CN116004776A - 一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及反转录荧光PCR技术领域，尤其是涉及一管式RT‑qPCR全预混反应试剂、应用及RT‑qPCR方法。本发明的一种一管式快速RT‑qPCR全预混反应体系。本发明主要针对现有RT‑qPCR反应体系存在的三个问题：(1)总反应体系分成多管保存，每次使用时各组分需要现配现用，引物探针必需单独保存或与扩增反应液一起保存，将各组分提前预混后会导致反应体系稳定性和特异性问题；(2)RT‑qPCR反应体系无法适应快速扩增程序，反应时间过长，不适用于快速检测；(3)RT‑qPCR反应体系与引物探针的适配性不足，需要根据不同的引物探针组合调整反应体系的配方。
Description
技术领域
本发明涉及反转录荧光PCR技术领域，尤其是涉及一管式RT-qPCR全预混反应试剂、应用及RT-qPCR方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reation PCR)是利用单链募核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法，该反应是一个指数式反应，可在短时间内使极微量的目的DNA片段特异地扩增上百万倍。
RT-qPCR则是在PCR的基础上加入了反转录酶，以RNA为原始模板进行扩增得到DNA的方法。RT-qPCR根据反应体系中加入的荧光基团所积累的荧光信号强度变化，对PCR反应中的每一个循环扩增产物进行实时监控。
目前常用的RT-qPCR反应体系由核酸扩增缓冲液、酶混合液、引物探针反应液等组成且需要单独保存，在使用时需要将各组分室温溶解充分混匀后待用，使用时将各组分按照固定比例加入混匀后再分装到pcr管中，整个流程需要进行计算和仔细操作，会经常出现配错的情况，而且反应体系需要现配现用，如提前将核酸扩增缓冲液、酶混合液、引物探针反应液预混，冷冻或冷藏保存后会出现稳定性问题，具体表现为灵敏度下降和阴性样本中出现非特异性扩增。
RT-qPCR反应体系中引物探针在快速程序下的扩增效率与反应体系中的核酸扩增缓冲液和酶混合液有直接关系，一般情况下一组引物探针需要对应开发一组核酸扩增缓冲液和酶混合液，反应体系之间不能混用，RT-qPCR反应体系对各种引物探针反应液的适用性较差。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种一管式RT-qPCR全预混反应试剂，使用该试剂制备一管式RT-qPCR全预混反应体系后，用于RT-qPCR反应，以期解决现有RT-qPCR反应体系各组分单独保存、需要现配现用，全预混后灵敏度下降、非特异性增加、保存稳定性下降，引物探针适用性低的问题。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一管式RT-qPCR全预混反应试剂，所述试剂包括带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体。
在可选的实施方式中，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体的氨基酸序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。
在可选的实施方式中，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的含量比(U/U)为1:3～9，优选为1:5。
在可选的实施方式中，还包括核酸适配体。
在可选的实施方式中，所述核酸适配体含有的碱基数量为50～100bp。
优选地，所述核酸适配体的浓度为0.2～0.7ng/mL，优选为0.5ng/mL。
在可选的实施方式中，还包括稳定剂和/或增强剂。
优选地，所述稳定剂包括0.5～1mg/mL BSA、0.005％～0.008％(v/v)明胶、5％～10％(v/v)甘油或0.1％～0.2％(v/v)非离子型去垢剂中至少两种。
优选地，所述稳定剂包括0.7mg/mL BSA、0.006％(v/v)明胶和7％(v/v)甘油。
优选地，所述增强剂包括1％～2％(v/v)甲酰胺、1％～5％(v/v)DMSO、0.1～0.3M甜菜碱、0.5～1.0g/L SSB单链结合蛋白、0.3～0.8g/L焦磷酸酶、0.1～0.3M海藻糖和0.05～0.1g/L叠氮钠。
优选地，所述增强剂包括2％甲酰胺、2.5％DMSO、0.2M甜菜碱、0.8g/L SSB单链结合蛋白、0.2M海藻糖和0.08g/L叠氮钠。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂在制备一管式RT-qPCR全预混反应体系中的应用。
第三方面，本发明提供一管式RT-qPCR全预混反应体系，包括前述实施方式任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂；
还包括DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、RNA酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、增强剂、上下游引物和荧光标记的探针组合物。
优选地，所述DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶，延伸速度为1.5sec/kb，优选添加量为3～6U。
优选地，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶，耐受温度为60℃以上，添加量为5～10U。
优选地，所述UNG酶为0.1～0.5U的热敏UNG酶。
优选地，所述RNA酶抑制剂添加量为2～3U。
优选地，所述缓冲液为100～500mM的Tris-Hcl缓冲溶液。
优选地，所述缓冲液含有无机盐，所述无机盐为硫酸盐和/或氯化盐，更优选为氯化盐。
在可选的实施方式中，按照单次扩增核酸产物种类数量的区别，所述上下游引物和荧光标记的探针组合物包括单重检测组合物、双重检测组合物、三重检测组合物或四重检测组合物。
优选地，所述核酸产物来源于病毒。
优选地，所述病毒选自诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
优选地，所述单重检测组合物为诺如病毒引物探针组合物。
优选地，所述诺如病毒引物探针组合物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(CTGGTGGATTGGAAATGTA)，所述诺如病毒引物探针组合物中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(AATTCGGGCAGAAGATTG)，所述诺如病毒引物探针组合物中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示(CTGTCCACAATCCGAGGTCAT)；
优选地，所述双重检测组合物为甲型乙型流感病毒引物探针组合物；
优选地，所述甲型乙型流感病毒引物探针组合物中甲型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示(AGTCTTCTAACCGAGGTC)，甲型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示(TCGAGATCTGCGTTCTTC)，甲型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示(CATCCTCAAGTCTCTGTGCGA)，乙型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示(GGAGTCTTATCCCAATTTG)，乙型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示(CTTCTGTGACCAGTCTAA)，乙型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示(CAAGAGCACCGATTATCACCAGAA)。
优选地，所述三重检测组合物为肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物。
优选地，所述肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物中含有：
肠道常规病毒通用上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示(GCAAGTAGTCACAGATTAG)，肠道常规病毒通用下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示(GATTCTTGTCACTAGCATT)，肠道常规病毒通用探针，核苷酸序列如SEQ ID No.14所示(TACCAGCACTACAAGCCGC)；
肠道病毒71型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.15所示(CACAGGTGAGCAGTCATC)，肠道病毒71型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示(CGCCCTACTGAAGAAACT)，肠道病毒71型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示(TACAGGCAAGGTTCCAGCAC)；
柯萨奇病毒16型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.18所示(CTTCCAGAGATTCGTTTG)，柯萨奇病毒16型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.19所示(CATATTATTCGGGCATTGA)，柯萨奇病毒16型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.20所示(CAGACAGCCACCAACCCAT)。
第四方面，本发明提供RT-qPCR方法，使用前述实施方式所述一管式RT-qPCR全预混反应体系对待测样本按照如下程序扩增：55～65℃下逆转录1～5min；94～98℃下预变性5～15s；94～98℃下变性1～5s；55～65℃下退火延伸8～15s；变性、退火延伸循环38～45次；
优选地，扩增程序为：60℃下逆转录2min；95℃下预变性10s；95℃下变性1s；60℃下退火10s；60℃下延伸10s；变性、退火和延伸循环40次。
第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应试剂，前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应体系，或者，前述实施方式所述RT-qPCR方法在病毒感染诊断中的应用。
优选地，所述病毒包括诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
第六方面，本发明提供了病毒感染的诊断方法，所述诊断方法包括，使用前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应试剂配置得到前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应体系对待测样本按照前述实施方式所述RT-qPCR方法进行扩增，确定扩增产物的病毒来源。
优选地，所述病毒包括诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
优选地，所述待测样本来源选自粪便、呕吐物、鼻拭子、咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液、细胞、鸡胚培养物、疱疹液、血清、脑脊液或组织培养物。
优选地，所述咽拭子包括人类咽拭子或禽类咽拭子。
采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明的一种一管式快速RT-qPCR全预混反应体系。本发明主要针对现有RT-qPCR反应体系存在的三个问题：(1)总反应体系分成多管保存，每次使用时各组分需要现配现用，引物探针必需单独保存或与扩增反应液一起保存，将各组分提前预混后会导致反应体系稳定性和特异性问题；(2)RT-qPCR反应体系无法适应快速扩增程序，反应时间过长，不适用于快速检测；(3)RT-qPCR反应体系与引物探针的适配性不足，需要根据不同的引物探针组合调整反应体系的配方。
本发明提供了一种全预混RT-qPCR反应体系及其应用有益效果是：优选了支持超快速延伸的热启动Taq DNA聚合酶，大幅度减少了反应体系的运行时间，整个反应时间控制在30min以内；同时优选了耐高温的逆转录酶，提高了RT-qPCR反应体系对引物探针的适配性，做到不同组合引物探针即插即用；RT-qPCR反应体系添加了带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体(Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody)、核酸适配体保证在低温情况下有效抑制Taq DNA聚合酶和逆转录酶的酶活，减少在高温加压和长期保存时引物二聚体的产生和Taq DNA聚合酶对探针的剪切作用，从而显著提高反应体系的特异性，避免了因反应体系导致的假阳性；RT-qPCR反应体系添加了稳定剂、增强剂，最大程度保护反应体系中Taq DNA聚合酶、逆转录酶及其它酶的活性，提高了高温加压和长效保存的稳定性，检测能力更好。全预混RT-qPCR反应体系可在37℃高温加压7天对检测能力无影响，-20℃以下条件稳定保存12～15个月。同时反应体系可直接分装后加核酸后使用，大幅度减少了检验人员的工作量，特别适用于自动化平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图2为本发明实施例2全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图3为本发明实施例2全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图4为本发明实施例2全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图5为本发明实施例3全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图6为本发明实施例4全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图7为本发明实施例5全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图8为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系和对照组的扩增结果；
图9为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存1个月后的长期稳定性检测结果；
图10为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存3个月后的长期稳定性检测结果；
图11为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存6个月后的长期稳定性检测结果；
图12为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存9个月后的长期稳定性检测结果；
图13为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存12个月后的长期稳定性检测结果；
图14为本发明实施例6全预混RT-PCR反应体系保存15个月后的长期稳定性检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供一管式RT-qPCR全预混反应试剂，所述试剂包括带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体。
在可选的实施方式中，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体的氨基酸序列如SEQID No.1(DIEMTQSSGAELARPGASVKMSCKASGTFRYSDYMHWVKQRPGQGLEWIGYRGPNDRYTKYNQKFKKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCGRDDYYCSHDATWGQGTTLSRT)和SEQ ID No.2(VQLVESGGMSASPGEKVTMTCAASSVYSSMHWYQQKSGTSPKRWIYDYQKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAETPETYYCEDWNPSDTFFGSGTTISRDN)所示。
在可选的实施方式中，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的含量比(U/U)为1:3～9，优选为1:5。
在可选的实施方式中，还包括核酸适配体。
在可选的实施方式中，所述核酸适配体含有的碱基数量为50～100bp。
优选地，所述核酸适配体的浓度为0.2～0.7ng/mL，优选为0.5ng/mL。
在可选的实施方式中，还包括稳定剂和/或增强剂。
优选地，所述稳定剂包括0.5～1mg/mL BSA、0.005％～0.008％(v/v)明胶、5％～10％(v/v)甘油或0.1％～0.2％(v/v)非离子型去垢剂中至少两种。
优选地，所述稳定剂包括0.7mg/mL BSA、0.006％(v/v)明胶和7％(v/v)甘油。
优选地，所述增强剂包括1％～2％(v/v)甲酰胺、1％～5％(v/v)DMSO、0.1～0.3M甜菜碱、0.5～1.0g/L SSB单链结合蛋白、0.3～0.8g/L焦磷酸酶、0.1～0.3M海藻糖和0.05～0.1g/L叠氮钠。
优选地，所述增强剂包括2％甲酰胺、2.5％DMSO、0.2M甜菜碱、0.8g/L SSB单链结合蛋白、0.2M海藻糖和0.08g/L叠氮钠。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂在制备一管式RT-qPCR全预混反应体系中的应用。
第三方面，本发明提供一管式RT-qPCR全预混反应体系，包括前述实施方式任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂；
还包括DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、RNA酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、增强剂、上下游引物和荧光标记的探针组合物。
优选地，所述DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶，延伸速度为1.5sec/kb，优选添加量为3～6U。
优选地，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶，耐受温度为60℃以上，添加量为5～10U。
优选地，所述UNG酶为0.1～0.5U的热敏UNG酶。
优选地，所述RNA酶抑制剂添加量为2～3U。
优选地，所述缓冲液为100～500mM的Tris-Hcl缓冲溶液。
优选地，所述缓冲液含有无机盐，所述无机盐为硫酸盐和/或氯化盐，更优选为氯化盐。
在可选的实施方式中，按照单次扩增核酸产物种类数量的区别，所述上下游引物和荧光标记的探针组合物包括单重检测组合物、双重检测组合物、三重检测组合物或四重检测组合物。
优选地，所述核酸产物来源于病毒。
优选地，所述病毒选自诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
优选地，所述单重检测组合物为诺如病毒引物探针组合物。
优选地，所述诺如病毒引物探针组合物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(CTGGTGGATTGGAAATGTA)，所述诺如病毒引物探针组合物中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(AATTCGGGCAGAAGATTG)，所述诺如病毒引物探针组合物中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示(CTGTCCACAATCCGAGGTCAT)；
优选地，所述双重检测组合物为甲型乙型流感病毒引物探针组合物；
优选地，所述甲型乙型流感病毒引物探针组合物中甲型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示(AGTCTTCTAACCGAGGTC)，甲型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示(TCGAGATCTGCGTTCTTC)，甲型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示(CATCCTCAAGTCTCTGTGCGA)，乙型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示(GGAGTCTTATCCCAATTTG)，乙型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示(CTTCTGTGACCAGTCTAA)，乙型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示(CAAGAGCACCGATTATCACCAGAA)；
优选地，所述三重检测组合物为肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物。
所述肠道常规病毒是指包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和在人类肠道致细胞病变的孤儿病毒(ECHO病毒)。1970年国际病毒命名委员会将这些病毒归属于微小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。
优选地，所述肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物中含有：
肠道常规病毒通用上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示(GCAAGTAGTCACAGATTAG)，肠道常规病毒通用下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示(GATTCTTGTCACTAGCATT)，肠道常规病毒通用探针，核苷酸序列如SEQ ID No.14所示(TACCAGCACTACAAGCCGC)；
肠道病毒71型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.15所示(CACAGGTGAGCAGTCATC)，肠道病毒71型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示(CGCCCTACTGAAGAAACT)，肠道病毒71型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示(TACAGGCAAGGTTCCAGCAC)；
柯萨奇病毒16型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.18所示(CTTCCAGAGATTCGTTTG)，柯萨奇病毒16型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.19所示(CATATTATTCGGGCATTGA)，柯萨奇病毒16型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.20所示(CAGACAGCCACCAACCCAT)。
第四方面，本发明提供RT-qPCR方法，使用前述实施方式所述一管式RT-qPCR全预混反应体系对待测样本按照如下程序扩增：55～65℃下逆转录1～5min；94～98℃下预变性5～15s；94～98℃下变性1～5s；55～65℃下退火延伸8～15s；变性、退火延伸循环38～45次；
优选地，扩增程序为：60℃下逆转录2min；95℃下预变性10s；95℃下变性1s；60℃下退火10s；60℃下延伸10s；变性、退火和延伸循环40次。
第五方面，本发明提供了前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应试剂，前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应体系，或者，前述实施方式所述RT-qPCR方法在病毒感染诊断中的应用。
优选地，所述病毒包括诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
第六方面，本发明提供了病毒感染的诊断方法，所述诊断方法包括，使用前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应试剂配置得到前述实施方式任一项所述一管式RT-qPCR全预混反应体系对待测样本按照前述实施方式所述RT-qPCR方法进行扩增，确定扩增产物的病毒来源。
优选地，所述病毒包括诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种。
优选地，所述待测样本来源选自粪便、呕吐物、鼻拭子、咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液、细胞、鸡胚培养物、疱疹液、血清、脑脊液或组织培养物。
优选地，所述咽拭子包括人类咽拭子或禽类咽拭子。
对于上述待测样本来源，本领域技术人员能够根据实际需求进行选择，例如，诺如病毒的待测样本可以选择患者粪便或呕吐物等样品，甲型流感病毒或乙型流感病毒的待测样本可以选择患者的鼻拭子、咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液；或者，环境采样得到的离体细胞、鸡胚培养物，以及禽类咽喉拭子等样品。而肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型的待测样本可以选择患者的疱疹液、咽喉分泌物、粪便、血清、脑脊液或离体组织培养物。
例如，某次具体扩增方法如下：
S100、预处理，取出RT-qPCR全预混反应体系，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
S200、加样：取出装有RT-qPCR全预混的预分装八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各10μL，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
S300、扩增和荧光信号检测，将步骤S200得到的PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；
优选的，根据权利要求1所述的RT-qPCR方法，其特征在于，所述步骤S300中的荧光定量PCR仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例的一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U Taq DNA聚合酶、6U M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂，0.5uM的诺如病毒上游引物和下游引物、0.55uM探针，引物探针序列为：上游引物序列为：CTGGTGGATTGGAAATGTA，下游引物序列为：AATTCGGGCAGAAGATTG，探针序列为：CTGTCCACAATCCGAGGTCAT。
其中4U Taq DNA聚合酶为延伸速度1.5sec/kb的Taq DNA聚合酶。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U Taq DNA聚合酶、6U耐高温M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂，不同组合引物探针。
其中6U M-MLV逆转录酶为耐60度高温M-MLV逆转录酶。
实施例3
本实施例与实施例2的不同之处在于的一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U快速Taq DNA聚合酶、6U M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂、5ug/mLDouble-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody、0.5uM的诺如病毒上游引物和下游引物、0.55uM探针，引物探针序列为：上游引物序列为：CTGGTGGATTGGAAATGTA，下游引物序列为：AATTCGGGCAGAAGATTG，探针序列为：CTGTCCACAATCCGAGGTCAT。
其中所述Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody为带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体，与Taq DNA聚合酶的使用比例为1:5。
实施例4
本实施例与实施例3的不同之处在于的一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U快速Taq DNA聚合酶、6U M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂、Double-Blockanti-Taq DNA Polymerase Antibody、0.5ng/mL核酸适配体、0.5uM的诺如病毒上游引物和下游引物、0.55uM探针，引物探针序列为：上游引物序列为：CTGGTGGATTGGAAATGTA，下游引物序列为：AATTCGGGCAGAAGATTG，探针序列为：CTGTCCACAATCCGAGGTCAT。
其中所述核酸适配体为50-100bp的寡核苷酸单链。
实施例5
本实施例与实施例4的不同之处在于的一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U快速Taq DNA聚合酶、6U M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂、Double-Blockanti-Taq DNA Polymerase Antibody、0.5ng/mL核酸适配体、PCR体系稳定剂、0.5uM的诺如病毒上游引物和下游引物、0.55uM探针，引物探针序列为：上游引物序列为：CTGGTGGATTGGAAATGTA，下游引物序列为：AATTCGGGCAGAAGATTG，探针序列为：CTGTCCACAATCCGAGGTCAT。
其中稳定剂为0.7mg/mLBSA、0.006％明胶、7.0％甘油、其中所述百分比为体积百分比。
实施例6
本实施例与实施例5的不同之处在于的一管式快速RT-qPCR全预混反应体系，包括：200mM Tris-Hcl缓冲溶液(pH8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.25mM dN(U)TPs、4U快速Taq DNA聚合酶、6U M-MLV逆转录酶、0.25U热敏UNG酶、2.5U的核酸酶抑制剂、Double-Blockanti-Taq DNA Polymerase Antibody、0.5ng/mL核酸适配体、PCR体系稳定剂、PCR体系增强剂、0.5uM的诺如病毒上游引物和下游引物、0.55uM探针，引物探针序列为：上游引物序列为：CTGGTGGATTGGAAATGTA，下游引物序列为：AATTCGGGCAGAAGATTG，探针序列为：CTGTCCACAATCCGAGGTCAT。
其中增强剂为2％甲酰胺、2.5％DMSO、0.2M甜菜碱、0.8g/LSSB单链结合蛋白、0.2M海藻糖、0.08g/L叠氮钠。
实验例
反应速度评价：将实施例1中预混好的反应液，取15μL进行分装，再加入5μL提取的RNA/DNA(5000拷贝/mL)作为模板，按照下述RT-qPCR进行扩增并检测。以使用常规Taq DNA聚合酶的全预混RT-qPCR反应体系作为对照组。检测结果如图1。
其中扩增程序：
适用性评价：将实施例2中预混好的反应液，取15μL进行分装，再加入5μL提取的RNA(1000拷贝/mL)(病原体靶标对应标准品)作为模板，其中，单重引物探针为诺如引物探针，与实施案例1一致，双重引物探针组合为甲型乙型流感病毒引物探针(甲流上游引物序列：AGTCTTCTAACCGAGGTC、甲流下游引物序列：TCGAGATCTGCGTTCTTC、甲流探针序列：CATCCTCAAGTCTCTGTGCGA，乙流上游引物序列：GGAGTCTTATCCCAATTTG、乙流下游引物序列：CTTCTGTGACCAGTCTAA、乙流探针序列：CAAGAGCACCGATTATCACCAGAA)，三重引物探针组合为肠道病毒通用肠道病毒71型柯萨奇病毒16型引物探针(肠道通用上游引物序列：GCAAGTAGTCACAGATTAG、肠道通用下游引物序列：GATTCTTGTCACTAGCATT、肠道通用探针序列：TACCAGCACTACAAGCCGC，肠道病毒71型上游引物序列：CACAGGTGAGCAGTCATC、肠道病毒71型下游引物序列：CGCCCTACTGAAGAAACT、肠道病毒71型探针序列：TACAGGCAAGGTTCCAGCAC，柯萨奇病毒16型上游引物序列：CTTCCAGAGATTCGTTTG、柯萨奇病毒16型下游引物序列：CATATTATTCGGGCATTGA、柯萨奇病毒16型探针序列：CAGACAGCCACCAACCCAT)，以使用常规M-MLV逆转录酶的全预混RT-qPCR反应体系作为对照组。按照实施案例1中RT-qPCR程序进行扩增并检测。检测结果如图2～4。
特异性评价：将实施例3～4中预混好的反应液，取15μL进行分装，再加入5μL提取的人基因组核酸(阴性样本)作为模板，加样后2～8℃保存12小时后按照RT-qPCR进行扩增并检测。以不含Double-Block anti-Taq DNAPolymerase Antibody、核酸适配体作为对照，检测结果如图5～6。
稳定性评价：将实施案例5预混好的反应液，取15μL进行分装，再加入5μL提取的RNA(5000拷贝/mL)作为模板，加样后37℃保存7天后，按照RT-qPCR进行扩增并检测。以不含PCR稳定剂的全预混RT-PCR反应体系作为对照组。其荧光定量PCR检测结果如图7所示。
灵敏度评价：将实施案例6预混好的反应液，取15μL进行分装，再加入5μL提取的RNA(400拷贝/mL)作为模板，按照RT-qPCR进行扩增并检测。以不含PCR增强剂的全预混RT-PCR反应体系作为对照组。其荧光定量PCR检测结果如图8所示。
长期稳定性评价：将实施案例6预混好的反应液，-20℃保存1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月时进行检测，具体的实验方法为：取15μL进行分装，再加入5μL提取的RNA(5000拷贝/mL)作为模板，按照RT-qPCR进行扩增并检测。以不含Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody、核酸适配体、PCR体系稳定剂、PCR体系增强剂作为对照，检测结果分别如图9～14，分别对应保存-20℃保存1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月。
由上述结果可以看出，本发明通过组分的筛选、Double-Block anti-Taq DNAPolymerase Antibody、核酸适配体的制备及使用、PCR体系稳定剂、PCR体系增强剂的使用，实现了RT-qPCR反应体系各组分的全预混，终端客户可在不配制的情况下直接使用，且全预混体系可长期稳定保存，解决了全预混体系长期保存的稳定性和特异性问题；在使用快速DNA聚合酶的情况下，整个反应时间缩短到30分钟以内，大幅度减少了实验时间，增加了等同时间内的检测通量；在使用耐高温逆转录酶的情况下，反应体系与引物探针的适配性有巨大提升，不同人设计的引物探针可直接使用，无需二次设计引物探针。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，所述试剂包括带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，所述带有双封闭能力Taq酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的含量比(U/U)为1:3～9，优选为1:5。
4.根据权利要求1所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，还包括核酸适配体。
5.根据权利要求4所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，所述核酸适配体含有的碱基数量为50～100bp；
优选地，所述核酸适配体的浓度为0.2～0.7ng/mL，优选为0.5ng/mL。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂，其特征在于，还包括稳定剂和/或增强剂；
优选地，所述稳定剂包括0.5～1mg/mL BSA、0.005％～0.008％(v/v)明胶、5％～10％(v/v)甘油或0.1％～0.2％(v/v)非离子型去垢剂中至少两种；
优选地，所述稳定剂包括0.7mg/mL BSA、0.006％(v/v)明胶和7％(v/v)甘油；
优选地，所述增强剂包括1％～2％(v/v)甲酰胺、1％～5％(v/v)DMSO、0.1～0.3M甜菜碱、0.5～1.0g/L SSB单链结合蛋白、0.3～0.8g/L焦磷酸酶、0.1～0.3M海藻糖和0.05～0.1g/L叠氮钠；
优选地，所述增强剂包括2％甲酰胺、2.5％DMSO、0.2M甜菜碱、0.8g/L SSB单链结合蛋白、0.2M海藻糖和0.08g/L叠氮钠。
7.权利要求1～6任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂在制备一管式RT-qPCR全预混反应体系中的应用。
8.一管式RT-qPCR全预混反应体系，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的一管式RT-qPCR全预混反应试剂；
还包括DNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶、RNA酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、增强剂、上下游引物和荧光标记的探针组合物；
优选地，所述DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶，延伸速度为1.5sec/kb，优选添加量为3～6U；
优选地，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶，耐受温度为60℃以上，添加量为5～10U；
优选地，所述UNG酶为0.1～0.5U的热敏UNG酶；
优选地，所述RNA酶抑制剂添加量为2～3U；
优选地，所述缓冲液为100～500mM的Tris-Hcl缓冲溶液；
优选地，所述缓冲液含有无机盐，所述无机盐为硫酸盐和/或氯化盐，更优选为氯化盐。
9.根据权利要求8所述的一管式RT-qPCR全预混反应体系，其特征在于，按照单次扩增核酸产物种类数量的区别，所述上下游引物和荧光标记的探针组合物包括单重检测组合物、双重检测组合物、三重检测组合物或四重检测组合物；
优选地，所述核酸产物来源于病毒；
优选地，所述病毒选自诺如病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、肠道常规病毒、肠道病毒71型或柯萨奇病毒16型中至少一种；
优选地，所述单重检测组合物为诺如病毒引物探针组合物；
优选地，所述诺如病毒引物探针组合物中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述诺如病毒引物探针组合物中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述诺如病毒引物探针组合物中探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
优选地，所述双重检测组合物为甲型乙型流感病毒引物探针组合物；
优选地，所述甲型乙型流感病毒引物探针组合物中甲型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，甲型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，甲型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，乙型流感病毒上游引物的核苷酸序列如SEQID No.9所示，乙型流感病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，乙型流感病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
优选地，所述三重检测组合物为肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物；
优选地，所述肠道常规病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型引物探针组合物中含有：
肠道常规病毒通用上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，肠道常规病毒通用下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，肠道常规病毒通用探针，核苷酸序列如SEQ IDNo.14所示；
肠道病毒71型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，肠道病毒71型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，肠道病毒71型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
柯萨奇病毒16型上游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，柯萨奇病毒16型下游引物，核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，柯萨奇病毒16型探针，核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
10.RT-qPCR方法，其特征在于，使用权利要求8或9所述一管式RT-qPCR全预混反应体系对待测样本按照如下程序扩增：55～65℃下逆转录1～5min；94～98℃下预变性5～15s；94～98℃下变性1～5s；55～65℃下退火延伸8～15s；变性、退火延伸循环38～45次；
优选地，扩增程序为：60℃下逆转录2min；95℃下预变性10s；95℃下变性1s；60℃下退火延伸10s；变性、退火和延伸循环40次。
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