CN115992169A - 一种高效的百合花被片瞬时表达方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效的百合花被片瞬时表达方法及应用，涉及植物基因工程技术领域，以东方百合‘西伯利亚’盛开花朵的花被片为材料，利用农杆菌介导法，将携带GUS报告基因的PBI121载体转入百合花被片。通过正交试验确定农杆菌菌株类型、乙酰丁香酮(AS)浓度和抽吸气压三个因素对GUS基因瞬时表达效率的影响，利用该方法进行一个带GFP标签蛋白的Super1300载体的转化以及LoWRKY33、LoSAG5和LoSAG10等三个基因的功能验证，表明目的基因编码的蛋白能在百合花被片中顺利表达。该方法极大地缩短了百合中基因功能验证的时间，为百合花朵开放衰老过程中重要基因的筛选和功能研究奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种高效的百合花被片瞬时表达方法及应用。
背景技术
百合(Lilium spp.)为百合科百合属球根类花卉,多年生鳞茎草本植物，主要分布于北半球的温带地区，如东亚、欧洲、北美。中国是世界百合属植物的自然分布中心，全世界百合属植物约有110～115个种，而中国有55个种、18个变种(李介文等，2019)。百合是世界上重要的切花种类，在我国鲜切花卉生产中,百合的种植规模不断扩大，年均增幅超过20％。然而，百合切花不耐贮运，储藏保鲜环节造成的经济损失就达40％之多(吴中军等，2013)，此外，百合切花瓶插寿命较短，严重制约其观赏品质。筛选和鉴定百合花朵衰老过程中的关键基因，进而通过分子育种或保鲜技术延缓百合花朵的衰老具有重要的理论价值和潜在的应用价值。
为研究基因功能，前人开发了农杆菌介导的遗传转化方法、病毒诱导的基因沉默和瞬时过表达等方法。根据转化的植物材料的不同，农杆菌介导的遗传转化又可细分为花序浸蘸法、叶盘法、体胚转化法和顶端分生组织转化法等。其中，花序浸蘸法适用于模式植物拟南芥，只需将花序浸泡在携带目的基因的菌液中即可完成侵染过程，再对种子进行抗性筛选获得转基因阳性苗(Zhang et al.,2006)。叶盘法广泛应用于菊花(Hu et al.,2018)和烟草(Wang et al.,2019)等植物的转化。近年来，体胚转化在月季(Zhang et al.,2021)、玫瑰(Shen et al.,2019)和百合(Yan et al.,2020)等花卉中也获得了成功。此外，植物的顶端分生组织可不经历脱分化及再分化过程而直接形成芽(Nguyen et al.,2016)，利用顶端分生组织进行转化的方法已应用在一些再生困难的植物中，如棉花(Rajasekaranet al.,2019)和小麦(Hamada et al.,2017)。农杆菌介导的遗传转化可获得稳定表达的转基因植株，但依赖于转化的植物材料具有良好的再生能力和较高的转化效率，且这一过程十分漫长。
为了快速鉴定基因功能，前人基于烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)开发了病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)的方法，用于进行目的基因的沉默(Liuet al.,2002)。TRV病毒来源于烟草，因而在烟草、番茄和辣椒等茄科植物上具有较高的侵染效率，在苹果果实以及月季和香石竹花朵中重要基因的功能研究方面也取得了良好的效果。在百合中，前人也通过VIGS技术研究了LoPIP2基因在百合花药开裂(Tong et al.,2013)以及LsGRP1基因在百合叶片感染真菌病害过程中的功能(Lin etal.,2020)。和瞬时沉默相对应的，还有瞬时过表达的方法。这一方法在月季和菊花花朵中得到一定的应用(Luo et al.,2021a；Wang et al.,2021；Yasmin and Debener,2010)，而在百合中，Wu等人在百合花被片中也尝试进行了LlHsfA3A和LlHsfA3B基因的瞬时过表达(Wu et al.,2018)，该方法需要将百合花被圆片平铺在MS培养基上培养，对无菌操作条件要求较高，且培养时间只有2天，还无法观察到表型的变化。
前人研究表明，百合生长周期长，遗传转化困难，因此，开发一种快速、高效的瞬时转化体系来筛选和鉴定影响百合花朵开放、衰老的关键基因具有重要理论和应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种高效的百合花被片瞬时表达方法，本发明通过农杆菌的介导，将携带GUS报告基因的PBI121载体转入东方百合‘西伯利亚’盛开花朵的花被片。通过正交试验确定了最佳转化条件为：农杆菌菌株为GV3101、AS浓度为100μmol/L、抽吸气压为0.7个标准大气压时，花瓣的瞬时表达效率最高，达到94.3％。
本发明的另一个目的是应用上述瞬时表达方法对百合花朵衰老相关基因LoWRKY33、LoSAG5和LoSAG10进行功能验证。首先，将带GFP标签蛋白的Super1300载体转化百合花被片，GFP荧光显示该瞬时表达系统可行。其次，应用该系统进行了LoWRKY33、LoSAG5和LoSAG10等三个基因的功能验证，表明LoWRKY33和LoSAG10过表达后可显著促进百合花朵的衰老。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种高效的百合花被片瞬时表达方法，包括以下步骤：
S1、以东方百合‘西伯利亚’为材料，通过农杆菌的介导和负压抽吸将携带GUS报告基因的双元表达载体PBI121转化百合花被片；
S2、侵染后，使用去离子水将百合花被片上附着的农杆菌冲洗干净；
S3、将冲洗干净的百合花被片平铺于垫有两层湿润滤纸的培养皿中，在温度为23℃的条件下暗培养3天，然后转移到23℃光照条件下培养，记为0天，每隔2天拍照记录表型变化，并通过生理指标测定和基因表达水平检测初步明确基因功能，建立百合花被片中高效的瞬时表达体系。
本发明还提供一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，所述的百合花被片中瞬时表达方法在LoWRKY33基因功能研究中的应用。
进一步地，所述LoWRKY33基因序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，所述的百合花被片中瞬时表达方法在LoSAG5基因功能研究中的应用。
进一步地，所述LoSAG5基因序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，所述百合花被片中瞬时表达方法在LoSAG10基因功能研究中的应用。
进一步地，所述LoSAG10基因序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。
与现有技术相比，本方案的有益效果：
本发明的百合花被片瞬时表达方法操作简便、成本较低且转化效率高，瞬时转化效率高达94.3％，并利用该方法应用于若干个基因在百合花朵衰老过程中的功能，表明LoWRKY33和LoSAG10过表达后显著促进百合花朵的衰老，为花朵衰老机理研究和抗衰老品种的分子育种提供了重要的基因资源。
附图说明
图1为本发明实施例中方法的技术流程图；
图2为本发明实施例中16个处理的花被圆片GUS染色情况；
图3本发明实施例中侵染和未侵染百合花被圆片的GFP荧光观察图；
图4本发明实施例中LoWRKY33超量表达载体的构建图谱；
图5本发明实施例中LoWRKY33在东方百合‘西伯利亚’花被片中瞬时过表达；
图6本发明实施例中LoWRKY33过表达样本中水杨酸合成基因的表达分析图；
图7本发明实施例中Super1300空载瞬时过表达百合花被片中GFP荧光观察图；
图8本发明实施例中LoSAG5瞬时过表达百合花被片中GFP荧光观察图；
图9本发明实施例中LoSAG10瞬时过表达百合花被片中GFP荧光观察图；
图10本发明实施例中LoSAG5和LoSAG10过表达百合花被片的表型；
图11本发明实施例中LoSAG5和LoSAG10过表达百合花被片中离子渗透率和MDA含量图；
图12本发明实施例中LoSAG5和LoSAG10过表达百合花被片中基因表达水平。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1：
GUS报告基因在百合花被片中的瞬时表达
1)菌株、载体、培养基和药品的准备
农杆菌菌株EHA105、GV3101、LAB4405和AGL1购自武汉绿日生物科技有限公司。
表达载体PBI121由实验室自存。
农杆菌培养所用的培养基为LB(1L)：5g酵母提取物(Yeast Extract)、10g蛋白胨(Tryptone)和10g氯化钠(NaCl)，充分溶解后调节pH为7.2～7.4，定容到1L，121℃高温灭菌15min。对于固体LB培养基，调节pH后还应加入琼脂15g/L，然后定容到1L，高温灭菌，待冷却到55℃左右的时候，在超净工作台中加入过滤灭菌的卡那霉素(Kanamycin,Kan)，Kan终浓度为50mg/L，混匀后倒入灭菌的平板，每块板中倒入30mL左右的培养基。
1mol/L2-(N-吗啉代)乙磺酸[2-(n-morphorinic)ethanesulfonic acid,MES]母液：将19.52g MES粉末溶于100mL蒸馏水中，用灭过菌的0.22μm滤器抽滤除菌，分装于10mL无菌离心管中，于4℃保存。
0.05mol/LAS：将1gAS粉末溶于100mL二甲基亚砜(DMSO)中，充分溶解，不需要灭菌，于4℃保存。
GUS组织化学染色液(100mL)：500μL X-Gluc溶液(100μg/μL)、75.5mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)、1mL 5mmol/L铁氰化钾、1mL 5mmol/L亚铁氰化钾、2mL 0.5mol/LEDTA、20mL甲醇、100μLTritonX-100。其中，X-Gluc溶液的配制：称20mgX-Gluc溶于200μLN,N--二甲基甲酰胺中，得终浓度为100μg/μL的X-Gluc溶液。
2)农杆菌的转化
超净工作台灭菌通风，从-80℃中取出保存的农杆菌，解冻后，将5μLPBI121质粒加入农杆菌中，轻柔混匀后，冰浴30min；
将混有质粒的菌液放入液氮中冷冻3min，然后放入37℃温水中水浴5min，再迅速将管子插入冰中冰浴5min；
在超净工作台中加入600μL LB培养液，放28℃摇床以200rpm的转速培养4h；
将菌液取出，5000rpm转速常温下离心6min，在超净工作台中去除600μL上清，剩余100μL菌液用移液枪抽打混匀；
在超净工作台中将涂板用的涂布器用酒精灼烧消毒，待冷却后使用；
吸取50-100μL菌液滴在含Kan抗生素的LB培养基上，用涂布器将菌液涂抹涂匀；
待菌液晾干后，用封口膜将平板封好，放28℃培养箱中倒置培养2天。
3)百合切花材料的处理
新鲜的东方百合‘西伯利亚’切花购自湖北省武汉市南湖花木城，半小时内运至实验室，在自来水中减去花枝基部10cm左右的茎段，然后去掉花枝基部15cm以内的叶片，将花枝基部浸泡在去离子水里，备用。
侵染前，取盛开期花朵的花被片，使用打孔器在花被片上打出直径为12mm的圆片，浸泡在去离子水里，备用。
4)转化条件的探索
对农杆菌菌株类型、AS浓度和抽吸气压三个可能影响转化效率的因素进行优化，设计了三因素四水平的正交试验(表1)。
表1三因素四水平正交表
5)农杆菌的培养和转化过程
农杆菌的培养：
用牙签从平板上挑取农杆菌单克隆，接种到新鲜的LB培养基(+50mg/LKan)中，28℃摇床中过夜培养，通过PCR检测菌液阳性。使用的检查引物为：
PBI121检测up 5'-AGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3'
PBI121检测low 5'-GCCCGGCTTTCTTGTAACGCGCTTT-3'
选取检测阳性的农杆菌，将200μL菌液加入到200mL新鲜的LB培养基(+50mg/L Kan+10mmol/L MES+20μmol/L AS)中，28℃摇床中过夜培养。
将菌液取出，5000rpm转速8℃下离心6min，去除上清，用侵染液重悬浮菌块，使用分光光度计调节菌液浓度至OD600nm＝0.8，黑暗条件下静置4h，备用。
附侵染液的配置：
配置500mL侵染液，其中包含氯化镁(终浓度10mM)、MES(终浓度10mM)和AS。AS的用量根据正交试验中浓度梯度添加。待药品充分溶解后，调节pH至5.6。
根据正交试验设计，将百合花被圆片浸泡在不同处理的菌液中，将装有菌液的瓶子放在抽气盘中，使用真空泵将抽气盘中气压降至0.4～0.7个大气压(atm)，再缓慢恢复至正常气压；
抽吸后用自来水清洗百合花被圆片3次，去离子水清洗2次；
将两张定性滤纸平铺在15cm直径的塑料培养皿中，加适量去离子水，保持滤纸湿润；
将百合花被圆片平铺在滤纸上，每盘摆放35-40个圆片；
将培养皿置于23℃黑暗条件下培养3天。
6)GUS染色和数据统计
将经过农杆菌浸染后暗培养3天后的百合花被圆片取出；
加入GUS组织化学染色溶液直至浸没花瓣；
37℃培养过夜；
将过夜染色的百合花被圆片取出，加入70％的酒精漂洗，按照花被圆片染色情况对其进行拍照，统计染色情况。16个处理的花被圆片GUS染色情况见图2。
为量化花被圆片染色情况，根据GUS染色面积大小分为以下4个等级：
表2GUS染色级数划分
基于量化的级数，计算各处理的加权级数，以判断瞬时表达的最佳表达条件，统计结果表3。
表3GUS染色结果及加权分级结果
从分级加权结果来看，当农杆菌菌株为GV3101、AS浓度为100μmol/L、抽吸气压为0.7atm时，基因瞬时表达的效率最高，总共70个花被圆片中，4个没有GUS染色，36个圆片染色面积达到1％～25％，18个圆片染色面积达到26％～50％，12个圆片染色面积达到51％～100％，加权级数＝(4×0+36×1+18×2+12×3)/70＝1.54，表达效率＝(36+18+12)/70，达到94.3％。
实施例2：
GFP报告基因在百合花被片中的瞬时表达
超净工作台灭菌通风，从-80℃中取出保存的农杆菌GV3101感受态，解冻后，将5μLSuper1300质粒转入农杆菌；使用下列引物检测农杆菌阳性。
Superup：5'-GGATAAATAGCCTTGCTTCC-3'
GFPlow：5'-GAACTTGTGGCCGTTTACG-3'
通过真空抽吸将携带Super1300质粒的农杆菌转入百合花被圆片，侵染过程中，AS浓度为100μM，抽吸气压为0.7个atm。
农杆菌侵染后，23℃暗培养3天，在体式显微镜下观察GFP荧光。随机观测了24个侵染后百合花被圆片和4个未侵染花被圆片的GFP荧光，结果表明，24个侵染后的花被圆片中21个都表现出不同程度的GFP荧光，侵染效率为87.5％，4个未侵染的圆片没有荧光(图3)。
实施例3：
LoWRKY33基因在百合花被片中的瞬时表达
1)LoWRKY33基因的克隆
基于申请人前期百合花朵开放过程中二代+三代转录组测序结果(Luoetal.,2021b)，筛选到一个在百合花朵衰老过程中呈现较高表达水平的WRKY基因LoWRKY33，序列编号为i1_LQ_lily14_c15136/f1p0/1297，长度为1300bp。参考前人发表的百合二代转录组(Duetal.,2017；Shi et al.,2018；Villacorta-Martin et al.,2015)，获得LoWRKY33基因的全长序列。用PrimerPremier5软件设计以下全长引物，从东方百合‘西伯利亚’的花被片cDNA中扩增LoWRKY33基因的全长。
LoWRKY33ORF up:5’-ATGACTTCATCCTCAGGAAGCAT-3’
LoWRKY33ORF low:5’-TCAGCAAGGCATGGAGTCG-3’
PCR反应体系见表4。
表4PCR反应体系
PCR扩增条件见表5。
表5PCR扩增条件
将扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，使用全式金胶回收试剂盒(货号：EG101-01)回收目标条带，方法参考试剂盒说明书。将扩增获得的PCR产物连入pCloneEZ载体(货号：C5852-50)，筛选阳性克隆并测序，获得LoWRKY33基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，长度1653bp，编码550个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.2所示。
2)LoWRKY33基因过表达载体的构建
通过对LoWRKY33全长序列进行酶切位点，结合Super1300载体多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)区域可用的酶切位点，选择SalI和KpnI两个酶切位点用于载体的构建。
首先设计带酶切位点的LoWRKY33全长引物：
LoWRKY33ORFup(+SalI)：
5'-TATGTCGACATGACTTCATCCTCAGGAAGC-3'
LoWRKY33ORFlow(+KpnI)：
5'-TATGGTACCGCAAGGCATGGAGTCGAG-3'
用带酶切位点的引物从含有校正后LoWRKY33全长序列的pCloneEZ质粒上扩增带酶切位点的LoWRKY33全长；
通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，使用胶回收试剂盒回收目标条带；
用限制性内切酶SalI和KpnI对LoWRKY33回收产物和Super1300空载进行酶切过夜，分离和回收目标条带，酶切体系见表6。
表6酶切体系
使用Thermo的T4 DNA连接酶(货号：EL0014)对LoWRKY33和Super1300载体酶切产物进行连接，连接体系见表7；
表7连接体系
16℃连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌感受态，涂布于LB+卡那霉素(Kanamycin,Kan)平板，在37℃培养箱中倒置培养15-16个小时；
从菌板上挑取阳性菌摇菌，经过PCR阳性检测和测序验证，获得构建成功的Super1300-LoWRKY33载体(图4)。
3)Super1300-LoWRKY33转化百合花被片
使用冻融法将Super1300、Super1300-LoWRKY33质粒转化农杆菌GV3101感受态，涂布在LB+Kan的平板上，28℃培养箱中倒置培养48h；
挑单菌落摇一次菌，使用带酶切位点的LoWRKY33全长引物进行阳性检测，随后参照实施例2中的方法进行二次摇菌与集菌，并侵染百合花被片。
如图5A所示，侵染4天后，与对照组相比，LoWRKY33过表达处理组花被片的衰老明显加快。测定两组花瓣侵染4天后的离子渗透率，发现过表达组的离子渗透率显著高于对照组(图5B)。利用实时定量PCR对侵染4天后的过表达与对照组中LoWRKY33表达量进行检测，发现LoWRKY33过表达处理样本中LoWRKY33基因的表达水平极显著高于对照组(P<0.01，图5C)。
申请人前期研究发现，水杨酸在百合花朵衰老过程中含量急剧上升，为了解LoWRKY33过表达后是否影响到水杨酸的合成，进一步通过荧光定量PCR检测了LoWRKY33过表达样本中水杨酸合成基因的表达。结果表明，水杨酸合成关键基因PBS3和ICS在过表达样本中的表达显著高于对照组(图6)。这一结果暗示，LoWRKY33可能通过促进水杨酸的合成来促进百合花朵的衰老。
实施例4：LoSAG5和LoSAG10基因在百合花被片中的瞬时表达
1)LoSAG5和LoSAG10基因的克隆
基于课题组前期百合花朵开放不同时期(S1-S4时期)转录组测序，筛选到11个SAG基因，它们的表达水平在花朵衰老后期都急剧升高(Luoetal.,2021b)，SwissProt等数据库的基因功能注释显示，SAG1、SAG2和SAG7是衰老特异的半胱氨酸蛋白酶基因，SAG3、SAG10和SAG11是核酸酶基因，SAG4、SAG5、SAG6、SAG8和SAG9是硫醇蛋白酶基因(表8)。
表8转录组测序获得的11个SAG基因
基于11个SAG基因在百合花朵开放过程中和根、茎、叶、花等不同器官中，以及脱落酸和水杨酸处理后的表达模式分析，初步推测LoSAG5和LoSAG10可能在百合花朵衰老过程中发挥了一定作用。用Primer Premier 5软件设计LoSAG5和LoSAG10的全长引物，引物序列如下：
LoSAG5 ORF up:5’-ATGGAGAACAATTCCACATCCTC-3’
LoSAG5 ORF low:5’-CTAGAGTTCATCTTTTTCTGGATTTG-3’
LoSAG10 ORF up:5’-ATGTATTCATTTTCAACCATCTCCG-3’
LoSAG10ORF low:5’-TCAGGTTGGTGGCGGTATTTC-3’
LoSAG5和LoSAG10基因全长的克隆过程参考实施例3中LoWRKY33基因的克隆。获得LoSAG5基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，长度1071bp，编码356个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.4所示；获得LoSAG10基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，长度921bp，编码306个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列SEQ IDNO.6所示。
2)LoSAG5和LoSAG10基因过表达载体的构建
参考实施例3中Super-LoWRKY33载体构建的过程，设计带酶切位点的LoSAG5和LoSAG10全长引物：
LoSAG5ORF up(+SalI)：5’-TATGTCGACATGGAGAACAATTCCACATCCTC-3’
LoSAG5ORF low(+KpnI)：5’-TATGGTACCGAGTTCATCTTTTTCTGGATTTG-3’
LoSAG10ORF up(+SalI)：5’-TATGTCGACATGTATTCATTTTCAACCATCTCCG-3’
LoSAG10ORF low(+KpnI)：5’-TATGGTACCGGTTGGTGGCGGTATTTC-3’
参考实施例3中Super-LoWRKY33载体构建的过程，通过限制性酶切和连接，将LoSAG5和LoSAG10的编码区构建到过表达载体Super1300中。
3)Super1300-LoSAG5/LoSAG10转化百合花被片
参考实施例3中Super-LoWRKY33的瞬时过表达试验，通过农杆菌GV3101的介导进行真空抽吸侵染，在百合花被片中进行Super1300-LoSAG5和LoSAG10的瞬时过表达。
农杆菌侵染后，23℃暗培养3天，在Super1300空载、LoSAG5和LoSAG10过表达样本中随机选取12个百合花被圆片进行GFP荧光观察，判断目的基因的表达情况。结果表明，三组百合花被片样本中均出现明显荧光，表明LoSAG5和LoSAG10在百合花被片中有不同程度的表达(图7)。
23℃暗培养3天后，开始对LoSAG5和LoSAG10瞬时过表达百合花被片进行表型观察，此时记为0天，和Super1300空载对照相比，LoSAG5、LoSAG10过表达百合花被片未出现明显表型。2天后，LoSAG5过表达体系花被片表型变化不明显，LoSAG10过表达花被片衰老程度明显加快(图8)。
通过离子渗透率和MDA含量来反映LoSAG5和LoSAG10过表达后百合花被片的衰老程度。如图9所示，2天后，LoSAG10过表达百合花被片的离子渗透率远高于LoSAG5过表达样本和Super1300空载对照样本。MDA含量测定结果表明：SAG10过表达体系花被片MDA含量显著高于Super1300空载对照组，其MDA值约为super空载的7倍，SAG5过表达体系MDA值略低于Super空载，过表达体系花被片膜系统损伤程度较低(图9)。
为了验证LoSAG5和LoSAG10基因在百合花被片瞬时过表达样本中表达量的变化，对0天和2天的样本进行了RNA的提取和荧光定量PCR实验。结果表明，0天时，LoSAG5在其过表达样本中的表达量略高于Super1300对照；2天时LoSAG5在过表达样本中的表达量显著高于对照。对于LoSAG10，0天时，该基因在过表达样本中的表达量为Super1300对照样本中的3.12±0.51倍，2天时，过表样本中的表达量达到Super1300对照组的12.35±1.38倍(图10)。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (7)
1.一种高效的百合花被片瞬时表达方法，其特征是：包括以下步骤：
S1、以东方百合‘西伯利亚’为材料，通过农杆菌的介导和负压抽吸将携带GUS报告基因的双元表达载体PBI 121转化百合花被片；
S2、侵染后，使用去离子水将百合花被片上附着的农杆菌冲洗干净；
S3、将冲洗干净的百合花被片平铺于垫有两层湿润滤纸的培养皿中，在温度为23℃的条件下暗培养3天，然后转移到23℃光照条件下培养，记为0天，每隔2天拍照记录表型变化，并通过生理指标测定和基因表达水平检测初步明确基因功能，建立百合花被片中高效的瞬时表达体系。
2.如权利要求1所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述的百合花被片中瞬时表达方法在LoWRKY33基因功能研究中的应用。
3.如权利要求2所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述LoWRKY33基因序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述的百合花被片中瞬时表达方法在LoSAG5基因功能研究中的应用。
5.如权利要求4所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述LoSAG5基因序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
6.如权利要求1所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述百合花被片中瞬时表达方法在LoSAG10基因功能研究中的应用。
7.如权利要求6所述的一种高效的百合花被片瞬时表达方法的应用，其特征是：所述LoSAG10基因序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。
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