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CN116059348A - 基于nkg2d的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用 - Google Patents

基于nkg2d的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用 Download PDF

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CN116059348A
CN116059348A CN202211132057.8A CN202211132057A CN116059348A CN 116059348 A CN116059348 A CN 116059348A CN 202211132057 A CN202211132057 A CN 202211132057A CN 116059348 A CN116059348 A CN 116059348A
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CN
China
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cells
nkg2d
binding domain
cell
senescent cells
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Application number
CN202211132057.8A
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赵旭东
杨东
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West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
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Publication date
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Abstract

本发明涉及NKG2D‑CD3和NKG2D‑CD16细胞接合器分子在清除衰老细胞和治疗衰老细胞累积相关疾病中的用途。具体地，所述细胞接合器分子包括NKG2D胞外域、连接段，以及CD3或CD16结合域。所述细胞接合器分子通过桥接衰老细胞和免疫细胞高效地诱导NKG2D配体高表达的衰老细胞死亡，因此可作为表达NKG2D配体的衰老细胞和相关疾病的有效治疗剂使用。

Description

基于NKG2D的细胞接合器分子在清除衰老细胞中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体涉及NKG2D-CD3和NKG2D-CD16细胞接合器分子在清除衰老细胞和治疗相关疾病中的应用。
背景技术
细胞衰老是细胞应对各种压力而进入永久性细胞周期终止状态的过程，贯穿于生物体的整个生命周期。细胞衰老与个体衰老虽有关联，但却是两个完全不同的概念。即使在老年个体中，衰老细胞的数量也是非常少的。当生物体的免疫系统足够强大可以及时清除衰老细胞时，衰老细胞可短暂存在于体内并发挥促进身体组织再生，伤口修复，减少癌细胞产生等有益功能。然而当生物体免疫功能下降或者持续受到伤害导致无法及时清除衰老细胞时，衰老细胞产生和清除的平衡被打破，衰老细胞开始在生物体内累积。累积的衰老细胞不仅会直接影响组织和器官的正常功能，同时还会不断分泌多种炎症因子造成组织器官损伤，引起脂肪肝、肝纤维化、肺纤维化、糖尿病、骨质疏松、肌肉萎缩以及动脉粥样硬化等多种疾病。由于现代生活方式的改变和不良的饮食习惯等因素，这些疾病在年轻个体中的发病率呈逐渐上升趋势，已成为社会关注焦点。临床前数据表明，清除小鼠、大鼠和猴子等人类疾病模型体内累积的衰老细胞，可使超过40种相关病症得到了延迟、预防或缓解。此外，通过清除衰老细胞治疗肾脏纤维化、糖尿病、肥胖、肾功能不全、衰老相关骨质疏松、骨关节炎等疾病的临床试验也在进行中。目前，清除衰老细胞的方法主要集中在寻找能够选择性清除衰老细胞的小分子化合物方面，例如达沙替尼、槲皮素、ABT263等，但这些化合物或清除衰老细胞效果欠佳，或存在明显的毒副作用。例如ABT-263可引起短暂性血小板减少症和中性粒细胞减少症；达沙替尼可能导致严重的肺动脉高压。因此，本领域迫切需要开发更安全有效清除衰老细胞的技术手段。双特异性抗体是近年来药物研发领域的热点之一，大量生物科技公司投入到其开发中，目前已在癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病等领域取得了突破性进展。双特异性细胞接合器是双特异性抗体中的一种，通过选择性募集免疫效应细胞(T细胞：Bispecific Cell Engager,BiTE；NK细胞：Bispecific NK cell Engager,BiKE)到靶细胞周围，建立免疫突触并激活免疫效应细胞，进而分泌端粒酶和穿孔素等效应分子清除靶细胞。相对于传统单抗，双特异性细胞接合器具有更高的灵敏度和特异性。
因此，本领域有需要开发一种安全有效清除衰老细胞的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供NKG2D-CD3和NKG2D-CD16细胞接合器分子特异性地、高效地清除衰老细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向NKG2D配体和免疫细胞的细胞接合器分子的用途，用于制备一药物，所述药物用于：
(i)清除衰老细胞；
(ii)预防和/或治疗衰老细胞累积相关疾病；
(iii)延缓个体衰老；
所述细胞接合器分子包括第一结合结构域和第二结合结构域，
其中，所述第一结合结构域特异性结合NKG2D配体，所述第二结合结构域特异性结合免疫细胞表面膜蛋白。
在另一优选例中，所述的第一结合结构域为NKG2D胞外域。
在另一优选例中，所述的第一结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的多肽，或与SEQID NO.1所示序列具有80％以上相似度并且可结合NKG2D配体的多肽。
在另一优选例中，所述的第二结合结构域特异性结合CD3或CD16。
在另一优选例中，所述的细胞结合器分子，所述分子从N端到C端具有选自下式的结构：
S-D1-L1-D2-T    (I)；或
S-D2-L1-D1-T      (II)，
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
S是无或信号肽序列；
D1是第一结合结构域；
L1是无或连接肽；
D2是第二结合结构域；
T是无或标记蛋白。
在另一优选例中，所述的第二结合结构域具有选自下组的结构：单域抗体(sdAb)、单链抗体(scFv)、抗原结合片段(Fab片段)、配体，或其多聚体，或其组合。
在另一优选例中，所述的第二结合结构域为CD3结合域，所述CD3结合域可特异性结合T淋巴细胞表面CD3。
在另一优选例中，所述CD3结合域具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的第二结合结构域为CD16结合域，所述CD16结合域可特异性结合自然杀伤细胞表面CD16。
在另一优选例中，所述CD16结合域具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述CD16结合域具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的CD16结合域为人IgG FC片段。
在另一优选例中，人IgG FC片段具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的标记蛋白T选自：His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述连接肽是甘氨酸-丝氨酸连接肽。
在另一优选例中，所述连接肽由式(GGGS)n表示，其中n为1、2、3、4或5。
在另一优选例中，所述的衰老细胞的选自下组：肺细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌肉细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的衰老细胞为人胚肺细胞HEL1。
在另一优选例中，所述的衰老细胞是自然的或人工诱导衰老的。
在另一优选例中，所述的人工诱导衰老方法包括：DNA损伤诱导衰老、过表达P16诱导衰老、端粒缩短诱导衰老，或其组合。
在另一优选例中，所述的衰老细胞中NKG2D配体表达上调。
在另一优选例中，所述NKG2D配体表达上调是指衰老细胞NKG2D配体的表达量(F1)与正常细胞表达量(F0)之比(即F1/F0)≥1.5，优选地≥2，更优选地≥2.5。
在另一优选例中，所述的药物用于预防和/或治疗衰老细胞累积导致的疾病。
在另一优选例中，所述的NKG2D配体包括(但不限于)MICA，MICB，ULBP1,ULBP2,ULBP3,ULBP4,ULBP5,ULBP6。
在另一优选例中，所述的老年性疾病选自下组：心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎等细胞衰老导致的器官退行性疾病，或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)靶向NKG2D配体和免疫细胞的细胞接合器分子；
(b)除(a)之外的其他清除衰老细胞药物；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，在组分(b)中，所述的其他抗衰老药物包括其他能够特异性地清除衰老细胞的药物。
在另一优选例中，组分(b)包括能够特异性清除衰老细胞的小分子化合物，优选地选自下组：达沙替尼、槲皮素、ABT263、ABT737、荜茇酰胺，或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)靶向NKG2D配体和免疫细胞的细胞接合器分子；
(b)能够上调NKG2D配体表达的药物；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，组分(b)包括能够上调细胞表面NKG2D配体表达，优选地选自下组：依托泊苷、顺铂、长春新碱、紫杉醇或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物是液态的药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了NKG2D-CD3蛋白制备
(A)NKG2D-OKT3和CD19-OKT3载体结构示意图。(B)NKG2D-OKT3和CD19-OKT3载体转染293T细胞，收集培养液上清并进行纯化后，考马斯亮蓝染色。(C)利用His抗体检测纯化蛋白中NKG2D-CD3和CD19-CD3表达。
图2显示了衰老细胞中NKG2D配体表达上调。
(A)HEL1-P16细胞用四环素(DOX)诱导P16过表达后，细胞β-gal染色。(B)HEL1-P16细胞用四环素(DOX)诱导P16过表达后，realtime PCR检测NKG2D配体表达。(C)HEL1-P16细胞用四环素(DOX)诱导P16过表达后，流式细胞术检测NKG2D配体表达。
图3显示了NKG2D-CD3促进T细胞对衰老细胞的杀伤。
(A)NKG2D-CD3与T细胞孵育后，流式细胞术检测结合率。(B)NKG2D-CD3与DOX诱导衰老的HEL1-P16细胞孵育后，流式细胞术检测结合率。(C)NKG2D-CD3加入到T细胞和衰老细胞共培养体系中8h后，检测衰老细胞死亡率。(D)NKG2D-CD3加入到T细胞和衰老细胞共培养体系中8h后，吸取培养体系上清，酶联免疫吸附(ELISA)检测IFN-γ表达。
图4显示了NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白制备
(A)NKG2D-CD16、NKG2D-FC和对照载体结构示意图。(B)NKG2D-CD16、NKG2D-FC和对照载体转染293T细胞，收集培养液上清并进行纯化后，利用His抗体检测纯化蛋白中NKG2D-NKp46和对照蛋白表达。
图5显示了NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白促进NK92细胞对衰老细胞的杀伤
(A)NKG2D-CD16、NKG2D-FC和对照载体分别与NK92细胞孵育后，流式细胞术检测结合率。(B)NKG2D-CD16、NKG2D-FC和对照载体分别加入到NK92细胞和衰老细胞共培养体系中8h后，检测衰老细胞死亡率。(C)NKG2D-CD16、NKG2D-FC和对照载体分别加入到NK92细胞和衰老细胞共培养体系中8h后，吸取培养体系上清，酶联免疫吸附(ELISA)检测IFN-γ表达。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种利用双特异性细胞接合器技术高特异性和高效地清除受试者中衰老细胞和治疗老年相关疾病的方法。
本发明所提供的双特异性细胞接合器分子由三部分组成：靶向衰老细胞表面NKG2D配体的NKG2D胞外域、连接段、以及结合免疫细胞的CD3或CD16结构域，该接合器分子通过NKG2D胞外域连接衰老细胞，同时桥接免疫细胞，从而将效应性免疫细胞桥接到衰老细胞表面，达到清除衰老细胞的目的。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的的双特异性细胞接合器及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
第一结合结构域
本发明所用的细胞接合器的第一结合结构域特异性结合NKG2D配体(NKG2DL)。
NKG2D-NKG2DL信号链是机体免疫系统发挥免疫监视功能的重要机制。基于NKG2D胞外域构建的双特异性细胞接合器分子NKG2D-CD3和NKG2D-CD16亦在抗肿瘤领域逐渐受到关注。研究表明NKG2D-CD3和NKG2D-CD16可分别激活T细胞和NK细胞，在体外高效杀伤NKG2D配体高表达的急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、软组织肉瘤和黑色素瘤等肿瘤细胞。在体内NKG2D-CD3可通过靶向肿瘤细胞和免疫抑制细胞抑制肿瘤生长并延长模型小鼠生存期。NKG2D配体在衰老细胞中表达也显著上调。
本发明细胞接合器的第一结合结构域优选地来自NKG2D的胞外域。在优选的实施方式中，所述的NKG2D胞外域包括SEQ ID NO:1所示的多肽，或与SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上相似度并且可结合NKG2D配体的多肽。
第二结合结构域
本发明所用的细胞接合器的第二结合结构域特异性结合免疫细胞表面膜蛋白。所述免疫细胞表面膜蛋白优选地为CD3或CD16。
本发明细胞接合器分子中所包含的第二结合结构域可以是抗体、或抗体的抗原结合片段、或其他任意的具有特异性结合CD3或CD16能力的多肽。
本文所称的抗体可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。在一种优选的实施方式中，本发明所用的抗体为单链抗体形式，所述单链抗体(scFv)含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。在另一种优选的实施方式中，本发明所用的抗体为单域抗体形式，所述单域抗体(VhH)仅由克隆抗体的一个重链可变区组成，是具有完整功能的最小的抗原结合片段。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
在本发明的优选实施方式中，所述的第二结合结构域为CD3结合域，所述CD3结合域可特异性结合T淋巴细胞表面CD3。所述CD3结合域具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的第二结合结构域为CD16结合域，所述CD16结合域可特异性结合自然杀伤细胞表面CD16。在一个实施方式中，所述CD16结合域具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，以及具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述的CD16结合域为人IgG FC片段，其具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
双特异性细胞接合器分子
如本文所用，术语“双特异性细胞接合器分子”、“双特异性细胞接合器”、“细胞接合器”、“BiTE”、“双特异性抗体”可互换使用，均指本发明第一方面提供能够同时结合NKG2D配体和免疫细胞表达蛋白的细胞接合器分子。
双特异性细胞接合器分子由两种结合不同靶蛋白的蛋白或多肽序列(抗体最为常见)连接而成。在优选的实施方式中，本发明的BiTE的功能是由NKG2D受体胞外域段、CD3或CD16蛋白结合段决定的。本发明的抗体可以同时结合NKG2D配体和免疫细胞表面膜蛋白CD3或CD16，通过配体段连接衰老细胞，同时通过抗免疫细胞表面膜蛋白段连接免疫细胞，从而有效将效应性免疫细胞与衰老细胞桥接，更有效地发挥清除衰老细胞的效果。
如本文所用，术语“双特异性”是指包含至少两个具有不同结合特异性的结合结构域的分子。每个结合结构域都能够与靶分子特异性结合。在一些实施方式中，双特异性细胞接合器是具有两个或更多个肽的聚合物分子。在一些实施方式中，结合结构域包含抗体的抗原结合结构域，或可变区，或CDR。在一些实施方式中，结合结构域包含与靶蛋白特异性结合的配体或其片段。
本发明的细胞接合器分子的至少两个靶向结构域可选地由连接肽相连。优选的连接肽序列为(GGGS)3，但不限于此。
在本发明的一个优选例中，所述的双特异性细胞接合器分子为单链多肽，其包括作为第一结合结构域的NKG2D胞外域段、连接段，以及作为第二结合结构域的抗CD3或CD16单链抗体，其中抗CD3或CD16单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区。
同时，本领域技术人员应当理解，虽然本发明BiTE的第一结合结构域优选为NKG2D胞外域段，但该第一结合结构域也可以选择为特异性结合NKG2D的抗体、或其抗原结合片段，只要其能够获得本发明的细胞接合效果。
本发明抗体可以是靶向NKG2D配体和CD3(例如人NKG2D配体和CD3)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明抗体可以是靶向NKG2D配体和CD16(例如人NKG2D配体和CD16)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
在本发明中，本发明的BiTE还包括其保守性变异体，指与本发明BiTE的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0003850370310000091
Figure BDA0003850370310000101
并且，所述的氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列，优选为同源性或序列相同性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-7个，更优选为1-5个，更优选为1-3个，更优选为1-2个。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的细胞接合器或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)结合NKG2D和免疫细胞表面膜蛋白的细胞接合器分子；
(b)除(a)之外的其他清除衰老细胞药物；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在优选的实施方式中，组分(b)包括能够特异性清除衰老细胞的小分子化合物，优选地选自下组：达沙替尼、槲皮素、ABT263、ABT737、荜茇酰胺，或其组合。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)结合NKG2D和免疫细胞表面膜蛋白的细胞接合器分子；
(b)能够上调NKG2D配体表达的药物；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在优选的实施方式中，组分(b)包括能够上调细胞表面NKG2D配体表达，优选地选自下组：依托泊苷、顺铂、长春新碱、紫杉醇或其组合。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌肉内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地，本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、动脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的细胞接合器还可与其他治疗剂一起使用。
本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
治疗性应用
本发明提供了靶向NKG2D配体细胞接合器分子和本发明的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗老年性疾病。
并且，本发明还提供了本发明的靶向NKG2D的细胞接合器分子和本发明的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于(i)清除衰老细胞；(ii)延缓个体衰老；和/或(iii)预防和/或治疗老年性疾病。
在优选的实施方式中，所述衰老细胞中NKG2D配体较正常细胞上调1.5倍以上
其中，老年性疾病包括：肌肉萎缩症、脂肪肝、心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎等细胞衰老导致的器官退行性疾病，或其组合。
本发明的通用型细胞接合器分子也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
除了就离体免疫细胞而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了用于体内以增强针对患者中靶向抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症的特征、疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗衰老有效量”、“衰老性疾病-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、衰老组织大小、衰老程度和病症的个体差异。
本发明的主要优点
本发明构建的双特异性细胞接合器分子同时靶向NKG2D配体和免疫细胞，通过直接输注入体内，或利用体内细胞(如NK细胞、T淋巴细胞、CAR-T细胞等)携带并在体内持续表达该抗体蛋白，从而使该双特异性细胞接合器分子在体内发挥杀伤作用。其主要优点包括：
1)高靶向性：针对NKG2D配体阳性衰老细胞的双特异性细胞接合器分子，能够有效地桥接衰老细胞和免疫细胞，结合稳定，杀伤力强。
2)高安全性：NKG2D配体是天然免疫细胞清除衰老细胞和肿瘤细胞的重要靶点，其在正常细胞表面表达受到严格调控；NKG2D-NKG2DL信号链经历了长期的自然选择形成，具有高度的安全性。并且目前已有大量针对NKG2D配体的免疫疗法正在进行临床实验，尚未发现严重的治疗相关副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例中涉及的序列如下所示。
SEQ ID NO:1NKG2D胞外域
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
SEQ ID NO:2CD3结合域(源于CD3单克隆抗体OKT3)
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:3CD16结合域scFv片段(引用自专利US11167029B2)
QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:4CD16结合域VhH片段(引用自GenBank ABS29544.1)
EVQLVESGGGFVQAGESLTLSCTSSTLTFTPYRMAWYRQAPGKQRDLVADISSGDGRTTNYADFAKGRFTISRDNIKNTVFLRMTNLKPEDTAVYYCNTFVSFVGIARSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:5IgG抗体FC片段(源于马吉妥昔单抗)
PKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例1 NKG2D-CD3蛋白制备
1.1载体构建
将如图1A所示结构的目的基因核苷酸序列合成后，通过EcoR I和Swa I酶切位点克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(参见Myeloid Leukemia.Mol Ther,2016.24(9):p.1615-26.)。克隆后的载体经过酶切和测序验证正确后，转化感受态大肠杆菌(Stbl3)并扩大培养，然后用QIAGEN公司的无内毒素中抽试剂盒抽提，并用Hind III酶切鉴定。
1.2病毒包装
在15cm培养皿中培养HEK-293T细胞用于病毒包装。待HEK-293T细胞汇合度在90％左右进行转染，准备2ml OPTIMEM溶解的质粒混合物(核心质粒20ug、pCMVΔR8.9 10ug、PMD2.G 4ug)；在另一离心管中2ml OPTIMEM以及68ul的lipo8000。室温静置5min后，将质粒复合物加入脂质体复合物中，室温静置20min。将上述混合物滴加入HEK-293T细胞中，37℃孵育6小时后去除培养基。重新加入预热的完全培养基。收集48小时和72小时病毒上清后，于4℃3000rpm离心20分钟。用0.45um滤膜过滤后，于25000rpm 4℃离心2.5小时进行病毒浓缩。浓缩的病毒用30ul病毒溶解液过夜溶解后，病毒滴度用QPCR检测。结果显示，病毒滴度达到要求。
1.3蛋白制备和纯化
取上述病毒感染CHO细胞，24h后加入1ug/ml嘌呤霉素筛选48h。筛选后的CHO细胞继续培养至7d后，收集培养液上清并用0.22um滤膜过滤，利用亲和层析柱从表达上清中获得带His标签的抗体。平衡缓冲液为0.5M Nacl、20mM磷酸钠缓冲液900ml，PH＝7.4；洗脱缓冲液为0.5M咪唑、0.5M Nacl、20mM磷酸钠缓冲液900ml,PH＝7.4。通过阳离子交换柱后获得NKG2D-CD3双特性抗体，最后用PBS缓冲液进行换液浓缩。纯化后NKG2D-CD3蛋白SDS-PAGE电泳如图1B所示。Western Blot结果如1C所示，分子量大小与理论一致。
实施例2衰老细胞中NKG2D配体表达上调
2.1Tet-on系统过表达p16蛋白的细胞衰老模型构建
(1)将3×105个细胞分别铺于10cm皿，第二天贴壁后细胞密度在20％左右；
(2)待细胞贴壁后，将Tet-on系统过表达p16蛋白的慢病毒以50-100的感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别感染细胞，并按照1:1000的比例加入原液浓度为8mg/mL的polybrene以提高感染效率；
(3)24h后以相同的病毒量进行二次感染；
(4)感染病毒4天后，加入终浓度为3μg/mL的嘌呤霉素筛选；
(5)将构建好的过表达p16蛋白的细胞传于孔板或培养皿中，24h贴壁后加入1μg/mL的dox诱导p16蛋白的表达；
(6)诱导8天后，用SA-βgal染色试剂盒(CS0030,Sigma)对细胞进行衰老染色，结果如图2A所示，90％以上细胞呈阳性，表明此时细胞已衰老。
2.2 NKG2D配体转录水平表达检测
(1)按上述方法准备衰老细胞后，在10cm皿中依据细胞密度加入1～2mL Trizol，冰上放置5min，枪头吹打混匀；
(2)吸取1mL各孔裂解液加入1.5mL EP管中，加入氯仿200μL，用力振摇15s；室温放置5min离心(4℃，12000g，15min)；
(3)在新的EP管中加入450μL的异丙醇；
(4)小心吸取离心后的上层无色液体，加入含异丙醇的EP管中，混匀，室温孵育10min，离心(4℃，12000g，10min)；
(5)弃上清，加入1mL RNase free水配置的75％乙醇洗RNA，离心(4℃，7500g，5min)；
(6)小心去上清，倒扣5min晾干，用枪头吸去管壁的液体；
(7)加入30μL RNase Free水溶解，溶解后立即放在冰上，测定浓度
(8)以提取的RNA为模板，使用Thermo Scientific RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒将2μg RNA反转录为cDNA。反应体系如下所示：
Figure BDA0003850370310000161
(9)按以上体系将反应物加入PCR管中，PCR仪内65℃，5min，立即放于冰上，再向管中加入以下成份：
Figure BDA0003850370310000162
轻轻混匀并瞬时离心，置于PCR仪中进行如下反应：25℃，5min；42℃，1h；70℃，5min；
(10)荧光实时定量PCR检测NKG2D配体表达，具体操作根据Thermo powerupTM SYBRGreen Master Mix(A25742)试剂盒说明书进行，程序：50℃，2min；95℃，2min；95℃，15s(40个循环)；60℃，1min(40个循环)；12℃，forever；
(11)导出Excel格式的数据，计算NKG2D配体的相对表达量，结果如图2B所示，NKG2D配体MICA和ULBP3均显著上调。
2.3 NKG2D配体膜表达水平表达检测
(1)胰酶消化收集HEIP-P16细胞，1xPBS洗三次后，用200ul 1xPBS(含2％FBS)重悬，调整浓度细胞浓度为1x106 cell/ml；
(2)向重悬的细胞中加入NKG2D配体抗体，混匀，放置于冰上孵育120min，期间每隔10min涡旋一次细胞，以500g的速度离心5min，弃上清；
(3)加入1ml 1xPBS(含2％FBS)重悬细胞，500g离心5min；
(4)重复步骤；
(5)流式仪检测NKG2D配体表达，结果如图2C所示。
实施例3 NKG2D-CD3蛋白促进T细胞对衰老细胞的杀伤
3.1人体外周血T淋巴细胞分离
(1)将人体外周血转移至50mL离心管中，添加RosetteSepTM Cocktail至血液中(50μL/mL血液)；
(2)充分混匀后，室温孵育20min；
(3)配制稀释液：将1640培养基与1*PBS按体积比1:2混合；
(4)准备梯度离心管，加入15mL梯度分离液Ficol Lymphoprep；
(5)将稀释液与孵育血样按1:1混合；
(6)将稀释血样轻柔转移至分离液上，1200g离心20min；
(7)将离心后的全部上清液快速转移至新的离心管；
(8)用25mL的稀释液与上清混合均匀，300g离心10min；
(9)重复操作上述步骤；
(10)加入2mL T细胞完全培养基重悬T细胞，计数并用于后续实验。
3.2 NKG2D-CD3与衰老细胞和T淋巴细胞结合检测
(1)用200ul 1xPBS(含2％FBS)重悬T细胞和衰老细胞；
(2)向重悬的细胞中加入终浓度为100ug/ml的NKG2D-CD3抗体，混匀，放置于冰上孵育120min，期间每隔10min涡旋一次细胞，以500g的速度离心5min，弃上清；
(3)加入1ml 1xPBS(含2％FBS)重悬细胞，500g离心5min；
(4)重复步骤；
(5)加入anti-His抗体并混匀，放置于冰上孵育60min，期间每隔10min涡旋一次细胞，以500g的速度离心5min，弃上清；
(6)加入cy3标记的的羊抗兔二抗，室温孵育30min后，以500g的速度离心5min，弃上清；
(7)加入1ml 1xPBS(含2％FBS)重悬细胞，500g离心5min；
(8)重复步骤7；
(9)流式仪检测结合检测率，结果如图3A和3B所示，表明NKG2D-CD3与衰老细胞和T淋巴细胞均可有效结合。
3.3 NKG2D-CD3蛋白促进T细胞对衰老细胞的杀伤
将T细胞与P16过表达诱导的衰老细胞按效靶比2:1(T细胞为效应细胞；衰老细胞为靶细胞)接种于96孔板中，然后分别加入NKG2D-CD3或CD19-CD3蛋白共孵育8小时(细胞培养液：advance 1640培养基(Gibco)+10％胎牛血清(Gibco)+1％青霉素、链霉素(Gibco))，显微镜先计算活细胞数目并计算T细胞杀伤率。杀伤效率＝(Blank组靶细胞数量-共培养组靶细胞数量)/Blank组靶细胞数量*100％。结果如图3C所示，相对于对照组，NKG2D-CD3显著促进T细胞对衰老细胞杀伤作用，并呈现出剂量依赖性。
收集培养体系中上清，用ELISA试剂盒检测IFN-γ浓度，并用GraphPad Prism软件进行统计分析。结果如图3D所示，相对于对照组，加入NKG2D-CD3后IFN-γ分泌显著增加。
实施例4 NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白制备
将如图4A所示结构的目的基因核苷酸序列合成后，通过EcoR I和Swa I酶切位点克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。克隆后的载体经过酶切和测序验证正确后，转化感受态大肠杆菌(Stbl3)并扩大培养，并用QIAGEN公司的无内毒素中抽试剂盒抽提，然后用于病毒包装，包装过程如实施例1所描述。将包装好的病毒感染CHO细胞进行蛋白制备。用His标签抗体检测制备的NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白，结果如图4B所示，大小如预期一致。
实施例5 NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白促进NK92细胞对衰老细胞的杀伤
5.1 NKG2D-CD16和NKG2D-FC与NK92细胞结合检测
(1)用200ul 1xPBS(含2％FBS)重悬NK92细胞；
(2)向重悬的细胞中分别加入终浓度为100ug/ml的NKG2D-CD16和NKG2D-FC蛋白，混匀，放置于冰上孵育120min，期间每隔10min涡旋一次细胞，以500g的速度离心5min，弃上清；
(3)加入1ml 1xPBS(含2％FBS)重悬细胞，500g离心5min；
(4)重复步骤；
(5)加入anti-His抗体并混匀，放置于冰上孵育60min，期间每隔10min涡旋一次细胞，以500g的速度离心5min，弃上清；
(6)加入cy3标记的的羊抗兔二抗，室温孵育30min后，以500g的速度离心5min，弃上清；
(7)加入1ml 1xPBS(含2％FBS)重悬细胞，500g离心5min；
(8)重复步骤7；
(9)流式仪检测结合率，结果如图5A所示。结果表明NKG2D-CD16和NKG2D-FC均可与NK92细胞结合。
5.2 NKG2D-CD16和NKG2D-FC促进NK92细胞对衰老细胞杀伤
将P16过表达诱导的衰老细胞与NK92细胞按效靶比2:1(衰老细胞为靶细胞，NK92细胞为效应细胞)接种于96孔板中，然后分别加入不同浓度NKG2D-CD16或NKG2D-FC蛋白共孵育8小时，利用显微镜计算活细胞数目并计算T细胞杀伤率。杀伤效率＝(Blank组靶细胞数量-共培养组靶细胞数量)/Blank组靶细胞数量。结果如图5B所示，相对于对照组，NKG2D-CD16和NKG2D-FC均显著促进NK92细胞对衰老细胞杀伤作用。收集培养体系中上清，用ELISA试剂盒检测IFN-γ浓度，并用GraphPad Prism软件进行统计分析。结果如图5C所示，相对于对照组，加入NKG2D-CD16或NKG2D-FC后IFN-γ分泌显著增加。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种靶向NKG2D配体和免疫细胞的细胞接合器分子的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于：
(i)清除衰老细胞；
(ii)预防和/或治疗衰老细胞累积相关疾病；
(iii)延缓个体衰老；
所述细胞接合器分子包括第一结合结构域和第二结合结构域，
其中，所述第一结合结构域特异性结合NKG2D配体，所述第二结合结构域特异性结合免疫细胞表面膜蛋白。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第一结合结构域为NKG2D胞外域。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第一结合结构域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，或氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上相似度并且可结合NKG2D配体的多肽。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第二结合结构域特异性结合CD3或CD16。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第二结合结构域为氨基酸序列如SEQID NO.2、3、4或5所示的多肽，或具有与SEQ ID NO.2、3、4或5所示的氨基酸序列至少有85％序列同源性或序列相同性的氨基酸序列并且可结合CD3或CD16的多肽。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的衰老细胞的选自下组：肺细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌肉细胞，或其组合。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NKG2D配体选自下组：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、或其组合。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的老年性疾病选自下组：心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎、或其组合。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)靶向NKG2D和免疫细胞的细胞接合器分子；
(b)除(a)之外的其他清除衰老细胞药物；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(a)靶向NKG2D和免疫细胞的细胞接合器分子；
(b)能够上调NKG2D配体表达的药物；和(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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