃体内、视网膜下、结膜下、眼球筋膜囊下或后部近巩膜途径施用于所述眼睛。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述年龄相关性眼睛疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性眼睛疾病、青光眼、低视力或干眼症。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述年龄相关性黄斑变性是湿性年龄相关性黄斑变性。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述年龄相关性黄斑变性是干性年龄相关性黄斑变性。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述表达载体是病毒载体。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述表达载体是编码延伸因子极长链脂肪酸样蛋白2蛋白(ELOVL2)的mRNA。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述mRNA使用脂质体、微米粒子或纳米粒子来递送。
CN202210822951.1A 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化 Pending CN116059404A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862683292P 2018-06-11 2018-06-11
US62/683,292 2018-06-11
US201862716554P 2018-08-09 2018-08-09
US62/716,554 2018-08-09
CN201980039446.6A CN112367971A (zh) 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化
PCT/US2019/034289 WO2019240946A1 (en) 2018-06-11 2019-05-29 Demethylation to treat eye disease

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980039446.6A Division CN112367971A (zh) 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116059404A true CN116059404A (zh) 2023-05-05

Family

ID=68763977

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210822951.1A Pending CN116059404A (zh) 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化
CN201980039446.6A Pending CN112367971A (zh) 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980039446.6A Pending CN112367971A (zh) 2018-06-11 2019-05-29 用以治疗眼睛疾病的脱甲基化

Country Status (10)

Country Link
US (2) US10632211B2 (zh)
EP (1) EP3801465B1 (zh)
JP (2) JP7089603B2 (zh)
KR (1) KR20210020008A (zh)
CN (2) CN116059404A (zh)
AU (2) AU2019285719B2 (zh)
CA (1) CA3103436A1 (zh)
ES (1) ES2986944T3 (zh)
NZ (1) NZ771567A (zh)
WO (1) WO2019240946A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112996500A (zh) * 2018-06-15 2021-06-18 优美佳生物技术有限公司 用于调节elovl2的组合物和方法
JP2023546751A (ja) * 2020-10-22 2023-11-07 ヴィスゲニックス・インコーポレイテッド ヒト遺伝子療法のためのｅｌｏｖｌ２コンストラクト
TW202335039A (zh) 2022-02-07 2023-09-01 日商國際電氣股份有限公司 氣體供給部、處理裝置及半導體裝置之製造方法
CN115501243A (zh) * 2022-07-19 2022-12-23 郑州大学 地西他滨在制备治疗慢性药物毒性视网膜感光细胞损伤的药物中的应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342784A (en) 1964-10-06 1982-08-03 E. R. Squibb & Sons, Inc. Chemical compositions and method of utilization
US4933184A (en) 1983-12-22 1990-06-12 American Home Products Corp. (Del) Menthol enhancement of transdermal drug delivery
EP0576605A4 (en) 1991-03-19 1994-06-08 Vithal J Rajadhyaksha Compositions and method comprising aminoalcohol derivatives as membrane penetration enhancers
US5238933A (en) 1991-10-28 1993-08-24 Sri International Skin permeation enhancer compositions
US5229130A (en) 1991-12-20 1993-07-20 Cygnus Therapeutics Systems Vegetable oil-based skin permeation enhancer compositions, and associated methods and systems
US5620980A (en) 1995-02-22 1997-04-15 Macrochem Corporation Method for treating hair loss
US5837289A (en) 1996-07-23 1998-11-17 Grasela; John C. Transdermal delivery of medications using a combination of penetration enhancers
US5807957A (en) 1996-12-23 1998-09-15 Macrochem Corporation Cationic film-forming polymer compositions, and use thereof in topical agents delivery system and method of delivering agents to the skin
CA2398571A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Genvec, Inc. Materials and methods for treating ocular-related disorders
WO2002013812A1 (en) 2000-08-17 2002-02-21 Pershadsingh Harrihar A Methods for treating inflammatory diseases
AU2003213084B2 (en) * 2002-02-13 2008-06-26 Numoda Biotechnologies, Inc. Treatment of ophthalmic disorders using urea and urea derivatives
US6982253B2 (en) 2002-06-05 2006-01-03 Supergen, Inc. Liquid formulation of decitabine and use of the same
US20050137124A1 (en) 2002-08-09 2005-06-23 Vitreo-Retinal Technologies, Inc. A California Corporation Agents for intravitreal administration to treat or prevent disorders of the eye
US6887855B2 (en) 2003-03-17 2005-05-03 Pharmion Corporation Forms of 5-azacytidine
US6943249B2 (en) 2003-03-17 2005-09-13 Ash Stevens, Inc. Methods for isolating crystalline Form I of 5-azacytidine
US7038038B2 (en) 2003-03-17 2006-05-02 Pharmion Corporation Synthesis of 5-azacytidine
EP1482418A1 (en) 2003-05-28 2004-12-01 Sap Ag A data processing method and system
WO2005030985A2 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Devgen N.V. Use of amino acid sequences involved in the elongation of fatty acids in identifying and/or developing compounds for preventing and/or treating metabolic diseases
US20060014949A1 (en) 2004-07-13 2006-01-19 Supergen Inc. Compositions and formulations of decitabine polymorphs and methods of use thereof
US8088773B2 (en) * 2005-05-12 2012-01-03 The Texas A&M University System Therapeutic compositions and methods
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
BRPI0921467B1 (pt) 2008-11-18 2021-12-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para a produção de óleo compreendendo ácido eicosapentaenóico (epa), ácido docosapentaenóico (dpa) e ácido docosahexaenóico (dha)
EP2396007A1 (en) 2009-02-10 2011-12-21 Celgene International Sarl Methods for treating non-small cell lung cancer using 5-azacytidine
CN101781347B (zh) * 2009-12-21 2012-09-12 南京卡文迪许生物工程技术有限公司 地西他滨多晶型物和药用组合物
WO2011097577A2 (en) * 2010-02-05 2011-08-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treating or preventing retinal degeneration
US11236351B2 (en) 2010-05-17 2022-02-01 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC PUFAs in plants
MY186676A (en) 2011-08-30 2021-08-05 Astex Pharmaceuticals Inc Drug formulations
AU2013221615B2 (en) * 2012-02-14 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Systemic delivery and regulated expression of paracrine genes for cardiovascular diseases and other conditions
CN102660576B (zh) 2012-04-12 2014-06-11 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种在哺乳动物细胞中生产dha的方法
CN104602670A (zh) 2012-08-31 2015-05-06 博士伦公司 含有ω-3 脂肪酸的眼用组合物
ES2774552T3 (es) 2014-03-24 2020-07-21 Translate Bio Inc Terapia de ARNm para el tratamiento de enfermedades oculares
US10202650B2 (en) * 2016-05-31 2019-02-12 Youhealth Biotech, Limited Methods for monitoring ELOVL2, KLF14 and PENK gene expression following treatment with vitamin C
CN108814461B (zh) 2018-09-14 2025-01-03 云鲸智能科技（东莞）有限公司 转盘结构和机器人

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021201036B2 (en) 2022-09-29
US10632211B2 (en) 2020-04-28
KR20210020008A (ko) 2021-02-23
EP3801465B1 (en) 2024-07-24
EP3801465A4 (en) 2022-03-23
NZ771567A (en) 2024-09-27
JP7089603B2 (ja) 2022-06-22
JP2022097478A (ja) 2022-06-30
AU2019285719B2 (en) 2021-03-25
AU2019285719A1 (en) 2021-01-21
WO2019240946A1 (en) 2019-12-19
US20190374653A1 (en) 2019-12-12
CN112367971A (zh) 2021-02-12
JP7382437B2 (ja) 2023-11-16
EP3801465A1 (en) 2021-04-14
JP2021521263A (ja) 2021-08-26
US20200188532A1 (en) 2020-06-18
ES2986944T3 (es) 2024-11-13
AU2021201036A1 (en) 2021-03-11
CA3103436A1 (en) 2019-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7382437B2 (ja) 眼疾患を治療するための脱メチル化
Wang et al. Microglia modulation by TGF-β1 protects cones in mouse models of retinal degeneration
Miyazaki et al. Therapeutic effects of tacrolimus ointment for refractory ocular surface inflammatory diseases
Shindler et al. SIRT1 activation confers neuroprotection in experimental optic neuritis
Rao Mechanisms of inflammatory response in sympathetic ophthalmia and VKH syndrome
EP3441069B1 (en) Treatment of diabetic retinopathy using pharmaceutical agents that eliminate senescent cells
Lee et al. Application for tacrolimus ointment in treating refractory inflammatory ocular surface diseases
CA2904164C (en) Mir-204 and mir-211 and uses thereof
JP2010254672A (ja) ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ）阻害ペプチドを有効成分として含有する網膜疾患の予防または治療剤
Rosa et al. Low intraocular pressure resulting from ciliary body detachment in patients with myotonic dystrophy
Khanum et al. Pirfenidone inhibits post-traumatic proliferative vitreoretinopathy
WO2009102021A1 (ja) 骨髄由来幹細胞、前駆細胞機能賦活による網膜疾患治療
Güngör et al. Comparison of intracameral dexamethasone and intracameral triamcinolone acetonide injection at the end of phacoemulsification surgery
Glybina et al. Photoreceptor neuroprotection in RCS rats via low-dose intravitreal sustained-delivery of fluocinolone acetonide
EP4094765A1 (en) Compounds for treatment of eye diseases associated with excessive vascularisation
Semkova et al. Overexpression of FasL in retinal pigment epithelial cells reduces choroidal neovascularization
CN109937053B (zh) 用于治疗黄斑变性的含有mTOR抑制剂的药物组合物
RU2804300C2 (ru) Деметилирование для лечения глазного заболевания
Chiang et al. The ocular graft-versus-host disease: the path from current knowledge to future managements
Ahmed et al. Corneal application of SOCS1/3 peptides for the treatment of eye diseases mediated by inflammation and oxidative stress
KR20110009084A (ko) 눈-관련된 장애의 치료방법
KR20220007085A (ko) 식도 협착 억제제
Kwok et al. Emerging treatments for dry age-related macular degeneration with geographic atrophy: a systematic review
JP2018050630A (ja) 変性性の網膜状態の処置のための組成物および方法
Zhu et al. Topical application of sphingosine 1-phosphate receptor 1 prolongs corneal graft survival in mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40088811

Country of ref document: HK