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CN115925846A - 用于检测针对Ses iPR-10变应原的抗体的方法和试剂 - Google Patents

用于检测针对Ses iPR-10变应原的抗体的方法和试剂 Download PDF

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CN115925846A CN202210965752.6A CN202210965752A CN115925846A CN 115925846 A CN115925846 A CN 115925846A CN 202210965752 A CN202210965752 A CN 202210965752A CN 115925846 A CN115925846 A CN 115925846A
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Abstract

本发明涉及一种多肽，其包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR‑10变应原或其变体，其中所述多肽是分离的、纯化的、稀释的或固定的，包含所述多肽的诊断有用的载体，包含所述载体的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含有以下各项的组的一项或多项：用于使诊断有用的载体与样品接触的合适的水密性容器、阴性对照、阳性对照、校准物、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、用于检测针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR‑10变应原的IgG和/或IgE类抗体的工具，用于捕获IgG类和/或IgE类抗体的工具，用于诊断或辅助诊断过敏症的方法，该方法包括在来自受试者的样品中检测是否存在与由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR‑10变应原特异性结合的抗体的步骤，以及所述多肽的用途，所述多肽用于检测特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR‑10变应原的抗体。

Description

用于检测针对Ses iPR-10变应原的抗体的方法和试剂
本发明涉及包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体，其中所述多肽是分离的、纯化的或固定的，包含所述多肽的诊断有用的载体，包含所述载体的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含有以下各项的组的一项或多项：用于使诊断有用的载体与样品接触的合适的水密性容器、阴性对照、阳性对照、校准物、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、用于检测针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的IgG和/或IgE类抗体，用于捕获IgG和/或IgE类抗体的工具，用于诊断或辅助诊断过敏症的方法，该方法包括在来自受试者的样品中检测是否存在与由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原特异性结合的抗体的步骤，以及所述多肽的用途，所述多肽用于检测特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体。
对植物的过敏反应范围从轻微到全身反应，包括严重的过敏性反应。除了食用可识别的植物产品后的过敏反应外，变应原可能是各种食品中无法识别的成分，其中隐藏了它们的性质并因此隐藏了过敏反应的危险。
尽管植物性食物过敏的高发病率，但很少有治疗方法可供选择，避免通常是唯一可能的选择。当然，这需要有关患者所反应的抗原的性质的精确信息。
一系列的测试是可商购的，特别是关于最普遍的植物性食物成分，特别是花生、榛子和核桃。例如，Ara h 7同种型7.0201已被确定为花生中的主要变应原(US20180231567A1)。US10842865中描述了一种基于新型澳洲坚果变应原的检测方法。
这种对植物性食物过敏的诊断测试包括检测患者的IgE和/或IgG抗体，该抗体对变应原来源的蛋白质具有特异性。然而，阳性IgE或IgG测试，例如IgE致敏，并不总是与临床表现相关。换言之，如果检测到针对一种变应原的IgE或IgG类抗体，则该观察结果不足以提供结论性诊断。
然而，这是第一个迹象表明测试到的变应原来源比其它变应原更可能相关。在临床实践中，医生对过敏的诊断通常基于对相关变应原来源的IgE或IgG致敏阳性以及对该变应原过敏反应的令人信服的临床病史。此外，可以进行补充测试的结果，例如通过在患者皮肤上局部应用特定提取物进行的皮肤点刺测试(SPT)、口服食物挑战和/或嗜碱性细胞活化测试。
在成功识别出对特定变应原过敏后，可以进行治疗。虽然抗组胺药可用于改善治疗，但基于变应原的受控给药，可以通过特异性免疫疗法进行长期和治愈性治疗。虽然确切的机制尚不完全清楚，但这种免疫系统的特异性激活缓解随后环境暴露于相同变应原时的症状。已经证明对各种植物花粉和动物变应原的成功治疗。然而，在某些情况下，回避已被确定为过敏的病原的变应原是唯一可行的选择。
芝麻过敏是一种越来越常见的植物性食物过敏。现在估计至少有0.2％的儿童和成人对芝麻过敏，这接近了一些众所周知的变应原(如大豆和开心果)的患病率。它可引起多器官系统受累的严重过敏反应(也称为anaphylaxis)。由于芝麻未被列为主要食物变应原，因此消费者可能容易意外接触该变应原。芝麻以种子、油和酱(即芝麻酱)的形式存在于广泛且不断增长的各种食品中。一些化妆品、药物、增补剂和宠物食品也含有芝麻。
芝麻过敏可以通过检测基于芝麻提取物或2S白蛋白、Ses i 1(主要变应原)的特异性IgE类抗体来诊断。然而，这会导致大约30％的芝麻过敏患者出现假阴性结果(Ehlers,A.M.,Rossnagel,M.,Brix,B.,Blankestijn,M.A.,Le,T.M.,Suer,W.,Otten,H.G.,&Knulst,A.C.(2019)。芝麻油质蛋白是轻微变应原。Clinical and translationalallergy,9,32.https://doi.org/10.1186/s13601-019-0271-x)。此外，植物提取物不是测试抗原的首选来源，因为它们难以标准化，这意味着根据不同方案或基于不同批次原材料制备的提取物会产生不同的结果。此外，次要抗原可能被其他成分掩盖或它们的浓度可能不足。
因此，优选使用纯化的重组芝麻变应原。然而，缺乏诊断有用的芝麻变应原。油质蛋白是花生和榛子中的一类主要变应原，被证明只是芝麻过敏中的次要变应原，没有诊断价值(Ehlers,A.M.,Rossnagel,M.,Brix,B.等人。芝麻油质蛋白是次要变应原。ClinTransl Allergy 9,32(2019).https://doi.org/10.1186/s13601-019-0271-x)。非常需要额外的诊断工具，以尽量减少对食物挑战的需求。
因此，本发明的根本问题是提供用于诊断或辅助诊断过敏症，优选植物性食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症的试剂和方法。
本发明潜在的另一个问题是提供用于检测芝麻特异性抗体，优选IgG和IgE抗体，优选诊断或辅助诊断植物食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症的试剂和方法。
另一个问题是提供用于诊断或辅助诊断芝麻过敏症或植物PR-10过敏症的方法和试剂，其与现有技术的方法和试剂相比，具有改进的诊断可靠性，特别是灵敏度和/或特异性。优选考虑30％的假阴性样品误诊患者的诊断差距。与诸如基于芝麻提取物和/或Ses i1变应原的那些现有技术分析相比，该问题可能涉及增加检测的灵敏度。
本发明的另一个问题是提供用于鉴别诊断或帮助鉴别诊断芝麻过敏症的试剂和方法，由此芝麻过敏症可以与其他植物性食物过敏症相区别，特别是对坚果或种子的过敏症。
本发明潜在的另一个问题是鉴定或帮助鉴定患有过敏症(优选植物食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症)的患者应该避免的植物材料。
本发明的基础问题通过所附独立和从属权利要求的主题来解决。
在第一方面，本发明的基础问题通过包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的多肽或其变体解决，其中所述多肽是分离的、纯化的或固定的。
在第二方面，该问题通过包含根据本发明的多肽的诊断有用的载体解决。
在一个优选的实施方案中，所述载体选自包括以下各项的组：珠子，测试条，微量滴定板，塑料表面，优选聚苯乙烯表面，支化的纤维素基聚合物，微阵列，印迹，优选选自包括蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹的组，玻璃表面，载玻片，生物芯片和膜，最优选微量滴定板或线印迹。
在一个优选的实施方案中，所述多肽与来自患者样品的抗体复合，优选IgG，更优选IgG4，或IgE类抗体。
在第三方面，本发明的基础问题通过包含根据本发明的载体的试剂盒来解决，其中所述试剂盒还包含含有以下各项的组的一项或多项、优选所有项：用于使诊断有用的载体与样品接触的合适的水密性容器，阴性对照，阳性对照，校准物，优选一组校准物，洗涤缓冲液，稀释缓冲液，用于检测针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的工具，所述抗体优选IgG和/或IgE类抗体，其中所述抗体优选是哺乳动物(更优选人抗体)，针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体，用于捕获抗体(优选IgG和/或IgEs抗体，更优选人)的工具，以及包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽，优选具有可检测标记。
在一个优选的实施方案中，所述载体是包含空间上分开的试剂的测试条，所述试剂包括由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，以及选自包含以下各项的组的一项或多项：一种或多种校准物、抗CCD-IgE对照、指示存在二抗(优选识别IgG、更优选识别IgG4或IgE类抗体的二抗)的试剂、指示带和一种或更多校准或截止带。
在第四方面，所述问题通过药物组合物解决，该药物组合物包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，优选进一步包含佐剂。
在第五方面，所述问题通过用于诊断或辅助诊断过敏症的方法解决，该方法包括在来自受试者的样品中检测是否存在特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的抗体的步骤。
在一个优选的实施方案中，样品选自包括全血、唾液、血清和血浆的组。
在第六个实施方案中，所述方法包括以下步骤：使包含多肽的医疗或诊断装置与包含抗体的缓冲溶液接触，所述多肽包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，所述抗体特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原，其中所述缓冲溶液不是来自需要诊断的患者的、包含未知浓度的所述抗体的样品，其中优选
a)溶液中所述抗体的浓度是已知的，和/或
b)所述抗体是重组抗体和/或
c)使医疗或诊断装置与包含所述抗体的两种或更多种溶液接触，其中所述两种或更多种溶液具有不同浓度的所述抗体，和/或
d)所述抗体被与IgE类抗体特异性结合的二抗识别，
随后检测指示所述抗体是否与所述多肽结合的信号，任选地检测与所述一种或多种溶液中所述抗体的浓度相关的信号。
在第7个实施方案中，所述问题通过包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的多肽或其变体、根据权利要求1至6中任一项所述的多肽、载体或试剂盒用于检测特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的用途解决。
在第八个实施方案中，所述问题通过包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的多肽或特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体或根据权利要求3、4或6中任一项的载体，用于制造诊断试剂盒的用途解决。
在第九个实施方案中，所述问题通过包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的多肽或特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体或根据权利要求3、4或6中任一项的载体，用于诊断或辅助诊断过敏症的用途解决。
在一个优选的实施方案中，抗体是IgE或IgG类抗体。
在一个优选的实施方案中，使用选自包括以下各项的组中的方法检测所述抗体：免疫扩散，免疫电泳，光散射，凝集，标记免疫测定，优选选自放射性标记免疫测定，酶免疫测定如比色测定，化学发光，优选电化学发光免疫测定和免疫荧光免疫测定。
在第九方面，所述问题通过富集、分离、稀释或纯化的抗体，优选IgE或IgG类抗体或重组抗体来解决，所述抗体特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原，其中所述抗体优选以非生理浓度处于包含人工缓冲液或天然缓冲液的溶液中。所述问题可以通过以非生理浓度处于包括人工缓冲液和/或生理缓冲液的溶液中的抗体解决，优选浓度高于或低于生理条件、优选低于生理条件的浓度。优选地，抗体存在于来自患者的稀释样品中。
本发明基于发明人的惊人发现，即来自患有过敏症的患者的样品中存在与由SEQID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原结合的抗体。发明人已发现此类抗体不存在于健康患者中并且可用于诊断或辅助诊断芝麻过敏症或植物PR-10过敏症。
根据本发明，提供了一种包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的多肽或其变体。在一个优选的实施方案中，术语“由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原”是指由板状目(Lamiales)植物，优选芝麻属(Sesamum sp.)，更优选芝麻(Sesamum indicum)表达的并且具有包括序列SEQ ID NO1、优选SEQ ID NO17、更优选SEQID NO18的任何多肽或其变体。优选地，由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原包含170个或更少的氨基酸(如果去除或不计任何信号序列)。在一个优选的实施方案中，由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原包含SEQ ID NO17，更优选SEQ ID NO18并且最优选选自包括以下各项的组：SEQ ID NO2(Ses iPR-10-2)、SEQ ID NO3(Ses iPR-10-3)、SEQ ID NO4(Ses iPR-10-4)、SEQ ID NO5(Ses iPR-10-5)和SEQ ID NO6(Ses iPR-10-6)。在一个优选的实施方案中，Ses iPR-10变应原具有SEQ ID NO28并且优选选自包括SEQID NO2(Ses iPR-10-2)、SEQ ID NO5(Ses iPR-10-5)和SEQ ID NO6(Ses iPR-10-6)的组及其变体。
在一个优选的实施方案中，由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原包含SEQ ID NO2或其变体。在一个优选的实施方案中，它包含SEQ ID NO3或其变体。在一个优选的实施方案中，它包含SEQ ID NO4或其变体。在一个优选的实施方案中，它包含SEQ IDNO5或其变体。在一个优选的实施方案中，它包含SEQ ID NO6或其变体。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“植物PR-10过敏症”是指对多种植物发病机制相关(PR)蛋白的过敏症状(优选过敏)的表现。这些蛋白由植物诱导，作为在微生物和昆虫感染、受伤、暴露于恶劣化学品和大气条件等应激条件下的防御反应系统(Sinha等人，The ScientificWorld Journal,2015,ID 543195)。实例包括Bet v 1、Cor a 1、Mal d 1、Api g 1、Gly m4、Jug r 5和Pru av 1。在一个优选的实施方案中，患有植物PR-10过敏症的患者对至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的PR蛋白表现IgE反应。
本发明涉及诊断有用的载体，其优选是固相载体，所述载体用于使特异性结合与所述载体相关的抗体的工具与来自受试者(优选哺乳动物受试者，更优选人类受试者)的体液样品接触，所述工具优选是包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的多肽或其变体。
在一个优选的实施方案中，所述载体还包含一种或多种用于特异性结合抗体的工具，优选一种或多种，更优选两种或更多种，更优选三种或更多种这样的工具，它们中的每一种都能够特异性地捕获不同的抗体，优选选自包括以下各项的组：针对芝麻提取物的抗体、针对Q9AUD1(Ses i 1)的抗体、针对Q9XHP1(Ses i 2)的抗体、针对Q9AUD0(Ses i 3)的抗体、针对Q9XHP0(Ses i 6)的抗体、针对Q9AUD2(Ses i7)的抗体、针对Bet v 1的抗体、针对Cor a 1的抗体和针对Mal d 1的抗体、针对Gly m 4的抗体、针对Jug r 5的抗体和针对Pru av 1的抗体和由来自欧洲专利申请EP21161331.0的SEQ ID NO11表征的针对芝麻LTP的抗体，优选来自包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的组，每个来自EP21161331.0。优选地，此类工具是待结合和/或检测的抗体所结合的多肽或其变体。例如，包含Ses i 1的多肽或其变体是用于特异性结合或捕获针对Ses i 1的抗体的工具。在一个优选的实施方案中，根据本发明的包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的多肽、针对所述多肽的抗体、试剂盒或载体可用于增加基于检测来自上述抗体列表的一种或多种抗体的诊断的敏感性和/或特异性，所述抗体优选与芝麻提取物反应的抗体或具有由Q9AUD1(Ses i 1)表示的序列的多肽的抗体。
用于特异性结合或能够特异性捕获的工具可以是待结合或捕获的抗体所结合的多肽，或所述多肽的变体，例如具有SEQ ID NO1的多肽或其变体，如果针对SEQ ID NO1的抗体是待检测的。
在整个本申请中，任何数据库蛋白质序列代码均指最早的优先权或申请日可在线获得的版本。所述一种或多种工具优选地固定在所述载体上。在一个优选的实施方案中，用于特异性结合抗体的工具是一种多肽或其变体，其包含或由待捕获或检测的抗体特异性结合的抗原组成。所述多肽可以是线性肽或折叠多肽，后者优选采用与天然蛋白质基本相同折叠的变体，如可通过CD光谱测定的。在一个优选的实施方案中，所述多肽包含针对待捕获或检测的抗体的至少7个、优选10个、更优选15个氨基酸的表位。所述工具连同其所附着的不溶性载体可以从反应混合物中分离，其中它以直接方式与样品接触，例如通过过滤、施加磁场、离心或倾析。
在一个优选的实施方案中，所述载体是线印迹(Raoult,D.,and Dasch,G.A.(1989)，线印迹：单克隆抗体和其他抗体的免疫测定法。其在革兰氏阴性菌血清分型中的应用。J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“线印迹”是指测试条，更优选基于膜的测试条，其已经涂有一种或多种用于特异性结合抗体的工具。如果使用两种或更多种工具，它们优选地在载体上是空间上分开的。优选地，条带的宽度是测试条宽度的至少30、更优选40、50、60、70或80％。所述线印迹可包含一个或多个对照条带，用于确认(a)它已与样品接触足够长的时间并在适当的条件下，特别是在存在人血清的情况下，和/或(b)存在必要的试剂，特别是二抗和/或(c)CCD对照。还可以包括指示来自另一个条带的信号是否足够强以表示阳性结果的截止条带(cut offband)。
根据本发明，可以通过表达包含亲和标签的由SEQ NO 1表征的芝麻Ses iPR-10的重组变体来制备医疗或诊断装置，例如诊断有用的载体，任选地使用可包含蛋白酶切割位点的人工接头，在细胞如真核或原核细胞中，使表达的变体与固定在固相上特异性结合亲和标签的配体接触，洗涤固相以使非特异性结合的物质从细胞中除去并从固相中洗脱表达的变体，优选通过添加过量的非固定配体。然后可以将变体固定在所述装置上。任选地，可以通过在固定之前使变体与蛋白酶接触来去除亲和标签，所述蛋白酶优选是识别蛋白酶切割位点的蛋白酶，例如市售可得的剪切蛋白酶。所述亲和标签可以选自包括以下各项的组：18A、ACP、醛、Avi、BCCP、钙调蛋白、几丁质结合蛋白、E-Tag、ELK16、FLAG、flash、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、GST、GFP、HA、Isope、麦芽糖结合蛋白、myc、nus、NE、ProtA、ProtC、视紫红质表位Tag、Tho1d4、S-Tag、SnoopTag、SpyTag、SofTag、链霉亲和素、Strep-tag II、T7表位Tag、TAP、TC、硫氧还蛋白、Ty、V5、VSV和Xpress Tag。有用的蛋白酶包括但不限于TEV、凝血酶、因子Xa或肠肽酶。合适的接头是载体的一部分，例如pET载体系列(Novagen)。
在一个优选的实施方案中，包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体被固定在载体上。在一个优选的实施方案中，如本文所用并且与“固定的”可互换使用的术语“包被的”是指多肽被固定在载体的表面上。任何固定可以是可逆或不可逆的方式。例如，如果待固定的多肽通过离子相互作用与载体相互作用，所述离子相互作用可以通过添加高浓度的盐来掩盖，或者如果多肽通过可切割的共价键结合，则固定是可逆的。相反，如果这样的多肽通过在生理条件下在水溶液中不能被切割的共价键束缚在载体上，则固定是不可逆的。例如，高反应性酯如N-羟基琥珀酰亚胺可用于将多肽不可逆地固定在珠子上。可以间接固定多肽，例如通过固定抗体或对多肽具有亲和力的其他实体，然后加入多肽并形成多肽-抗体复合物。捕获的抗体可以使用标记的二抗或用于特异性捕获待检测抗体的标记工具来检测。可以为根据本发明的方法、用途和产品提供固定化的多肽或其他分子，其以固定化形式或配置用于固定化的形式，特别是具有特异性结合配体的亲和标签，所述配体包被在载体上，其上将固定所述多肽。例如，载体可以用链霉亲和素包被，并且固定的多肽可以携带生物素标记，反之亦然。用于固定的方法描述于Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,1991,CRC Press,和Rosenberg,I.M.,Protein Analysis and Purification,Second Edition,Springer,2005和Thermo Scientific Pierce Antibody Production and Purification TechnicalHandbook，2020年在线版。
在一个优选的实施方案中，可以在载体上的CCD对照允许鉴定由于IgE或类似抗体与糖蛋白表位如N-聚糖上的α-1,3-岩藻糖的结合导致的假阳性(Altmann,F.(2016)Copingwith cross-reactive carbohydrate determinants in allergy diagnosis,Allergo JInt 25(4),98-105)。这可以是线印迹中的附加线或微量滴定板中的孔、单独的珠子或其他载体或其空间上分开的部分，其包含糖蛋白表位，如果为阴性，则表明在其他条带中没有假阴性反应性。大量线印迹是可商购的，例如来自德国吕贝克的欧蒙医学实验诊断股份公司。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括检测是否存在与交叉反应性碳水化合物表位结合并因此导致假阳性结果的抗体的步骤。在另一个优选的实施方案中，该方法包括用CCD吸收剂处理样品以去除这种抗体，并且这种吸收剂(ZD 3001-0101，EUROMMUN)可以是根据本发明的试剂盒的一部分。
在另一个优选的实施方案中，诊断有用的载体是珠子。用于多种应用的各种珠子是可商购的，主要基于碳水化合物，例如琼脂糖或琼脂糖(sepharose or agarose)，或塑料。它们含有活性或可活化的化学基团，例如羧基或酯基，可用于固定特异性结合抗体的工具。优选地，珠子是平均直径为0.1μm至10μm、0.5μm至8μm、0.75μm至7μm或1μm至6μm的珠子。珠子可以直接用特异性捕获抗体的工具包被，或通过亲和配体，例如分别为生物素或谷胱甘肽和链霉抗生物素蛋白和GST。例如，珠子可以用生物素或谷胱甘肽包被，并且用于特异性结合抗体的工具或任何多肽可以分别与链霉抗生物素蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶或其变体融合。优选地，珠子以水悬浮液的形式提供，珠子含量为10-90％，优选20-80％，优选30-70％，更优选40-60％(w/w)。在一个优选的实施方案中，珠子涂有第一可检测标记，例如荧光染料。如果载体是珠子，则化学发光，优选电化学发光或荧光是优选的检测方法。
如果使用一种以上类型的珠子，其上包被有用于特异性结合待检测抗体的不同工具，则每种类型可具有不同类型的可检测标记，以使珠子的类型可区分，例如用于识别在流式细胞仪中珠子和结合的抗体的类型。如果使用荧光标记检测特异性结合工具的抗体的存在，则选择第一个可检测标签，如果也是荧光标签，则可以区分两者，例如使用单独的激光，例如绿色和红色激光用于检测标签。
在一个优选的实施方案中，可检测标记用于检测根据本发明的抗体，其是可用于使用生物物理检测方法将分子群与其他分子区分开来的标记。所述标记优选选自包括以下各项的组：荧光、放射性、化学发光标记、重金属如金标记、纳米颗粒、珠子或酶活性标记，优选催化比色反应的标记。在一个优选的实施方案中，荧光标记选自包括以下各项的组：Alexa染料、FITC、TRITC和绿色荧光蛋白(GFP)。Iodine-125可用作放射性标记。在一个优选的实施方案中，酶活性标记选自包括以下各项的组：辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和萤光素酶。本领域技术人员能够选择合适的标记并将它们连接到蛋白质、核酸和其他分子上(Hassanzadeh L、Chen S、Veedu RN.Radiolabeling of NucleicAcid Aptamers for High Sensitive Disease-Specific MolecularImaging.Pharmaceuticals(Basel).2018；11(4):106.Published 2018Oct 15.doi:10.3390/ph11040106,Bioconjugate Techniques,3rd Edition(2013)by GregT.Hermanson,Obermaier C,Griebel A,Westermeier R.Principles of proteinlabeling techniques.Methods Mol Biol.2015；1295:153-65)，并且有宽范围的经标记的分子可商购。
在一个特别优选的实施例中，所述珠子是顺磁珠子，其可以借助磁体容易地集中在表面上。为此目的，商业顺磁珠通常包含顺磁矿物，例如氧化铁。多种合适的顺磁珠是可商购的。珠子可以用可检测的标记来标记。
在另一个优选实施方案中，所述载体是亲水性支化聚合物，优选纤维素聚合物。可携带用于固定抗原性多肽的化学反应基团的此类聚合物是可商购的，例如来自Phadia的ImmunoCAP。
在另一个优选的实施方案中，所述载体是包含至少8个孔的微量滴定板，可用于ELISA。至少一个孔用一种或多种直接或间接特异性结合抗体的工具包被。两个或多个孔可以各自用校准物包被。
根据本发明，对于ELISA以及其他测定形式的产品和用途，提供至少2、3、优选4、更优选5种校准物。在一个优选的实施方案中，校准物包含特异性结合所述一种或多种工具的抗体，优选以确定的浓度，并且可以用于建立用于半定量分析的校准曲线，参见Wild，TheImmunoassay Handbook，第3版，2005，Elsevier，第9章。优选地，它是特异性结合由SEQ IDNO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的抗体，但它也可以是特异性结合与待检测的抗体相同的用于捕获抗体的工具和/或用于检测抗体的工具的抗体或类似试剂，优选特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原和特异性结合特异性结合人IgE或IgG类抗体的二抗。例如，包含与待检测抗体相同的恒定区的嵌合抗体，例如包含人IgE或IgG抗体的恒定区，而可变区可以是或可以包括特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的重组抗体的部分。参见Hamilton RG.Application ofengineered chimeric antibodies to the calibration of human antibodystandards.Ann Biol Clin(Paris).1991；49(4):242-8.PMID:1928840。一组校准物包括包含已知浓度的所述抗体的校准物，它们彼此不同。通常选择它们以使其覆盖检测范围的重要部分，例如，可以以至少1:2、1:5、1:10、1:50、1:100、1:200、1:500和1:1000的浓度比提供两中校准物。还可以包括反映样品中不存在待检测抗体的校准物。当执行本发明的方法时，校准物可以与样品平行地处理和显影，或者在样品被处理和显影之前。在优选实施例中，校准曲线被存储和/或可能必须仅以周期性间隔重复。
在一个优选的实施方案中，所述标记是可以被检测的化学基团，优选地选自包含以下各项的组：酶活性标记，例如具有辣根过氧化物酶活性或碱性磷酸酶活性的标记，化学发光标记，例如能够产生化学发光信号，例如吖啶酯或鲁米诺，放射性标记例如碘125，自旋标记和荧光标记例如FITC。
在另一个优选的实施方案中，所述载体是微阵列。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“微阵列”指点有多种空间上分开的变应原多肽的芯片，其中一种或多种根据本发明的多肽或其变体，优选至少5、10、20，优选至少30、40、50、80或100种多肽。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“用于检测抗体的工具”是指使抗体可检测的试剂，该抗体是包含固定在载体上的抗原(例如由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体)的复合物的一部分。在一个优选的实施方案中，所述工具是一种特异性结合具有与待检测抗体相同免疫球蛋白类别的所有抗体的分子，所述免疫球蛋白类别优选IgE或IgG，更优选二抗。在一个优选的实施方案中，所述工具是特异性结合来自待诊断对象(优选哺乳动物)更优选人的所有抗体的分子。这样的工具可以是二抗的混合物或待检测的抗体结合的包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体。例如，二抗可用于免疫测定，多肽可用于捕获桥测定(Wild，The ImmunoassayHandbook，第3版，2005，Elsevier，分别为图1.2和1.42)。在另一个优选的实施方案中，所述工具是由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体。它可以与待检测的抗体结合，该抗体已被固定或将被固定，使得其抗原结合位点的至少一个未被占据且可用于结合。例如，抗体可以通过其恒定区或通过其可变区上的多个结合位点之一固定。在一个优选的实施方案中，所述工具携带可检测的标记。在一个优选的实施方案中，用于检测抗体的工具可用于检测一种或多种哺乳动物(优选灵长类，更优选人)抗体。根据本发明，广义上的术语“二抗”应理解为是指任何种类的“结合部分”，优选结合蛋白，能够特异性结合抗体或其片段，优选IgE和/或IgG类抗体，例如选定物种(优选人)的特定Ig类的恒定结构域。结合部分的非限制性实例包括抗体，例如免疫学或遗传衍生自任何物种的抗体，例如人、鸡、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鲨鱼、山羊、啮齿动物、牛、狗、兔等，抗体片段，结构域或其部分，例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFab、Fv、scFv、VH、VHH、VL、VLR等，双抗体，单克隆抗体(mAb)，多克隆抗体(pAb)，mAbdAbs，噬菌体展示衍生的结合子，亲和抗体，异源共轭抗体，双特异性抗体，evibodies，脂质运载蛋白，anticalins，亲和抗体，avimers，maxibodies，纳米体，热休克蛋白如GroEL和GroES，跨体，DARPins，适体，C-型凝集素结构域如四连蛋白；人γ-晶状体蛋白和人泛素衍生的结合子如affilins，PDZ结构域衍生的结合子、蝎子毒素和/或Kunitz型结构域结合子、纤连蛋白衍生的结合子如adnectin、受体、配体、凝集素、亲和素、链霉亲和素、生物素，包括衍生物和/或它们的组合，例如由两种或更多种这些结合分子形成的双特异性/多特异性形式。各种抗体衍生和替代(即非抗体)结合蛋白支架，包括其生成方法是本领域已知的(例如，在Chiu ML等人，Antibodies(Basel),(2019)；8(4):55中综述；Simeon R.&Chen Z.,Protein Cell.(2018)；9(1):3-14；和第7章–Non-Antibody Scaffolds fromHandbook of Therapeutic Antibodies(2007)由Stefan Dübel编辑)。直接参考参见EP21158065.9的描述，其中定义了这些分子并概述了它们的用途和产生。
在一个优选的实施方案中，二抗是特异性结合来自一种或多种免疫球蛋白类别的所有抗体的抗体，优选一种或多种或所有来自包括人IgA、人IgM、人IgE和人IgG的组的抗体，或者更优选地人免疫球蛋白类，例如IgG或IgE。二抗通常识别所述类别的恒定结构域，但也可以识别与来自感兴趣类别的抗体共有的其他表位，例如跨3D结构的构象表位。它们中有很多种是可商购的，例如从Thermo Fischer。它可以是单克隆或多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“识别”是指二抗特异性结合待检测的一种或多种抗体。二抗可以特异性结合一种或多于一种免疫球蛋白类别。这可以通过使用包含特异性结合每种免疫球蛋白的抗体或与所有感兴趣的所有免疫球蛋白类别反应的单一抗体的混合物作为该类二抗(优选IgG类抗体)来实现。二抗的使用在Kruger,N.J.,Detection ofPolypeptides on Blots Using Secondary Antibodies,The Protein ProtocolsHandbook(ed.J.M.Walker),page 967,volume 1996,Springer中有解释。简而言之，可以通过用待识别的抗体或待识别的抗体的混合物免疫实验动物来产生这样的二抗。
在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“用于捕获抗体的工具”是可用于将抗体固定在固相上的工具，优选地来自免疫球蛋白类的所有抗体或特异性结合由SEQ IDNO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的抗体。该工具可以是固定在固相上的二抗、适体或其他蛋白质，其特异性结合具有选自IgA、IgM、IgG和IgE(优选IgG和/或IgE)的组的免疫球蛋白类别的所有抗体。免疫球蛋白类更优选人免疫球蛋白类。该工具可以是固定在固相上的由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，从而其仅捕获特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体。通常，与用于检测抗体的工具相比，该工具不携带可检测标记。
优选用于实施本发明的来自受试者的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。通常，所述样品是一种包含具有代表性的一组受试者的全部免疫球蛋白的体液。然而，所述样品一旦提供，可能会进行进一步处理，包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，优选IgE和/或IgG，这可能会影响各种类别的免疫球蛋白的相对分布。所述样品可以选自包括全血、血清、血浆和唾液的组，并且优选是血清。在最优选的实施方案中，所述样品包含IgE类抗体。在一个更优选的实施方案中，所述样品包含一组代表性的受试者抗体，选自IgA、IgG、IgM和IgE，优选IgG和IgE，更优选IgG1、IgG4和IgE，其中与从受试者获得的样品相比，最优选抗体与不同的抗原的比率基本上没有改变。所述样品优选来自哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
本发明的教导不仅可以使用具有在本申请中明确(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含提及的确切序列的多肽来进行，而且还可以使用这种多肽的变体来进行。
在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“变体”可以指全长序列的至少一个片段，更具体地，一个或多个氨基酸，相对于全长序列，在一个或两个末端被截短一个或多个氨基酸。这样的片段包含或编码具有原始序列的至少6、7、8、9、10、15、25、50、60、70、80、90或100个连续氨基酸的肽或其变体，优选在至少8个。在一个更优选的实施方案中，所述变体的总长度可以是至少25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、140或150个或更多个氨基酸。在另一个更优选的实施方案中，所述变体的总长度可以不超过25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或250个或更多个氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，还指包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列的多肽或其片段，其中除了对生物活性至关重要的氨基酸(例如特异性结合待检测的抗体的能力，或多肽的折叠或结构)之外的氨基酸被缺失或取代和/或一种或多种这样的必需氨基酸以保守方式被取代和/或氨基酸被添加或缺失，使得多肽的生物活性至少部分保留。现有技术包括可用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008,3rd版。在一个优选实施例中，ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)用于应用默认设置。
在一个优选的实施方案中，变体还可以包括化学修饰，例如标记如同位素标记或可检测标记或共价修饰如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧化、瓜氨酸化、羟基化等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。此外，变体也可以通过与其他已知多肽或其变体融合产生，例如人工接头，优选不是源自芝麻多肽，亲和标签，其他抗原等。特别地，变体可以包含生物素或链霉抗生物素。
多肽的变体(特别是由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原)具有生物活性。在一个优选的实施方案中，这种生物活性是特异性结合待检测的相应抗体的能力，更优选取自患有与这种抗体的存在相关的疾病或过敏症的患者的样品，特别是针对由SEQID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体。在一个优选的实施方案中，它包含具有特异性结合相应抗体的能力的表位，所述抗体优选来自患有与此类抗体的存在相关的植物过敏症(更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症)的患者的样品，特别是针对由SEQ IDNO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体。所述表位可以包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的至少6、7、8、9、10、20、30或40个氨基酸。特别优选折叠表位。SEQ iPR-10变应原的示例性变体包括SEQ ID NO7至SEQ ID NO11、SEQ ID NO19至SEQID NO21和SEQ ID NO25至SEQ ID NO27。
在设计变体时，本领域技术人员可以考虑有助于生物活性的表位。
在一个优选的实施方案中，包含变体作为特异性捕获抗体的工具的线印迹测定，优选如实施例中所述，可用于测试变体是否具有这种活性。所述变体还可以包含N-末端和/或C-末端肽或多肽融合物，只要它们对抗原序列部分不具有特异性结合活性和/或不与其他序列部分结合而掩蔽抗原序列使得其结合特性显著改变和/或不再能够与抗体结合。示例性融合变体包括SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
多肽可以任何形式和任何纯化程度提供，从包含内源形式的所述多肽的组织、体液或细胞，更优选过表达多肽的细胞，这些细胞的粗制或富集裂解物，到纯化和/或基本上是纯的经分离的多肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中如本文所用的术语“天然多肽”是指折叠多肽，更优选是从细胞(更优选从原核或真核，优选哺乳动物细胞，更优选植物细胞)中纯化的折叠多肽。在另一个优选的实施方案中，所述多肽是从芝麻或由芝麻制成的加工产品中纯化的。可以使用糖基化形式的多肽。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“纯化的”是指多肽或任何其他纯化的试剂或分子已经经历了一个或多个实现纯化的方法步骤，优选选自包括以下各项的组的方法步骤：色谱法，更优选选自包括尺寸排阻、亲和、疏水相互作用和离子交换色谱法的组，更优选使用亲和标签如GST、MPB或His标签的亲和色谱。
在一个优选的实施方案中，多肽以非还原状态使用。这可以通过在非还原条件下纯化多肽或通过在纯化后氧化多肽来完成，例如通过在不存在还原剂如DTT的情况下暴露于空气。
根据本发明，所述多肽可以是重组蛋白，其中本文所用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用基因工程方法生产的多肽，例如通过融合编码多肽为在细胞或组织中过表达的强启动子的核酸，或者通过改造多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造编码的核酸和多肽的方法(例如，描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH或Brown T.A.(1986),Gene Cloning–an Introduction,Chapman&Hall)以及用于生产和纯化天然或重组多肽(例如手册“Strategies for ProteinPurification”、“Antibody Purification”，由GE Healthcare Life Sciences和Burgess,R.R.出版,Deutscher,M.P.(2009)：Guide to Protein Purification)。在另一个优选的实施方案中，所述多肽是经分离的多肽，其中术语“经分离的”是指与其在生产时的状态或作为天然原材料的一部分例如未加工样品相比，多肽已使用生物技术或合成方法被富集并且优选是纯的，即通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳随后考马斯蓝染色和目视检查判断，相应液体中至少60、70、80、90、95或99％的多肽由所述多肽组成。优选地，载体上用作捕获抗体的工具的任何多肽都是纯的。
本发明的教导提供了一种试剂盒，优选用于诊断植物食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症。这种试剂盒是一种容器，其包含实施本发明方法所需的特定试剂，任选地在一种或多种(优选所有)实施本发明方法所需的试剂之外，特别是根据本发明的诊断有用的载体。所述试剂盒可包含用于检测针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的抗体的工具。所述试剂盒可以包含用于捕获针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原的抗体的工具。所述试剂盒可以包含阳性对照，例如重组抗体或来自患者血清的抗体，优选IgA、IgM、IgE或IgG，更优选IgE和/或IgG，其特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的芝麻Ses iPR-10变应原或用于特异性结合待检测抗体的工具。所述重组抗体可以来自非人类哺乳动物或鸟类，例如来自山羊、大鼠、鸡、小鼠、兔、马、绵羊或非人类灵长类动物。更优选地，所述样品是来自人的样品。例如，用作工具的多肽可以包含人工标签，并且用作阳性对照的抗体可以与所述标签特异性结合。所述试剂盒可包含阴性对照，例如不特异性结合抗体(所述抗体特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原)，例如牛血清白蛋白。阴性对照也可以是来自未患有植物过敏症(优选芝麻或植物PR-10过敏症)的受试者(优选人类受试者)的血清。所述试剂盒可以包括一种或多种校准物。所述试剂盒可以包括用于在存在其他液体例如反应缓冲液的情况下使诊断有用的载体与样品接触的合适的水密性容器。例如，可以在培养盘中或结合培养盘提供线印迹，或者可以提供微量滴定板。现有技术中描述了合适的容器，例如EP3025780或EP3025779。
根据本发明，检测多肽(特别是由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原)和与其特异性结合的抗体之间的特异性结合以及其他分子(例如二抗与待检测的抗体)之间的特异性结合。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语“特异性结合”是指通过使用Biacore设备在25℃的PBS缓冲液中于pH 7的表面等离子体共振测定，结合反应比以1×10-5M、更优选1×10-7M、更优选1×10-8M，更优选1×10-9M，更优选1×10-10M，更优选1×10- 11M，更优选1×10-12M的解离常数为特征的结合反应更强。
根据本发明的方法或产品可用于诊断或辅助诊断过敏症，优选植物性食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症，或用于识别患有或具有增加的患植物性食物过敏症(更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症)风险的患者。在另一个优选的实施方案中，所述过敏症的特征在于致敏，优选与临床过敏症状相关。
在优选实施例中，如本文所用的术语“诊断”将以其最广泛的可能意义使用，并且可以指旨在获得有助于评估患者在过去、诊断时或将来是否患有或可能或与平均或比较对象(优选具有相似的症状)相比更有可能患有某种疾病或病症的信息的任何类型的程序，以了解疾病如何进展或将可能在未来如何进展或评估一个或多个患者对某种治疗的一般反应性，例如免疫抑制药物的给药或免疫疗法的治疗，或查明样品是否来自此类患者。此类信息可以用于临床诊断，但也可以由实验和/或研究实验室获得用于一般性研究的目的，例如确定患者队列或人群中患有过敏症的受试者的比例。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，还包括预测和/或监测疾病或病症例如过敏症的病程，包括监测一名或多名患者对给药或候选药物或候选疫苗的反应，例如确定其功效。虽然结果可能会分配给特定患者用于临床诊断应用，并且可能会传达给治疗该患者的医生或机构，但对于其他应用(例如用于研究目的的诊断，足以将结果分配给来自匿名患者的样品)则不必如此。根据本发明的产品、方法和用途的目的还可以是确定样品是否来自在过去、在诊断时或在未来患有或更可能患有疾病的人。根据本发明的产品、方法和用途的目的还可以是确定组中是否有或有多少受试者患有或可能患有疾病。该组可以包括代表总体人群的随机个体、患有某些症状或接受治疗的患者群组。该组可以包括人类或哺乳动物，优选实验室动物。在一个优选的实施方案中，所述疾病可以是过敏症，优选植物食物过敏症，更优选芝麻过敏症或植物PR-10过敏症。在另一个优选的实施方案中，所述过敏症的特征在于致敏，优选与临床过敏症状相关，其可能与针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体相关。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和产品可以用于相互作用研究，包括确定候选药物或其他化合物是否可以干扰抗体与由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原的结合，或可能影响任何下游过程或它们与目标结合的强度。在一个优选的实施方案中，它们可以用于监测免疫反应，更优选地，在施用包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其免疫原性变体的免疫原性组合物后，针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的出现和/或滴度，例如哺乳动物，其可以是除人之外的哺乳动物，例如实验室动物。
本领域技术人员将理解，临床医生通常不会仅根据单个诊断参数来断定患者是否患有或可能患有诸如过敏症的疾病、病症或障碍，而是需要考虑其他方面，例如所存在的其他抗体、标志物、血液参数、患者症状的临床评估或医学成像或其他方法的结果，特别是涉及使患者与一种或多种潜在变应原接触的补充性侵入测试，例如SPT和/或口服食物挑战，优选基于包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽，以得出结论性诊断。可以进行基于相同多肽的嗜碱性细胞活化测试。
在许多情况下，仅检测抗体，即确定样品中是否存在可检测水平的抗体，就足以辅助诊断。如果可以检测到抗体，该信息将有助于临床医生的诊断，并表明患者患过敏症的可能性增加。特别是，抗体(特别是IgE)检测将表明所谓的致敏作用，即对特定过敏原的免疫反应，其可确定疑似过敏。然后可以对患者进行额外的测试，甚至是体内激发测试，例如使用一种或多种芝麻变应原(例如芝麻提取物)的食物挑战。
诊断试剂或方法的价值还可能在于排除一种过敏症的可能性，从而允许间接诊断另一种过敏症或使用额外的变应原进行补充测试。在一个优选的实施方案中，本申请通篇提及的任何症状或疾病的含义与本领域技术人员截至申请日或优选本申请的最早优先权日的理解一致，如教科书和科学出版物所证明的那样。应该提到的是，本发明的方法或用途或产品，单独来看，不能用于得出明确的最终诊断。本领域技术人员熟悉过敏症的诊断程序，例如在Hamilton,R.G.,Diagnosis of Human Allergic Disease,in PediatricAllergy,4th Edition,2016,Elsevier中详述。
在一个优选的实施方案中，术语“诊断”还可以指用于区分与相似或相同症状相关的两种或更多种病症的方法或试剂，例如过敏症如一方面是芝麻过敏症、植物PR-10过敏症，而另一方面是其它食物过敏症(优选植物过敏症)。
在一个优选的实施方案中，证明抗体是否存在的任何信息或数据可以口头传达给患者或治疗患者的医生，优选通过电话，以书面形式，优选传真或信件，或以电子形式通过传真或互联网，例如电子邮件或短信。
本发明涉及一种方法，该方法包括以下步骤：在液体例如来自受试者的样品中检测特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体是否存在。这种方法可以包括以下步骤：a)提供液体，优选患者样品，b)使液体与载体接触，所述载体包含一种或多种用于在与形成复合物相容的条件下特异性结合一种或多种待检测抗体的工具，所述复合物包含诊断有用的载体与工具和抗体，更具体地，包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体和抗体，c)任选地分离任何所述复合物，例如通过除去液体，d)任选洗涤所述复合物，和e)检测所述复合物。该方法优选是体外方法。这样的方法可以用于生产试剂，例如用于实施根据本发明的方法或用于确认商业化验的质量的阳性对照或校准物。
用于根据本发明的预后、诊断、方法或试剂盒的抗体或复合物的检测包括使用选自包括以下各项的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记免疫测定如选自包含以下各项的组的那些：放射性标记的免疫测定、酶免疫测定如比色测定、化学发光优选电化学发光免疫测定和免疫荧光技术。本领域技术人员熟悉这些方法，这些方法也在现有技术中有所描述，例如Zane,H.D.(2001):Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company，特别是在第14章中。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语抗体的“存在”是指使用如在实施例中所描述的基于线印迹和使用碱性磷酸酶活性的检测的这种方法(优选选自包含以下各项的组的方法：酶免疫测定法，更优选比色测定法或化学发光法，优选电化学发光免疫测定法)可检测到抗体。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“不存在”是指使用这种方法无法检测到抗体，因为它在低于相应检测限的极低浓度下不存在或存在。
在一个优选的实施方案中，使用两种或更多种特异性结合待检测抗体的工具，特别是用于特异性结合或捕获针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原和其它变应原的抗体的工具，其可以是一种特异性结合或捕获针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的其它Ses iPR-10变应原或针对芝麻提取物或针对Ses i 1的抗体的工具。在更优选的实施方案中，可以区分存在哪种抗体。如果两种或更多种工具在空间上是分开的或使用可区分的检测方法检测抗体，例如包含可区分的荧光团的标记，则可能是这种情况。在另一个优选的实施方案中，只能确定两种或多种待检测抗体中的至少一种是存在的。如果使用两种或多种方法的混合物，则可能是这种情况，并且只能确定抗体与该混合物特异性结合。
在许多情况下，检测，优选意指检测抗体的不存在或存在，任选意指确定抗体浓度是否高于特定阈值，优选通过使用根据本发明优选的检测方法例如ELISA或线印迹的测量来设定，在液体中，是足以用于诊断的。如果可以检测到一种或多种特异性结合由SEQ IDNO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体，这将有助于临床医生的诊断，并表明患者患过敏症的可能性增加。然后将鼓励临床医生跟进更具侵入性的测试，例如口服食物挑战或SPT。
在一个优选的实施方案中，同时检测两种或多种抗体的存在或不存在，即同时检测。
在一个优选的实施方案中，在空间上分开的反应中，更优选在分开的容器中的不同反应混合物中检测两种或更多种抗体的不存在或存在。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种试剂或工具或多肽用于检测一种或多种特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的用途，或编码由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的核酸或在严格条件下与所述核酸特异性杂交的核酸的用途，或包含所述核酸的载体或细胞在制造用于诊断过敏症的试剂盒中的用途。在一个优选的实施方案中，提供包含所述载体的细胞并在允许所述核酸表达的条件下培养，然后分离表达产物，其可以是由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原或其变体，然后在根据本发明的方法或产品中使用所述表达产物作为特异性结合抗体的工具。更具体地，可以用表达产物包被诊断有用的载体。
在另一个优选的实施方案中，所述方法可以用于确认抗体检测测定的可靠性或确定特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的抗体的浓度，并且可以涉及检测一种溶液，它不是来自患者的样品，但已知或预期包含抗体，优选以已知浓度。或者，该溶液可以是不包含用于检查背景的抗体的阴性对照。这种方法可以与诊断方法并行、之后或之前运行。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用于分析来自患者的样品以检测一种或多种表明过敏症可能性增加的抗体的装置，其中所述抗体是特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的抗体，其包括：
a)载体，其包含在样品与载体接触时从样品中捕获至少一种抗体的工具，
b)当可检测工具与载体接触时能够与载体捕获的抗体结合的可检测工具，特别是所述可检测工具是能够与载体上捕获的抗体结合的标记二抗，
c)任选地用于从载体中去除任何样品的工具和可检测工具，优选通过洗涤，
d)用于检测可检测工具的存在并将结果转换为电信号的检测设备，和
e)任选地，用于接收来自检测设备的电信号，并通过与背景中检测到的信号水平或从健康受试者的样品中获得的输入参考值相比较，来确定信号水平是否指示芝麻过敏或植物PR-10过敏可能性增加。
本发明提供了一种药物组合物，优选用于免疫疗法，其包含一种或多种抗原，所述抗原选自包括以下各项的组：包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体，任选地与一种或多种其它植物抗原组合，所述组合物优选适合施用于受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人。所述组合物中的任何多肽都可以是纯化的和/或重组的。任何抗原都可以与载体蛋白融合。任何变应原或其变体优选是低过敏性的。这种药物组合物可以包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可以例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、通过滴眼剂、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库给药，其中如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。所述药物组合物可以以合适的剂型提供，例如胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液，优选以无菌形式。它可以在疾病(优选过敏症)治疗的方法中使用，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。可以使用抗原的低变应原性变体。本领域技术人员熟悉产生已知变应原的低过敏性变体的方法。所述药物组合物可以是灭菌的液体溶液，其可以用于注射。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含佐剂和至少一种稀释剂、至少一种助流剂、至少一种稳定剂和/或至少一种填充剂。合适的组合物描述于现有技术中，例如Plotkin,Orenstein and Offit,Vaccines,Elsevier Saunders,2013或Schijns,O'HaganImmunopotentiators in Modern Vaccines,Elsevier Academic Press,2006。它们在免疫疗法中的用途描述于Varshney/Matsui，Immunotherapy for Allergic Disease,inPediatric Allergy by Leung等人，第3版，2016年，Elsevier。此类药物组合物的治疗、成分和组合物、有用的佐剂、载体、低变应原性变体的产生和载体蛋白公开于US2021/0128781,Aglas L,Bethanis A,Chrusciel P,Stolz F,Gruen M,Jaakkola UM,JongejanL,Yatkin E,Van Ree R。低过敏性Bet v 1变体对功能性抑制性IgG抗体的体内诱导，FrontImmunol.2020年9月3日；11:2118，US9856296，US9040054，Orozco-Navarrete B，Kaczmarska Z，Dupeux F等。Structural Bases for the Allergenicity of Fra a1.02in Strawberry Fruits,J Agric Food Chem.2020；68(39):10951-10961.doi:10.1021/acs.jafc.9b05714以及Neudecker P,Lehmann K,Nerkamp J等人,Mutationalepitope analysis of Pru av 1and Api g 1,the major allergens of cherry(Prunusavium)and celery(Apium graveolens):correlating IgE reactivity with three-dimensional structure.Biochem J.2003；376(Pt 1):97-107.doi:10.1042/BJ20031057,Hofer等人,Tackling Bet v 1and associated food allergies with a single hybridprotein,Journal of Allergy and Clinical Immunology,140(2)2,2017,525-533andUS9844591。基于RNA的变应原疫苗在US2017/136121中有描述。
根据本发明，提供了一种包括富集或分离针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的步骤的方法。本领域技术人员熟悉从各种来源富集或分离抗体的方法，示例性过程描述于Thermo Scientific Pierce Antibody Production andPurification Technical Handbook，Thermo Scientific。简而言之，提供抗体的来源，例如来自包含抗体的患者的样品，所述患者优选患有诸如芝麻过敏症或植物PR-10过敏症的植物食物过敏的疾病，或来自用由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体免疫的实验动物的样品，或过表达由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的细胞或这种细胞的裂解物。然后将呈液体溶液形式的抗体源与由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体在与形成包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原和抗体的复合物相容的条件下接触，然后将液体样品与复合物分离。通常，由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原在复合物形成之前或之后固定在固相上，该固相可以与本文公开的作为诊断有用的载体或任何其他固相的任何载体相关，例如色谱柱，然后使用洗涤缓冲液洗涤复合物。例如，由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的SesiPR-10变应原可以使用交联剂例如EDC与携带固定二氨基二丙胺接头的琼脂糖珠通过侧链羧基共价连接。这已经是抗体的分离，但它可以任选地从由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原解离，例如通过将复合物暴露于变性条件如在电泳纯化步骤中的SDS或者高盐缓冲溶液。最后，可以通过将抗体与检测抗体的工具接触来检测抗体的存在，无论是否解离。在一个优选的实施方案中，该方法用于制备抗体作为阳性对照、校准物或用于确定溶液中抗体的浓度，例如制备抗体的标准化溶液作为对照或校准物。
根据本发明，包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或者特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体，优选来自包含以下各项的组：SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，或根据本发明的载体可以用于制造诊断试剂盒，优选用于诊断过敏症(更优选芝麻过敏症，或植物PR-10过敏)。例如，这可能涉及使用所述多肽和所述抗体来包被载体的固相，测试载体的质量通过进行对照反应或使用标准化组分(例如重组抗体而不是来自患者样品的抗体)校准来，它可以与来自健康献血者的样品(例如血清)混合，将成分包装到试剂盒中或实际执行方法的步骤以获得可能有助于诊断的结果。
根据本发明，提供了包含编码由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体的核酸。优选地，所述核酸处于启动子的功能控制之下，该启动子允许所述多肽的恒定或可诱导表达。示例性载体包括SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ IDNO15、SEQ ID NO16及其变体。根据本发明，提供了包含所述载体的可以是原核或真核的细胞。所述细胞可用于表达所述多肽，随后将其纯化并固定在设备的固相上并根据本发明使用。本领域技术人员熟悉使用细胞表达和纯化多肽的方法。
序列：
本发明包括一系列新的核酸和多肽序列，更具体地如下，它们与序列表中的序列相同。仅为了预防起见，任何SEQ ID NO可以指本文件中列出的序列和序列表中的序列，以防出现任何意外偏差。
“z”代表一个或没有氨基酸，“B”代表极性和/或带电荷的氨基酸，“u”代表疏水性氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸和蛋氨酸，“X”代表一个氨基酸。
SEQ ID NO1(一般Ses iPR10抗原共有序列)
ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZXXXKXXXXXXGBGZXUXBUXXXBFXBXXXUBXXKXBUBXXBXBBUXXXYBUUXGXZXUXXXUBBUXXXUBUXXXXZZXUXBUXBXXBZZZXXXXXXUXBBBUBXGKBXUXXUUXUXBXXXZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ
SEQ ID NO2(Ses iPR10-2，抗体结合的抗原序列)
GVLTFTEEHTSAVSPSRIFKASILDANNLIPKLLPQVIKSMEFIQGTGSPGSIKQICFAEGSTLSSLKYRIDELNEETYTYNYTVIEGDALTDKLEKITHEVKLEAAPGGGTFSKVTSTYYTKGDFALKEEDVKAGKERVLGVYKVVEAYLLNNPDAYA
SEQ ID NO3(Ses iPR10-3，抗体结合的抗原序列)
GVTSITQEFSSPVAPERLFKALILDSNNLIPKLLPQSIKSVDLLRGDGGAGSIEQVNFTETSHFKYVKHQINELDKQNLVCKYTMIEGDALGDKLESIVYEIKFEASDINGAGCVCKMTSEYHTLGGYEVKEEEIKGGKESAMGIYKVVEAHLLENPHLYA
SEQ ID NO4(Ses iPR10-4，抗体结合的抗原序列)
GVIKVSQSFRTKVTPSRMFKALILDSHNLCPQLMFSSIKSIDFLQGKGEPGTIKQMNFTDASPFNYVKHRIDEMDEEKFMCKYTFIEGDALMDKLDHITYEVKFEPYGFGGCICRITSEYYTKENVEIKEEDIELGKDRAIGMYEVVEAYLLAHPHAYN
SEQ ID NO5(Ses iPR10-5，抗体结合的抗原序列)
GAITYDIEIPSSIPAAKMFKAVVLDADTLIPKIMPQAIKNVEILEGDGGVGTVKIIHFGEGSQYKSAKHRVDAIDTENLTHSYTIVEGDALAGVLESITYHVKIVPTEDGGCICKNRSIYHTKGDVEITEEKIKEGKEKAMQMLKAIEAYLQANA
SEQ ID NO6(Ses iPR10-6，抗体结合的抗原序列)
GVLNYEDELISPVPPARLFKSLVLDGDNLIPKLLPHAFKSFQILEGHGGPGTIKLVTFADGSPYKTAKHRIDEIDEENYIYKYSVIGGDALGEDFDSMTHGFKIEVGADGGSICKTTSTFHTKGEDHVIQEKIKAGKERAKAIFKAVETHLHAHPHEYN
SEQ ID NO7(Ses iPR10-2，经His标签的序列，剪切蛋白酶切割位点和接头，如示例中使用的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLTFTEEHTSAVSPSRIFKASILDANNLIPKLLPQVIKSMEFIQGTGSPGSIKQICFAEGSTLSSLKYRIDELNEETYTYNYTVIEGDALTDKLEKITHEVKLEAAPGGGTFSKVTSTYYTKGDFALKEEDVKAGKERVLGVYKVVEAYLLNNPDAYA
SEQ ID NO8(Ses iPR10-3，经His标签的序列，剪切蛋白酶切割位点和接头，如示例中使用的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVTSITQEFSSPVAPERLFKALILDSNNLIPKLLPQSIKSVDLLRGDGGAGSIEQVNFTETSHFKYVKHQINELDKQNLVCKYTMIEGDALGDKLESIVYEIKFEASDINGAGCVCKMTSEYHTLGGYEVKEEEIKGGKESAMGIYKVVEAHLLENPHLYA
SEQ ID NO9(Ses iPR10-4，经His标签的序列，剪切蛋白酶切割位点和接头，如示例中使用的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVIKVSQSFRTKVTPSRMFKALILDSHNLCPQLMFSSIKSIDFLQGKGEPGTIKQMNFTDASPFNYVKHRIDEMDEEKFMCKYTFIEGDALMDKLDHITYEVKFEPYGFGGCICRITSEYYTKENVEIKEEDIELGKDRAIGMYEVVEAYLLAHPHAYN
SEQ ID NO10(Ses iPR10-5，经His标签的序列，剪切蛋白酶切割位点和接头，如示例中使用的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLTFTEEHTSAVSPSRIFKASILDANNLIPKLLPQVIKSMEFIQGTGSPGSIKQICFAEGSTLSSLKYRIDELNEETYTYNYTVIEGDALTDKLEKITHEVKLEAAPGGGTFSKVTSTYYTKGDFALKEEDVKAGKERVLGVYKVVEAYLLNNPDAYA
SEQ ID NO11(Ses iPR10-6，经His标签的序列，剪切蛋白酶切割位点和接头，如示例中使用的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLNYEDELISPVPPARLFKSLVLDGDNLIPKLLPHAFKSFQILEGHGGPGTIKLVTFADGSPYKTAKHRIDEIDEENYIYKYSVIGGDALGEDFDSMTHGFKIEVGADGGSICKTTSTFHTKGEDHVIQEKIKAGKERAKAIFKAVETHLHAHPHEYN
SEQ ID NO12(Ses iPR10-2，载体序列，如示例中使用的)：仅在序列表中
仅在序列表中
SEQ ID NO13(Ses iPR10-3，载体序列，如示例中所用)：仅在序列表中
仅在序列表中
SEQ ID NO14(Ses iPR10-4，载体序列，如示例中所用)：仅在序列表中
仅在序列表中
SEQ ID NO15(Ses iPR10-5，载体序列，如示例中所用)：仅在序列表中
仅在序列表中
SEQ ID NO16(Ses iPR10-6，载体序列，如示例中所用)：仅在序列表中
仅在序列表中
SEQ ID NO17(更特定的Ses iPR10抗原共有序列)
MGUXBUXXBXXBXUXUXBUFBXXUXDXBBUXPBXXZBXUKBUBXUBGBGZXUGBUXXXBFXBXSXUBXUKXBUBXUBBBBUXXBYBUUXGBULXXXUBBUXXXUKUXXXZZZZUGBUXBXBSXUXTXXXXXUXBEBUBXGKBBUXXUUBUUEXXLXXBUZZZZ
SEQ ID NO18(更为特定的iPR10抗原共有序列)
MGUXBUBXBXXBXUXUXBUFKXXULDXBBLXPBUUUBXUKBUBUUBGBGXUGBUBXUBFXBXSXUBXUKXBUBXUBBBBUXXBYBUUXGDALXXXUBBUXXXUKUXUXZZZZUGBUBBXBSXUXTXXXXXUXBEBUBXGKBBUXXUUBUUEXXLXXBUZZZZ
SEQ ID NO19(Ses iPR10-2变体序列，经His标签的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLTYTEEHTSAVPPARIFKASVLDADNLIPKLLPQAIKSMEILEGTGGPGTIKQICFAEGSTYKSAKHRIDEIDEENYTYNYTVIEGDALTDKLESITHEVKIEAAPDGGTICKVTSTYHTKGDFALKEEKIKAGKERALGVYKAVEAYLLANPDAYA
SEQ ID NO20(Ses iPR10-5变体序列，经His标签的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLTYDIEIPSSVPPARMFKAVVLDADNLIPKLLPQAIKSVEILEGDGGPGTIKIIHFAEGSQYKSAKHRIDEIDEENYTYSYTVIEGDALAGVLESITHHVKIEPTEDGGCICKNTSTYHTKGDVEITEEKIKAGKERAMQMLKAVEAYLQANP
SEQ ID NO21(Ses iPR10-6变体序列，经His标签的)
MSHHHHHHHHLEVLFQGPSMGVLTYEDELISPVPPARLFKALVLDADNLIPKLLPQAIKSFEILEGHGGPGTIKLITFAEGSPYKSAKHRIDEIDEENYTYKYTVIEGDALGEDLESITHGVKIEVGADGGSICKTTSTYHTKGDDHVIEEKIKAGKERAKAIFKAVEAYLHANPHEYN
SEQ ID NO22(载体序列，用于表达Ses iPR10-2变体的序列)：
仅在序列表中
SEQ ID NO23(载体序列，用于表达Ses iPR10-5变体的序列)：
仅在序列表中
SEQ ID NO24(载体序列，用于表达Ses iPR10-6变体的序列)：
仅在序列表中
SEQ ID NO25(Ses iPR10-2变体的序列)
MGVLTYTEEHTSAVPPARIFKASVLDADNLIPKLLPQAIKSMEILEGTGGPGTIKQICFAEGSTYKSAKHRIDEIDEENYTYNYTVIEGDALTDKLESITHEVKIEAAPDGGTICKVTSTYHTKGDFALKEEKIKAGKERALGVYKAVEAYLLANPDAYA
SEQ ID NO26(Ses iPR10-5变体的序列)
MGVLTYDIEIPSSVPPARMFKAVVLDADNLIPKLLPQAIKSVEILEGDGGPGTIKIIHFAEGSQYKSAKHRIDEIDEENYTYSYTVIEGDALAGVLESITHHVKIEPTEDGGCICKNTSTYHTKGDVEITEEKIKAGKERAMQMLKAVEAYLQANP
SEQ ID NO27(Ses iPR10-6变体的序列)
MGVLTYEDELISPVPPARLFKALVLDADNLIPKLLPQAIKSFEILEGHGGPGTIKLITFAEGSPYKSAKHRIDEIDEENYTYKYTVIEGDALGEDLESITHGVKIEVGADGGSICKTTSTYHTKGDDHVIEEKIKAGKERAKAIFKAVEAYLHANPHEYN
SEQ ID NO28(Ses iPR10-2/5/6共有序列)
GXXXXXXEXXSXXXXXXXFKXXXLDXXXLIPKXXPXXXKXXXXXXGXGXXGXXKXXXFXXGSXXXXXKXRXDXXXXEXXXXXYXXXXGDALXXXXXXXTXXXKXXXXXXGGXXXKXXSXXXTKGXXXXXXEXXKXGKEXXXXXXKXXEXXLXXXXXXXX
本发明通过以下非限制性实施例进一步说明，从这些实施例可以得到本发明的进一步特征、实施方案、方面和优点。
附图说明
图1显示了来自IMAC纯化的重组Ses iPR10-2、Ses iPR10-3、Ses iPR10-4、SesiPR10-5和Ses iPR10-6的1D-SDS-PAGE分析的凝胶图像。对于分析，使用4-12％梯度Bis-Tris-凝胶，然后进行考马斯染色。每个面板包含一个带有未染色蛋白标准的左侧泳道，Broad Range(New England Biolabs)和一个带有纯化的重组Ses iPR10(还原型)的右侧泳道。
图2显示了如实施例2中所述产生和显影的示例性线印迹。
图3显示了来自IMAC纯化和1D-SDS-PAGE分离的重组SesiPR10-2和Ses iPR10-6(还原型)的蛋白质印迹分析的膜条图像。对于分析，使用4-12％梯度Bis-Tris-凝胶，然后在硝酸纤维素膜上进行电印迹转移。如所示，作为一抗，每个条带与集合1血清的稀释的响应探针或集合3血清的无响应探针接触。使用抗人IgE(单克隆)抗体偶联物(碱性磷酸酶)作为二抗。对照：对于空白(B)仅使用二抗，对于His-Tag对照(H)仅使用抗多聚组氨酸(单克隆)抗体偶联物(碱性磷酸酶)。
图4显示了通过免疫印迹测定在30名对芝麻敏感的患者中测量的针对iPR-10蛋白的IgE反应性的热图。从同一个体识别的iPR-10蛋白质以行显示。响应水平以不同深浅的绿光表示EAST等级(亮绿色：最高反应性，5级；深绿色：最低反应性1级；黑色：无反应性)。
图5显示了与所示的14个芝麻阳性血清和5个阴性血清一起温育的Ses iPR10及其变体的蛋白质印迹。底框突出显示了Ses iPR10-5反应性的弱条带。
具体实施方式
实施例1：
使用标准分子生物学方法，Ses iPR10-1(SEQ ID NO:5)、Ses iPR10-2(SEQ IDNO:7)、Ses iPR10-3(SEQ ID NO:18)、Ses iPR10-4(SEQ ID NO:30)、Ses iPR10-5(SEQ IDNO:10)和Ses iPR10-6(SEQ ID NO:29)的每个编码区通过商业基因合成从头产生，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并亚克隆进入表达pET24d，产生由SEQ ID NO12(Ses iPR10-2)、SEQ ID NO13(Ses iPR10-3)、SEQ ID NO14(Ses iPR10-4)、SEQ ID NO15(Ses iPR10-5)和SEQ ID NO 16(Ses iPR10-6)表示的载体。
如EP3754337所述在转化到E.coli中并选择阳性克隆之后，Ses iPR-10多肽表达为由所述SEQ ID NO7(Ses iPR10-2)、SEQ ID NO8(Ses iPR10-3)、SEQ ID NO9(Ses iPR10-4)、SEQ ID NO10(Ses iPR10-5)和SEQ ID NO11(Ses iPR10-6)表示的His-标记的N-末端融合蛋白，并通过金属亲和色谱法(HiTrap IMAC HP)纯化(产品#17092005，Cytvia)。通过质谱和一维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-SDS-PAGE)(NP0321PK2，ThermofisherScientific Inc.)控制纯度，如图1所示分析3μg重组蛋白。
实施例2：线印迹分析
除非另有说明，否则所有描述的工艺步骤均在室温18至25℃下进行。
线印迹如下制造：通过使用精密分配器(可从Zeta Corporation购得)，将每种本发明的Ses iPR10蛋白作为均质线转移至膜(硝酸纤维素或尼龙，(可从Whatman购得))。根据制造商的说明，将印迹封闭、清洗并切成3毫米长的条带。示例性线印迹如图2所示。
按照制造商(欧蒙医学实验诊断股份公司，吕贝克，德国)说明(产品编号DP 3110-1601E)中的建议对EUROLINE条带进行温育。详细地说，将条带与0.88或1.1ml的1/11稀释的患者样品在工作强度通用缓冲液(ZD 1129-0101E，EUROMMUN)中温育16小时。随后吸出上清液，用1ml工作强度通用缓冲液将条带洗涤3次，每次5分钟，然后与与碱性磷酸酶(ZD 1129-0101E，EUROMMUN)偶联的抗人IgE抗体温育1小时。之后，吸出上清液，再次用1ml工作强度通用缓冲液洗涤条带3次，每次5分钟。为了染色，将条带与1ml显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/4-硝基蓝四唑氯化物(NBT)溶液(ZD 1129-0101E,EUROMMUN)温育10分钟，然后吸出上清液，用蒸馏水淬灭反应。
使空白对照以相同方式温育，但仅温育工作强度通用缓冲液而不是稀释血清。
扫描条带并使用
Figure BDA0003794659540000402
软件(EUROMMUN)评估条带的信号强度。
检查了对芝麻变应原提取物具有IgE反应性的预表征的血清(n＝15)和对芝麻变应原提取物没有IgE反应性的非致敏患者(n＝10)。
结果总结在表1中，更具体地说是可检测到的与芝麻提取物反应的样品的数量，所述芝麻提取物中存在针对相应Ses iPR-10变应原(即Ses iPR-10-2、Ses iPR-10-3、SesiPR-10-4、Ses iPR-10-5、Ses iPR-10-6)的抗体。此外，显示了不与芝麻提取物反应的样品的数量，所述芝麻提取物中存在针对相应Ses iPR-10变应原的抗体。
Figure BDA0003794659540000401
这些结果表明，发明人现在已经将由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原识别为芝麻提取物在患者中的免疫反应性成分。五种示例性Ses iPR-10变应原，称为Ses iPR-10-2、Ses iPR-10-3、Ses iPR-10-4、Ses iPR-10-5和Ses iPR-10-6，被表达并使用线分析显示为是反应性的。
在五种Ses iPR-10变应原中，当使用Ses iPR-2和Ses iPR-6时检测到特别强烈的反应。
有趣的是，第一组中的至少两个样品与至少一种Ses iPR-10变应原反应，但不与常规变应原Bet v 1和Cor a 1反应，表明本发明的教导也可用于增加辅助诊断PR-10过敏的方法的敏感性。
实施例3：蛋白质印迹分析
除非另有说明，所有描述的工艺步骤均在室温下进行。对于蛋白质印迹(WB)分析，通过1D-SDS-PAGE(NP0321PK2,Thermofisher Scientific Inc.)在制造商所述的还原条件下将8μg/cm重组Ses iPR10-2或Ses iPR10-6蛋白(还原的)在4-12％的梯度Bis-Tris-gels中分离，并使用制造商(Thermo Fisher)提供的Fast Blotter系统将其印迹到硝酸纤维素膜上。随后用Ponceau-S(Ponceau S溶液(ab270042，abcam，柏林，德国))对蛋白质进行染色。将膜切成3mm的条带，并用0.4ml工作强度通用缓冲液洗涤15分钟。将血清用工作强度通用缓冲液按1/11(v/v)稀释。每个条带分别与0.4ml稀释的患者样品接触16小时。吸出上清液，用0.4ml工作强度通用缓冲液洗涤条带3次，每次5分钟。随后，用0.4ml与碱性磷酸酶偶联的抗人IgE抗体(ZD 1129-0101 E，EUROMMUN)温育所述条带。之后，吸出上清液并如前所述再次洗涤条带。对于染色条，用0.4ml显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/4-硝基蓝四唑氯化物溶液(ZD 1129-0101 E,EUROIMMUN)温育10分钟。通过用蒸馏水温育所述条带来淬灭反应。将空白对照以相同的方式温育，但仅温育工作强度通用缓冲液而不是稀释血清。
对于His-Tag对照条带，用工作强度通用缓冲液温育15分钟，然后用0.4ml以1:8000(v/v)在工作强度通用缓液中稀释的与碱性磷酸酶(ab81652，abcam)偶联的抗多聚组氨酸抗体温育。之后，吸出上清液并如前所述再次洗涤条带。对于染色条，用0.4ml显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/4-硝基蓝四唑氯化物溶液(ZD 1129-0101 E,EUROMMUN)温育10分钟。通过用蒸馏水温育所述条带来淬灭反应。
条带被扫描和评估。结果如图3所示。
蛋白质印迹膜条与来自实施例2的反应性血清的患者样品(对于Ses iPR10-2，n＝8，对于Ses iPR10-6，n＝8)一起温育。在来自8个阳性血清样品中的7个，可以检测到针对Ses iPR10-2的抗体。在来自8个阳性血清样品中的8个，可以检测到针对Ses iPR10-6的抗体。
此外，芝麻非致敏患者(n＝5)的血清与蛋白质印迹膜条一起温育。在所有样品中均未检测到针对Ses iPR10-2和Ses iPR10-6中至少一种的抗体。
单独的空白条带在没有一抗仅与偶联二抗接触的情况下温育。在所有样品中均未检测到针对Ses iPR10-2和Ses iPR10-6中至少一种的抗体。
用于His-Tag检测的单独条带仅与抗多聚组氨酸抗体一起温育。可以检测到SesiPR10-2和Ses iPR10-6的多聚组氨酸标签。
实施例4：基于更大的患者队列的线印迹分析
使用来自对芝麻敏感的患者的30种特征血清重复实施例2中所概述的实验程序。结果如图4所示。也使用了阴性血清，但没有反应。
60％的患者血清与Ses iPR10-6反应，33％的血清与Ses iPR10-5反应，46％的血清与Ses iPR10-2反应。Ses iPR10-4和Ses iPR10-3仅观察到微弱反应(反应性根据EAST等级不超过1级)。
所有对Ses iPR10-6、Ses iPR10-5或Ses iPR10-2中的任何一种显示反应的血清都与Ses iPR10-6反应，尽管一些血清对Ses iPR10-2的反应性比对Ses iPR10-6的反应性更高。只有一名患者对Ses iPR10-3表现出根据EAST的3级反应性。
这些结果表明，Ses iPR10-6是所用变应原中反应性最强的，其次是Ses iPR10-5和Ses iPR10-2。与单独使用Ses iPR10-6相比，Ses iPR10-6可以与Ses iPR10-2结合使用，以提高灵敏度。
实施例5：Ses iPR变体的蛋白质印迹分析
为了证明分别衍生自Ses iPR10-2和Ses iPR10-5、SEQ ID NO19和SEQ ID NO20的野生型序列的变体的反应性，除了Ses iPR10-2、Ses iPR10-5和Ses iPR10-6的野生型蛋白，使用来自芝麻致敏患者的14份血清和5份阴性血清来重复实施例3。如实施例1所述表达蛋白质。
结果显示在图5中。不仅可以用野生型序列证明反应性，还可以用Ses iPR10-2和Ses iPR10-5的变体证明反应性。初步数据还显示与Ses iPR10-6变体(SEQ ID NO21)有一定程度的反应性。
结果表明不仅野生型蛋白而且变体都可以用于实践本发明。
Figure IDA0003794659620000011
Figure IDA0003794659620000021
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Claims (16)

1.一种包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体，其中所述多肽是分离的、纯化的或固定的。
2.一种诊断有用的载体，其包含根据权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的载体，其中所述载体选自包括以下各项的组：珠子，测试条，微量滴定板，塑料表面，优选聚苯乙烯表面，支化的纤维素基聚合物，微阵列，印迹，优选选自包括蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹的组，玻璃表面，载玻片，生物芯片和膜，最优选微量滴定板或线印迹。
4.根据权利要求2至3中任一项所述的载体，其中所述多肽与来自患者样品的抗体复合，所述抗体优选IgG，更优选IgG4，或IgE类抗体。
5.一种包含根据权利要求2至4中任一项所述的载体的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含有以下各项的组的一项或多项、优选所有项：用于使所述诊断有用的载体与所述样品接触的合适的水密性容器，阴性对照，阳性对照，校准物，优选一组校准物，洗涤缓冲液，稀释缓冲液，用于检测针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的工具，所述抗体优选IgG和/或IgE类抗体，其中所述抗体优选是哺乳动物，更优选人抗体，针对由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体，用于捕获抗体的工具，所述抗体优选IgG和/或IgEs抗体，更优选人，以及包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽，优选具有可检测标记。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的载体或试剂盒，其中所述载体是包含空间上分开的试剂的测试条，所述试剂包括由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，以及选自包含以下各项的组的一项或多项：一种或多种校准物、抗CCD-IgE对照、指示存在二抗(优选识别IgG、更优选识别IgG4或IgE类抗体的二抗)的试剂、指示带和一种或更多校准或截止带。
7.一种药物组合物，其包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，优选还包含佐剂。
8.一种诊断或辅助诊断过敏症的方法，其包括在来自受试者的样品中检测是否存在特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述样品选自包括全血、唾液、血清和血浆的组。
10.一种方法，其包括以下步骤：使包含多肽的医疗或诊断装置与包含抗体的缓冲溶液接触，所述多肽包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原或其变体，所述抗体特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原，其中所述缓冲溶液不是来自需要诊断的患者的、包含未知浓度的所述抗体的样品，其中优选
a)溶液中所述抗体的浓度是已知的，和/或
b)所述抗体是重组抗体和/或
c)使医疗或诊断装置与包含所述抗体的两种或更多种溶液接触，其中所述两种或更多种溶液具有不同浓度的所述抗体，和/或
d)所述抗体被与IgE类抗体特异性结合的二抗识别，
随后检测指示所述抗体是否与所述多肽结合的信号，任选地检测与所述一种或多种溶液中所述抗体的浓度相关的信号。
11.包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或其变体、根据权利要求1至6中任一项所述的多肽、载体或试剂盒用于检测特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体的用途。
12.包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体或根据权利要求3、4或6中任一项的载体，用于制造诊断试剂盒的用途。
13.包含由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的多肽或特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原的抗体或根据权利要求3、4或6中任一项的载体，用于诊断或辅助诊断过敏症的用途。
14.根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5或6中任一项所述的试剂盒或根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgE或IgG类抗体。
15.根据权利要求8至13中任一项所述的方法或用途，其中使用选自包括以下各项的组中的方法检测所述抗体：免疫扩散，免疫电泳，光散射，凝集，标记免疫测定，优选选自放射性标记免疫测定，酶免疫测定如比色测定，化学发光，优选电化学发光免疫测定和免疫荧光免疫测定。
16.一种富集的、分离的、稀释的或纯化的抗体，优选IgE或IgG类抗体，或重组抗体，所述抗体特异性结合由SEQ ID NO1表征的来自芝麻的Ses iPR-10变应原，其中所述抗体优选以非生理浓度处于包含人工缓冲液或天然缓冲液的溶液中。
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