CN115948550A - 一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用 - Google Patents
一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测前列腺癌的标志物tRF‑Gly‑CCC‑1‑M4及其应用，属于分子生物学检测技术领域。本发明提供的检测前列腺癌的标志物tRF‑Gly‑CCC‑1‑M4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与前列腺正常组织相比，前列腺癌组织细胞中的tRF‑Gly‑CCC‑1‑M4相对表达含量明显升高。通过检测tRF‑Gly‑CCC‑1‑M4，可准确的判断前列腺癌的增殖状态，为前列腺癌的诊断提供新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用。
背景技术
前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，目前对于前列腺癌细胞增殖检测的方法通常采取血清PSA检测来评判。但在广泛应用的过程中发现此检测方法特异性差与敏感性不足，不能区分前列腺重度炎症及提示早期前列腺癌细胞增殖。虽然还有超声、核磁共振等检测方法作为补充，但这些方法仍具有上述不足之处。因此寻找敏感性高、特异性强的标志物检测前列腺癌细胞增殖，已成为医学研究的热点。
2016年Nature Genetics杂志报道了tRNA是一种高丰度的、广泛存在的、被动参与的mRNA解码器及蛋白翻译元件。tRNA通过其反密码子与mRNA的密码子结合而显著影响生物学过程和疾病进展。同时，tRNA在体液中高丰度存在的特点使其成为临床应用的生物标志物，可被运用到肿瘤增殖、转移的检测中。2019年Pan Jiang等在Current MedicinalChemistry杂志上综述报道了tRF和tiRNA是在特定的细胞/组织中或者在细胞受到胁迫等特定条件下，由特定的核酸酶(如Dicer、血管生成素)在tRNA的环上剪切，产生的特定大小的小片段RNA。tRF和tiRNA属于一类小的非编码RNA，被统称为tsRNA。tRF分为tRF-1，tRF-2，tRF-3，tRF-5和i-tRF；tiRNA分为5′tiRNA和3′tiRNA。tRF和tiRNA在抑制蛋白质合成、调节基因表达、启动病毒逆转录酶和调节DNA损伤反应中发挥重要作用，是tRNA的功能单位。随着分子生物学的发展，针对tsRNA进行研究有望为前列腺癌的诊断和治疗提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用。tRF-Gly-CCC-1-M4属于tsRNA，来源于tRNA-Gly-CCC-1，属于tRF-5c类型。与前列腺正常组织相比，前列腺癌组织细胞中的tRF-Gly-CCC-1-M4相对表达含量明显升高。通过检测tRF-Gly-CCC-1-M4，可准确的判断前列腺癌的增殖状态，为前列腺癌的诊断提供新的途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4，所述标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种检测上述标志物的引物对，所述上游引物的序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种上述标志物或上述引物对在制备检测前列腺癌的试剂或试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂或试剂盒的检测样本包括前列腺细胞株、新鲜前列腺组织、穿刺前列腺组织、新鲜尿液、新鲜前列腺按摩液或血液。
本发明还提供了一种检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。
优选的，所述试剂盒中的对照样本为人前列腺增生细胞系。
本发明提供了一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用。tRF-Gly-CCC-1-M4属于tsRNA，来源于tRNA-Gly-CCC-1，由该tRNA 5’端第1位至第28位核苷酸组成，由于tRNA序列重合度高，M代表多重比对，M4说明tRF-Gly-CCC-1片段在tRNA上能比对到4个，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1(GCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTC)所示，属于tRF-5c类型。与前列腺正常组织相比，前列腺癌组织细胞中的tRF-Gly-CCC-1-M4相对表达含量显著升高。以tRF-Gly-CCC-1-M4为标志物，通过检测tRF-Gly-CCC-1-M4相对表达含量，可准确的、可靠的检测前列腺癌的增殖状态，能够更好的诊断前列腺癌的发生以及前列腺癌的恶化程度。
附图说明
图1为实施例1中的检测样本和对照样本中tRF-Gly-CCC-1-M4的相对表达含量，其中，Control为对照样本，TEST为检测样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例验证了通过检测标志物tRF-Gly-CCC-1-M4来诊断前列腺癌的准确性。具体操作如下：
1.检测样本RNA的抽提
2021年10月至2022年1月期间，收集扬州大学附属医院新鲜前列腺组织为检测样本，收集后立即置于-80℃冰箱中保存。检测时将收集的新鲜前列腺组织取出，室温下解冻后进行RNA的抽提，具体操作如下：
1.1匀浆样本的制备
将新鲜前列腺组织研磨后，用蒸馏水溶解，振荡后，于4℃下，7500转/分钟离心5分钟，得到沉淀细胞。按照每克沉淀细胞使用1ml TRI REAGENT试剂(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，加入TRI REAGENT试剂后反复吹打使细胞裂解，得到匀浆样本。
1.2两相分离
将1.1得到的匀浆样本于25℃下孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。按照每1ml的TRI REAGENT试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿(购自上海化学试剂有限公司)，向解离后的匀浆样本中加入氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，于25℃下孵育3分钟，孵育结束后于4℃下，12000转/分钟离心15分钟。离心后的混合液体出现分层，分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色水相。此时RNA全部被分配于水相中。水相的体积为匀浆时加入的TRI REAGENT试剂的60％。
1.3RNA沉淀
将1.2得到的水相转移到新离心管中。向该新离心管中加入异丙醇，异丙醇的加入量为1.1样本匀浆时TRI REAGENT试剂加入量的50％。使水相和异丙醇混合，混匀后于25℃下孵育10分钟，以沉淀其中的RNA。孵育结束后于4℃下，12000转/分钟离心10分钟。此时，离心前不可见的RNA沉淀在管底部和侧壁上形成了胶状沉淀块。
1.4RNA清洗
移去1.3中的上清液，向剩余的沉淀中加入75％乙醇(用DEPC水配制，DEPC水购自上海浦予工业科技有限公司)，乙醇的加入量与1.1样本匀浆时TRI REAGENT试剂的加入量相同。振荡清洗RNA沉淀后，于4℃下，7500转/分钟离心5分钟。
1.5重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，将RNA沉淀于空气中干燥10分钟。此时RNA沉淀没有完全干燥，保证了RNA的可溶性。溶解RNA时，先加入1mL的DEPC水用枪反复吹打几次，然后于60℃下孵育10分钟得到检测样本的RNA溶液。将RNA溶液保存于-70℃。
1.6RNA浓度和纯度检测
采用紫外吸收测定法，使用
ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前用溶解RNA的DEPC水调零处理测量基座表面，然后进行RNA检测。取1.5得到的RNA溶液1μL，滴加至测量基座的表面，液滴自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数在电脑中自动生成文件。
RNA浓度测定：260nm处读值为1表示40ng RNA/μL。样品RNA浓度计算公式为：A260(读数)×40ng/μL。
RNA纯度测定：A260/A280的比值表示RNA纯度。
2.对照样本RNA的抽提
以BPH-1人前列腺增生细胞系(购自上海宾穗生物科技有限公司)为对照样本，进行RNA的抽提，具体操作如下：
将对照样本于4℃下，7500转/分钟离心5分钟，得到沉淀细胞。每克沉淀细胞使用1ml TRI REAGENT试剂，加入TRI REAGENT试剂反复吹打使细胞裂解。匀浆后的样本重复1.2至1.5进行操作，得到对照样本的RNA溶液。其中，为降低溶液粘度，在加氯仿前先将样本两次过26号针头以剪切基因组DNA。在加入异丙醇沉淀RNA前，加10μg的无RNA酶的糖原作为水相载体，两相分离后糖原留在水相中并和RNA共沉淀。
按照1.6的步骤进行RNA浓度和纯度检测。
3.RNA前处理与cDNA合成
将检测样本的RNA溶液和对照样本的RNA溶液分别进行RNA前处理与cDNA合成，具体操作如下：
试剂与原料：
rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005)、rtStarTMFirst-StrandcDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003)均购自美国Arraystar生物公司。
其他相关试剂均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
3.1 3’末端去乙酰化处理
按照表1所示的体系配制去乙酰化反应液，将去乙酰化反应液涡旋混合，于37℃下孵育40分钟。孵育结束后，依次加入19μL Deacylation Stop缓冲液(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。
表1去乙酰化反应液
| 样本RNA | 5μg |
| DeacylationReaction缓冲液(5×) | 3uL |
| SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂 | 1μL |
| 无核酸酶水 | 补充至总体积为15μL |
3.2去除3’-cP与添加5’-P
将3.1终止反应后的反应液置于冰上，依次加入表2所示的试剂，此时反应液总体积为50μL。将反应液涡旋混合，于37℃下孵育40分钟，孵育结束后，于70℃下孵育5分钟终止反应。反应终止后重新抽提RNA。
表2反应试剂
| Terminal Enzyme Reaction缓冲液(10×) | 5μL |
| 10mM ATP | 5μL |
| Terminal Enzyme Mix | 3U(1μL) |
| 无核酸酶水 | 5μL |
3.3去甲基化处理
按照表3所示的体系配制去甲基化反应液，将反应液在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μL无核酸酶水与10μL Demethylation Stop缓冲液(5×)，终止去甲基化反应。反应终止后重新抽提RNA。
表3去甲基化反应液
| Demethylation Reaction缓冲液(5×) | 10μL |
| Demethylase | 5μL |
| SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂 | 1μL |
| Input RNA | 5μg |
| 无核酸酶水 | 补充至总体积为50μL |
3.4连接3′接头
在200μL无RNA酶的PCR管中依次加入表4所示的试剂，将PCR管在70℃下孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上，继续添加5μL的3’Ligation Reaction缓冲液(2X)、1.5μL的3’Ligation Enzyme Mix，此时PCR管中总体积为10μL，然后将PCR管于25℃下孵育1小时。
表4反应试剂
| 经3.3处理后RNA样本溶液 | 2μL |
| 3’Adaptor | 0.5μL |
| RNA Spike-in | 0.5μL |
| 无核酸酶水 | 补充至总体积为3.5μL |
3.5反转录引物杂交
向3.4孵育结束后的PCR管中依次加入2.3μL的无核酸酶水、0.5μL的逆转录引物(Reverse Transcription Primer)，此时PCR管中总体积为12.8μL，然后将PCR管转移至热循环仪中依次于75℃下孵育5分钟，37℃下孵育15分钟，25℃下孵育15分钟。
3.6连接5′接头
向3.5孵育结束后的PCR管中依次加入0.5μL的5’Adaptor(denatured)、0.5μL的5’Ligation Reaction缓冲液、1.2μL的5’Ligation Enzyme Mix，此时PCR管中总体积为15μL，充分混合后转移至热循环仪中，于25℃下孵育1小时。
3.7反转录反应
按照表5所示的反应体系，在200μL无核酸酶的PCR管中依次加入表5中的试剂，将PCR管转移至热循环仪中，于50℃下孵育1小时，然后立即在冰上冷却，分别得到检测样本的cDNA和对照样本的cDNA，用于后续PCR扩增。
表5反应体系
| Adaptor Ligated RNA | 15μL |
| First-Strand Synthesis Reaction缓冲液 | 4μL |
| SUPERase·In<sup>TM</sup>RNase抑制剂 | 0.5μL |
| Reverse Transcriptase | 0.5μL |
| 总体积 | 20μL |
4.实时定量PCR检测
试剂与材料：试剂2X PCR mastermix(AS-MR-006-5)购自美国Arraystar生物公司；引物设计软件是Primer 5.0；QuantStudioTM5 Real-time PCR System(AppliedBiosystems)购自美国应用生物系统公司。
4.1制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板
按照表6所示的反应体系将各试剂混合。其中，PCR特异引物F为：5’-ATCGCCCGGCTAGCTCAGT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；PCR特异引物R为：5’-CTTCCGATCTGTCCCATGCTC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；该引物的退火温度为60℃。
轻弹管底使溶液混合，5000转/分钟短暂离心后进行PCR反应。PCR反应程序为：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。将PCR产物与100bp DNALadder采用2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
表6反应体系
将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9。
4.2进行Realtime PCR反应
按照表6，将除cDNA模板以外的试剂混合，用水补充至总体积为8μL，轻弹管底将溶液混合，5000转/分钟短暂离心后，再加入2μL 3.7中得到的检测样本的cDNA和对照样本的cDNA，短暂离心混合，进行PCR反应。PCR反应程序为：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
建立PCR产物的熔解曲线，在扩增反应结束后，进行(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)的程序，再从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。
由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因U6(不同样品间表达量基本恒定)作为内参校正目的基因浓度。将管家基因按照上述步骤进行PCR反应。其中，管家基因的PCR特异引物F为：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’(如SEQ ID NO.4所示)，PCR特异引物R为：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；该引物的退火温度为60℃。
4.3结果与计算
根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，得到目的基因(tRF-Gly-CCC-1-M4)和管家基因的浓度，将目的基因浓度除以管家基因U6的浓度，即为此样本目的基因校正后的相对含量。
5.检测结果
检测样本与对照样本经3～4的步骤处理后，可得到组织中tRF-Gly-CCC-1-M4的相对含量，检测结果如图1所示。从图1可以看出，检测样本(TEST)中tRF-Gly-CCC-1-M4相对含量明显高于对照样本(Control)中tRF-Gly-CCC-1-M4相对含量，提示前列腺癌细胞处于增殖状态。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4，其特征在于，所述标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种检测权利要求1所述标志物的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种权利要求1所述的标志物或权利要求2所述的引物对在制备检测前列腺癌的试剂或试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒的检测样本包括前列腺细胞株、新鲜前列腺组织、穿刺前列腺组织、新鲜尿液、新鲜前列腺按摩液或血液。
5.一种检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的对照样本为人前列腺增生细胞系。
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|---|---|---|---|
| CN202211455208.3A CN115948550A (zh) | 2022-11-21 | 2022-11-21 | 一种检测前列腺癌的标志物tRF-Gly-CCC-1-M4及其应用 |
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