CN115927575A - 一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述SEQIDNO:1所示的序列第56位存在A/T多态性。同时本发明基于所述分子标记再结合限制性内切酶技术和/或Taqman探针技术开发了一套可以快速准确鉴定大口黑鲈性别的方法，仅需剪取少量尾鳍样品，对鱼体无任何伤害。

Description

一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用。

背景技术

大口黑鲈原产于美国加利福尼亚州，中国台湾地区于20世纪70年代引进，广东地区也于1983年引进大口黑鲈苗，并于1985年相继人工繁殖成功。根据最新渔业统计，其养殖产量已达47.8万吨，并达到10％的涨幅，是我国年涨幅第二大鱼类。因其肉质鲜美，抗病能力强，生长迅速等诸多优点，深受大众喜爱，已迅速成为我国的重要养殖品种。研究表明，雌性大口黑鲈在生长速度和体型上都比雄性更快。而大口黑鲈雌雄个体在外部形态差异不明显，无法通过肉眼分辨雌雄，想要通过外部形态或组织学观察判断其遗传性别十分困难。

开发性别相关分子标记是培育单性大口黑鲈以期提高其产量的有效手段。扩增性别相关分子标记的引物是快速筛选繁殖两性种群的最有效和可行的前提。因此性别相关分子标记可用于对生物的遗传性别进行准确地识别，在性别控制育种和性别决定分子机制等研究中有着十分重要的作用。目前已有许多鱼类找到了性别相关的DNA分子标记，建立了以PCR为基础的遗传性别鉴别技术。而在大口黑鲈的性别鉴定上较为成熟的分子标记技术还鲜有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，确定SNP3(35142120)位点存在A/T多态性，与大口黑鲈的雌雄性别紧密连锁，能够用于准确判断大口黑鲈的性别。

本发明提供了一种用于鉴定大口黑鲈的雌雄性别的扩增引物，可快速准确地扩增大口黑鲈的雌雄性别相关的分子标记。

本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1所示的序列第56位存在A/T多态性。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的试剂盒，包括限制性内切酶TaaI酶切试剂或qPCR检测试剂。

优选的，所述限制性内切酶TaaI酶切试剂包括限制性内切酶TaaI和酶切缓冲液；

所述qPCR检测试剂包括Taqman探针和qPCR扩增引物。

优选的，所述qPCR扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反向引物；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

本发明提供了所述分子标记或所述试剂盒在检测大口黑鲈性别中的应用。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的方法，包括以下步骤：

提取待测大口黑鲈的基因组DNA；

将所述基因组DNA为材料基于所述分子标记的多态性位点进行检测，根据检测结果判断待测大口黑鲈的性别。

优选的，所述检测包括限制性内切酶TaaI酶切检测和/或Taqman探针检测。

优选的，采用限制性内切酶TaaI酶切检测的方法为将PCR产物进行TaaI酶切，将酶切产物进行电泳分析，若得到一条988bp的条带，判断待测大口黑鲈为雌鱼；若得到一条988bp的条带的同时，还包括一条1268bp和1508bp的条带，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

优选的，采用Taqman探针检测的方法，将qPCR产物根据探针上的荧光颜色判断待测大口黑鲈的SNP位点基因型：根据具体基因型判断大口黑鲈的性别：

荧光颜色显示TT基因型，判断待测大口黑鲈为雌鱼；

荧光颜色显示AT和AA基因型，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

本发明提供的与大口黑鲈性别相关的分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1所示的序列第56位存在A/T多态性，属于SNP分子标记。本发明基于雌雄个体的大口黑鲈重测序数据开发得到SNP分子标记。所述SNP分子标记与大口黑鲈的性能紧密连锁，能够准确区分大口黑鲈的性能，其中TT基因型为大口黑鲈雌性，AT和AA基因型为大口黑鲈雄性。可见，本发明提供的分子标记为大口黑鲈全雌或全雄养殖以获得更高产量，提高经济效益，促进产业的发展提供了可行方法，同时具有快速、准确的检测特点。

附图说明

图1为SNP2在大口黑鲈美国北方亚种雌雄鱼中的电泳结果(n＝8)；

图2为SNP3在大口黑鲈美国北方亚种雌雄鱼中的电泳结果(n＝16)；

图3为SNP3在大口黑鲈“优鲈3号”雌雄鱼中的电泳结果(n＝80)；

图4为Taqman探针检测大口黑鲈美国北方亚种雌雄鱼(n＝16)；

图5为Taqman探针鉴定大口黑鲈“优鲈3号”雌雄鱼(n＝80)。

具体实施方式

本发明提供了一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1所示的序列第56位存在A/T多态性。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(TTTGTTCATCACTTCATATTAACGCTGA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3(AGAGAAACTTCCGAGATAACGCAGAA)所示的反向引物。所述引物通过扩增大口黑鲈基因组DNA，所得扩增产物为上述分子标记。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的试剂盒，包括包括限制性内切酶TaaI酶切试剂或qPCR检测试剂。

在本发明中，所述限制性内切酶TaaI酶切试剂优选包括限制性内切酶TaaI和酶切缓冲液。其中限制性内切酶TaaI的酶切位点为TGACAT/A。

在本发明中，所述qPCR检测试剂优选包括Taqman探针和qPCR扩增引物。所述qPCR扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反向引物；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。所述Taqman探针Taqman探针为一段寡核苷酸序列，在其5′端与3′端分别标记有一个荧光基团与一个淬灭基团，基于Taq聚合酶5′-3′外切酶活性，在PCR扩增时Taq酶会将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离产生荧光信号。本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团即可。

本发明提供了所述分子标记或所述试剂盒在检测大口黑鲈性别中的应用。

在本发明中，所述分子标记中A/T多态性位点与大口黑鲈性别紧密连锁，因此，所述分子标记中A/T多态性可作为检测靶点预测大口黑鲈性别，其中TT基因型为雌性，AA和TA基因型为雄性。同时所述引物具有特异性扩增分子标记的作用，通过检测扩增产物中多态性位点的基因型实现快速预测大口黑鲈性别的目的。

本发明提供了一种检测大口黑鲈性别的方法，包括以下步骤：

提取待测大口黑鲈的基因组DNA；

将所述基因组DNA为材料基于所述分子标记的多态性位点进行检测，根据检测结果判断待测大口黑鲈的性别。

本发明提取待测大口黑鲈的基因组DNA。

本发明对大口黑鲈的基因组DNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的水产动物基因组DNA提取方法即可，例如采用诺唯赞生物科技公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取。

得到待测大口黑鲈的基因组DNA后，本发明将将所述基因组DNA为材料基于所述分子标记的多态性位点进行检测，根据检测结果判断待测大口黑鲈的性别。

在本发明中，所述检测的方法优选包括TaaI酶切检测和/或Taqman探针检测。若采用Taqman探针检测，优选先qPCR扩增，得到的qPCR扩增产物分析荧光显色情况。所述qPCR扩增的反应条件优选如下：25μL：DNA样1μL，灭菌水9.5μL，Premix Ex Taq 12.5μL，正反向引物各0.5μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)。qPCR反应扩增条件：95℃30s；95℃5s，65℃34s，40个循环。对扩增结果进行荧光信号收集。

在本发明中，采用限制性内切酶TaaI酶切检测的方法优选为将大口黑鲈的基因组DNA进行TaaI酶切，将酶切产物进行电泳分析，若得到一条988bp的条带，判断待测大口黑鲈为雌鱼；若得到一条988bp的条带的同时，还包括一条1268bp和1508bp的条带，判断待测大口黑鲈为雄鱼。所述TaaI酶切的反应体系为10μL：PCR产物3μL，H₂O 5.8μL，10×Buffer 1μL，TaaI酶0.2μL。TaaI的酶切条件优选为在65℃条件下酶切15min即可。

在本发明中，采用Taqman探针检测的方法，优选将qPCR产物根据探针上的荧光颜色判断待测大口黑鲈的SNP位点基因型：根据具体基因型判断大口黑鲈的性别：荧光颜色显示TT基因型，判断待测大口黑鲈为雌鱼；荧光颜色显示AT和AA基因型，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

下面结合实施例对本发明提供的一种与大口黑鲈性别相关的分子标记、扩增引物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种与大口黑鲈性别相关的SNP分子标记的开发

一、雌雄大口黑鲈样品的选取

选取大口黑鲈美国北方亚种雌鱼30条和雄鱼30条，剪取尾鳍组织，取样量0.2g，用95％酒精固定，保存于-20℃备用。所有实验用鱼均经解剖准确确认生理性别。

二、基因组DNA的提取

将采集到的所有大口黑鲈样品采用诺唯赞生物科技公司的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取尾鳍基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值处于1.8到2.0之间，浓度在750～1200ng/L之间，说明提取的DNA较为理想，并将其稀释为50ng/μL，-80℃保存备用。

三、性别差异SNP标记筛选

将60尾个体分别进行基因组重测序，根据重测序结果，分别统计雌性材料(30个)和雄性材料(30个)中的等位基因频率，满足SNP测序平均深度≥2x；自然群体最小基因频率(MAF)≥0.05；Fst>＝0.4；即为与性别相关的SNP位点。基于这一标准再结合基因分型结果筛选出2个与性别相关最为密切的位点分别是位点SNP2(35042234)和SNP3(35142120)。

表1 SNP位点的引物设计与基因分型

其中PCR反应体系为20μL:DNA样1μL，灭菌水8μL，Premix Ex Taq10μL，正向引物1μL，反向引物1μL。PCR反应程序如下：95℃，5min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，50s，重复35个循环；72℃，5min。

四、限制性内切酶酶切对性别相关SNP分子标记的验证

上述通过筛选得到与性别相关的2个位点，若存在SNP位点，酶切片段的长度和数量则会出现差异，则可以根据电泳的结果就可以判断是否有SNP位点情况，从而根据电泳结果可以判断大口黑鲈的性别。查询2个位点相应的内切酶。基于位点SNP2(35042234)的多态性，对大口黑鲈基因组DNA中采用限制性内切酶DdeI，同时基于位点SNP3(35142120)的多态性，采用限制性内切酶TaaI进行酶切反应。酶切体系10μL：PCR产物3μL，H₂O5.8μL，10×Buffer 1μL，酶0.2μL。DdeI在37℃条件下酶切1.5h，酶切产物在65℃灭活20min。TaaI在65℃条件下酶切15min即可。酶切结束后，采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

首先验证位点SNP2，其结果显示在8条美国北方亚种雌鱼中只有一条雌鱼有一条1502bp的特异性条带其余7条均有两条分别是1244bp与1502bp的特异性条带，而在8条美国北方亚种雄鱼中同样如此，无法在雌鱼与雄鱼中发现明显不同片段的特异性条带(图1)。随后用16条美国北方亚种雌性与16条美国北方亚种雄性验证位点SNP3，其结果显示，在16条雌性的电泳结果均只有一条988bp的特异性条带，而16尾雄性大口黑鲈的电泳结果中除了有一条988bp的特异性条带外，还都均有一条1268bp与1508bp的特异性条带(图2)。位点SNP3初步显示，在雌性与雄性大口黑鲈间存在明显差异的特异性条带。

实施例2

一种与大口黑鲈性别相关的SNP分子标记的验证

为进一步验证其结果的准确性，进一步随机选取了80尾大口黑鲈“优鲈3号”的尾鳍样品，并解剖鉴定生理性别。将尾鳍样品对位点SNP3进行PCR扩增，得到的PCR产物用限制性内切酶Taa I进行酶切反应，使用琼脂糖凝胶电泳，在得到80尾大口黑鲈的电泳结果后，将大口黑鲈生理性别与电泳结果进行对应。

结果显示，80尾大口黑鲈解剖后的生理性别结果与酶切结果一一对应(图3)，位点SNP3可以准确的鉴别大口黑鲈的性别，是一个稳定的雌性差异位点。

实施例3

Taqman探针制作

在限制性内切酶验证结束后，确定了位点SNP3是一个稳定的雌雄差异位点，酶切结果具有可靠的准确性，在其基础上开发出更为快速精确的Taqman实时荧光PCR验证方法，省略了酶切过程中的PCR反应过程，可以大大提高筛选雌雄大口黑鲈的效率。

针对位点SNP3及上下游核苷酸序列，设计一种qPCR检测的探针，具体核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示。具体为：

正向引物:TGCAGAATTTGTTCATCACTTCA(SEQ ID NO:6)；

反向引物：GCGGCCAAAAACTTTGTTTA(SEQ ID NO:7)；

探针Allele1:5′-FAM-ACTTGACATCAGTTTGA-MGB-3′(SEQ ID NO:8)；

探针Allele2:5′-HEX-ACTTGACAACAGTTTGATA-MGB-3′(SEQ ID NO:9)。

按照实施例1的方法提取待测样本的DNA，配制qPCR反应体系为：DNA样品1μL，灭菌水9.5μL，Premix Ex Taq 12.5μL，正反向引物各0.5μL(10μmol/L)，探针0.5μL(10μmol/L)。qPCR反应扩增条件：95℃30s；95℃5s，65℃34s，40个循环。此过程仅需50min即可完成。

为验证Taqman探针的准确性，采用8尾大口黑鲈北方亚种雌鱼，8尾大口黑鲈北方亚种雄鱼进行初步验证。SNP3具有三种基因分型分别是纯合TT，纯合AA与杂合AT，其基因分型在散点图上会呈现3种荧光。等位基因TT与等位基因AA的探针分别采用FAM(黄色，圆形)和HEX(蓝色，正方形)荧光素进行标记。当样本为等位基因AA时，PCR扩增过程中仅能检测到HEX荧光；样本为等位基因TT时，PCR扩增过程中仅能检测到FAM荧光；样本为杂合型AT时，PCR扩增过程中可同时检测到FAM和HEX两种荧光则为绿色(三角形)。结果显示，8尾雌鱼均为黄色散点，8尾雄鱼有6尾为绿色散点，2尾为蓝色散点。Taqman探针检测结果与生理性别完全一致。

实施例5

采用80尾“优鲈3号”DNA样品继续用Taqman实时荧光PCR验证，方法同实施例4记载。

Taqman实时荧光PCR检测结果与实施例3中酶切结果完全一致，所有雌鱼均为黄色散点，所有雄鱼是绿色与蓝色两种散点。通过此方法可以快速、准确的鉴别出大口黑鲈的性别，并且在多个群体间均能准确的鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1所示的序列第56位存在A/T多态性。

2.一种检测大口黑鲈性别的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

3.一种检测大口黑鲈性别的试剂盒，其特征在于，包括限制性内切酶TaaI酶切试剂或qPCR检测试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶TaaI酶切试剂包括限制性内切酶TaaI和酶切缓冲液；

所述qPCR检测试剂包括Taqman探针和qPCR扩增引物。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述qPCR扩增引物包括核苷酸序列如SEQID NO:6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反向引物；

所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

6.权利要求1所述分子标记或权利要求3～5任意一项所述试剂盒在检测大口黑鲈性别中的应用。

7.一种检测大口黑鲈性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测大口黑鲈的基因组DNA；

将所述基因组DNA为材料基于权利要求1所述分子标记的多态性位点进行检测，根据检测结果判断待测大口黑鲈的性别。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述检测包括限制性内切酶TaaI酶切检测和/或Taqman探针检测。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用限制性内切酶TaaI酶切检测的方法为将PCR产物进行TaaI酶切，将酶切产物进行电泳分析，若得到一条988bp的条带，判断待测大口黑鲈为雌鱼；若得到一条988bp的条带的同时，还包括一条1268bp和1508bp的条带，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用Taqman探针检测的方法，将qPCR产物根据探针上的荧光颜色判断待测大口黑鲈的SNP位点基因型：根据具体基因型判断大口黑鲈的性别：

荧光颜色显示TT基因型，判断待测大口黑鲈为雌鱼；

荧光颜色显示AT和AA基因型，判断待测大口黑鲈为雄鱼。

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