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CN1159019C - 可提取物化合物以及其制备方法和用途 - Google Patents

可提取物化合物以及其制备方法和用途 Download PDF

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CN1159019C CNB971951810A CN97195181A CN1159019C CN 1159019 C CN1159019 C CN 1159019C CN B971951810 A CNB971951810 A CN B971951810A CN 97195181 A CN97195181 A CN 97195181A CN 1159019 C CN1159019 C CN 1159019C
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Abstract

公开和在权利要求中要求保护的是可可提取物，化合物及其组合和含有相同物质如多酚类或矢车菊苷配质的组合物；制备此类提取物，化合物和组合物的方法及其用途；特别是式An的聚合化合物以及其药学上可接受的盐或衍生物(包含氧化产物)，其中A是式(I)的单体，其中n是2-18的整数，从而至少有一个末端单体单元A和一个或多个附加单体单元；R是3-(α)-OH，3-(β)-OH，3-(α)-O-糖，3-(β)-O-糖；邻近单体的键合发生在4，6或8位；附加单体单元在4位的键有α或β立体化学；X，Y和Z选自单体单元A，氢和糖，条件是附加单体单元在4位键合于该至少一个末端单体单元(邻近末端单体单元的附加单体单元的键合)并且任选地Y＝Z＝氢；糖可任选地在任何位置例如通过酯键被酚性部分取代。

Description

可提取物化合物以及其制备方法和用途
相关申请的参考
参考文献是共同未决的1996年9月6日申请的U.S.申请号08/709，406、1996年4月2日申请的08/631，661和1994年10月3日申请的08/317，226(U.S.专利号5,554，645)和PCT/US 96/04497，这些文献在此引入以供参考。
发明领域
本发明涉及可可提取物和因此得到的化合物例如多酚类，优选富含矢车菊苷配质的多酚类。本发明还涉及制备这样的提取物和化合物的方法以及其用作抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂、NO(一氧化氮)或NO合酶调制剂，或者作为非甾类抗炎剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体液葡萄糖调制剂、抗菌剂和氧化性DNA损伤的抑制剂。
在本发明中在每篇文献出现的地方充分引述这些文献或者在说明书的结尾处权利要求书之前的参考文献部分引用。这些文献属于本发明的范围；这里引用的每篇文献在此引入以供参考。
背景技术
多酚类是一组广泛出现在各种不同植物中的非常不同的化合物(Ferreira等，1992)，其中一些植物进入食物链。在一些情况下，它们代表一类重要的用于人类饮食的化合物。虽然一些苯酚被认为是无营养的，但是对这些化合物的兴趣逐渐增高，因为它们可能对健康产生有益作用。
例如，已表明栎精(一种类黄酮)在试验用动物体中具有抗癌活性(Deshner等，1991和Kato等，1983)。业已表明(+)-儿茶酸和(-)-表儿茶酸(黄烷-3-醇类)可以抑制白血病病毒逆转录酶活性(Chu等，1992)。同样已表明Nobotainin(一种低聚可水解的鞣酸)具有抗肿瘤活性(Okuda等，1992)。同样统计报告显示，日本的茶叶生产地区的胃癌死亡率明显低。业已报道过表棓儿茶酸孔棓酸盐是一种绿茶中的抑制小鼠皮肤癌的药理学活性物质(Okua等，1992)。已表明鞣花酸在各种动物模型中具有抗癌因子活性(Bukharta等，1992)。最近，Kikkoman公司已获得原花色素寡聚物作为抗诱变剂用途的专利。实际上，最近在美国化学协会第202次全国会议中已经提出食物中酚类化合物的领域和它们在试验用动物模型中对肿瘤扩散的调制作用(Ho等，1992；Huang等，1992)。
然而，这些报告均没有教导或建议可可提取物或因此得到的化合物、制备这样的提取物和因此得到的化合物的方法，或者可可提取物或因此获得的化合物作为例如抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂、NO(氧化一氮)或NO合酶调制剂，或者作为非甾类抗炎剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体液葡萄糖调制剂、抗微生物剂和氧化性DNA损伤的抑制剂的用途。
目标和发明概述
因为未发酵的可可豆包含大量的多酚类，所以本发明人认为可能通过从可可中提取可可提取物，即可可中的化合物，和筛选该提取物的活性可以使该提取物显示出类似的活性和用途。国家癌症研究所已经筛选了各种不同的用于抗癌活性的可可权属(Theobroma)和Herrania属作为他们庞大的天然产物选择计划的一部分。报道过在一些可可组织的提取物中具有低水平的活性，并且该工作没有继续进行。因此，在抗肿瘤或抗癌手段中，不认为可可和其提取物是有用的；也就是说，在抗肿瘤或抗癌手段中的教导误导本领域技术人员在癌症治疗中不使用可可和其提取物。
因为已提供许多分析步骤研究可可多酚类对调料发展的贡献(Clapperton等，1992)，所以，与抗肿瘤或抗癌手段中的知识相反，本发明人决定采用类似的方法来制备抗癌筛选的样品。令人惊奇地，与现有技术中的知识例如国家癌症研究所的筛选相反，本发明人发现包含矢车菊苷配质的可可多酚提取物作为抗癌剂和抗肿瘤剂具有显著的效用。
此外，本发明人证明，含矢车菊苷配质的可可提取物和由可可提取物获得的化合物可以作为抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂、NO(氧化一氮)或NO合酶调制剂，或者作为非甾类抗炎剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体液葡萄糖调制剂、抗菌剂和氧化性DNA损伤的抑制剂。
本发明的一个目的是提供一种制备可可提取物和/或因此得到的化合物的方法。
本发明的另一目的是提供一种可可提取物和/或因此得到的化合物。
本发明的又一目的是提供一种式An的聚合化合物和其药物学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物)，其中A是具有结构式
Figure C9719518100261
的单体，n是2～18的整数，这样至少存在一个末端单体单元A和多个附加单体单元；
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
相邻单体之间的键合发生在4、6或8位上；
在4位中附加单体单元的键具有α或β立体化学；
X、Y和Z选自单体单元A、氢和糖，但条件是对于至少一个末端单体单元来说，在此键合的附加单体单元在4位上以及Y＝Z＝氢；
糖任选地在任何位置上例如通过酯键被酚部分取代。
本发明的又一目的是提供一种式An的聚合化合物和其药物学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物)，其中A是具有结构式
Figure C9719518100271
的单体，n是2～18的整数，例如3～18；
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
相邻单体通过(4→6)或(4→8)键合在4位上；
在4位上的键具有α或β立体化学；
X、Y和Z各自是氢、糖或相邻单体，但条件是，如果X和Y是相邻单体，那么Z是H或糖，如果X和Z是相邻单体，那么Y是H和糖，并且对于二个末端单体至少之一来说，相邻单体的键合在4位上以及任选地，Y＝Z＝氢；
4位上的键有α或β立体化学。
糖任选地在任何物质上例如通过酯键被酚部分取代。
本发明的另一目的是提供一种抗氧化组合物。
本发明的又一目的是证明对DNA拓扑异构酶II酶活性的抑制作用。
本发明的目的还在于提供一种治疗肿瘤或癌症的方法。
本发明的目的还在于提供一种抗癌、抗瘤或抗肿瘤组合物。
本发明的又一目的是提供一种抗微生物组合物。
本发明的又一目的是提供一种环加氧酶和/或脂氧化酶调制组合物。
本发明的又一目的是提供一种NO或NO合酶调制组合物。
本发明的又一目的是提供一种非甾类抗炎组合物。
本发明的又一目的是提供一种血液或体液葡萄糖调制组合物。
本发明的目的还在于提供一种使用抗肿瘤、抗氧化、抗微生物、环加氧酶和/或脂氧化酶调制或NO或NO合酶调制、非甾类抗炎调制和/或血液或体液葡萄糖调制组合物治疗患者的方法。
本发明的附加目的是提供一种抑制氧化性DNA损伤的组合物和方法。
本发明的又一目的是提供一种血小板聚集调制的组合物和方法。
本发明的又一目的是提供一种编程性细胞死亡调制的组合物和方法。
本发明的又一目的是提供一种制备上述任何组合物的方法。
本发明的目的还在于提供一种在上述方法中使用的或用于制备上述组合物的试剂盒
已令人惊奇地发现，可可提取物和因此得到的化合物具有抗瘤、抗癌和抗肿瘤活性，或者是一种抗氧化组合物，或者抑制DNA拓扑异构酶II酶活性，或者是抗微生物剂，或者是一种环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂，或者是NO或NO合酶调制剂，或者是非甾类抗炎剂，是编程性细胞死亡调制剂，是血小板聚集调制剂，或者是血液或体液葡萄糖调制剂，或者是氧化性DNA损伤的抑制剂。
相应地，本发明提供一种基本上纯的可可提取物和由此得到的化合物。该提取物或化合物优选包括多酚类例如富含可可矢车菊苷配质的多酚(类)，例如至少一种可可矢车菊苷配质选自(-)表儿茶酸、(+)儿茶酸、矢车菊苷配质B-2、矢车菊苷配质寡聚物2～18，例如3～18，如2～12或3～12，优选2～5或4～12，更优选3～12，最优选5～12，矢车菊苷配质B-5、矢车菊苷配质A-2、矢车菊苷配质C-1。
本发明还提供一种由基本上纯的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚类例如富含矢车菊苷配质的多酚类和合适载体例如药物学、兽医学或食品科学上可接受的载体组成的抗瘤、抗癌和抗肿瘤剂，或者抗氧化剂，或者DNA拓扑异构酶II酶抑制剂，或者抗微生物剂，或者环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂，或者NO或NO合酶调制剂，非甾类抗炎剂，编程性细胞死亡调制剂，血小板聚集调制剂，血液或体液葡萄糖调制剂，或者氧化性DNA损伤的抑制剂的组合物。该提取物和由此得到的化合物优选包括可可矢车菊苷配质。该可可提取物或由此得到的化合物优选是通过如下方法得到，该方法包括将可可豆磨成粉末，使该粉末脱脂，从该粉末中提取活性化合物并纯化。
本发明还包括一种使用抗瘤、抗癌和抗肿瘤剂，或者抗氧化剂，或者DNA拓扑异构酶II酶抑制剂，或者抗微生物剂，或者环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂，或者NO或NO合酶调制剂，非甾类抗炎剂，编程性细胞死亡调制剂，血小板聚集调制剂，血液或体液葡萄糖调制剂，或者氧化性DNA损伤的抑制剂治疗需要治疗的患者的方法，该方法包括给患者施用一种由有效量的基本上纯的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚或矢车菊苷配质和一种载体，例如药物学、兽医学或食品科学上可接受的载体。可可提取物或由此得到的化合物可以是可可矢车菊苷配质；优选是通过将可可豆磨成粉末，使该粉末脱脂，并从该粉末中提取活性化合物并纯化而获得的。
此外，本发明提供一种使用抗瘤、抗癌和抗肿瘤剂，或者抗氧化剂，或者DNA拓扑异构酶II酶抑制剂，或者抗微生物剂，或者环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂，或者NO或NO合酶调制剂，非甾类抗炎剂，编程性细胞死亡调制剂，血小板聚集调制剂，血液或体液葡萄糖调制剂，或者氧化性DNA损伤的抑制剂治疗需要治疗的患者的试剂盒，其包括基本上纯的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚或矢车菊苷配质和一种合适于与提取物或由此得到的化合物或合成多酚或矢车菊苷配质混合的载体，例如药物学、兽医学或食品科学上可接受的载体。
本发明提供一种在附图38A～38P和39A～39AA中所示的化合物；目前优选4→6和4→6的连锁。
本发明进一步包括含本发明化合物的食品防腐和制备组合物，以及通过在食品中添加该组合物来制备或防腐食品的方法。
以及，本发明还包括含本发明化合物和合适载体或稀释剂的DNA拓扑异构酶II抑制剂，以及通过施用该组合物来治疗需要治疗的患者的方法。
概括地，鉴于上述包括可可提取物的实施方案，本发明也包括这样的实施方案，其中使用本发明的化合物代替或作为可可提取物。因此，本发明包括试剂盒、方法和类似于那些上述与可可提取物和本发明化合物有关的组合物的组合物。
下面的详细说明公开了这些和其它目的和实施方案或将使它们更清楚。
附图简述
参照附图将更好地理解下面的详细说明，在附图中：
附图1表示粗可可矢车菊苷配质级分的代表性凝胶渗透层析谱；
附图2A是表示从未发酵的可可中提取的可可矢车菊苷配质分离的代表性反相HPLC层析图(洗脱图)；
附图2B表示从未发酵的可可中提取的可可矢车菊苷配质的代表性正相HPLC分离；
附图3表示几个代表性的矢车菊苷配质结构；
附图4A～4E表示在抗癌或抗肿瘤活性的筛选中采用的5个级分的代表性HPLC层析图；
附图5和6A～6D表示可可提取物和癌细胞ACHN(附图5)和PC-3(附图6A～6D)之间的剂量-反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；M&M2 F4/92、M&MA+E U12P1、M&MB+E Y192P1、M&MC+E U12P2、M&MD+E U12P2；
附图7A～7H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、A+B、A+E和A+D与PC-3细胞系之间的典型剂量反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；MM-1 A 0212P3、MM-1 B 0162P1、MM-1 C0122P3、MM-1 D 0122P3、MM-1 E 0292P8、MM-1 A/B 0292P6、MM-1 A/E 0292P6、MM-1 A/D 0292P6；
附图8A～8H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、A+B、B+E和D+E与KB鼻咽/Hela系之间的典型剂量反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；MM-1 A 092K3、MM-1 B 0212K5、MM-1 C0162K3、MM-1 D 0212K5、MM-1 E 0292K5、MM-1 A/B 0292K3、MM-1 B/E 0292K4、MM-1 D/E 0292K5；
附图9A～9H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、B+D、A+E和D+E与HCT-116细胞系之间的典型剂量反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；MM-1 C 0192H5、D 0192H5、E 0192H5、MM-1 B&D 0262H2、A/E 0262H3、 MM-1 D&E 0260H1；
附图10A～10H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、B+D、C+D和A+E与ACHN肾细胞系之间的典型剂量反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；MM-1A 092A5、MM-1 B 092A5、MM-1 C0192A7、MM-1D 0912A7、M&M1 E 0912A7、MM-1 B&D0302A6、MM-1 C&D 0302A6、MM-1 A&E 0262A6；
附图11A～11H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、A+E、B+E和C+E与A-549肺细胞系之间的典型剂量反应关系(级分存活/剂量，微克/毫升)；MM-1 A 019258、MM-1 B 09256、MM-1 C019259、MM-1 D 091258、MM-1 E 091258、A/E 026254、MM-1B&E 030255、MM-1 C&E N6255；
附图12A～12H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、B+C、C+D和D+E与SK-5黑色瘤细胞系之间的典型剂量反应关系(残存级分/剂量，微克/毫升)；MM-1A 0121S4、MM-1 B 0121S4、MM-1C 0121S4、MM-1 D 0121S4、MM-1 E N32S1、MM-1 B&C N32S2、MM-1 C&D N32S3、MM-1 D&E N32S3；
附图13A～13H表示可可矢车菊苷配质级分A、B、C、D、E、B+C、C+E和D+E与MCF-7乳腺细胞系之间的典型剂量反应关系(级分存活/剂量，微克/毫升)；MM-1 A N22M4、MM-1 B N22M4、MM-1C N22M4、MM-1 D N22M3、MM-1 E 0302M2、MM-1 B/C0302M4、MM-1 C&E N22M3、MM-1 D&E N22M3；
附图14表示可可矢车菊苷配质(特别是级分D)与CCRF-CEM T-细胞白血病细胞系之间的典型剂量反应关系(细胞/mL/生长天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是125μg的级分D，空心倒三角是250μg的级分D，实心倒三角是500μg的级分D)；
附图15A表示XTT和抗使用级分D+E处理的MCF-7 p168肺癌细胞的结晶紫细胞毒性鉴定的对比(空心圆圈是XYY，实心圆圈是结晶紫)；
附图15B表示从使用各种水平的来自UIT-1可可基因型的粗多酚处理的MDA MB231肺癌细胞系得到的典型剂量反应曲线(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是载体，空心倒三角是250μg/mL，实心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板读数器的最大值，并且不一定表示细胞数目)；
附图15C表示从使用各种水平的来自UIT-1可可基因型的粗多酚处理的PC-3前列腺癌细胞系得到的典型剂量反应曲线(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是载体，空心倒三角是250μg/mL，实心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL)；
附图15D表示从使用各种水平的来自UIT-1可可基因型的粗多酚处理的MCF-7 p168乳腺癌细胞系得到的典型剂量反应曲线(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是载体，空心倒三角是250μg/mL，实心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL，实心正方形是1μg/mL；吸光度2.0是板读数器的最大值，并且不一定表示细胞数目)；
附图15E表示从使用各种水平的来自UIT-1可可基因型的粗多酚处理的海拉子宫癌细胞系得到的典型剂量反应曲线(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是载体，空心倒三角是250μg/mL，实心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板读数器的最大值，并且不一定表示细胞数目)；
附图15F表示抗使用不同可可多酚级分处理的Hela子宫癌细胞系的细胞毒性作用(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是100μg/mL级分A-E，实心圆圈是100μg/mL级分A-C，空心倒三角是100μg/mL级分D&E；吸光度2.0是板读数器的最大值，并且不一定表示细胞数目)；
附图15G表示抗使用不同可可多酚级分处理的SKBR-3乳腺癌细胞系的细胞毒性作用(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是级分A-E，实心圆圈是级分A-C，空心倒三角是级分D&E)；
附图15H表示可可矢车菊苷配质级分D+E和Hela之间的典型剂量反应关系(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是100μg/mL，空心倒三角是75μg/mL，实心倒三角是50μg/mL，空心正方形是25μg/mL，实心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板读数器的最大值，并且不表示细胞数目)；
附图15I表示可可矢车菊苷配质级分D+E和SKBR-3细胞之间的典型剂量反应关系(吸光度(540纳米)/天数；空心圆圈是对照物，实心圆圈是100μg/mL，空心倒三角是75μg/mL，实心倒三角是50μg/mL，空心正方形是25μg/mL，实心正方形是10μg/mL)；
附图15J表示可可矢车菊苷配质级分D+E和使用软琼脂克隆鉴定的Hela之间的典型剂量反应关系(柱状图表；菌落数目/对照物，1、10、50和100μg/mL)；
附图15K表明当使用从8种不同的可可基因型中获得的粗多酚提取物处理Hela时对Hela生长的抑制(％控制率/浓度，μg/mL；空心圆圈是C-1，实心圆圈是C-2，空心倒三角是C-3，实心倒三角C-4，空心正方形是C-5，实心正方形是C-6，空心三角是C-7，实心三角C-8；C-1＝UF-12：园艺学品种＝Trinitario，并且是UF-12(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-2＝NA-33：园艺学品种＝Forastero，并且是NA-33(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-3＝EEG-48：园艺学品种＝Forastero，并且是EEG-48(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-4＝未知的：园艺学品种＝Forastero，并且是未知的(西非)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-5＝UF-613：园艺学品种＝Trinitario，并且是UF-613(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-6＝ICS-100：园艺学品种＝Trinitario(尼加拉瓜Criollo祖先)，并且是ICS-100(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-7＝ICS-139：园艺学品种＝Trinitario(尼加拉瓜Criollo祖先)，并且是ICS-139(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；C-8＝UIT-1：园艺学品种＝Trinitario，并且是UIT-1(马来西亚)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可碱的)；)；
附图15L表示当使用从发酵可可豆和干可可豆获得的粗多酚提取物处理时对Hela生长的抑制(完整的发酵步骤和太阳干燥；％对照物/浓度，μg/mL；空心圆圈是零天的级分，实心圆圈是1天的级分，空心倒三角是2天的级分，实心倒三角是3天的级分，空心正方形是4天的级分和实心正方形是9天的级分)；
附图15M表示酶氧化的可可矢车菊苷配质抗Hela的作用(多酚氧化酶处理的粗可可多酚的剂量反应；％对照物/浓度，μg/mL；实心正方形是粗UIT-1(具有咖啡因和可可碱)，空心圆圈是粗UIT(无咖啡因和可可碱)和实心圆圈是粗UIT-1(多酚氧化酶催化的))；
附图15N表示复合可可矢车菊苷配质级分D和E的代表性的半制备规模的反相HPLC分离；
附图15O表示粗可可多酚提取物的代表性正相半制备规模HPLC分离；
附图16表示与合成抗氧化剂BHA和BHT相比可可矢车菊苷配质提取物和级分的典型Rancimat氧化曲线(任意单位/时间；点划线和十字(+)是BHA和BHT；*是D-E；×是粗的；空心正方形是A-C；和空心菱形是对照物)；
附图17表示一种显示通过可可矢车菊苷配质级分对拓扑异构酶II催化的动质体DNA去链状排列抑制的典型琼脂糖凝胶(泳道1包括0.5μg的标记(M)单体长度的动质体DNA环；泳道2和20包括在存在4％DMSO但无任何可可矢车菊苷配质存在时与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA。(对照物-C)；泳道3和4包括在0.5h和5.0μg/mL可可矢车菊苷配质级分A存在下与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA；泳道5和6包括在0.5和5.0μg/mL可可矢车菊苷配质级分B存在下与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA；泳道7、8、9、13、14和15是在0.05、0.5和5.0μg/mL可可矢车菊苷配质级分D存在下与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA的复制物；泳道10、11、12、16、17和18在0.05、0.5和5.0μg/mL可可矢车菊苷配质级分D存在下与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA的复制物；泳道19是在5.0μg/mL可可矢车菊苷配质级分E存在下与拓扑异构酶II一起保温的动质体DNA的复制物；)
附图18表示可可矢车菊苷配质级分D抗DNA修复感受态和缺损细胞系的剂量反应关系(残存级分/μg/mL；左侧xrs-6 DNA缺损修补细胞系，MM-1 D D282X1；右侧BRI感受态DNA修补细胞系，MM-1 DD282B1)；
附图19表示当使用可可级分D+E处理时与MCF-7 p168亲代细胞系相比抗阿霉素MCF-7细胞的剂量反应曲线(％控制率/浓度，μg/mL；开环是MCF-7 p168；实心圆圈是MCF-7 ADR)；
附图20A和B表示使用100μg/mL和25μg/mL水平的通过正相半制备型HPLC制备的十二种级分处理时Hela和SKBR-3的剂量反应效果(柱状图表，％控制率/对照物和级分1-12)；
附图21表示由可可提取物制备的粗的、富集的和纯化的五聚物的正相HPLC分离；
附图22A、B和C分别表示富含矢车菊苷配质的五聚物、级分A-C和级分D-E的MALDI-TOF/MS；
附图23A表示通过改进的半制备型HPLC纯化的低聚矢车菊苷配质的洗脱图；
附图23B表示通过改进的半制备型HPLC纯化的三聚物矢车菊苷配质的洗脱图；
附图24A-D各表示所有的基于表儿茶酸结构的(4-8)键合的五聚物的能量最低结构；
附图25A表示在用苄硫醇进行硫解作用时表儿茶酸的相对荧光性；
附图25B表示在用苄硫醇进行硫解作用时儿茶酸的相对荧光性；
附图25C表示在用苄硫醇进行硫解作用时二聚物(B2和B5)的相对荧光性；；
附图26A表示在硫解作用时二聚物的相对荧光性；
附图26B表示在二聚物硫解和随后脱硫时B5二聚物的相对荧光性；
附图27A表示在使用五聚物处理MDA MB 231裸鼠模型期间相对肿瘤体积；
附图27B表示使用五聚物处理的MDA MB 231裸鼠模型的相对存活率曲线；
附图28表示来自可可提取物的矢车菊苷配质的丙酮萃取物的无卤素分析分离的洗脱图；
附图29表示用于矢车菊苷配质的正相HPLC分离的固定相的孔径尺寸的作用；
附图30A表示在可可豆发酵期间底物的利用；
附图30B表示发酵期间代谢物的生成；
附图30C表示在可可豆发酵期间板读数；
附图30D表示在可可豆的发酵溶液中各组分的相对浓度；
附图31表示NO相关的脱羟肾上腺素-预收缩鼠主动脉的乙酰胆碱诱导松弛；
附图32表示来自各种试验混合物的血糖耐受性图；
附图33A-B表示吲哚美辛对COX-1和COX-2活性的影响；
附图34A-B表示聚合程度和IC50/COX-1/COX-2之间的相关性(μM)；
附图35表示化合物对COX-1和COX-2活性的影响之间的相关性(μM)；
附图36A-V表示含矢车菊苷配质和COX-1/COX-2的样品的IC50值(μM)；
附图37表示用于从可可中分离矢车菊苷配质的提纯流程图；
附图38A-38P表示五聚物的优选结构；
附图39A-AA表示五聚物的立体异构体库；
附图40A-B表示矢车菊苷配质的正相HPLC分离的70分钟的梯度，分别通过UV和荧光测定；
附图41A-B表示矢车菊苷配质的正相HPLC分离的30分钟的梯度，分别通过UV和荧光测定；
附图42表示矢车菊苷配质的制备型正相HPLC分离；
附图43A-G分别表示矢车菊苷配质二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的CD(圆二色性)图谱
附图44A表示表儿茶酸的结构和1H/13C NMR数据；
附图44B-F表示表儿茶酸的APT、COSY、XHCORR、1H和13CNMR图谱；
附图45A表示儿茶酸的结构和1H/13C NMR数据；
附图45B-E表示儿茶酸的1H、APT、XHCORR和COSY NMR图谱；
附图46A表示B2二聚物的结构和1H/13C NMR数据；
附图46B-G表示B2二聚物的13C、APT、1H、HMQC、COSY和HOHAHA NMR图谱；
附图47A表示B5二聚物的结构和1H/13C NMR数据；
附图47B-G表示B5二聚物的1H、13C、APT、COSY、HMQC和HOHAHA NMR图谱；
附图48A-D表示表儿茶酸/儿茶酸三聚物的1H、COSY、HMQC和HOHAHA NMR图谱；
附图49A-D表示表儿茶酸三聚物的1H、COSY、HMQC和HOHAHA NMR图谱；
附图50A和B表示可可矢车菊苷配质级分A和C分别对血压的影响；在施用级分A之后在1分钟内血压水平降低21.43％，并在15分钟之后重新恢复正常，而在施用级分C之后在1分钟内血压水平降低50.5％，并在5分钟之后重新恢复正常；
附图51表示可可矢车菊苷配质对麻醉豚鼠的动脉血压的影响；
附图52表示L-NMMA对通过可可矢车菊苷配质级分C产生的麻醉豚鼠动脉血压变化的影响；
附图53表示缓激肽对通过HUVEC产生的NO生成量的影响；
附图54表示可可矢车菊苷配质级分对通过HUVEC产生的巨噬细胞NO生成量的影响；
附图55表示可可矢车菊苷配质级分对巨噬细胞NO生成量的影响；
附图56表示可可矢车菊苷配质对LPS诱导和γ干扰素诱发的巨噬细胞的影响；
附图57表示可可矢车菊苷配质寡聚物的胶束电动毛细管层析分离；
附图58A-F表示配合到三聚物上的Cu+2-、Zn+2-、Fe+2-、Fe+3-、Ca+2-和Mg+2-离子的MALDI-TOF质谱；
附图59表示可可矢车菊苷配质寡聚物的MALDI-TOF质谱(四聚物至十聚物)；
附图60表示可可矢车菊苷配质寡聚物和产生白血病病毒的猫FeA类淋巴母细胞细胞系的剂量反应关系；
附图61表示可可矢车菊苷配质寡聚物和猫CRFK正常肾细胞系的剂量反应关系；
附图62表示可可矢车菊苷配质寡聚物和犬MDCK正常肾细胞系的剂量反应关系；
附图63表示可可矢车菊苷配质寡聚物和犬GH正常肾细胞系之间的剂量反应关系；
附图64表示六聚物水解的时间-温度作用；和
附图65表示三聚物形式时的时间-温度作用；
发明详述
本发明的化合物
正如上面所讨论的一样，现在已令人惊奇地发现，可可提取物或由其衍生的化合物表现出抗瘤、抗癌和抗肿瘤活性，抗氧化活性，抑制DNA拓扑异构酶II酶和氧化性DNA损伤，以及具有抗微生物、环加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、编程性细胞死亡、血小板聚集和血液或体液葡萄糖调制活性，以及作为非甾类抗炎剂的效能。
该提取物、化合物或由此衍生的化合物的混合物通常是这样制备的，即将可可豆粉碎成粉末，使该粉末脱脂，并从该粉末中提取活性化合物并提纯。该粉末可以通过冻干可可豆和果肉，除去冻干可可豆的果肉和外壳并碾磨去壳的可可豆。活性化合物的提取可以通过溶剂萃取技术进行。可以例如通过凝胶渗透层析或通过制备型高效液相层析(HPLC)技术或通过这些技术的组合来纯化包括活性化合物的提取物例如以获得大体上纯的提取物。
关于从可可衍生的本发明化合物的分离和纯化，不用说将可以采用任何种类的可可树属、Herrania或它们的种间或种内的杂种。在这方面，参考文献是Schultes的《Herrania的概要》(“Synopsis ofHerrania”)，《阿诺德植物园杂志》(“Journal of the ArnoldArboretum”)第XXXIX期，第217～278页，以及图片I～XVII(1985)，Cuatrecasas《可可和其同源物，属间可可树属的分类修订本》(“Cocoa and Its Allies，A Taxonomic Revision of the GenusTheobroma”)《美国国家博物馆的专刊》(“Bullletin of the UnitedStates National Museum”)第35期，第6部分，第379～613页，以及图片1～11(Smithsonian Institution 1964)，以及Addison等《亚马逊河存在的属间可可树属的观察》(“Observations on the Species ofthe  Genus Theobroma Which Occurs in the Amazon  ”)《Bol.Tech.Inst.Agronomico de Nortes》，25(3)(1951)。
此外，实施例25列出以前未报道过的在可可树属和Herrania和它们的种间和种内混合种中发现的本发明的化合物的浓度；同样实施例25也描述了调节通过控制可可发酵条件而从可可获得的本发明化合物含量的方法。
在基本上纯的矢车菊苷配质的分离中使用的提纯方法的示意图列于附图37中。提纯流程图的步骤1和2描述在实施例1和2中；步骤3和4描述在实施例3、13和23中；步骤5描述在实施例4和14中；步骤6描述在实施例4、14和16中。本领域的技术人员将理解和想象到对附图37中概述的提纯流程图进行改进以获得活性化合物而不会偏离本发明的宗旨和范围，并且无需进行过分的试验。
具有活性的提取物、化合物和由此衍生的化合物的混合物，不希望被任何特殊的理论所限制，已经被认为是可可多酚，例如矢车菊苷配质。这些可可矢车菊苷配质具有显著的抗瘤、抗癌和抗肿瘤活性；抗氧化活性；抑制DNA拓扑异构酶II酶和氧化性DNA损伤；具有抗微生物的活性；具有调制环加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、编程性细胞死亡、血小板聚集和血液或体液葡萄糖的能力，以及作为非甾类抗炎剂的效能。
本发明提供一种式
Figure C9719518100391
的化合物，其中：n是2～18的整数，例如3～12，这样存在第一单体单元A和多个其它单体单元；
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
4位是α或β立体化学；
X、Y和Z代表单体单元之间键和的位置，但条件是对于第一单体单元来说，在此键合的其它单体单元在4位上以及Y＝Z＝氢，以及条件是，当不是用于键和单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z、Y是糖和X是氢，或X是α或β糖和Z、Y是氢，或它们的组合。该化合物中的n可以是5～12，当然优选n是5的化合物。糖可以选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。任何或所有的R、X、Y和Z的糖可以任选地通过酯键被酚部分取代。
因此，本发明提供式
Figure C9719518100401
的化合物，其中n是2～18的整数，例如3～12，有利地是5～12，优选n是5，这样存在第一单体单元A，
和多个A的其它单体单元。
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
4位是α或β立体化学；
X、Y和Z代表单体单元之间键和的位置，但条件是对于第一单体单元来说，在此键合的其它单体单元在4位上以及Y＝Z＝氢，以及条件是，当不是用于键和单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z、Y是糖和X是氢，或X是α或β糖和Z、Y是氢，或它们的组合。
所述的糖可以任选地通过酯键被酚部分取代。
相应地，本发明提供一种式An的聚合化合物以及其药物学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物)，其中A是具有结构式
Figure C9719518100411
的单体，n是2～18的整数，这样至少存在一个末端单体单元A和至少一个或多个附加单体单元；
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
相邻单体之间的键合发生在4、6或8位上；
在4位中附加单体单元的键具有α或β立体化学；
X、Y和Z选自由单体单元A、氢和糖组成的该组中，但条件是对于至少一个末端单体单元来说，在此键合的附加单体单元(也就是说邻近末端单体单元的单体单元的键合)在4位上以及任选地Y＝Z＝氢；
糖任选地在任何位置上例如通过酯键被酚部分取代。
在优选的实施方案中，n可以是3～18，2～18，3～12，例如5～12；并且有利地，n是5。该糖选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。任何或所有的R、X、Y和Z的糖可以任选地通过酯键被酚部分取代。酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羟基苯甲酸和芥子酸。
附加地，本发明提供一种式An的聚合化合物和其药物学上可接受的盐或衍生物(包括氧化产物)，其中A是具有结构式
Figure C9719518100421
的单体，n是2～18的整数，例如3～18，有利地是3～12，例如5～12，优选n是5；
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；
相邻单体在4位上通过(4→6)或(4→8)键合；
X、Y和Z各自是氢、糖或相邻单体，但条件是，如果X和Y是相邻单体，那么Z是H或糖，如果X和Z是相邻单体，那么Y是H和糖，以及条件是对于二个末端单体至少之一来说，相邻单体的键合在4位上以及任选地，Y＝Z＝氢；
在4位上的键具有α或β立体化学；
糖任选地在任何位置上例如通过酯键被酚部分取代。
关于叙述的“至少一个末端单体单元A”，当然应该理解为本发明的化合物具有二个末端单体单元，以及这二个末端单体单元可以是相同的或不同的。此外，应该明白所叙述的“至少一个末端单体单元A”包括其中该末端单体单元被称为“第一单体单元”的实施方案，而所叙述的“第一单体单元”涉及其上附加了其它单体单元以获得式An聚合化合物的单体。此外，对于二个末端单体至少之一来说，相邻单体的键合在4位上并且任选地Y＝Z＝氢。
至于所叙述的术语“它们的混合物”，应该理解为同时可以使用一种或多种本发明的化合物，也就是说给需要治疗的患者施用包括一种或多种本发明化合物的制剂。
本发明的化合物或它们的混合物显示出上面提及的可可提取物的用途；并且在整个公开文本中，术语“可可提取物”可以被本发明的化合物或其混合物所代替，这样可以理解为本发明的化合物和其混合物是可可提取物。
这里使用的术语“寡聚物”是指上面出现的结构式的任何化合物或其混合物，其中n是2～18。当n是2时，该寡聚物被称为“二聚物”；当n是3时，该寡聚物被称为“三聚物”；当n是4时，该寡聚物被称为“四聚物”；当n是5时，该寡聚物被称为“五聚物”；并且可以使用类似的术语代表n高达并包括18的寡聚物，这样当n是18时，该寡聚物被称作“十八聚物”。
本发明的化合物或其混合物例如可以从天然来源如任何的可可树属、Herrania或它们的种间或种内杂种中分离；或者本发明的化合物或其混合物可以被纯化，也就是说本发明的化合物或其混合物基本上是纯的；例如纯化至表观均一性。提纯是一相对概念，并且许多实施例证明例如通过本领域专业人员列举的方法分离本发明化合物或其混合物以及纯化它们可以获得基本上纯的本发明化合物或它们的混合物，或者纯化它们至表观均一性(即通过分离纯化，特征层析峰)。考虑到实施例(例如实施例37)，基本上纯的化合物或化合物的混合物的纯度至少是约40％，例如至少是约50％，有利地是至少约60％，例如至少约70％，更有利地至少约75％～80％，优选至少约90％，更优选大于90％，例如至少是90～95％，或甚至更纯，例如纯度大于95％，如95～98％。
此外，包括在这里使用的寡聚物的单体单元的实例分别是(+)-儿茶酸和(-)-表儿茶酸、简写为C和EC。相邻单体之间的键合是从4位到6位或从4位到8位；单体的4位和相邻单体单元的6位和8位之间的这种键合在这样被称为(4→6)或(4→8)。在单体的4位和其相邻单体的6位和8位之间存在4种可能的立体化学键；单体之间的立体化学键合在这里被称为(4α→6)或(4β→6)或(4α→8)或(4β→8)。当C被键合到另一个C或EC时，这里该键合被称为(4α→6)或(4α→8)。当EC被键合到另一个C或EC时，该键合在这里被称为(4β→6)或(4β→8)。
释放上述活性的化合物的实例包括二聚物，EC-(4β→8)-EC和EC-(4β→6)-EC，其中优选EC-(4β→8)-EC；三聚物[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，其中优选[EC-(4β→8)]2-EC；四聚物[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，其中[EC-(4β→8)]3-EC是优选的；和五聚物[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中五聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；[EC-(4β→8)]4-EC是优选的。
此外，释放上述活性的化合物还包括六聚物～十二聚物，其实例如下：
六聚物，其中一个单体(C或EC)具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，其中六聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中六聚物是[EC-(4β→8)]5-EC；
七聚物，其中二个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4 α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，其中七聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中七聚物是[EC-(4β→8)]6-EC；
八聚物，其中三个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，其中八聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中八聚物是[EC-(4β→8)]7-EC；
九聚物，其中四个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，其中九聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中九聚物是[EC-(4β→8)]8-EC；
十聚物，其中五个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，其中十聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中十聚物是[EC-(4β→8)]9-EC；
十一聚物，其中六个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，其中十一聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中十一聚物是[EC-(4β→8)]10-EC；和
十二聚物，其中七个单体(C和/或EC)的任何组合具有与另一个单体键合的键(4β→8)或(4β→6)，该键用于将EC键合到另一个EC或C上，以及具有与另一个单体键合的用于将C键合到另一个C或EC上的键(4α→8)或(4α→6)；随后通过(4β→8)键键合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C，其中十二聚物末端单体单元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在优选的实施方案中十二聚物是[EC-(4β→8)]11-EC。
从该详细描述将明白上述列举是示范性的并作为本发明化合物的几个非限制性实例的解释，其决不是穷举地列出本发明包括的本发明化合物。
实施例3A、3B、4、14、23、24、30和34描述分离本发明化合物的方法。实施例13、14A～D和16描述纯化本发明化合物的方法。实施例5、15、18、19、20和29描述鉴别本发明化合物的方法。附图38A～P和39A～AA图示代表本发明五聚物的立体化学构型库。实施例17描述制作本发明化合物的分子模型的方法。实施例36提供可可中存在较高寡聚物(其中n是13～18)的证据。
此外，因为本发明描述了关于优选包括可可矢车菊苷配质的可可提取物这方面，所以有机化学的专业人员从该公开文本将理解和预见获得和/或制备该活性化合物的合成路径(例如，参见实施例11)。相应地，本发明包括合成可可多酚或矢车菊苷配质或它们的衍生物和/或它们的合成前体等，其中该前体包括但不限于苷、棓酸盐、酯等。也就是说，本发明的化合物可以通过从可可或从可可树属或Herrania中的任何属以及从合成路途中分离来制备；本发明化合物的衍生物和合成前体例如苷、棓酸盐、酯等也包括在本发明的范围中。衍生物同样包括其中糖或棓酸盐部分在Y或Z位的末端单体上或者取代的糖或棓酸盐部分在Y或Z的末端单体上的上述结构式的化合物。
例如，实施例8，方法C描述使用可可酶氧化地改性本发明化合物或其组合物以获得改进的抗某种癌细胞系的细胞毒性(参见附图15M)。本发明包括例如使用多酚氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶混合物、和/或酶例如水解酶、酯酶、还原酶、转移酶等和它们的混合物酶改性本发明化合物的能力，同时考虑动力学和热力学因素(参见实施例41，注意水解作用)。
关于本发明化合物的合成，在该公开文本和现有技术中的知识的基础上，本领域专业人员将能够预见其它的合成途径，而无需过分的试验，例如，在聚合化合物的细心的反合成分析以及单体的基础上。例如给定本发明化合物的特性，专业人员可以使用各种各样的选择性保护/去保护的方法、与有机金属加成物偶合的方法、酚偶合和光化学方法，例如在会聚、线性或仿生方法中，或者这些方法的的组合，以及精通合成有机化学的专业人员熟知的标准反应一起作为制备本发明化合物得到附加合成方法，而无需过分的试验。在这方面，参考文献是W.Carruthers，《一些有机合成的现代方法》(“Some Modern Methods of OrganicSynthesis”)第3版，Cambridge University Press，1986，和J.March，《高级有机化学》(“Advanced Organic Chemistry”)第3版，JohnWiley & Sons，1985，Van Rensburg等，Chem.Comm.，24：2705～2706(1996，12，21)，Ballenegger等，(Zyma SA)欧洲专利0096 007B1和在下面的参考文献部分中的文件，所有的这些在这里引入以供参考。
本发明化合物的用途
关于本发明的化合物，已经令人惊奇地发现，本发明的化合物有不同的活性，因此，本发明的化合物可以广泛地用于治疗各种疾病，下面对此进行讨论。
COX/LOX-相关用途
动脉粥样硬化，最流行的心血管疾病，是心脏患病、中风和血管循环问题的主要原因。动脉粥样硬化是一种复杂的的疾病，其包括许多细胞类型、生化现象和分子因素。该疾病、其疾病状况和疾病发展这几个方面是通过低密度脂蛋白(LDL)氧化反应、环加氧酶(COX)/脂氧化酶(LOX)生物化学和一氧化氮(NO)生物化学的依存结果识别的。
临床研究已经断然地确定LDL的血浆浓度的升高与动脉粥样硬化的加重有关。聚集在动脉粥样病灶中的胆固醇主要从血浆脂蛋白包括LDL中产生。LDL的氧化反应在动脉粥样化形成的开始是关键的事件，并且与超氧阴离子自由基(O2·-)的产量增大有关。通过O2·-或其它活性种类(例如·OH、ONOO·-、脂质过氧化自由基、铜离子和铁基蛋白质)进行的LDL的氧化反应降低LDL的亲和性以便通过受体介导的胞吞作用吸收在细胞中。然后氧化改性的LDLs快速被巨噬细胞吸收，该巨噬细胞接着转变为非常类似于在早期动脉粥样病灶中发现的“泡沫细胞”的细胞。
氧化的脂蛋白同样可以通过在LDL颗粒中脂质氢过氧化物的形成来促进血管损伤。该事件引起不饱和的LDL脂质的自由基链氧化反应，因此产生更多的用于巨噬细胞掺入的氧化的LDL。
由这些方法装满氧化LDL的泡沫细胞的集中聚集导致早期“脂条”病灶，其最终发展为更高级的复杂的导致冠状病的动脉粥样硬化病灶。
正如Jean MarX在《科学》(“Science”)第265期(1994，7，15)第320页中概括讨论的一样，在美国每年大约330,000名患者接受冠状和/或外周血管成形术，该血管成形术是一种打开被危险的动脉粥样斑块(动脉粥样硬化)堵塞的血管例如冠状血管并因此恢复正常血液流动的方法。对于大多数患者来说，该手术均在计划中。然而，这些患者的几乎33％(据一些报道可能更高)出现再次狭窄，其中被治疗的血管再次快速被堵塞。与进行血管成形术之前相比，这些患者情况不是更好，有时更坏。血管壁中平滑肌细胞(SMCs)的过度增生促进再次狭窄。在病灶中氧化LDL的快速聚集可能有助于动脉粥样硬化形成机理有关的过程如再次狭窄。Zhou等《初次巨细胞病毒感染和冠状Atherectomy之后再次狭窄的危险性之间的关系》(“Association Between PriorCytomegalovirus Infection And The Risk Of Restenosis After CoronaryAtherectomy”)1996，8，29，New England Journal of Medicine，335：624-630，以及在这里引用的文件，所有的这些在此引入以供参考。相应地，本发明与动脉粥样硬化有关的用途可以适用于再次狭窄。
在通过本发明化合物抑制环加氧酶方面，已知环加氧酶是前列腺素和其它涉及许多生理过程的花生四烯酸代谢物(例如类花生酸)生产中的关键酶。COX-1是一种在许多组织，包括血小板，中表达的组成型酶，而COX-2，酶的第二种同种型，是可通过各种细胞因子、荷尔蒙和肿瘤促进剂诱导的。COX1产生血栓烷A2，其与血小板的聚集有关，而血小板聚集反过来涉及动脉粥样硬化的发展。其抑制是心血管疾病预防效果的基础。
COX-1和COX-2的活性是通过阿斯匹林和其它的非甾类抗炎药(NSAIDs)来抑制的，并且NSAIDs对胃的副作用被认为与COX-1的抑制有关。加之，已经发现有规律地服用NSAIDs的患者与未施用这类药物的人相比感染结肠直肠癌的危险性是40～50％；并且在86％的结肠直肠腺癌患者中，COX-2 mRNA水平显著提高。
表达细胞系的COX-2的一个显著性能是更强地表达参与编程性细胞死亡即细胞程序死亡调制的基因。几个NSAIDs已经暗示细胞死亡增加和在鸡胚成纤维细胞中诱导编程性细胞死亡。
细胞脂氧化酶同样涉及通过不饱和脂质进行的LDL的氧化改性。脂质过氧化自由基有助于不饱和LDL脂质的自由基链的进一步氧化，以生产更多的用于巨噬细胞并入的氧化LDL。
已经令人惊奇地发现，本发明化合物在治疗与COX/LOX有关的疾病中的用途。在实施例28中，COX是通过浓度类似于已知NSAID，吲哚美辛，的单独的本发明化合物来抑制的。
为了抑制COX，本发明化合物是其中n是2～18的寡聚物。在优选的实施方案中，本发明化合物是其中n是2～10的寡聚物，更优选地，本发明化合物是其中n是2～5的寡聚物。
释放关于上述COX/LOX的抑制活性的化合物的实施例包括上面讨论的二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。
因此，由于本发明化合物对COX-2产生显著的抑制能力，以及对推定的COX-2表达结肠癌细胞系的毒害细胞作用，所以本发明化合物具有作为导致癌的多步发展的抑制剂的编程性细胞死亡的活性，以及作为具有预防活性广谱的NSAID类药物中一员的活性(例如，参见实施例8，附图9D～9H)。
另外，前列腺素，COX催化的花生四烯酸转化为前列腺素H2的次末端产物，与发炎、疼痛、发热、胎儿发育、分娩和血小板聚集有关。因此，本发明化合物对与NSAIDs相同的条件是有效的，例如抗心血管疾病并且中风等(实际上，减少血栓烷A2产生的血小板COX-1的抑制是阿斯匹林对心血管疾病产生预防效果的基础)。
炎症是活组织对损伤的响应。它包括一系列复杂的酶活化、介质释放、体液的外渗、细胞迁移、组织的破坏和修补。炎症是通过释放花生四烯酸(COX和LOX的底物)的磷脂酶A2激活的。COX将花生四烯酸转化为在从急性水肿到慢性关节炎的发炎条件中发现的主要类花生酸的前列腺素PGE2。通过NSAID对其抑制是治疗的主要手段。
关节炎是风温病的一种，风湿病包括各种各样的疾病和病理过程，这些病大多数损害关节组织。通过这些疾病损害的基础结构是包括滑膜、软骨、骨头、腱、韧带和间质组织的结缔组织。暂时结缔组织综合症包括扭伤和拉伤、腱炎和腱鞘畸形。最严重的关节炎形式是类风湿关节炎、骨关节炎、痛风和系统性红斑性狼疮。
除风温病外，其它疾病的特征也在于炎症。齿龈炎和牙根骨膜炎遵循类似于类风湿关节炎的病理图片。炎性肠疾病是指肠的自发性慢性炎症病情、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。脊椎炎涉及脊椎关节的慢性炎症。这里与肥胖症有关的骨关节炎的发病率同样高。
因此，本发明化合物溃疡用于治疗涉及发炎、疼痛、发热、胎儿发展、分娩和血小板聚集有关的病情。
通过本发明化合物对COX的抑制同样将抑制前列腺素即PGD2、PGE2的形成。因此，本发明化合物溃疡用于治疗与前列腺素PGD2、PGE2有关的病情。
与NO有关的用途
已知一氧化氮可用于抑制主要与动脉粥样化形成过程有关的血小板聚集、单核细胞粘着和趋化性以及血管平滑肌组织的增生。支持这种观点的证据是，由于NO与氧气游离基反应，在动脉粥样组织中NO减少。由于这些反应造成的NO的减少导致大量的血小板和炎性细胞粘着在血管壁上，进一步损害NO的松弛机理。在这种情况下，NO的减少促进动脉粥样化过程，导致病情加剧。
高血压是心血管疾病包括中风、心脏发作、心力衰竭、不规则心搏和肾衰竭的主导原因。高血压是一种血管中的血压高于其流过身体时正常血压的状态。当在一段持续时间内收缩压超过150毫米汞柱或舒张压超过90毫米汞柱时，对身体造成危害。例如过高的收缩压可以破坏任何地方的血管。当它出现在大脑中时，导致中风。它也可以引起血管增厚和狭窄，从而导致动脉粥样硬化。血压升高同样迫使心脏肌肉增大，因为当排出血液时，它要加倍运转以克服升高的静(舒张)压。这种增大最终产生不规则心搏和心力衰竭。高血压被称为“无声杀手”，因为它不产生任何症状并且仅在量血压时被发现。
血液的调节是一复杂事件，这里一种机理涉及组成型Ca+2/一氧化氮合酶的钙调蛋白依赖形式的表达(缩写为eNOS)。通过这种酶产生的NO使血管中的肌肉松弛(舒张)，这种松弛降低血压。当不能得到通过eNOS产生的NO的正常水平时，或者因为抑制剂阻止生成或者在病理情况下，例如动脉粥样硬化，血管肌肉不能舒张至合适的程度。所产生的血管收缩提高血压，并可能对高血压的一些形式负责任。
血管内皮细胞包括eNOS。通过eNOS合成的NO以相反的方向扩散，并且当它到达底层的血管平滑肌时，NO粘附在鸟苷酸环化酶的血红素基上，引起cGMP提高。cGMP的提高造成细胞内游离Ca+2的降低。环GMP可以活化蛋白激酶，该蛋白激酶使Ca+2转运蛋白磷酸化，从而使Ca+2隐蔽在肌肉细胞中的细胞内结构中。因为肌肉收缩需要Ca+2，所以，由于Ca+2的浓度降低，收缩力下降。肌肉的松弛使血管舒张，这种舒张降低血压。因此eNOS的抑制引起血压升高。
当不能产生正常水平的NO时，或者因为抑制剂阻止生成或者在病理情况下，例如动脉粥样硬化，血管肌肉不能舒张至合适的程度。所产生的血管收缩提高血压，并可能对高血压的一些形式负责任。非常有兴趣发现一种治疗方法以提高高血压患者中的eNOS活性，但是对具体的治疗方法没有任何报道。能释放NO的药剂，例如硝化甘油或二硝酸异山梨酯仍然是血管舒张治疗的主要手段。
虽然本发明化合物抑制LDL的氧化，但是这些化合物的更综合的作用是它们通过NO对动脉粥样硬化产生的多元化作用。通过本发明化合物对NO的调制产生许多有益效果，包括高血压调节、降低NO影响的高胆固醇血症、抑制血小板聚集和单核细胞粘着，所有这些均与动脉粥样硬化发展有关。
NO在免疫系统中的作用不同于其在血管中的功能。巨噬细胞包括一种被称为iNOS的NOS类型，其是诱导型的，而不是组成型的。iNOS基因的转录受许多被称为生物因子的生物反应调节物的正控制或负控制。最重要的诱导物是γ干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素2和脂多糖(LPS)，其中脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞壁的一种组分。刺激的巨噬细胞产生足够的NO以抑制核糖核酸酶还原酶，该酶用于将核苷酸转化为DNA合成所需的脱氧核苷酸。DNA合成的抑制是一种重要的方法，其中巨噬细胞和其它具有iNOS的组织可以抑制快速分裂的肿瘤细胞或感染性细菌的生长。
关于NO和感染性细菌的作用，微生物在反映身体接触和损害、习性、职业、个体环境以及通过非正常储存、处理和污染导致的食物传染疾病的感染过程中起重要作用。
本发明化合物、它们的混合物和包含它们的组合物在治疗与调节NO浓度有关的情况是有效的。实施例9描述本发明化合物抗氧化活性(作为自由基的抑制剂)。假定NO是自由基，本发明化合物是强氧化剂，那么可推测以体内和体外实验方式施用本发明化合物将造成NO水平降低。NO的任何降低将导致高血压效果，而不是低血压效果。与所期望的相反，在体外实验中本发明化合物使NO增加，而在体内实验中产生低血压效果(实施例31和32)。这些结果不是预计的并完全是出乎意料的。
实施例27描述在口服含本发明化合物和葡萄糖的溶液之后不久红细胞增多症(erythmia)(脸潮红)，因此暗示血管舒张作用。
实施例31描述在体内动物模型中通过本发明化合物得到的低血压效果，其证明本发明在治疗高血压方面是有效的。在该实施例中，本发明化合物、其混合物和包括它们的组合物包括其中n是2～18，优选2～10的寡聚物。
实施例32描述在体外模型中本发明化合物对NO生成的调节。在该实施例中，本发明化合物、其混合物和含它们的组合物包括其中n是2～18，优选2～10的寡聚物。
此外，实施例35提供通过MALDI/TOF/MS发现的所形成的Cu+2-、Fe+2-、Fe+3-寡聚物的配合物的证据。这些结果表明本发明化合物可以与铜和/或铁离子配合以降低它们对LDL氧化的作用。
此外，本发明化合物在感染治疗和食物酸败的预防中具有有效的抗微生物活性。实施例22和30描述本发明化合物对下面所列的几种有代表性的具有临床和食物意义的微生物的抗微生物活性。
微生物                类型               临床/食物意义
幽门螺杆菌            革兰氏阴性         胃炎、溃疡、胃癌
芽孢杆菌属            革兰氏阳性         食物中毒、伤口感
                                         染、牛乳腺炎、败血
                                         病
沙门氏菌属            革兰氏阴性         食物中毒、腹泻
金黄色葡萄球菌        革兰氏阳性         疖子、痈、伤口感染、
                                         败血病、乳房脓肿
大肠杆菌              革兰氏阴性         婴儿腹泻、尿道感染
假单胞  菌属          革兰氏阴性         尿道感染、伤口感
                                         染、“游泳耳”
酿酒酵母              酵母菌             食物酸败
巴氏醋杆菌            革兰氏阴性         食物酸败
实施例33描述本发明化合物对巨噬细胞NO形成的作用。在该实施例中，结果证明本发明化合物诱导单核细胞/巨噬细胞NO形成，这二者不依赖和依赖于脂多糖(LPS)或细胞因子的刺激。形成NO的巨噬细胞溃疡抑制感染的细菌的生长。
释放抗微生物活性的本发明化合物是其中n是2～18的寡聚物，优选其中n是2、4、5、6、8和10的寡聚物。
释放与上述NO有关的抗微生物活性的化合物的实施例包括上面讨论的二聚物、四聚物、五聚物、六聚物、十聚物和十二聚物。
抗癌用途
癌症被划分为三组：癌(carcinomas)、肉瘤和淋巴瘤。癌是一种在皮肤、各种器官的衬料(linings)、腺和组织中产生的恶性肿瘤。肉瘤是在骨头、肌肉或结缔组织中产生的恶性肿瘤。第三组包括白血病和淋巴瘤，因为这二者均是在形成血液的器官中出现。癌症的主要类型是前列腺、乳腺、肺、结肠直肠、膀胱、非何杰金氏淋巴、子宫、皮肤黑素瘤、肾、白血病、卵巢和胰腺。
癌症的形成由通过许多因子例如遗传基因因子、电离辐射、污染、氡和损害DNA的自由基造成的DNA细胞的改变而引起的。携带突变的细胞在细胞分裂的有序过程中产生缺陷。这些细胞不能承受编程性细胞死亡(细胞程序死亡)并继续分裂，这种分裂或者标志着恶性肿瘤的开始，或者允许在一段时间内产生更多的突变，从而导致恶性肿瘤。
对于各种不同的癌症存在三个主要的共同特征。它们是(1)无限增生的能力；(2)肿瘤对植物组织的侵入性；(3)转移过程。
一定类型的癌症是以独特的方式转移。例如甲状腺、肺、乳腺和前列腺癌通常转移到骨头。肺癌通常扩散到脑和肾上腺，结肠直肠癌经常转移到肝脏。白血病在发作时被认为是一种全身性疾病，在贯穿全身的骨髓中发现该疾病。
已经令人惊奇地发现，本发明化合物在治疗上述讨论的各种不同的癌症中是有效的。实施例6、7、8和15描述释放抗癌活性的本发明化合物对人Hela(宫颈)、前列腺、乳腺、肾、T-细胞白血病、结肠癌细胞系的作用。实施例12(附图20)表明使用基本上通过HPLC纯化的低聚(二聚物～十二聚物)的矢车菊苷配质治疗的Heal和SKBR-3乳腺癌细胞系的剂量反应效应。抗这些癌细胞系的细胞毒性取决于五聚物至十二聚物矢车菊苷配质，而较低的寡聚物未表现出效果。
因为不希望受任何理论的限制，所以这里出现解释上述效果的最小结构基元。实施例37同样表明较高寡聚物(五聚物至十二聚物)抗猫类淋巴母细胞系的相同细胞毒性效果。同样在较高寡聚物(附图58～61)抗正常犬和猫细胞系中的细胞毒性。
在实施例8(附图9D-H)中，表明本发明化合物可以释放抗表达人结肠癌细胞系(HCT116)的推定COX-2的细胞毒性。
实施例9描述本发明化合物的抗氧化活性。本发明化合物抑制DNA链断裂、DNA蛋白质交联和核苷酸的自由基氧化以降低和/或防止突变的发生率。
实施例10描述本发明化合物作为拓扑异构酶II抑制剂，其是化疗剂例如阿霉素的靶。
实施例21描述在裸鼠模型(鼠的平均重量是约25克)中基本上纯的五聚物的体内效果，该五聚物释放抗人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231/LCC6)的抗肿瘤活性。由于出乎意料的动物毒性，以较高剂量(5毫克)的五聚物重复的体内实验不是完全成功的。目前认为该毒性可能与本发明化合物的血管舒张效应有关。
实施例33描述本发明化合物对巨噬细胞NO形成的作用。产生NO的巨噬细胞可以抑制快速分裂的肿瘤细胞的生长。
此外，本发明包括本发明化合物通过编程性细胞死亡导致细胞增生抑制的用途。
用于抗癌活性的本发明化合物是其中n是2～18，例如3～18，如3～12的寡聚物，优选其中n是5～12，更优选其中n是5的寡聚物。
释放关于上述癌症的抑制活性的化合物包括上述讨论的五聚物至十二聚物。
制剂和方法
因此，总的来说，本发明化合物、其混合物和包含它们的组合物已表现出一系列抗动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、血压调节和/或高血压、炎性疾病、感染物和食物酸败几个方面的活性。
因此，本发明化合物、其混合物和含它们的组合物是COX抑制剂，其通过抑制血栓烷A2形成和因此降低血栓形成的危险性来影响血小板聚集。另外，COX的抑制导致更少的血小板和炎性细胞粘着在血管壁上，从而为改善NO的松弛机理创造条件。这些结果与以类似于一种已知NSAID，吲哚美辛，的浓度抑制COX相结合表现出抗凝效能。
此外，本发明化合物、其混合物和含它们的组合物是抗氧化剂，其通过降低超氧化物自由基负离子和脂氧化酶媒介脂质过氧化自由基的水平来抑制LDL的氧化。在该阶段LDL氧化的抑制降低巨噬细胞的活性并且延缓泡沫细胞的形成，从而进一步中断动脉粥样硬化过程。同样LDL氧化的抑制也可以延缓再狭窄的过程。因此，本发明化合物或其混合物或含它们的组合物可以被用于预防和/治疗动脉粥样硬化和/或再狭窄。并且，因此在血管成形术或类似手术之前或之后可以施用本发明化合物来预防或治疗易于再狭窄患者的再狭窄。
为了治疗或预防再狭窄和/或动脉粥样硬化，根据该公开文本和本领域中的常识，例如在初次出现再狭窄和/或动脉粥样硬化病症或症状时，在即将进行血管形成术之前、同时或之后，或者在血管形成术之后按照内科专业人员的要求尽早地将一种本发明化合物或它们的混合物或含一种或多种本发明化合物的组合物按照内科专业人员所希望的单独或与其它治疗一起施用，而无需任何过分的试验；可以在一个疗程例如一个月、二个月、半年、一年或者在一些其它的内科专业人员认为需要的时间段的疗程中连续地施用本发明化合物或其混合物或含它们的组合物，而无需任何其它过分的试验。
此外，本发明化合物，其混合物和含它们的组合物已经显示出可以在体内产生低血压效果和在体外诱导NO。实际上，这些结果可以应用在治疗高血压和在涉及高胆固醇血症的NO水平显著降低的临床情况中。
本发明化合物、其混合物和含它们的组合物的制剂可以按照制药、食品科学、医学和兽医领域的专业人员熟知的标准方法以立即或缓释活性化合物的液体、悬浮液、片剂、胶囊、注射液或栓剂的形式制备。
载体可以是聚合的延迟释放体系。在控制释放的组合物制剂中合成聚合物是特别有用的。其早期的例子是将甲基丙烯酸甲酯聚合成直径小于1微米的球体以形成所谓的纳米级颗粒，参见Kreuter，J.，《医学和药学中的微胶囊和纳米级颗粒》(“ Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology”)，M.Donbrow(ED).CRC Press，125-148页。
通常选择用于药剂和最近用于抗原的载体是聚(d，1-丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)。这是一种长期以来在易受腐蚀药用缝合线、骨平板(boneplates)和其它临时性假器官中使用的可生物降解的聚酯，它们在其中没有显示出任何毒性。已经可以将各种各样的药剂配制成PLGA微胶囊。正如Eldridge，J.H.等《微生物学和免疫学的当代课题》(“CurrentTopics in Microbiology and Immunology”)1989，146：59-66中综述的一样，关于PLGA用于控制的适应性已经积累了很多数据。在口服时，直径为1～10微米的PLGA微球中的俘获物(entrapm ent)发挥作用。PLGA的微囊包封方法采用油包水乳液的相分离方法。本发明化合物或它们的混合物是作为作为一种水溶液制备的，PLGA溶解在合适的有机溶剂例如二氯甲烷和乙酸乙酯中。这二种不能混合的溶液通过高速搅拌被共乳化。然后加入一种该聚合物的非溶剂，造成该聚合物沉淀在含水液滴的周围，形成初期微胶囊。收集该微胶囊，用一种试剂(聚乙烯醇(PVA)、明胶、藻酸盐、甲基纤维素)稳定该微胶囊，并通过真空干燥或者溶剂萃取除去溶剂。
此外，关于缓释制剂的制备，参考文献是U.S.5,024,843、5,091,190、5,082,668、4,612,008和4,327,725，这些文献在此引用以供参考。
此外，所关心的可可基因型的选择方法和鉴定被用于制备单位标准(SOI)和非SOI的巧克力产物，该产物可以作为将活性成分输送给需要治疗上述病情的患者的载体以及作为以守恒水平输送本发明化合物的工具。
在这方面，参考文献是1996年9月6日申请的共同未决的美国申请序列号08/709,406，该文献在此引入以供参考。USSN08/709,406涉及一种由可可豆制备具有水平守恒的多酚的可可油和/或可可固体的方法，其中采用一种组合独特的不需要分离的可可豆焙烧或磨浆设备的加工步骤，以便任选地在不暴露于强烈的热处理下在一段持续时间内加工可可豆和/或使用脂肪的溶剂萃取方法。该方法的优点在于，与在传统可可加工方法中发现的多酚相比可以提高多酚的守恒性，这样在未加工可可豆中发现的多酚的最初含量与在加工之后获得的多酚含量的比例小于或等于2。
本发明的组合物包括一种或多种上述提及的在具有药物学上可接受的载体或赋形剂的剂型中的化合物。本发明化合物具有抗瘤、抗癌和抗肿瘤活性，抗氧化活性，抑制DNA拓扑异构酶II酶，抑制氧化性DNA损伤，诱导单核细胞/巨噬细胞NO形成，具有抗微生物、环加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、编程性细胞死亡、血小板聚集和血液或体内葡萄糖调节活性，以及作为非甾类抗炎剂的效能。
本发明的其它实施方案包括由本发明化合物和其混合物以及除药物学上可接受载体或赋形剂外至少一种附加的抗瘤剂、降压剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗氧化剂和血细胞生成剂组成的组合物。
在考虑这里所列数据、给药途径、单个寡聚物的浓度和毒性(例如LD50)下，按剂量或通过内科、营养学或兽医领域中的专业人员熟知的技术，可以将这样的组合物施用给需要这种服用法的患者，这些数据是这样的一些因素例如年龄、性别、体重、单个受试者或患者的遗传学和状况。
该组合物可以与其它抗瘤、抗癌、抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、氧化性DNA损伤的抑制剂或环加氧酶和/或脂氧化酶抑制剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体内葡萄糖调制剂或NO或NO合酶调制剂，非甾类抗炎剂和/或与能够降低或减轻抗瘤、抗癌、抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、氧化性DNA损伤的抑制剂或环加氧酶和/或脂氧化酶抑制剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体内葡萄糖调制剂或NO或NO合酶调制剂、非甾类抗炎剂的不良作用的试剂一起共同服用或顺序地服用，同时还要考虑这些因素如年龄、性别、体重、单个受试者或患者的遗传学和状况以及施用途径。
用于人或兽类的本发明组合物的实例包括用于口服的可食组合物，例如固体或液体剂型，例如胶囊、片剂、丸剂等，以及可咀嚼的固体或饮用剂型，本发明特别适合于这种剂型，因为本发明来自可食用源(例如可可或巧克力味的固体或液体组合物)；适合于针注射、口服、鼻、肛门、阴道等给药的液体制剂，例如悬浮液、糖浆或酏剂(包括可可或巧克力味的组合物)；适合于肠胃外、皮下、真皮内、肌肉内或静脉内给药(例如可注射的给药方式)的制剂例如无菌的悬浮液或乳液。然而，在组合物中的活性成分可以与蛋白质配合，这样当在血液中给药时，由于血蛋白质的沉淀可能出现凝结；本领域专业人员应该考虑到这点。在这样的组合物中，活性可可提取物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如消毒水、生理盐水、葡萄糖、DMSO、乙醇等混合。本发明的活性可可提取物可以以冻干的形式提供，然后重新用于例如等渗压水溶液、盐水、葡萄糖或DMSO缓冲液中。在某一盐水溶液中，发现了一些沉淀；可以采用这种发现作为分离本发明化合物的手段，例如通过“盐析”方法。
实施例38描述在药物、补充物和食品领域中使用的片剂剂型的本发明化合物制剂。另外，实施例39描述用于相同领域的胶囊剂型的本发明化合物制剂。此外，实施例40描述含本发明化合物或根据待审查的美国申请序列号08/709,406(其在此引入以供参考)中描述的方法获得的可可固体的标准鉴定(SOI)和非SOI巧克力的剂型。
试剂盒
此外，本发明还包括一种试剂盒，其中具有活性可可提取物。该试剂盒可以包括含合适载体、稀释剂或赋形剂的独立的容器。该试剂盒还可以包括一种附加的抗瘤、抗癌、抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、氧化性DNA损伤的抑制剂或环加氧酶和/或脂氧化酶抑制剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体内葡萄糖调制剂或NO或NO合酶调制剂，非甾类抗炎剂和/或与能够降低或减轻抗瘤、抗癌、抗肿瘤剂、抗氧化剂、DNA拓扑异构酶II酶抑制剂、氧化性DNA损伤的抑制剂或环加氧酶和/或脂氧化酶抑制剂、编程性细胞死亡调制剂、血小板聚集调制剂、血液或体内葡萄糖调制剂或NO或NO合酶调制剂、非甾类抗炎剂的不良作用的试剂。该附加的试剂可以在一个单独的容器中或与活性可可提取物混合。此外，试剂盒可以包括混合或组合成分的工具和/或给药方法。
基因的鉴定
本发明的另一实施方案包括用借助于本发明化合物或这些化合物的混合物而紧密细胞接触的结果来表达的基因的调制。这样，本发明包括鉴定通过本发明化合物或其混合物诱导的或抑制的与几种疾病有关的基因的鉴定，这些疾病包括但不限于动脉粥样硬化、高血压、癌症、心血管疾病和炎症。更精确地说，在通过本发明混合物或其混合物接触之前和之后鉴定和描述在这些疾病状态中表达不同(相对于它们在“正常”无病状态下的表达)的基因。
正如在上面讨论中提及的一样，这些疾病和疾病状态部分是以自由基的相互作用和生物分子的多样性为基础的。这些疾病有关的中心课题是许多自由基反应涉及反应性氧物质，其反过来诱导与疾病发展有关的生理状态。例如，反应性氧物质已经涉及到转录因子例如核因子(NF)-κB的调节。(NF)-κB的靶基因包括一系列与协同炎症反应相关的基因。这些基因包括编码肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-I、(IL)-6和(IL)-8、诱导NOS、主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原和其它的基因。同样，反过来，调节转录因子活性的基因可以通过氧化应激来诱导。在自由基清除剂和自由基产生体系之间的氧化压力是不平衡的。这些情况的一些已知的实施例(Winyard和Blake，1977)包括gaddl 53(由生长抑制和DNA损伤诱导的基因)，其产物已显示出与NF-IL6结合并形成不能与DNA结合的异源二聚体。NF-IL6正调节一些基因的表达，包括编码白细胞介素6和8的那些。氧化压力可诱导基因的另一个实例为调节转录因子p53在生长抑制中的作用的gadd45。p53编码可终止细胞分裂并诱导异常细胞(如癌细胞)进行编程性细胞死亡的p53蛋白。
给出本发明化合物或化合物的混合物在部分基于自由基机理的多种疾病的治疗中的应用的出人意料，非显而易见和新用途的全貌。本发明进一步包括通过使用基因表达测定来确定本发明化合物在特定疾病或疾病状态的动物体外和成体内模型中，对基因或基因产物表达的暂时性作用的方法。这些分析包括，但不局限于差示，cDNA文库的测序，基因表达的系列分析(SAGE)，通过与高密度寡核苷酸种类杂交的表达监测和基于该方法或它们的组合的各种逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)(Lockhart等，1996)。
包含在本发明中的本发明化合物或化合物的混合物的综合生理作用，结合遗传评价方法使得能发现无论是已知或新的，被诱导的或被抑制的基因和基因产物。例如本发明包括使用RT-PCR在体外和体内诱导和/或抑制淋巴细胞中的细胞因子(如IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12和TNF-α)。类似地，本发明包括应用差示来确定选择基因的诱导和/或抑制；用于在刺激和/或氧化剂刺激的条件下(如TNF-α或H2O2条件)下的心血管领域(如超氧化物歧化酶，血红素氧化酶，COXI和2，及其它氧化剂防御基因)。对于癌症领域，本发明包括应用分化显示来确定在对照和氧化剂应激细胞中基因或基因产物，如CuZn-超氧化物酶歧化酶，Mn-超氧化物歧化酶，过氧化氢酶等的诱导和/或抑制。
仅通过举例说明的方式给出下面非限制性实施例，并不被认为是限制本发明，在不背离其实质或范围的情况下，许多明显的变化均是可能的。
实施例
实施例1： 可可来源和制备方法
从世界三大主要可可生产地获得代表三种已确定的可可园艺学品种的一些可可树(Theobroma cocao)的属典型种。本研究中所采用的那些属典型种的表示于表1中。将收获的可可豆荚打开，取出带果肉的豆用于冷冻干燥。从冷冻干燥物中人工取出果肉，并将豆如下进行分析。首先人工将未发酵，冷冻干燥的可可豆去皮，并用TEKMAR Mill研磨成很细的粉状物。接着使用重蒸馏的己烷作为溶剂，通过Soxhlet提取，将产生的物质脱脂过夜。室温下，用真空将残留溶剂从脱脂物中除去。
表1：可可(Theobroma cacao)来源物质的描述
    属典型种     产地     园艺学品种
    UIT-1     马来西亚     Trinitario
    未知     西非     Forastero
    ICS-100     巴西     Trinitario(NicaraguanCriollo ancestor)
    ICS-39     巴西     Trinitario(NicaraguanCriollo ancestor)
    UF-613     巴西     Trinitario
    EEG-48     巴西     Forastero
    UF-12     巴西     Trinitario
    NA-33     巴西     Forastero
实施例2： 矢车菊苷配质提取方法
A. 方法1
使用由Jalal和Collin(1977)描述的方法的改进，从实施例1的脱脂，未发酵，冷冻干燥的可可豆中提取矢车菊苷配质。使用2×400mL70％丙酮/去离子水，接着用400mL 70％甲醇/去离子水从一批50g脱脂的可可物中提取矢车菊苷配质。收集提取物，通过在45℃下，用置于部分真空的旋转蒸发仪蒸发除去溶剂。将产生的水相用去离子水稀释至1L，并用400mL CHCl3萃取两次。弃去溶剂相。接着将水相用500mL乙酸乙酯萃取4次。通过10℃下，在Sorvall RC 28S离心机上以2,000×g离心30分钟破碎所有产生的乳状液。向混合的乙酸乙酯萃取物中加入100-200mL去离子水，通过45℃下，用置于部分真空的旋转蒸发仪蒸发除去溶剂。将产生的水相冻于液N2中，接着在LABCONCO冷冻干燥系统中冷冻干燥。从不同可可属典型种获得的粗矢车菊苷配质的产率列于表2中。
表2：粗矢车菊苷配质的产率
    属典型种     产地     产率(g)
    UIT-1     马来西亚     3.81
    未知     西非     2.55
    ICS-100     巴西     3.42
    ICS-39     巴西     3.45
    UF-613     巴西     2.98
    EEG-48     巴西     3.15
    UF-12     巴西     1.21
    NA-33     巴西     2.23
B. 方法2
另外，用70％丙酮水溶液从实施例1的脱脂，未发酵，冷冻干燥的可可豆中提取矢车菊苷配质，将10g脱脂物与100mL溶剂一起搅拌5-10分钟。4℃下，以3000×g将淤浆离心15分钟，并将上清通过玻璃棉。部分真空下，让滤液进行蒸馏，将产生的水相冻于液N2中，接着在LABCONCO冷冻干燥系统中冷冻干燥。粗矢车菊苷配质的产率为15-20％。
不愿被任何特定理论所局限，认为粗产率的不同反映了不同属典型种，地理来源，园艺学品种和制备方法之间的差异。
实施例3： 可可矢车菊苷配质的部分纯化
A. 凝胶渗透层析
通过在Sephadex LH-20(28×2.5cm)上的液体层析部分纯化从实施例2获得的矢车菊苷配质。用从去离子水至甲醇的分级梯度来辅助分离。起始的梯度组合物从15％甲醇的去离子水溶液开始，其后是每30分钟逐步使用25％甲醇的去离子溶液，35％甲醇的去离子水溶液，70％甲醇的去离子水溶液和最终100％甲醇。将黄嘌呤生物碱(咖啡碱和可可碱)洗脱之后的流出物收集作为单一级分。该级分产生被进一步进行细分级以产生称为MM2A-MM2E的5个亚级分(Subfraction)的无黄嘌呤生物碱的亚级分。通过在45℃下，用置于部分真空的旋转蒸发仪蒸发从各个亚级分中除去溶剂。将产生的水相冻于液N2中，并在LABCONCO冷冻干燥系统中冷冻干燥过夜。显示分级分离的代表性凝胶渗透层析示于图1中。用这种方法细分级分离了约100mg物质。
层析条件：柱；28×2.5cm Sephadex LH-20，流动相：甲醇/水分级梯度，15∶85，25∶75，35∶65，70∶30，100∶0，以1/2小时间隔进行，流速；1.5mL/分钟，检测器；UV在λ1＝254nm和λ2＝365nm，记录速度：0.5mm/分钟，柱负荷；120mg。
B. 半制备高效液相色谱(HPLC)
方法1：反相分离
通过半制备HPLC部分纯化从实施例2和/或3A获得的矢车菊苷配质。安装有可变波长检测器，带有1mL注射口的Rheodyne 7010注射阀的Hewlett Packard 1050 HPLC系统被装备有Pharmacia FRAC-100级分收集器。在与Phenomenex 10μODS UltracarbTM(60×10mm)保护柱相连的Phenomenex UltracarbTM 10μ ODS柱(250×22.5mm)上进行分离。流动相结合物A＝水；B＝甲醇，以下面的线性梯度条件使用：[时间，％A]；(0，85)，(60，50)，(90，0)和(110，0)，流速为5mL/分钟。在254nm用紫外检测化合物。
用于分离存在于级分D+E的矢车菊苷配质的代表性半制备HPLC的量示于图15N中。在规定的时间间隔或通过人工级分收集来收集各个峰或选择的层析区域以用于进一步的纯化和后面的评价。注射填充量为25-100mg物质。
方法2.正相分离
通过半制备HPLC部分纯化从实施例2和/或3A获得的矢车菊苷配质提取物。带有设置在254nm的Millipore-Waters型480 LC检测器的Hewlett Packard 1050 HPLC系统安装有设置在峰形的PharmaciaFrac-100级分收集器。在与Supelco 5μm Supelguard LC-Si保护柱(20×4.6mm)相连的Supelco 5μm Supelcosil LC-Si柱(250×10mm)上进行分离。用下面条件下的线性梯度洗脱矢车菊苷配质：(时间：0％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70，10，86)，接着是10分钟的重新平衡。流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水(1∶1)。采用3mL/分钟的流速。在254nm下用紫外检测各成分，并在Kipp和Zonan BD41记录仪上记录。注射体积为100-250μl将10mg矢车菊苷配质提取物溶解在0.25mL 70％丙酮水溶液中的溶液。代表性半制备HPLC的量示于图15中。在规定的时间间隔或通过人工收集级分来收集各峰或选择的层析区以用于进一步的纯化和后面的评价。HPLC条件：250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)
      半制备柱20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si
      (5μm)保护柱
      检测器：Waters LC
      分光光度计类型 480@254nm
      流速：3mL/分钟，
      柱温：室温
      注射：250μL 70％丙酮提取物
     梯度：时间(分钟)   CH2Cl2     甲醇  乙酸∶H2O(1∶1)
    0     82     14     4
    30     67.6     28.4     4
    60     46     50     4
    65     10     86     4
    70     10     86     4
获得的级分如下：
    级分     类型
    1     二聚体
    2     三聚体
    3     四聚体
    4     五聚体
    5     六聚体
    6     七聚体
    7     八聚体
    8     九聚体
    9     十聚体
    10     十一聚体
    11     十二聚体
    12     更高的寡聚体
实施例4： 矢车菊苷配质的分析性HPLC分析
方法1：反相分离
将从实施例3获得的矢车菊苷配质给0.45μ滤器过滤，并用装备了Diode Array检测器和HP类型1046A程度可控荧光检测器的HewlettPackard 1090三元HPLC系统进行分析。45℃下，在Hewlett-Packard5μ Hypersil ODS柱(200×2.1mm)上进行分离。将黄烷醇(flavanols)和矢车菊苷配质用60％B至A的线性梯度洗脱，接着用B以0.3mL/分钟的流速洗涤柱。流动相组合物为B＝0.5％乙酸的甲醇溶液和A＝0.5％乙酸的毫微纯水溶液。在A和B流动相中的乙酸水平可被增加至2％。用其中λex＝276nm和λem＝316nm的荧光及在280nm处用紫外检测各成分。根据参考标准溶液确定(+)儿茶酸和(-)表儿茶酸的浓度。通过使用(-)表儿茶酸的应管因子计算矢车菊苷配质的水平。对于一种可可属典型种，显示各种成分分离的代表性HPLC层析示于图2A中。从另一种可可属典型种获得类似的HPLC分布图。
HPLC条件：柱：200×2.1mm Hewlett Packard Hypersil ODS
      (5μ)
保护柱：20×2.1mm Hewlett Packward Hypersil
ODS(5μ)
检测器：Diode Array @280nm
荧光λex＝276nm；λem＝316nm
流速：0.3mL/分钟
柱温：45℃
    梯度：时间(分钟)     0.5％乙酸的毫微纯水溶液     0.5％乙酸的甲醇溶液
    0     100     0
    50     40     60
    60     0     100
方法2：正相分离
将从实施例2和/或3获得的矢车菊苷配质提取物经0.45μ滤器过滤，并用装备有HP型1046A程序可控荧光检测器和二极管系统检测器的Hewlett Packward 1090系列II HPLC系统进行分析。37℃下，在与Supelco Supelguard LC-Si 5μ保护柱(20×4.6mm)相连的5μPhenomenex Lichrosphere_硅100柱(250×3.2mm)上进行分离。在下面条件下，用线性梯度洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)(65，10，86)，(70，10，86)，接着进行8分钟的重新平衡。流动相组合物为A＝二氯甲烷，B＝甲醇，和C＝乙酸∶水，体积比为1∶1。采用0.5mL/分钟的流速。用其中λex＝276nm和λem＝316nm的荧光或通过在280nm下的紫外线检测各成分。对于一个属典型种，显示各种矢车菊苷配质的分离的代表性HPLC层析示于图28中。从另一个可可属典型种获得类似的HPLC分布图。
HPLC条件：
250×3.2mm Phenomenex Lichrosphere_Silica 100柱(5μ)
20×4.6mm
Supelco Supelguard LC-Si(5μ)保护柱检测器：Photodiode
Array@280nm荧光λex＝276nm；λem＝316nm
流速：0.5mL/分钟
柱温：37℃
    梯度：时间(分钟)     CH2-Cl2     甲醇     乙酸/水(1∶1)
    0     82     14     4
    30     67.6     28.4     4
    60     46     50     4
    65     10     86     4
    70     10     86     4
实施例5： 矢车菊苷配质的鉴定
通过在Sephadex LH-20(28×2.5cm)柱上的液相层析，接着通过使用10μBondapak C18(100×8mm)柱的半制备HPLC或通过使用5μSupelcosil LC-Si(250×10mm)柱的半制备HPLC纯化矢车菊苷配质。
使用正和负离子型的液相二级离子质谱(LSIMS)法，在VG ZAB-T高分解MS系统中通过快速原子轰击-质谱法(FAB-MS)分析部分纯化的分离物。30KV下，铯离子枪被用作电离源，“MagicBullet Matrix”(1∶1二硫苏糖醇/二硫赤藓糖醇)被用作质子供体。
用LSIMS对这些级分的分析研究表明了如下表所示的多种黄烷-3-醇寡聚体的存在。
表3：来自可可矢车菊苷配质级分的LSIMS(正离子)数据。
    寡聚体  (M+1)+m/z   (M+Na)+m/z     分子量
  单体(儿茶酸)     291     313     290
  二聚体(S)     577/579     599/601     576/578
  三聚体(S)     865/867     887/889     864/866
  四聚体(S)     1155     1177     1154
  五聚体(S)     1443     1465     1442
  六聚体(S)     1731     1753     1730
  七聚体(S)     ---     2041     2018
  八聚体(S)     ---     2329     2306
  九聚体(S)     ---     2617     2594
  十聚体(S)     ---     2905     2882
  十一聚体(S)     ---     ---     3170
  十二聚体(S)     ---     ---     3458
主要质量段的离子与以前报导的对矢车菊苷配质的正和负离子FAB-MS分析的工作一致(Self等，1986和Porter等，1991)。对应于m/z 577(M+H)+的离子和其在m/z 599(M+Na)+的钠加合物表明在分离物中双重连接的矢车菊苷配质二聚体的存在。非常感兴趣地注意到较高的寡聚体与其被质子化的分子离子(M+H)+更有可能形成钠加合物(M+Na)+。基于由Revilla等(1991)，Self等(1986)和Porter等(1991)报导的工作，推测性地鉴定了矢车菊苷配质异构体B-2，B-5和C-1。在部分纯化的级分中，通过FAB-MS证实了高至八聚体和十聚体的矢车菊苷配质。另外，高至十二聚体的矢车菊苷配质的证据从正相HPLC分析中观察到(参见图2B)。表4列出了基于反相HPLC分析的在无黄嘌呤生物碱的分离物中发现的矢车菊苷配质的相对浓度。表5列出了基于正相HPLC分析的矢车菊苷配质的相对浓度。
表4：在无黄嘌呤生物碱的分离物中的矢车菊苷配质的相对浓度。
    成分     量
    (+)-儿茶酸     1.6％
    (-)表儿茶酸     38.2％
    B-2二聚体     11.0％
    B-5二聚体     5.3％
    C-1三聚体     9.3％
    双键连接的二聚体     3.0％
    四聚体(S)     4.5％
    五聚体-八聚体     24.5％
    未知和更高的寡聚体     2.6％
表5：矢车菊苷配质在丙酮水溶液提取物中的相对浓度
    成分     量
    (+)-儿茶酸和(-)-表儿茶酸     41.9％
    B-2和B-5二聚体     13.9％
    三聚体     11.3％
    四聚体     9.9％
    五聚体     7.8％
    六聚体     5.1％
    七聚体     4.2％
    八聚体     2.8％
    九聚体     1.6％
    十聚体     0.7％
    十一聚体     0.2％
    十二聚体     ＜0.1％
图3表明一些矢车菊苷配质的结构，图4A-4E表明在下面筛选抗癌或抗肿瘤活性中采用的五个级分的代表性HPLC层析。用于图4A-4E的HPLC的条件如下：
HPLC条件：装备有HP型1046A程序可控荧光检测器的HewlettPackard 1090三元HPLC系统。
柱：Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS(200×2.1mm)，线性梯度为60％B至A，流速为0.3mL/分钟，B＝0.5％乙酸的甲醇溶液；A＝0.5％乙酸的去离子水溶液。λex＝280nm；λem＝316nm。
图15O表明在筛选抗肿瘤或抗癌活性中采用的另外12种级分的代表性半制备HPLC层析(HPLC条件如上所述)。
实施例6： 可可提取物(矢车菊苷配质)的抗癌，抗瘤或抗肿瘤活性
最初由Mosmann(1983)开发的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴鎓)-微量滴定板四唑鎓细胞毒性分析被用来筛选来自实施例5的试验样品。以10mg/mL浓度将试验样品，标准样(顺式铂氨和苯丁酸氮芥)及MTT试剂溶解在100％DMSO(二甲亚砜)中。从贮液制备系列稀释液。在为试验样品的情况下，在0.5％DMSO中制备从0.01至100μg/mL变化的稀释液。
从美国典型培养物保藏中心获得所有人肿癌细胞系。在含10％胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素和240单位/mL制霉菌素的α-MEM中让细胞生长成单层。37℃下，将细胞保存在湿润的5％CO2气氛中。
在胰蛋白酶消化后，计数细胞并调至50×105细胞/mL的浓度(根据癌细胞系而变化)。将200μl细胞悬浮液平板接种至96孔微量滴定板的4行孔中。在让细胞贴壁四小时后，将2μl包含试验样品溶液的DMSO加入到四行孔中。采用试验样品稀释的大小顺序的寻找初始剂量应答的实验被用来确定待考查的剂量范围。接着在BIO RAD MP 450平板计数器中测定在540nm的各孔吸光率。将四行试验样品处理的孔的平均吸光率与对照比较，结果以对照吸光率加上/减去标准偏差的百分数来表示。MTT还原为紫色甲_产物以线性方式与孔中存活细胞的数目相关。因此，通过测定还原产物的吸光率，可获得在给定剂量的试验样品时，存活细胞的百分数。对照孔中包含最终浓度为1％DMSO。
用这种方法首先试验两个样品。样品MM1代表非常粗的可可矢车菊苷配质的分离物，并包含可鉴定量的咖啡因和可可碱。样品MM2代表用凝胶渗透层析部分纯化的可可矢车菊苷配质分离物。在MM2中不存在咖啡因和可可碱。使用前面描述的方法筛选两个样品抗下列癌细胞系的活性：
HCT 116结肠癌
ACHN肾腺癌
SK-5黑素瘤
A 498肾腺癌
MCF-7乳腺癌
PC-3前列腺癌
CAPAN-2胰腺癌
在任何观察的肿瘤细胞系中，用MM1观察到很少活性或没有活性。发现MM2具有抗HCT-116，PC-3和ACHN肿瘤细胞系的活性。然而，发现MM1和MM2与MTT相干扰，以致它模糊了反映存活细胞数目减少的吸光率的降低。由于化学反应看来在孔中沿平板的周围更加迅速地发生，因此这种干扰还由于大量错误障碍物所导致。这些作用的一个典型实例示于图5中。在为高浓度的试验材料时，将期望观察到存活细胞的大量减少，而非显示高的存活水平。然而，显微镜检查表明尽管发生MTT干扰，但仍产生细胞毒性效果。例如，以这种方式获得了MM2对ACHN细胞的效果的0.5μg/mL的IC50值。
在本发明人看来，这些初步结果需要修改分析方法以排除MTT的干扰。如下完成它。在37℃下，将平板在湿润，5％CO2气氛中保温18小时后，小心地将培养基吸出并以新鲜α-MEM培养基代替。在分析的第三天再将该培养基从各孔中吸出，并代之以100μl新配制的McCoy′s培养基。接着向各平板的孔中加入11μl 5mg/mL MTT的PBS(磷酸盐缓冲液)贮液。37℃下，在湿润，5％CO2气氛中保温4小时后，向平板各孔中加入100μl 0.04N盐酸异丙醇溶液，接着充分混合以由任何活细胞产生的甲_。另外，决定细分级分离矢车菊苷配质以确立导致活性的特定成分。
前述细分级分离方法被用来制备用于进一步筛选的样品。制备代表图1所示区域和图4A-4E所示成分分布的五个级分。将样品编号为MM2A-MM2E以反映这些分析特征并表示不存在咖啡因和可可碱。
针对HCT-116，PC-3和ACHN肿瘤细胞系分别筛选各级分。结果表明该活性并不集中在任何一个特定的级分。由于在“活性”天然产物分离物中的成分可协同作用，因此这种结果被认为是常有的。在为可可矢车菊苷配质分离物(MM2)的情况下，多于二十种的可检测成分组成了分离物。被认为有可能该活性与存在于不同级分中的各成分的混合有关，而非该活性与各个成分有关。
基于此结果，决定混合级分并重复抗相同肿瘤细胞系的分析。一些级分混合产生了抗PC-3肿瘤细胞系的细胞毒性效果。具体地，获得了各自对于MM2A和MM2E混合的40μg/mL的IC50值，和对于MM2C和MM2E混合的20μg/mL的IC50值。还报导了抗HCT-1 6和ACHN细胞系的活性，但如前，MTT指示剂的干扰排除了明确的观察结果。在HCT-116和ACHN系重复进行重复实验以改进数据。然而，由于细菌污染和试验样品标样的消耗，这些结果不稳定。图6A-6D表明在可可提取物的混合物与PC-3肿瘤细胞之间的剂量应答关系。
然而，从这个数据中清楚可见可可提取物，尤其是可可多酚或矢车菊苷配质具有显著的抗肿瘤；抗癌或抗瘤活性，尤其是对人PC-3(前列腺)，HCT-116(结肠)和ACHN(肾)肿瘤细胞系。此外，那些结果表明特定矢车菊苷配质可能是抗PC-3细胞系活性的主要原因。
实施例7： 可可提取物(矢车菊苷配质)的抗癌，抗肿瘤或抗瘤活性
为了证实上面的发现和进一步研究级分混合物，进行另外综合性筛选。
所有制备的物质和方法与上面描述的那些相同，除开将每个试验剂量标准4次重复增加到每个剂量8或12次重复。为了这个研究，筛选五个可可矢车菊苷配质级分的每一种及其混合物的抗下面肿瘤细胞系活性：
PC-3前列腺
KB鼻咽/Hela
HCT-116结肠
ACHN肾
MCF-7乳腺
SK-5黑素瘤
A-549肺
CCRF-CEM T-细胞白血病
各个筛选由分析不同剂量水平(0.01-100μg/mL)的级分A，B，C，D和E(参见图4A-4E和其讨论，见上文)抗各种细胞系的活性组成。混合物筛选由混合等剂量水平的级分A+B，A+C，A+D，A+E，B+C，B+D，B+E，C+D，C+E和D+E的抗
各种细胞系的活性组成。分别讨论这些分析的结果，接着进行全面总结。
A. PC-3前列腺细胞系
图7A-7H表明在可可矢车菊配质级分和PC-3细胞系之间的典型剂量应答关系。图7D和7E证明级分D和E在75μg/mL的IC50值时具有活性。当级分D或E存在时，从其它矢车菊苷配质级分的混合物的剂量反应曲线获得的IC50值在60-80μg/mL之间变化。各IC50值示于表6中。
B. KB鼻咽/Hela细胞系
图8A-8H表明可可矢车菊苷配质级分和KB鼻咽/Hela细胞系之间的典型的剂量应答关系。图8D和8E证明级分D和E在IC50值为75μg/mL时具有活性。图8F-8H描述了从级分混合物研究获得的代表性结果。在这种情况下，矢车菊苷配质级分混合物A+B没有作用，而级分混合物B+E和D+E在IC50值为60μg/ml时具有活性。当存在级分D或E时，从来自其它级分混合物的其它剂量反应曲线获得的IC50值在60-80μg/mL之间变化。各IC50值示于表6中。这些结果本质上与针对PC-3细胞系获得的那些相同。
C. HCT-116结肠细胞系
图9A-9H表明在可可矢车菊苷配质级分和HCT-116结肠细胞系之间的典型的剂量应答关系。图9D和9E证明级分E在IC50值为约400μg/mL具有活性。该值通过外推现有曲线而获得。注意到级分D的剂量反应曲线的斜率也表明活性。然而，由于该曲线的斜率太低不得获得可靠值，因此无IC50值从该曲线获得。图9F-9H描述了从级分混合物研究获得的代表性结果。在这种情况下，矢车菊苷配质级分混合物B+D没有显示明显的活性，而级分混合物A+E和D+E分别在IC50值为500μg/mL和85μg/mL具有活性。当级分E存在时，从其它级分混合物的剂量反应曲线获得的IC50值平均为约250μg/mL。外推IC50值列于表6中。
D. ACHN肾细胞系
图10A-10H表明可可矢车菊苷配质级分和ACHN肾细胞系之间的典型的剂量应答关系。图10A-10E说明各级分对该细胞系不具活性。图10F-10H描述从级分混合物研究中获得的代表性结果。在这种情况下，矢车菊苷配质级分混合物B+C不具活性，而级分混合物A+E产生外推的IC50值为约500μg/mL。类似于C+D混合物的剂量反应曲线被认为不具活性，因为它们的斜率太低。其它级分混合物的外推IC50值列于表6中。
E. A-549肺细胞系
图11A-11H表明在可可矢车菊苷配质和A-549肺细胞系之间的典型的剂量应答关系。在用于该分析的剂量下，从任何各种级分或级分的混合物没有活性可被检测出。然而，矢车菊苷配质对该细胞系可能具有用途。
F. SK-5黑素瘤细胞系
图12A-12H表明在可可矢车菊苷配质级分和SK-5黑色瘤细胞系之间的典型的剂量应答关系。在用于该分析中的剂量下，从任何各种级分或级分的混合物中没有活性可被检测出。然而，矢车菊苷配质对该细胞系可能具有用途。
G. MCF-7乳腺细胞系
图13A-13H表明在可可矢车菊苷配质级分和MCF-7乳腺细胞系之间的典型的剂量应答关系。在用于该分析中的剂量下，从任何各种级分或级分的混合物中没有活性可被检测出。然而，矢车菊苷配质对该细胞系可能具有用途。
H. CCRF-CEM T-细胞白血病细胞系
最初获得抗CCRF-CEM T-细胞白血病细胞系的典型的剂量反应曲线。然而，不同级分浓度下针对时间的对细胞数目的显微镜计数表明500μg级分A，B和D在4天期间内完成80％生长的降落。代表性剂量应答关系示于图14中。
I. 总结
从这些分析中获得的对于所有细胞系，除开CCRF-CEM T-细胞白血病的IC50值集中列于表6中。因为采用不同的分析方法，从表中有目的地省去T-细胞白血病的数据。对这些结果的一般性总结表明最大活性与级分D和E相关。这些级分对PC-3(前列腺)和KB(鼻咽/Hela)细胞系最具活性。虽然仅在如此高的剂量下，这些级分也显示抗HCT-116(结肠)和ACHN(肾)细胞系的活性。未检测出抗MCF-7(乳腺)，SK-5(黑素瘤)和A-549(肺)细胞系的活性。然而，对于这些细胞系，矢车菊苷配质可能具有用途。还显示出抗CCRF-CEM(T-细胞白血病)细胞系的活性。还应注意到级分D和E为组成最复杂的混合物。然而，从这些数据清楚可见可可提取物，尤其是可可矢车菊苷配质具有显著的抗肿瘤，抗癌或抗瘤活性。
       表6：可可矢车菊苷配质对各种细胞系的IC50值
                      (IC50值，μg/mL)
  级分   PC-3   KB   HCT-116   ACHN   MCF-7   SK-5   A-549
  A
  B
  C
  D     90   80
  E     75   75     400
  A+B
  A+C     125   100
  A+D     75   75
  A+E     80   75     500     500
  B+C
  B+D     75   80
  B+E     60   65     200
  C+D     80   75     1000
  C+E     80   70     250
  D+E     80   60     85
从剂量反应曲线外推大于100μg/mL的值
实施例8： 可可提取物(矢车菊苷配质)的抗癌，抗肿瘤或抗瘤活性
一些另外的体外分析方法被用来补充和扩展示于表6和7的结果。
方法A.结晶紫染色分析
所有人肿瘤细胞系均从美国典型培养物保藏中心获得。在含10％胎牛血清而不含抗生素的IMEM中让细胞生长至单层。37℃下，将细胞保存在湿润，5％CO2气氛中。
胰蛋白酶消化后，计数细胞并调至浓度为1,000-2,000细胞/100mL。通过将细胞(1,000-2,000细胞/孔)平板接种在96孔微量滴定板中来确定细胞增殖。在每孔加入100μl细胞后，让细胞贴壁生长24小时。在24小时末，以不同浓度加入各种可可级分以获得剂量应答结果。将可可级分溶解在2倍浓度的培养基中，在三孔中加入100μl各种溶液。在连续的几天中，将平板用50μl结晶紫(2.5g结晶紫溶解在125mL甲醇，375mL水中)染色15分钟。除去染料，将平板轻轻浸至冷水中以除去过量染料。将洗涤重复二次或多次，并让平板干燥。通过向各孔中加入100μl 0.1M柠檬酸钠/50％乙醇来溶解剩余的染料。溶解后，在540nm下(在410nm下的参考滤器)，在ELISA平板计数器上定量细胞数。用吸光率作为Y轴，生长天数作为X轴作图来自ELISA计数器的结果。
方法B. 软琼脂克隆分析
根据由Nawata等(1981)描述的方法，在软琼脂上克隆细胞。在含0.8％琼脂和各种浓度的可可级分的培养基中制备单细胞悬液。将悬液以等分样品分至被含1.0％琼脂的培养基覆盖的35mm平皿中。10天保温后，在Ominicron 3600 Image Analysis System中确定直径大于60μm的菌落的数量。将菌落数量作为Y-轴，可可级分的浓度作为X-轴将结果作图。
方法C.XTT微量培养四唑鎓分析
由Scudiero等(1988)描述的XTT分析方法被用来筛选各种可可级分。除开下面的修改，XTT分析本质上与使用MTT方法(实施例6)描述的相同。以1mg/mL不含血清的培养基制备XTT((2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酰苯基)-5-((苯基氨基)羰基)-2H-四唑鎓氢氧化物)，并预保温至37℃。以5mM PBS制备PMS。将XTT和PMS混合在一起；向各孔中加入10μl PMS/mL XTT和50μlPMS-XTT。37℃，保温4小时后，在机械摇床上将平板混合30分钟并在450-600nm处测量吸光率。用吸光率作为Y-轴，生长天数或浓度作为X-轴将结果作图。
对于方法A和C，还将对照百分数作为Y-轴，生长天数或浓度作为X-轴将结果作图。
用可可级分D和E(实施例3B)进行抗乳腺癌细胞系的MCF-7p168的XTT和结晶紫分析法的比较以确定何种分析是最灵敏的。如图1 5A中所示，两种分析对于浓度＞75μg/mL显示出相同的剂量-应答效果。在低于此值的浓度时，结晶紫分析比XTT分析结果显示出更高的标准偏差。然而，由于结晶紫分析易于使用，因此除开另有说明，所有后面的分析均用此方法进行。
提供结晶紫分析结果(图15B-15E)以分别证实粗多酚提取物(实施例2)对乳腺癌细胞系MDA MB231，前列腺癌细胞系PC-3，乳腺癌细胞系MCF-7 p163和颈癌细胞系Hela的作用。在所有情况下，在5-7天期间，250μg/mL的剂量完全抑制所有癌细胞生长。由于100μg/mL剂量也抑制生长，因此Hela细胞系看来对提取物更为敏感。还分析了来自实施例3B的可可级分抗Hela和其它乳腺癌细胞系SKBR-3。结果(图15F和15G)表明级分D和E具有最高活性。如图15H和15I所示，从两种癌细胞系获得了约40μg/mL D和E的IC50值。
在确定试验化合物抑制不依赖贴壁生长的能力的软琼脂克隆分析中还试验了可可级分D和E。如图15J所示，100μg/mL的浓度完全抑制了Hela细胞的菌落形成。
还分析了从代表三种可可园艺学品种的8种不同可可的属典型种获得的粗多酚提取物抗Hela细胞系。如图15K所示，所有可可变异种显示相似的剂量应答作用。UIT-1变种显示最大的抗Hela细胞系活性。这些结果证实所有可可的属典型种拥有不依赖于地理来源，园艺学品种和属典型种的产生抗至少一种人癌细胞系活性的多酚级分。
每日基础上从一吨规模巴西可可豆的传统的5天发酵，接着进行4天太阳干燥阶段而制备的粗多酚提取物进行另一系列分析。示于图15L中的结果未显示出这些早期加工阶段的显著效果，这表明在多酚的组合物中变化很小。然而，已知(Lehrian和Patterson，1983)在发酵阶段多酚氧化酶(PPO)将氧化多酚。为了确定酶促氧化多酚将对活性具有何种影响，进行另外的实验。通过用丙酮，以1mg粉比10mL丙酮的比例萃取磨得很细，未发酵，冷冻干燥的脱脂巴西可可豆来制备粗PPO。将浆液以3,000rpm离心15分钟。将其重复三次，每次弃去上清，将第四次萃取物倒入Buchner过滤漏斗。让丙酮粉末空气干燥，接着根据由McLord和Kilara(1983)描述的方法进行分析。向粗多酚溶液中(100mg/10mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，0.02M，pH5.5)中加入100mg丙酮粉末(4,000单位活性/mg蛋白)并用让气泡流通过浆液来搅拌30分钟。将样品以5,000×g离心15分钟，用20mL乙酸乙酯将上清萃取3次。混合乙酸乙酯萃取物，部分真空下蒸馏干燥并加入5mL水，接着冷冻干燥。然后针对Hela细胞对物质进行分析并将剂量应答与未经酶促处理的粗多酚提取物进行比较。结果(图15M)表明酶促氧化提取物的剂量反应曲线中的明显的偏离，这表明氧化产物比它们的天然形式更具抑制性。
实施例9： 含矢车菊苷配质的可可提取物的抗氧化剂活性
文献中的证据提出了天然产生的抗氧化剂(维生素C，E和β-胡萝卜素)的消耗与包括癌症的疾病的低发病率之间的关系(DesigningFoods，1993；Caragay，1992)。通常认为这些抗氧化剂影响某些参与一些类型的肿瘤启动的氧化和自由基过程。另外，已表明为抗癌剂的一些植物多酚化合物本质上也具有抗氧化剂活性(Ho等，1992；Huang等，1992)。
为了确定含矢车菊苷配质的可可提取物是否具有抗氧化剂性质，采用标准Rancimat方法。实施例1，2和3中描述的方法被用来制备被进一步处理以从凝胶渗透层析中产生两个级分的可可提取物。这两个级分实际上为混合的级分A-C，及D和E(见图1)，其中它们的抗氧化剂性质被与合成抗氧化剂BHA和BHT进行了比较。
去皮后从未烘烤的花生中挤出花生油。以两个水平～100ppm和～20ppm，将各个试验化合物掺入油中，实际水平示于表7中。将50μl甲醇溶解的抗氧化剂加入各样品中以辅助抗氧化剂的分散。用50μl不含抗氧化剂的甲醇制备对照样品。
在100℃和20cc/分钟空气下，使用Rancimat稳定性试验将样品的氧化稳定性评价两次。选择实验参数以匹配使用活性氧法(AOM)或Swift稳定性试验(Van Oosten等，1981)的那些。典型的Rancimat显示于图16中。结果以达到100meq过氧化物水平所需的小时数表示报导在表8中。
表7：抗氧化剂的浓度
样品                        水平1       水平2ppm
丁化羟基甲苯(BHT)   24   120
丁化羟基茴香醚(BHA)   24   120
可可的粗乙酸乙酯级分   22   110
级分A-C   20   100
级分D-E   20   100
表8：花生油和各种抗氧化剂的氧化稳定性
样品                               20ppm            100ppm平均
对照                 10.5±0.7
BHT     16.5±2.1     12.5±2.1
BHA     13.5±2.1     14.0±1.4
粗可可级分     18.0±0.0     19.0±1.4
级分A-C     16.0±6.4     17.5±0.0
级分D-E     14.0±1.4     12.5±0.7
这些结果证实了含所有试验添加物的花生油的增加的氧化稳定性。通过向样品中掺入可可的粗乙酸乙酯提取物实现了氧化稳定性的最大的增加。这些结果证实含矢车菊苷配质的可可提取物具有等于或大于等量的合成BHA和BHT的抗氧化剂能力。因此，本发明可在BHA或BHT的已知用途方面被用于替代BHT或BHA，例如作为抗氧化剂和/或食品添加剂。并且在此方面，也应注意到本发明来自可食用来源。给出这些结果，本领域技术人员不需过分实验还可很容易地确定用于该“BHA或BHT”用途中的本发明的适宜量，如加入到食物中的量。
实施例10： 拓扑异构酶II抑制研究
DNA拓扑异构酶I和II为催化DNA链断裂和重新连接，从而控制DNA的拓扑状态的酶(Wang，1985)。除研究拓扑异构酶的细胞内功能外，一个最引人注目的发现是确定了拓扑异构酶II作为许多临床重要的抗肿瘤化合物的初级细胞靶(Yamashita等，1990)，其中包括嵌入剂(m-AMSA，Adriamycin_和椭圆玫瑰树碱)以及非嵌入的表鬼臼毒素。一些证据的线索表明一些抗肿瘤药物具有稳定DNA-拓扑异构酶II复合物(“可切割复合物”)的共同的性质，其中该复合物在暴露于变性试验时导致DNA切割的诱导(Muller等，1989)。已提出抗肿瘤药物导致的可切割复合物的形成产生大量可导致细胞死亡的DNA加合物。
根据该具有吸引力的模型，DNA拓扑异构酶II可切割复合物的特定的新诱导物可用作抗癌，抗肿瘤或抗瘤剂。在试图确定具有靶定DNA活性的细胞毒性化合物中，筛选可可矢车菊苷配质的增加的抗一些DNA-损伤敏感性细胞系的细胞毒性活性，并用从淋巴癌获得的人拓扑异构酶II进行酶分析。
A.拓扑异构酶II的动质体DNA的去连锁(decatenation)
如Muller等(1989)所描述的，如下进行动质体DNA的拓扑异构酶II去连锁的体外抑制。用Miller等(1981)和Danks等(1988)的方法的改进，从人淋巴癌中制备含拓扑异构酶II活性的核提取物。34℃下，1单位的纯化酶足以在30分钟内将0.25μg动质体DNA去连锁。动质体从短膜虫属锥虫(Crithidia fasciculata)获得。在含19.5μlH2O，2.5μl 10×缓冲液(1×含50mM tris-HCl的缓冲液，pH8.0，120mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM ATP，0.5mM二硫苏糖醇和30μg BSA/mL)，1μl动质体DNA(0.2μl)和1μl各种浓度的含DMSO的可可矢车菊苷配质试验级分的0.5mL微量离心管中进行各个反应。将该混合物充分混合并置于冰上。34℃下，在水浴中保温30分钟之前立即加入1单位拓扑异构酶。
保温后，通过加入5μl终止缓冲液(5％Sarkosyl，0.0025％溴酚兰，25％甘油)并置于冰上来终止去连锁分析。在1％琼脂糖凝胶上，在含溴化乙锭(0.5μg/ml)的TAE缓冲液中将DNA进行电泳。310nm波长下的紫外线照射使DNA显色。用Polaroid Land/相机将凝胶照相。
图17表明这些实验的结果。完全连锁的动质体DNA不迁移至1％琼脂糖凝胶中。拓扑异构酶II导致的动质体DNA的去连锁产生不迁移至凝胶中的单体DNA带(单环，类型I和类型II)。作为增加的浓度的函数的单体带的逐步消失使加入可可矢车菊苷配质导致的酶的抑制成为显然。基于这些结果，在为0.5-5.0μg/mL内变化的浓度下，可可矢车菊苷配质级分A，B，D和E显示出抑制拓扑异构酶II。这些抑制剂浓度非常类似于对蒽环型药和m-AMSA(4′-(9-吖啶基氨基)甲磺酰-间-茴香酰胺)所获得的。
B. 药物敏感细胞系
筛选可可矢车菊苷配质的对一些DNA损伤敏感性细胞系的细胞毒性。一个细胞系为由P.Jeggo(Kemp等，1984)开发的xrs-6 DNA双链断裂修复突变体。xrs-6细胞系的DNA修复缺陷使得它们对X-射线，导致DNA双链直接断裂的化合物，如博来霉素，和对抑制拓扑异构酶II的化合物尤为敏感，并因此如Warter等(1991)所提出的可能间接诱导双链的断裂。将针对修复缺陷细胞系的细胞毒性与针对DNA修复良好的CHO细胞系BR1的细胞毒性进行比较。针对修复缺陷(xrs-6)细胞系的增强的细胞毒性被解释作为DNA可切割双链断裂形成的证据。
DNA修复良好的CHO细胞系BR1由Barrows等(1987)开发，并除开正常CHO DNA修复酶外还表达06-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶。CHO双链断裂修复缺陷细胞系(xrs-6)是来自Dr.P.Jeggo和同事(Jeggo等，1989)的赠品。如实施例6所描述，在含血清和抗生素的α-MEM中让两种细胞生成为单层。37℃下，将细胞保存在湿润，5％CO2气氛中。在用可可矢车菊苷配质处理之前，用胰蛋白酶处理让生长为单层的细胞脱离。使用实施例6描述的MTT分析方法进行分析。
结果(图18)表明针对xrs-6细胞系没有增加的细胞毒性，这说明可可矢车菊苷配质以不同于可切割双链断裂形成的方式抑制剂拓扑异构酶II。即在其与DNA相互作用以形成不可切割复合物之前先与拓扑异构酶II相互作用。
不可切割复合物形成化合物是相对新的发现。蒽环型药，鬼臼素生物碱，蒽二酮，吖啶，和椭圆玫瑰树碱中的成员均可用于临床抗癌，抗肿瘤或抗瘤用途，且它们产生可切割复合物(Liu，1989)。最近已鉴定出了看来不产生可切割复合物的一些新类型的拓扑异构酶II抑制剂。这包括氨萘非林(Hsiang等，1989)，司替霉素(Fesen等，1989)，黄酮类(flavanoids)(Yamashita等，1990)，saintopin(Yamashita等，1991)，膜酮(Drake等，1989)，萜类(Kawada等，1991)，蒽吡唑(Fry等，1985)，双氧哌嗪(Tanabe等，1991)，和海洋吖啶-dercitin(Burres等，1989)。
由于在形成可切割复合物之前，可可矢车菊苷配质使拓扑异构酶II失活，因此它们单独或与其它已知的并从机理上被定义为拓扑异构酶II抑制剂一起混合具有化学治疗价值。另外，可可矢车菊苷配质看来还是一类新的拓扑异构酶II抑制剂(Kashiwada等，1993)和因此可比其它已知抑制剂对细胞毒性更小，从而增加了它们在化学治疗中的应用。
采用表达膜结合糖蛋白(gp 170)以传递多种药物抗性的人乳腺癌细胞系MCF-7(ADR)(Leonessa等，1994)和其亲代细胞系MCF-7分析可可级分D和E的效果。如图19所示，在增加剂量水平的级分D和E时，亲代细胞系被抑制，而阿霉素(ADR)抗性细胞系在较高剂量时受影响较小。这些结果表明可可级分D和E对多药抗性细胞系具有影响。
实施例11： 矢车菊苷配质的合成
根据Delcour等(1983)开发的方法的改进进行矢车菊苷配质的合成。除开在还原条件下，将(+)-儿茶酸与二氢栎精缩合外，还采用(-)-表儿茶酸的反映在未发酵可可豆中自然产生的高浓度的(-)表儿茶酸。如实施例3，4和5中描述的方法分离，纯化，分析和鉴定合成产物。在此方法中，制备了二黄酮类，三黄酮类和四黄酮类并用上面描述的针对可可提取物的方法将其用作分析标准。
实施例12： 正相半制备级分的分析
由于多酚提取物为组成复杂的组合物，为了进一步纯化，剂量应答分析和全面的结构鉴定，必需确定何种成分具有抗癌细胞系活性。根据寡聚体大小，将正相半制备HPLC分离法(实施例3B)用来分离可可矢车菊苷配质。除开初始提取物，制备十二种级分(图2B和15O)并在100μg/mL和25μg/mL剂量下分析抗Hela和SKBR-3癌细胞系活性以确定何种寡聚体拥有最大活性。如图20A和B所示，在100μg/mL水平上，级分4-11(五聚体-十二聚体)明显抑制剂Hela和SKBr-3癌细胞系。这些结果表明这些特定的寡聚体具有抗Hela和SKBR-3细胞的最大活性，另外，可可级分D和E的正相HPLC分析表明在前面研究，如实施例7中采用的该级分富含这些寡聚体。
实施例13： HPLC纯化方法
方法A.GPC纯化
通过Sephadex LH 20(72.5×2.5cm)上的液相层析，使用100％甲醇作为洗脱溶剂，以3.5mL/分钟流速部分纯化如实施例2获得的矢车菊苷配质。在第一个1.5小时后，收集洗脱级分，并用旋转蒸发仪浓缩级分，重新溶于水中并冷冻干燥。这些级分被称为五聚体富集级分。用该方法将约2.00g从实施例2获得的提取物进行细分级分离。结果示于表9中。
                                                                     表9：获得的级分的组成
   级分(时间)     单体(％面积)   二聚体(％面积)    三聚体(％面积)    四聚体(％面积)   五聚体(％面积)    六聚体(％面积)   七聚体(％面积) 八聚体(％面积)   九聚体(％面积)    十聚体(％面积) 十一聚体(％面积)   其它(％面积)
  1:15     73     8     16     3     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND
  1:44     67     19     10     3     1     tr     tr     tr     tr     tr     tr     tr
  2:13     30     29     24     11     4     1     tr     tr     tr     tr     tr     tr
  2:42     2     16     31     28     15     6     2     tr     tr     tr     tr     tr
  3:11     1     12     17     25     22     13     7     2     1     tr     tr     tr
  3:40     tr     18     13     18     20     15     10     5     2     tr     tr     tr
  4:09     tr     6     8     17     21     19     14     8     4     2     tr     tr
ND＝未检测出
tr＝痕量
方法B.正相分离
通过在Supelcosil LC-Si，100_，5μm(250×4.6mm)上的正相层析，以1.0mL/分钟的流速或另外在Lichrosphere_Silica 100，100_，5μm(235×3.2mm)，以0.5mL/分钟的流速将如实施例2获得的矢车菊苷配质进行分离纯化。在下面条件下，用分级梯度来辅助分离：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70，10，86)。流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水(1∶1)。用其中λex＝276nm和λem＝316nm的荧光，以及通过280nm下的紫外线照射来检测各成分。注射体积为0.5μl(20mg/mL)从实施例2获得的矢车菊苷配质。这些结果示于图40A和40B中。
另一种方法，用在下面条件下的分级梯度来辅助分离：(时间，％A，％B)；(0，76，20)；(25，46，50)；(30，10，86)。流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水(1∶1)。结果示于图41A和41B。
方法C.反相分离
通过在Hewlett Packard Hypersil ODS 5μm、(200×2.2mm)，和Hewlett Packard  Hypersil ODS 5μm保护柱(20×2.1mm)的反相层析将如实施例2获得的矢车菊苷配质进行分离纯化。在20分钟内，用20％B至A的线性梯度洗脱矢车菊苷配质，接着用100％B以0.3mL/分钟的流速洗涤柱。流动相组合物为B＝1.0％乙酸的甲醇溶液与A＝2.0％乙酸的毫微纯水溶液的脱气混合物。在280nm用紫外线，及λex＝276nm和λem＝316nm的荧光来检测各成分；注射体积为2.0μl(20mg/mL)。
实施例14： 五聚体富集级分的HPLC分离
方法A.半制备正相HPLC
用装备有设置在254nm的Millipore-水类型480LC检测器的Hewlett Packard 1050 HPLC系统，通过半制备正相HPLC进一步纯化五聚体富集级分，其中该系统中装有设置在峰型的Pharmacia  Frac-100级分收集器。在与Supelco 5μ Supelguard  LC-Si保护柱(20×4.6mm)相连的Supelco 5μm Supelcosel LC-Si，100_柱(250×10mm)上进行分离。用在下面条件下的线性梯度洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70，10，86)，接着进行10分钟重新平衡，流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水(1∶1)。采用3mL/分钟的流速。254nm下，用紫外线检测各成分；并在Kipp & Zonan BD41记录仪上进行记录。注射体积范围为100-250μl将10mg矢车菊苷配质溶解在0.25mL 70％丙酮水溶液中的溶液。在规定的时间间隔上或通过人工级分收集来收集各峰或选择的层析区域以用于进一步纯化和后面的评价。
HPLC条件：250×100mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)
          半制备柱
          20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)
          保护柱
检测器：Waters LC
        分光光度计类型480@254nm
流速：3mL/分钟
柱温：室温
注射：250μl五聚体富集级分
梯度：            CH2Cl2        甲醇        乙酸∶水(1∶1)
0                  82               14             4
30                 67.6             28.4           4
60                 46               50             4
65                 10               86             4
70                 10               86             4
方法B.反相分离
将实施例13得到的矢车菊苷配质提取物用0.45μ尼龙膜过滤并用带二级管陈列检测器和HP型1046A程度荧光检测器的Hewlett Packard1090三相HPLC系统分析。在Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS柱(200×2.1mm)柱上于45℃进行分离。用60％的B对A线性梯度洗脱矢车菊苷配质，随后以0.3ml/分钟的流速以B洗柱。移动相的组成是脱气的混合物：B＝0.5％的溶于甲醇中的乙酸，A＝溶于毫微纯水中的0.5％的乙酸。A和B移动相中乙酸的浓度可增加至2％。于UV 280m检测组份的荧光，其中λex＝276nm，λem＝316nm。参照标准溶液确定(+)-儿茶酸和(-)-表儿茶酸的浓度。用对(-)-表儿茶酸的反应系数评估矢车菊苷配质的水平。
方法C.正相分离
将如实施例13获得的矢车菊苷配质提取物经0.45μ尼龙滤器过滤并用装备有二极管系统检测器和HP型1046A程序可控荧光检测器的Hewlett Packard 1090系列II HPLC系统进行分析。37℃下，在与Supelco Supelguard LC-Si 5μ保护柱(20×4.6mm)相连的5μPhenomenex Lichrosphere_Silica 100柱(250×3.2mm)上进行分离。因为下面条件的线性梯度洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A，％B)；(0，82，14)，(30，67.6，28.4)，(60，46，50)，(65，10，86)，(70，10，86)，接着进行8分钟的重新平衡，流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水，体积比为1∶1。采用0.5mL/分钟的流速。用其中λex＝276nm，λem＝316nm的荧光，或通过280nm下的紫外线检测各成分。对于一个属典型种，显示各种矢车菊苷配质分离的代表性HPLC层析示于图2中。从其它可可属(Theobroma)，可可属(Herrania)和/或其种间种内特定的杂交种获得了类似的HPLC分布图。
HPLC条件：250×3.2mm Phenomenex Lichrosphere_Silica 100
          柱(5μ)20×4.6mm Supelco Supelguard LC-Si
          (5μ)保护柱
检测器：光二极管系统@280nm
        荧光λex＝276nm；λem＝316nm
流速：0.5mL/分钟
柱温：37℃
乙酸：
梯度：        CH2Cl2         甲醇            水(1∶1)
0              82               14                 4
30             67.6             28.4               4
60             46               50                 4
65             10               86                 4
70             10               86                 4
方法D.制备正相分离
通过Rigaud等(1993)层析杂志654，255-260的方法的改进，用制备正相层析进一步纯化如实施例13获得的五聚体富集级分。
室温下，用适宜的保护柱在5μSupelcosil LC-Si100_柱(50×2cm)上进行分离。用在下面条件下的线性梯度洗脱矢车菊配质：(时间，％A，％B，流速)；(0，92.5，7.5，10)，(10，92.5，7.5，40)；(30，91.5，18.5，40)；(145，88，22，40)；(150，24，86，40)；(155，24，86，50)；(180，0，100，50)。使用前，按下面方案混合流动相各成分：
溶剂A的制备(82％CH2Cl2，14％甲醇，2％乙酸，2％水)：
1.量取80mL水并倒至4L瓶中。
2.量取80mL乙酸并倒至同一4L瓶中。
3.量取560mL甲醇并倒至同一4L瓶中。
4.量取3280mL二氯甲烷并倒至该4L瓶中。
5.盖上瓶子并混合均匀。
6.用高纯度氦将混合物清洗5-10分钟以脱气。
将步骤1-6重复两次以产生8体积的溶剂A。
溶剂B的制备(96％甲醇，2％乙酸，2％水)。
1.量取80mL水并倒至4L瓶中。
2.量取80mL乙酸并倒至同一4L瓶中。
3.量取3840mL甲醇并将3840甲醇倒至同一4L瓶中。
4.盖上瓶子并混合均匀。
5.用高纯度氦将混合物清洗5-10分钟以脱气。
重复步骤1-5以产生4体积溶剂B。流动相组合物为A＝二氯甲烷，含2％乙酸和2％水；B＝甲醇，含2％乙酸和2％水。柱负荷为7mL中含0.7g。254nm下，用紫外线检测各成分。可可矢车菊苷配质的典型的制备正相HPLC分离示于图42中。
HPLC条件：
柱：50×2cm 5μ Supelcosil LC-Si run 室温
流动相：A＝含2％乙酸和2％水的二氯甲烷
        B＝含2％乙酸和2％水的甲醇
梯度/流速分布图：
时间(分钟)     ％A   ％B     流速(mL/分钟)
    0     92.5   7.5     10
    10     92.5   7.5     40
    30     91.5   8.5     40
    145     88.0   22.0     40
    150     24.0   86.0     40
    155     24.0   86.0     50
    180     0.0   100.0     50
实施例15： 矢车菊苷配质的鉴定
使用装备有Lecroy 9350 500MHz示波器的HP G2025A MALDI-TOF/MS系统，用刮板/质谱的基质辅助激光解吸的电离时间(MALDI-TOF/MS)分析如实施例14，方法D获得的矢车菊苷配质。根据制造商的说明使用低分子量肽标准(HP部分号G2051A)或肽标准(HP部分号G2052A)，用2，5-二羟基苯甲酸(DHB)(HP部分号G2056A)作为相同基质来校准仪器。将1.0mg样品溶解在500μl70/30甲醇/水，并以1∶1，1∶10或1∶50(样品：基质)的比例将样品与DHB基质混合，真空下在台面干燥器中干燥。将检测器电压设在4.75KV，激光能量设在1.5与8μJ之间用阳离子方式分析样品。以多次单一试验的和来收集数据并以分子量单位和刮板时间来表示。代表性MALDI-TOF/MS示于图22A中。
图22和C显示从如实施例3描述的制备的部分纯化的矢车菊苷配质获得的并如实施例6和7描述的用于体外评价的MALDI-TOF/MS谱，其结果总结于表6中。这一数据说明本文描述的本发明化合物主要在级分D-E，而非A-C中被发现。
如下获得谱图：
如上所述将纯化的D-E级分进行MALDI-TOF/MS，除开最初用SEP-PACK_C-18柱体纯化级分。将5mg级分D-E的1mL毫微纯水溶液上样至预平衡的SEP-PACK_柱体中。将柱用5mL微毫纯水洗涤以消除污染物，并用1mL 20％甲醇洗脱矢车菊苷配质。因为它们在实施例3中已被用方法3进行了纯化，因此不需进一步纯化而直接使用级分A-C。
这些结果证实并扩展了早期的结果(见实施例5，表3，图20A和B)并表明本发明化合物具有作为阳离子多价螯合物的用途。尤其是，MALDI-TOF/MS结果总结性地说明n＝5和较高的矢车菊苷配质寡聚体(见图20A和B；和本发明目的和概述中的公式)强烈地与针对Hela和SKBR-3癌细胞系类型的抗肿瘤活性相关。n＝4或更少的寡聚体对这些模型无效。该五聚体结构明显具有存在于其中和更高的寡聚体中的提供这种活性的结构单元。另外，观察到MALDI-TOF/MS数据显示强的Na+，2Na+，K+，2K+，Ca++的M+离子，这证明了其作为阳离子多价螯合物的用途。
实施例16： 寡聚体级分的纯化
方法A.用半制备反相HPLC进行纯化
将从实施例14，方法A和B和D获得的矢车菊苷配质进一步分离以获得用于下一步结构鉴定和说明的实验量的类似寡聚体(如实施例15，18，19和20)。装备有可变波长检测器，具1mL注射孔的Rheodyne7010注射阀的Hewlett Packard 1050 HPLC系统被装有PharmaciaFRAC-100级分收集器。在与Phenomenex 10μ ODS Ultracarb_(60×10mm)保护柱相连的Phenomenex Ultracarb_ 10μODS柱(250×22.5mm)上进行分离。流动相组合物为A＝水；B＝甲醇，在下面线性梯度条件下使用：(时间，％A)；(0，85)，(60，50)，(90，0)和(110，0)，流速为5mL/分钟。在规定的时间间隔或通过人工级分收集来收集各峰或选择的层析区域用于通过MALDI-TOF/MS和NMR的进一步评价。注射负荷变化范围为25-100mg物质。代表性洗脱分布图示于图23b。
方法B.改进的半制备HPLC
将从实施例14，方法A和B和D获得的矢车菊苷配质进一步分离以获得用于下一步结构鉴定和说明的实验量的类似寡聚体(如实施例15，18，19和20)。Supelcosil LC-Si 5μ柱(250×10mm)具有Supelcosil LC-Si 5μ(20×2mm)保护柱。室温下，以3.0mL/分钟的流速进行分离。流动相组合物为A＝二氯甲烷；B＝甲醇；和C＝乙酸∶水(1∶1)；在下面线性梯度条件下使用：(时间，％A，％B)；(0，82，14)；(22，74，21)；(32，74，21)；(60，74，50，4)；(61，82，14)，接着将柱重新平衡7分钟。注射体积为60μl含12mg富含五聚体的级分。280nm下用紫外线检测成分。代表性洗脱分布图示于图23A中。
实施例17： 五聚体分子模型的建立
通过使用Desktop Molecular Modeller，3.0版本，Oxford UniversityPress，1994的分子模型的建立来确定能量最小结构。基于表儿茶酸结构的[EC(4→8)]4-EC(EC＝表儿茶酸)五聚体的四个代表性图示于图24A-D中。推测为螺旋结构。通常，当表儿茶酸为第一个单体时，则结合为4→8，β构型结果，当第一个单体为儿茶酸，则结合为4→8，α构型结果，并且无论第二个单体是否为表儿茶酸或儿茶酸(一个例外是ent-E(4→8)ent-EC)均获得这些结果。图38A-38P显示优选的五聚体，图39A-39P显示高至并包括五聚体的立体异构体库，不需过分实验，从中可制备落在本发明范围内的其它化合物。
实施例18： 矢车菊苷配质的NMR鉴定
13C NMR光谱被认为是一种常用于研究矢车菊苷配质的方法，尤其是因为酸通常提供质量良好的图谱，而质子NMR光谱相当宽。寡聚体的13C NMR光谱产生有关A或B环取代类型，C环的有关的立体化学和一些情况下的黄酮类内部连接的位置的信息。尽管如此，1H NMR光谱仍产生有用的信息。
而且，HOHAHA使用脉冲方法将第一个氢的磁化顺序地转移至第二个以获得对应于α，β，γ或δ质子的交叉峰。COSY是一种2D-Fourier转移NMR方法，其中垂直和水平轴提供1H化学移动和1D光谱；横切位置提供质子之间的相互关系，从可确定自旋-自旋偶合。HMQC光谱增加了核NMR光谱的敏感性，而非质子并且可揭示从第二和第四个碳至相应质子的交叉峰。APT为用于确定位于碳位置的氢的数目的13C方法。位于碳位置的质子的偶数将产生阳性信号，而位于碳位置的质子的奇数将产生阴性信号。
因此13C NMR，1H NMR，HOHAHA(同核Hartmann-Hahn)HMQC(异核多量子相干)，COSY(同核相关光谱学)，APT(附着质子试验)和XHCORR(HMQC的改进)光谱学被用来说明本发明的结构。
方法A.单体
室温下，用约10mg/mL的样品浓度在氘化甲醇中获得所有光谱。使用甲醇作为内部标准，在Bruker 500MHZ NMR上获得光谱。
图44A-E代表用来表征表儿茶酸单体的结构的NMR光谱。图44A表明为平片状形式的1H和13C的化学变化。图44B-E表明表儿茶酸的1H，APT，XHCORR和COSY谱。
类似地，图45A-F代表用来表征儿茶酸单体结构的NMR谱。图45A表明为平片状形式的1H和13C的化学转变。图44B-F表明儿茶酸的1H，13C，APT，XHCORR和COSY谱。
方法B.二聚休
使用丙酮作为内部标准，约10mg/mL浓度的样品，在75％氘化甲醇的D2O溶液中获得所有光谱。
图46A-G代表被用来表征B2二聚体结构的光谱。图46A表明为平片状形式的1H和13C的化学转变。术语T和B代表二聚休的上半部和二聚体的下半部。
图46B和C分别表明室温下，在Bruker 500MHZ NMR上获得的13C和APT谱。
图46D-G分别表明-7℃下，在AMZ-360MHZ NMR上获得的1H，HMQC，COSY和HOHAHA。使用梯度脉冲获得COSY谱。
图47A-G代表被用来表征B5二聚体结构的光谱。图47A表明为平片状形式的13C和1H的化学转变。
图47B-D分别表明室温下，在Bruker 500MHZ NMR上获得的1H，13C和APT。
图47E表明室温下，使用梯度脉冲在AMX-360上获得的COSY光谱。
图47F和G表明室温下，分别在AMX-360MHZ NMR上获得的HMQC和HOHAHA。
方法C.三聚体-表儿茶酸/儿茶酸
-3℃下，在AMX-360MHZ NMR上，使用丙酮作为内部标准，和10mg/mL的适宜样品浓度在75％氘化丙酮的D2O溶液中获得所有光谱。
图48A-D代表被用来表征表儿茶酸/儿茶酸三聚体的结构的光谱。这些图分别显示1H，COSY，HMQC和HOHAHA。使用梯度脉冲获得COSY谱。
方法D.三聚体-全是表儿茶酸
在AMX-360MHZ NMR上，使用丙酮作为内部标准和10mg/mL的适宜样品浓度在70％氘化丙酮的D2O溶液中获得所有光谱。
图49A-D代表被用来表征所有表儿茶酸三聚体的结构的光谱。这些图分别显示1H，COSY，HMQC和HOHAHA。使用梯度脉冲获得COSY光谱。
实施例19： 矢车菊苷配质的硫解
在表征矢车菊苷配质的努力中，将苄基硫醇(BM)与儿茶酸，表儿茶酸或二聚体B2和B5反应。苄基硫醇以及间苯二酚和苯硫酚在醇/乙酸环境中可用于矢车菊苷配质的水解(硫解作用)。将儿茶酸，表儿茶酸或二聚体(B2和B5二聚体的1∶1混合物)(2.5mg)溶于1.5mL乙醇，100μl BM和50μl乙酸中，并将容器(Beckman氨基酸分析容器)抽空，反复用氮清洗直至最后用氮清洗之后是密封反应容器。将反应容器置于95℃下的热装置中，在30，60，120和240分钟时获得反应的等分样品。分别代表表儿茶酸，儿茶酸和二聚体的各个等分样品的相对荧光示于图25A-C中。更高寡聚体被类似硫解。
实施例20： 二聚体的硫解和脱硫作用
通过将二聚体(B2或B5；1.0mg)溶解在600μl乙醇，40μl BM和20μl乙酸中，用硫醇将二聚体B2和B5水解。95℃，氮气氛中，在Beckman氨基酸分析容器中将混合物加热4小时，抽取等分样品用于反相HPLC分析，并将75μl各种乙醇阮内(Raney)镍和棓酸(10mg/mL)加入2mL小瓶中的剩余反应物中。氢气氛下清洗容器，偶尔摇荡达1小时。将产物经0.45μ滤器过滤并用反相HPLC分析。代表性洗脱分布图示于图26A和B中。更高寡聚体被类似脱硫。该数据表明表儿茶酸或儿茶酸的聚合作用，从而代表制备本发明化合物的合成途径。
实施例21： 在MDA MB231裸鼠模型中五聚体的体内活性
MDA-MB-231/LCC6细胞系。让细胞系在改进的含10％胎牛血清的基本必需培养基(IMEM)上生长并37℃下，保持在湿润的，5％CO2气氛中。
小鼠。从NCI购得雌性六至八周龄NCr nu/nu(裸鼠)小鼠并圈养于动物实验室中且根据由美国农业部和美国实验动物饲养鉴定协会提出的规则来饲养。每两天及每周称重患肿瘤的小鼠以确定适宜的药物剂量。
肿瘤移植。用IMEM将组织培养的MDA-MD-231稀释至3.3×106细胞/mL，在小鼠各侧的乳头2和3之间皮下注射0.15mL(即0.5×106细胞)。通过乘法计算肿瘤体积：长度×宽度×高度×0.5。计算处理组的肿瘤体积的平均值并用学生实验来计算p值。
样品制备。通过心穿刺获得血浆样品并与15-20mM EDTA一起贮存于-70℃以用于血液化学测定的目的。在对照组和实验组之间未注意到有不同。
前面经皮下注射肿瘤细胞系MDA-MB-231而被500,000细胞感染的15只裸鼠被随机分成每组有5只动物的三组，并用下面中的一种经腹膜注射来处理：(i)仅含赋形剂(DMSO)的安慰剂；(ii)赋形剂(DMSO)中含2mg如实施例14方法D中分离的纯化的五聚体矢车菊苷配质提取物/小鼠；和(iii)在赋形剂(DMSO)中含10mg如实施例14方法D中分离的纯化的五聚体矢车菊苷配质提取物/小鼠。
在给药10mg后，组(iii)小鼠在约48-72小时之内死亡，而组(ii)小鼠显示正常。组(iii)小鼠的死亡原因不确定；且可不必须归于给药本发明的化合物。然而，10mg被认为是毒性的较高限度。
每周重复对组(i)和(ii)的处理，监测每实验组和对照组的肿瘤生长。在处理两周后，在组(ii)小鼠中未观察到毒性信号，并且后来每周以1/2对数大小的增量增加对该组的给药剂量。下表表示在组(ii)小鼠的处理过程中的给药剂量：
    天   ％存活组(i)   ％存活组(ii)   ％存活组(iii)
    18     100     100
    19     100     100
    20     100     100
    21     100     100
    22     75     100
    23     75     100
    24     75     100
    25     75     100
    26     75     100
    27     75     100
    28     75     100
    29     50     100
    30     50     100
    31     50     100
    32     50     100
    33     50     100
    34     50     100
    35     50     100
    36     25     100
    37     25     100
    38     25     100
    39     25     100
    40     25     100
    41     25     100
    42     25     100
    43     25     80
    44     25     80
    45     25     80
    46     25     80
周          剂量(mg/小鼠)
1           2
2           2
3           4
4           5
5           5
6           5
7           5
处理结果示于图27A和B及表10中。
表10：体内抗癌结果
    天   ％存活组(i)   ％存活组(ii)   ％存活组(iii)
    1     100     100     100
    2     100     100     100
    3     100     100     0
    4     100     100
    5     100     100
    6     100     100
    7     100     100
    8     100     100
    9     100     100
    10     100     100
    11     100     100
    12     100     100
    13     100     100
    14     100     100
    15     100     100
    16     100     100
    17     100     100
    天   ％存活组(i)   ％存活组(ii)   ％存活组(iii)
47 25 80
    48     25     80
    49     25     80
    50     25     60
    51     25     60
    52     25     60
    53     25     60
    54     25     60
    55     25     60
    56     25     60
    57     0     40
    58     40
    59     40
    60     40
    61     40
    62     40
    63     40
    64     40
这些结果表明本发明的级分及本发明的化合物确实在抗肿瘤组合物中具有用途，且在低和中等剂量时没有毒性，在不需过分实验即可确定的较高剂量时具有毒性。
实施例22： 可可提取物的抗微生物活性
方法A：
进行研究以评价来自可可豆的粗矢车菊苷配质提取物的抗在食物酸败或致病中非常重要的各种微生物的抗微生物活性。在该研究中使用来自实施例2方法A的可可提取物。用1mL每种细胞培养物悬液的0.45％盐溶液(最终群体数为102-104cfu/mL)接种适宜于各种试验培养物生长的琼脂培养基，并倒入培养皿中。用#2木栓穿孔器(5mm直径)将孔切至硬化的琼脂中。让平板置于4℃冰箱中过夜以使提取物扩散至琼脂中，并随后在对目的微生物适宜的生长温度下保温。结果如下：
                         抑制的样品区(mm)
提取物浓度(mg/mL)   圆形芽胞杆菌   蜡样芽胞杆菌   金黄色葡萄球菌  铜绿假单孢菌    枯草杆菌
    0     Nl     Nl     Nl     Nl     Nl
    25     Nl     12     Nl     11     Nl
    250     12     20     19     19     11
    500     14     21     21     21     13
Nl＝无抑制作用
在使用上述孔扩散分析(在方法A中)，用全黄色葡萄球菌作为目的培养物的研究中证明来自可可豆的纯化的矢车菊苷配质的抗微生物活性。结果如下：
可可提取物：如实施例13方法A中的10mg/100μl除去咖啡因的/除去可可碱的丙酮提取物
如实施例14方法D中的10mg/100μl二聚体(99％纯度)
如实施例14方法D中的10mg/100μl四聚体(95％纯度)
如实施例14方法D中的10mg/100μl六聚体(88％纯度)
如实施例14方法D中的10mg/100μl八聚体/九聚体(92％纯度)
如实施例14方法D中的10mg/100μl九聚体和更高聚体(87％纯度)
抑制的样品区(mm)
0.45％盐溶液                  0
二聚体                        33
四聚体                        27
六聚体                        24
0.45％盐溶液                  0
八聚体                        22
九聚体                        20
除去咖啡因/除去可可碱         26
方法B：
以变化的浓度将如实施例2方法2的粗矢车菊苷配质提取物加入具酚红(0.08g/L)的TSB(胰胨豆胨培养液)中，将TSB用猪霍乱沙门氏菌或纽波特沙门氏菌(105cfu/mL)接种，并在35℃下保温18小时。结果如下：
              猪霍乱沙门氏菌            纽波特沙门氏菌
0mg/mL              +                          +
50                  +                          +
100                 +                          +
250                 +                          -
500                 -                          -
750                 -                          -
其中+＝生长，-＝不生长，从肉汤培养基产酸由红变为黄的变化而得以证实。通过从TSB管平板接种至XLD平板上来证实抑制。
本实施例证实本发明化合物可用于食品制备和保存。
本实施例进一步证实本发明化合物可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长。从中本发明化合物可被用于抑制幽门螺杆菌。在导致胃溃疡和胃肿瘤中已涉及到幽门螺杆菌。因此，本发明化合物可被用来治疗或预防细菌起源的这些和其它疾病。考虑本领域熟知的因素，如疾病，个体的年龄，体重，性别和通常的健康状况，不需要过分实验即可确定适宜的给药途径，剂量和制剂。
实施例23： 提取物的无卤素分析分离
通过流速为1.0mL/分钟，柱温为37℃的在100_Supelcosil LC-Si上的无卤素正相色谱部分纯化从实施例2获得的矢车菊苷配质。用下面条件下的线性梯度来辅助分离：(时间，％A，％B)；(0，82，14)；(30，67.6，28.4)；(60，46，50)。流动相组合物为A＝30/70％二乙基醚/甲苯；B＝甲醇；及C＝乙酸/水(1∶1)。在280nm处用紫外线检测各成分。代表性洗脱分布图示于图28。
实施例24： 用于矢车菊苷配质的正相HPLC分离的固定相的孔大小的作 用
为了改善矢车菊苷配质的分离，研究硅固定相的更大的孔大小的使用。在硅-300，5μm，300_(250×2.0mm)或另一种方法，在硅-1000，5μm，1000_(250×2.0mm)上进行分离。使用作流动相组成的线性梯度为：A＝二氯甲烷；B＝甲醇；及C＝乙酸/水(1∶1)。用其中λex＝276nm，λem＝316nm的荧光，在280nm下用紫外线检测器检测各成分。流速为1.0mL/分钟，烘箱温度为37℃。来自三个不同柱(100_孔大小，来自实施例13，方法D)的代表性色谱图示于图29。这表明了用于矢车菊苷配质分离的有效的孔大小。
实施例25： 借助于进行发酵获得所需矢车菊苷配质
与可可发酵相关的一系列微生物菌株的代表选自M&M/Mars可可培养物群。采用下面的分离物：
醋化醋杆菌ATCC 15973
乳酸杆菌(BH 42)
Candida cruzii(BA 15)
啤酒糖酵母(BA 13)
蜡状芽孢杆菌(BE 35)
球形芽孢杆菌(ME 12)
将各菌株从贮用培养物转移至新鲜培养基中。26℃下，将酵母和醋化醋杆菌保温72小时，37℃下，将芽孢杆菌和乳酸杆菌保温48小时。使用前用5mL磷酸缓冲液收集斜面培养物。
从新鲜荚果收获可可豆，除去果肉和壳。将豆用过氧化氢(35％)消毒20秒，接着用过氧化氢酶处理直至停止起泡。将豆用无菌水漂洗两次并重复该过程。将豆分至两个玻璃缸中并根据下表中详述的方法处理：
水 乙醇/酸 发酵浸溃物 样品发酵
每天转移至新鲜水中 在样品果肉发酵的各个阶段，每天转移至对应于测定水平的醇和酸溶液中 在发酵的连续每天中每天转移至发酵的巴氏消毒的果肉中 在用试验菌株共同接种的无菌果肉中的小试规模的样品发酵
将小试规模的发酵进行两次。如下所示保温所有处理物：
第一天：26℃
第二天：26℃-50℃
第三天：50℃
第四天：45℃
第五天：40℃
在研究期间，通过平板计数以评价微生物菌群及HPLC分析发酵培养基的微生物代谢物的产生来监测样品发酵。处理后，在层流罩超静台下将豆干燥至水活性为0.64，并在66℃烘烤15分钟。制备样品以用于矢车菊苷配质分析。将每次处理的三颗豆研磨并用己烷脱脂，接着用丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5％)提取。将丙酮溶液提取物过滤至小瓶中，并用如实施例13，方法B中的正丁HPLC定量多酚水平。将剩余的豆研磨并试验。样品桌面发酵法的培养和分析分布图示于图30A-C。经过各种发酵处理的可可豆的矢车菊苷配质分布图示于图30D。
本实施例证实本发明不需局限于任何特定的可可属典型种，并且通过发酵，由特定的可可属(Theobroma)或可可属(Herrania)种或其种间或种内种的特异性杂交种产生的矢车菊苷配质的水平可被调节，例如增加。
下表显示在为可可属(Theobroma)和其种间或种内种的特异性杂交种的代表的种中测得的矢车菊苷配质水平。如实施例1和2(方法1和2)制备样品，并如实施例13，方法B进行分析。该数据说明包含本发明化合物的提取物在可可(Theobroma)和可可(Herrania)的种，以及其种内和种间种的特异性杂交性中被发现。
在脱脂粉末中可可和Herrania种的矢车菊苷配质水平ppm(μg/g)
                                                                                           寡聚物
样品     单体    二聚体     三聚体     四聚体     五聚体    六聚体     七聚体    八聚体   九聚体   十聚体  十一聚体   总数
T.grandillorum x T.obovatum 11     3822     3442     5384     4074     3146     2060     850     421     348     198     tr+   23,765
T.grandillorum x T.obovatum 21     3003     4098     5411     3983     2931     1914     1090     577     356     198     tr   23,561
T.grandillorum x T.obovatum 3A1     4990     4980     7556     5341     4008     2576     1075     598     301     144     tr   31,569
T.grandillorum x T.obovatum 3B1     3880     4498     6488     4930     3706     2560     1208     593     323     174     tr   28,360
T.grandillorum x T.obovatum 41     2647     3591     5328     4240     3304     2380     1506     815     506     249     tr   24,566
T.grandillorum x T.obovatum 61     2754     3855     5299     3872     2994     1990     1158     629     359     196     88   23,194
T.grandillorum x T.obovatum SIN1     3212     4134     7608     4736     3590     2274     936     446     278     126     ND*   23,750
T.obovatum 11     3662     5683     9512     5358     3858     2454     1207     640     302     144     ND   32,820
T.grandillorum TEFFE2     2608     2178     3090     2704     2241     1586     900     484     301     148     tr   16,240
T.grandillorum TEFFE x T.grandiflorum2     4773     4096     5289     4748     3804     2444     996     737     335     156     tr   27,380
T.grandillorum x T.subincanum1     4752     3336     4916     3900     3064     2039     782     435     380     228     ND   23,832
T.obovatum x T.subincanum1     3379     3802     5836     3940     2868     1807     814     427     271     136     tr   23,280
T.speciosum x T.sylvestris1     902     346     1350     217     152     120     60     tr     tr     ND     ND   3,147
T.microcarpum2     5694     3250     2766     1490     822     356     141     tr     ND     ND     ND   14,519
T.cacao，SIAL 659，t0     21,929     10,072     10,106     7788     5311     3242     1311     626     422     146     tr   60,753
T.cacao，SIAL 659，t24     21,088     9762     9119     7094     4774     2906     1364     608     381     176     tr   57,252
T.cacao，SIAL 659，t48     20,887     9892     9474     7337     4906     2929     1334     692     412     302     tr   58,165
T.cacao，SIAL 659，t96     9552     5780     5062     3360     2140     1160     464     254     138     tr     N0   27,910
T.cacao，SIAL 659，1120     8581     4665     4070     2527     1628     888     326     166     123     tr     ND   22,974
Pod Rec.10/96，Herrania mariae     869     1295     545     347     175     97     tr    *ND     ND   3329
在10/96之前的样品记录Herrania mariae     130     354     151     131     116     51     tr     ND     N0   933
ND＝未检测 样品指定CPATU tr＝痕量(＜50μg/g)  *样品指定ERJON
实施例26：矢车菊苷配质对NO的作用
方法A
本研究的目的是建立矢车菊苷配质(如实施例14，方法D)与NO之间的关系，其中NO被已知诱导大脑血管扩张。评价浓度范围为100μg/mL-0.1μg/mL的单体和较高寡聚体对来自HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的硝酸盐(NO的分解代谢物)的产生的影响。在存在或不存在各种矢车菊苷配质时研究HUVEC(来自Clnetics)24或48小时。在实验末期，收集上清并用量热分析确定硝酸盐的含量。在各单独实验中，在存在或不存在矢车菊苷配质时，将HUVEC与乙酰胆碱一起保温24-48小时，其中乙酰胆碱被已知诱导NO产生。在实验末期，收集上清并用量热分析确定硝酸盐的含量。通过加入为NO合成酶特异性阻断剂的硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸来确认NO的作用。
方法B.苯福林诱导的收缩的大鼠动脉的血管松驰
100μg/mL-0.1μg/mL各种矢车菊苷配质对大鼠动脉的作用是研究苯福林诱导的收缩的大鼠动脉血管松驰的目的。在存在或不存在矢车菊苷配质(如实施例14，方法D)时保温分离的大鼠动脉，并用肉眼观察来评价肌张力的改变。确定大鼠动脉的收缩或舒张。接着，使用其它器官，在加入肾上腺素时诱导分离的大鼠动脉的预收缩。一旦收缩稳定，加入矢车菊苷配质并确定大鼠动脉的收缩或舒张。通过加入硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸确认NO的作用。如苯福林预收缩大鼠主动脉所完成的，乙酰胆碱诱导的NO的释放示于图31中。
方法C.大鼠低血压的诱导
本方法针对各种矢车菊苷配质(如实施例14，方法D)对血压的作用。给大鼠装上血压计以监测收缩和舒张血压。静脉内注射各种矢车菊苷配质(剂量范围＝100～0.1μg/kg)，确定血压的改变。此外，确定各种矢车菊苷配质对由肾上腺素引起的血压改变的影响。通过加入硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸确认NO的作用。
这些研究与下一个实施例一起说明可用于调节血管扩张，并且可进一步用于调节血压或改善冠状动脉状况，和周期性偏头痛状况。
实施例27： 可可多酚对饱感的影响
使用血液葡萄糖水平作为体内发生用于调节食欲和饱感的信号事件的指示剂，选用年龄为48岁的健康男性成年志愿者进行一系列简单实验以确定可可多酚是否调节葡萄糖水平。根据由Clapperton等(1992)描述的方法从巴西可可豆部分纯化可可多酚。该物质不包含咖啡困或可可碱。在喝入10流体盎司含和不含75mg可可多酚的Dexicola 75(无咖啡因)葡萄糖耐量试验饮料(Curtin Matheson 091-421)后，在定时的基础上分析加快的血液葡萄糖水平。该多酚水平代表试验饮料的总葡萄糖的0.1％并反映出将以标准100g巧克力棒形式存在的大约量。使用Accu-Chek III血液葡萄糖监测系统(Boehringer Mannheim公司)测定血液葡萄糖水平。在喝入试验饮料，以及在以下面规定的时间间隔喝入试验饮料之后测定血液葡萄糖水平：15，30，45，60，75，90，120和180分钟。在开始各葡萄糖耐量试验之前，测定高和低葡萄糖水平对照。将各葡萄糖耐量试验重复进行两次。对包含溶解在10流体盎司蒸馏水(无葡萄糖)中的75mg可可多酚的对照试验溶液也进行实验。
下面表11列出了由本研究中进行的各葡萄糖耐量试验所得的数据和对照值。图32代表具有在三小时时间过程中获得的血液葡萄糖水平的平均值和标准偏差。很容易看出在喝入包含可可多酚的试验混合物之后获得的血糖水平有显著增加。两个主要葡萄糖耐量分布图之间的差别不能由在喝入仅有可可多酚的溶液后获得的分布图来解决。向葡萄糖试验饮料中加入可可多酚显著提高了葡萄糖耐量分布图。尽管其典型的葡萄糖耐量分布图被认为是正常的(Davidson，I.等，编者Todd-借助于实验室方法的Sandford临床诊断第14版；W.B.Saunders Co.；费城，PA 1969 Ch.10，pp.550-9)，但血液葡萄糖水平的这种升高是在被认为是中等糖尿病的范围中。这提示由于本发明的化合物，另外的葡萄糖的差异被从糖原贮存部位释放至血液中。因此，本发明可用来在存在糖时调节血液葡萄糖水平。
表11.葡萄糖耐量试验数据和对照结果
    周     描述     高对照a     低对照b
    0     葡萄糖耐量     265mg/dL     53mg/dL
    1     对0.1％多酚的葡萄糖耐量     310     68
    2     葡萄糖耐量     315     66
    4     对0.1％多酚的葡萄糖耐量     325     65
    5     0.1％多酚     321     66
a＝预期范围：253-373mg/dL
b＝预期范围：50-80mg/dL
个体在摄入本发明化合物后还经历了面潮红(红斑)和见光头痛，这说明调节血管舒张。
表12和13中存在的数据说明这样的事实，即从属于可可原材料和商品巧克力且本发明化合物包含在其中的本发明的提取物可被用作药物，兽医和食品科学制品及运用物的赋形剂。
表13：商品巧克力中的矢车菊苷配质水平
                    μg/g
样品     单体    二聚体    三聚体   四聚体   五聚体   六聚体   七聚体和更高     总计
牌号1     366     166     113     59     56     23     18     801
牌号2     344     163     111     45     48     ND*     ND     711
牌号3     316     181     100     41     40     7     ND     685
牌号4     310     122     71     27     28     5     ND     563
牌号5     259     135     90     46     29     ND     ND     559
牌号6     308     139     91     57     47     14     ND     656
牌号7     196     98     81     58     54     19     ND     506
牌号8     716     472     302     170     117     18     ND     1,795
牌号9     1,185     951     633     298     173     25     21     3,286
牌号10     1,798     1,081     590     342     307     93     ND     4,211
牌号11     1,101     746     646     372     347     130     75     3,417
牌号12     787     335     160     20     10     8     ND     1,320
ND*＝未检测出
表14：在可可原料中的矢车菊苷配质水平
                    μg/g
样品 单体  二聚体   三聚体   四聚体   五聚体   六聚体   七聚体和更高     总计
未发酵 13,440  6,425   6,401   5,292   4,236   3,203    5,913     44,910
发酵 2,695  1,538   1,362   740   470   301    277     7,383
烘烤 2,656  1,597   921   337   164   ND*    ND     5,675
巧克力溶液 2,805  1,446   881   442   184   108    ND     5,866
可可壳 114  53   14   ND   ND   ND    ND     181
可可粉1％脂肪 506  287   112   ND   ND   ND    ND     915
可可粉11％脂肪 1,523  1,224   680   46   ND   ND    ND     3,473
红荷兰可可粉，pH7.4，11％脂肪 1,222  483   103   ND   ND   ND    ND     1,808
红荷兰可可粉，pH8.2，23％脂肪 168  144   60   ND   ND   ND    ND     372
ND*＝未检测出
实施例28： 矢车菊苷配质对环加氧酶1和2的影响
通过室温下，在存在各种浓度的包含单体至十聚体及矢车菊苷配质混合物的矢车菊苷配质溶液时，将来自公羊精液小泡和羊胎盘的酶分别与花生四烯酸(5μM)一起保温10分钟来评价矢车菊苷配质对环加氧酶1和2(COX1/COX2)活性的影响。使用来自Interchim的PGF2 EIA盒(法国)评价转换。吲哚美辛被用作参考化合物。结果提供在下表中，其中如实施例14，方法D中，IC50值以μM的单位来表示(除开S11，它代表从实施例13，方法A制备的矢车菊苷配质混合物，且其中样品S1-S10依次代表矢车菊苷配质寡聚体(单体至十聚体)，且IC50以mg/mL单位来表示)。
    样品#     IC50COX-1(*)     IC50COX-2(*)     比例IC50COX2/COX1
    1     0.074     0.197     2.66
    2     0.115     0.444     3.86
    3     0.258     0.763     2.96
    4     0.154     3.73     24.22
    5     0.787     3.16     4.02
    6     1.14     1.99     1.75
    7     1.89     4.06     2.15
    8     2.25     7.2     3.20
    9     2.58     2.08     0.81
    10     3.65     3.16     0.87
    11     0.0487     0.0741     1.52
    吲哚美辛     0.599     13.5     22.54
(*)除开样品11为mg/mL，其余以μM表示。
抑制研究的结果提供在图33A和B中，其中它显示吲哚美辛对COX1和COX2活性的影响。图34A和B表明矢车菊苷配质的聚合度与对COX1和COX2的IC50之间的相互关系；图35表明对COX1和COX2的IC50值间的相互关系。并且图36A-Y表明各样品(S1-S11)对COX1和COX2的IC50值。
这些结果说明本发明化合物具有镇痛，抗凝血剂，及抗炎症用途。而且，COX2已与结肠癌有关。本发明化合物对COX2活性的抑制说明一种可能的机理，通过它本发明化合物具有针对结肠癌的抗肿瘤活性。
COX1和COX2还参与前列腺素的合成。因此，本实施例的结果还说明可调节肾功能，免疫应答，发烧，疼痛，有裂分裂，偏程性细胞死亡，前列腺素的合成，溃疡形成(如胃溃疡)以及生殖。注意到肾功能的调节可影响血压；再一次意味着本发明化合物参与调节血压，血管舒张和冠状血管(如调节血管紧张肽，缓激肽)。
参考Seibert等，PNAS USA 91：12013-12017(12，1994)，Mitchell等，PNAS USA 90：11693-11697(12，1994)，Dewitt等，细胞83：345-348(113，1995)，Langenbach等，细胞83：483-92(113，1995)和Sujii等，细胞83：493-501(113，1995)，Morham等，细胞83：473-82(113，1995)。
进一步参考实施例9，26和27。在实施例9中，显示了本发明化合物的抗氧化剂活性。在实施例26中，证实了对NO的影响。且在实施例27中提供了面部血管舒张的证据。从本实施例的结果，结合实施例9，26和27，本发明化合物可调节驱动生理作用的自由基机理。类似地，本发明可调节从生化上直接针对白三烯合成的脂肪氧化酶介导的自由基类型的反应，从而影响后来的生理活动(如炎症，免疫应答，冠状血管状况，致癌机理，发烧，疼痛，溃疡)。
因此，除开具有镇痛性质外，当与其它止痛药一起服用时，本发明化合物还可具有协同作用。同样，除开具有抗肿瘤性质外，当与其它抗肿瘤剂一起服用时，本发明化合物还可具有协同作用。
实施例29： 圆二色性/矢车菊苷配质的研究
进行CD研究努力解释如在实施例14方法D中的纯化的矢车菊苷配质的结构。使用CD光谱软件AVIV 60DS V4.1f，在25℃下收集光谱。
在300nm-185nm，以1.50nm带宽，每次1.00nm扫描样品。代表性CD光谱示于图43A-G，它们显示二聚体至八聚体的CD光谱。
这些结果说明了本发明化合物的螺旋结构。
实施例30： 可可矢车菊苷配质对幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作 用
进行研究以评价矢车菊苷配质寡聚体对幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。如实施例13，方法A所描述地制备五聚体富集物并如实施例14，方法C所描述地进行分析，其中89％为五聚体，11％为更高的寡聚体(n为6-12)。如实施例14，方法D所描述地制备纯化的五聚体(96.3％)。
幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。对于幽门螺杆菌，将管形瓶用0.5mL胰冻豆胨培养液重新水合，并将悬液转移至含5％去纤维形成的羊血的新鲜TSA斜面上。37℃下，在厌气瓶中(5-10％二氧化碳；CampyPakPlus，BBL)，在微需氧条件下将斜面保温3-5天。当在斜面底部的培养液层中形成良好的生长时，将培养液用来接种含羊血的另外的TSA斜面。由于存活率随连续传代培养而降低，因此，汇集从斜面收集的培养液并贮存于-80℃。直接使用来自冻冷管形瓶的用于分析的培养物。将金黄色葡萄球菌培养在TSA斜面上并在使用前24小时时转移至新鲜斜面上。
制备各种培养物的细胞悬液(幽门螺杆菌，108-109cfu/mL；金黄色葡萄球菌106-107cfu/mL)，并将0.5mL涂布到含5％羊血的TSA平板上。将标准分析盘(Difco)浸入过滤灭菌的五聚体的一系列稀释物中(23mg/mL至无菌水)。将试验盘和空白对照盘(无菌水)放在被接种的平板上。含80μg甲硝唑(对幽门螺杆菌物有抑制性)或30μg万万古霉素(对金黄色葡萄球菌有抑制性)(BBL Sensidiscs)的对照盘也放在平板的适宜部位。在微有氧条件下保温幽门螺杆菌接种的平板。将金黄色葡萄球菌进行有氧保温。生长后测定抑制区。
表14.五聚体对幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌的生物分析
  富含五聚体的级分(mg/ml) 金黄色葡萄球菌的抑制(mm)  幽门螺杆菌的抑制(mm)
  0     NI     NI
  15     0     10
  31     10     10
  62     11     11
  125     13     13
  250     15     13
  万古霉素标准     15     --
  甲硝唑标准     --     11
  96％纯五聚体     15     11
NI＝没有抑制
实施例31：豚鼠中的NO依赖性低血压
研究五种可可矢车菊苷配质级分对豚鼠血压的影响。简而言之，注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉豚鼠(约400g体重；雄性和雌性)。颈动脉插管以监测动脉血压。经颈静脉静脉注射五种可可矢车菊苷配质级分(剂量范围为0.1mg/kg-100mg/kg)。在多道记录仪上记录血压的变化。在这些实验中，通过在给药可可矢车菊苷配质级分之前10分钟给药L-N-甲基精氨酸(1mg/kg)来确定NO的作用。
根据被本文引作参考的美国专利5,554,645中描述的方法制备和分析可可矢车菊苷配质级分。
组分A：代表由单体-四聚体组成的制备HPLC级分。HPLC分析揭示出下面的组成：
单体         47.2％
二聚体       23.7
三聚体       18.7
四聚体       10.3
级分B：代表由五聚体-十聚体组成的制备HPLC级分。HPLC分析揭示出下面的组成：
五聚体         64.3％
六聚体         21.4
七聚体         7.4
八聚体         1.9
九聚体         0.9
十聚体         0.2
级分C：代表用于制备级分A和B(上面)的富集的可可矢车菊苷配质级分。HPLC分析揭示出下面的组成：
单体           34.3％
二聚体         17.6
三聚体         16.2
四聚体         12.6
五聚体         8.5
六聚体         5.2
七聚体         3.1
八聚体         1.4
九聚体         0.7
十聚体         0.3
级分D：代表由牛奶巧克力制备的矢车菊苷配质提取物。HPLC分析揭示出类似于在表12中对于牌号8所列的组成。另外，存在10％的咖啡因和6.3％的可可碱。
级分E：代表由用碱化水溶液制备的黑巧克力而制得的矢车菊苷配质提取物。HPLC分析揭示出类似于在表12中对于牌号12所列的组成。另外，存在16.0％的咖啡因和5.8％的可可碱。
在三个单独的实验中，研究了给药10mg/kg可可矢车菊苷配质级分对麻醉的豚鼠的动脉血压的影响。静脉注射时，矢车菊苷配质级分A和E导致血压降低约20％。这种降低仅仅在一定程度上不同于从溶剂(DMSO)对照(15±5％，n＝5)所获得的。相反，矢车菊苷配质级分B，C和D(10mg/kg)诱导血压显著降低，对于级分C高达50-60％。在这些实验中，低血压效果的顺序如下：C＞B＞D＞＞A＝E。
在注射矢车菊苷配质级分后产生的血压的典型记录对于级分提供在图50A，对于级分C在图50B。图51说明这些级分对血压的比较效果。
使用L-N-甲基精氨酸(LNMMA)分析NO对由给药级分C诱导的豚鼠低血压的可能的作用。该药剂通过抑制NO合成酶而抑制NO的形成。在注射可可矢车菊苷配质级分之前10分钟以1mg/kg的剂量给药L-NMMA。如图52中所示，用L-NMMA处理动物完全阻断了
由矢车菊苷配质级分C引发的低血压。的确，在用该抑制剂处理之后，由级分C产生的血压的变化类似于仅使用溶剂观察到的那些。
实施例32：可可矢车菊苷配质级分对人脐静脉内皮细胞中的NO的产生的影响
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)从Clonetics获得，并根据生产商的说明进行培养物的培养。将HUVEC细胞以5,000细胞/cm2接种在12孔平板中(Falcon)。在相同条件下的第三代之后，让它们达到铺满。用包含规定浓度的缓激肽(25，50和100nM)或如实施例31所描述的可可矢车菊苷配质级分A-E(100μg/mL)的新鲜培养基更新上清。继续培养24小时，收集无细胞上清并在如下所描述地评价NO含量之前冷冻贮藏。在选择的实验中，加入NO合成酶(NOS)拮抗剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10μM)以评价在所观察的NO产生中的NOS的参与。
通过用Griess反应测定培养物上清中的亚硝酸盐浓度来测定HUVEC NO的产生。Griess试剂为1％磺胺，0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐。简而言之，反复四次从各种上清取出50μl等分样品并与150μl Griess试剂一起保温。540nm下，在多重扫描仪(multiscan)(Labsystems Multiskans MCC/340)中测定吸光度。采用规定浓度的亚硝酸钠以建立标准曲线。将无细胞培养基(空白)的吸光度从用包含细胞的上清获得的值中减去。
图53说明缓激肽对HUVEC的NO产生的影响，其中观察到剂量依赖性NO的释放。抑制剂L-NAME完全抑制缓激肽诱导的NO的释放。
图54说明可可矢车菊苷配质级分对HUVEC细胞的NO产生的影响。级分B，C和D诱导HUVEC的中等但是显著量的NO的产生。如通过亚硝酸盐的产生所评价的，级分C是诱导NO形成的最有效的级分，而级分E几乎是无效的。在存在L-NAME时，级分C对NO产生的影响被极剧降低。有趣的是，级分B，C和D比级分A和E包含更大量的矢车菊苷配质寡聚体。级分D和E之间明显的不同是E从其中采用碱化可可溶液作为巧克力制剂的黑巧克力制备而来。碱化导致迅速减少这些化合物水平的碱催化的矢车菊苷配质的聚合作用。在这些类型的巧克力中发现的矢车菊苷配质水平的分析比较示于表12中，其中牌号12为用碱化可可溶液制备的黑巧克力，牌号11为典型的牛奶巧克力。因此，从牛奶巧克力获得的抽取物包含高比例的能诱导NO的矢车菊苷配质寡聚体。向级分C样品中加入NO抑制剂L-NMMA明显导致NO的抑制。从矢车菊苷配质级分获得的结果与用缓激肽诱导的NO实验获得的那些一致(参见图53)。
如在HUVEC结果的情况下，可可矢车菊苷配质级分C在豚鼠中产生主要的低血压效果，而级分A和E最不有效。而且，高分子量矢车菊苷寡聚体的存在与NO产生的调节有关。
实施例33：可可矢车菊苷配质对巨噬细胞NO产生的影响
室温下，新鲜的加入肝素的人血(70mL)中被加入等体积的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。使用3mL聚蔗糖-3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸钠对10mL血液-PBS溶液的比例将聚蔗糖-3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸钠溶液层压在血液-PBS混合物下，18-20℃下，以2,000rpm将试管离心30分钟。弃去包含血浆和血小板的上层。将单核细胞层转移至另一个离心管中并在Hanks平衡的盐溶液中将细胞洗涤两次。将单核细胞重新悬浮在补充有10％胎牛血清的完全RPMI 1640中，计数并用台盼蓝排阻法测定存活率。将细胞沉淀重新悬浮在补充有20％胎牛血清的完全RPMI 1640中至最终浓度为1×106细胞/mL。将细胞悬浮液的等分样品平板接种至96孔培养平板中，用补充有10％胎牛血清的RPMI 1640漂洗3次，弃去非贴壁细胞(淋巴细胞)。
在存在或不存在实施例31中描述的五种矢车菊苷配质时，将这些细胞保温48小时。在保温期末期，收集培养基，离心并将无细胞上清冷冻贮藏以用于亚硝酸盐分析测定。
通过用Greiss反应测定亚硝酸盐浓度来确定巨噬细胞NO的产生。Greiss试剂为1％磺胺，0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐。简而言之，重复四次从上清取出50μl等分样品并与150μl Greiss试剂一起保温。540nm下，在多重扫描仪(Labsystems Multiskans MCC/340)中测定吸光度。采用规定浓度的亚硝酸钠以建立标准曲线。将无细胞培养基(空白)的吸光度从用包含细胞的上清获得的值中减去。
在一个单独实验中，在存在5U/mLγ-干扰素时，将巨噬细胞接触抗原12小时，接着在存在或不存在100μg/mL五种矢车菊苷配质级分时，用10μg/mL LPS再刺激36小时。
图55说明仅100μg/mL的矢车菊苷配质C可诱导单核细胞/巨噬细胞的NO的产生。未能检测这些细胞的基础NO产生，在以100μg/mL采用的任何可可矢车菊苷配质级分中未能检测到亚硝酸盐。图56说明矢车菊苷配质级分A和D增加接触过γ-干扰素抗原的单核细胞/巨噬细胞的LPS-诱导的NO的产生。由于在不存在矢车菊苷配质级分时培养的LPS-刺激的单核细胞/巨噬细胞仅产生4μmol/105细胞/48小时，因此矢车菊苷配质级分C在一定程度上是有效的。仅仅γ-干扰素在诱导NO中是无效的。
总之，这些结果证明以特定浓度使用的本发明化合物的混合物能诱导独立和依赖于LPS或细胞因子刺激的单核细胞/巨噬细胞NO的产生。
从前面来看，显然提取物和可可多酚，尤其是本发明化合物以及本发明的组合物，方法和试剂盒具有明显和许多用途。
通过本文体内和体外数据很清楚地证明了抗肿瘤用途，并且表明本发明化合物可被用来代替或与常规抗肿瘤剂一起结合使用。
本发明具有如BHT和BHA的抗氧剂活性，以及氧化稳定性。因此，本发明可被用来代替或在BHA和BHT的已知用途中与BHT或BHA结合使用，例如抗氧化剂，如抗氧化剂，食品添加剂。
本发明还可被采用来代替或在其目前已知的用途中与拓扑异构酶II-抑制剂一起结合使用。
本发明化合物可被用于食品防腐或制备，以及预防或治疗细菌起源的疾病。简单地说本发明化合物可被用作抗微生物剂。
本发明化合物还可被用作环加氧酶和/或脂氧化酶，NO或NO-合酶，或血液或体内葡萄糖调节剂，从而可用于治疗或预防或调节疼痛，发烧，炎症性冠状动脉疾病，溃疡，致癌机理，血管扩张，以及镇痛，抗凝血抗炎症以及免疫应答调节剂。
而且，本发明包括化合物或提取物作药物制剂的赋形剂的用途。因此，具有许多由本发明预见的组合物和方法。例如，抗氧化剂或防腐组合物，拓扑异构酶II-抑制组合物，用于保存食物或任何所需物质例如免于氧化的方法，以及用于抑制拓扑异构酶II的方法。组合物可包含本发明化合物。方法可包括将食物，物质或拓扑异构酶II与各组合物或与本发明化合物接触。从前面清楚可见本发明其它组合物，方法和具体实例。
在这方面，已提到本发明来自可食用来源，且体外活性可以证明至少一些体内活性；从本文的体外和体内数据出发，不需过分实验即可获得剂量，给药途径和制剂。
实施例34. 可可矢车菊苷配质的胶束电动毛细管层析
使用胶囊电动毛细管层析(MECC)分离矢车菊苷配质寡聚体开发出了一种快速法。该方法是由Delgado等，1994报导的方法的改进。MECC法仅需要12分钟即可实现用70分钟正相HPLC分析获得的相同的分离。图57代表由实施例2获得的可可矢车菊苷配质的MECC分离。
MECC条件：
用实施例2中描述的方法制备可可矢车菊苷配质提取物并以1mg/mL的浓度溶解在由200mM硼酸，50mM十二烷基硫酸钠(电泳法)及NaOH组成的MECC缓冲液中以将pH调至8.5。
将样品通过0.45μm滤器，在下面条件下，使用Hewlett PackardHP-3D CZE系统进行电泳：
入口缓冲液：如上所述的Run缓冲液
出口缓冲液：如上所述的Run缓冲液
毛细管：50cm×75μm内径未涂覆的熔融硅
检测：200nm，用二极管系统检测器
注射：50m巴持续3秒(150m巴秒)
电压：6瓦
电流：系统限制(＜300μA)
温度：25℃
毛细管条件：每次试验之前及之后用试验缓冲液冲洗5分钟。
通过模仿改变温度，压力及电压参数，以及包括试验缓冲液中的有机调节剂及手性选择剂可改进该方法。
实施例35. MALDI-与金属盐溶液混合的矢车菊苷配质寡聚体的 TOF/MS分析
在与各种金属盐溶液混合的三聚体中进行一系列MALDI-TOF/MS分析以确定寡聚体的阳离子加合物是否可被检测。该实验的重要性是提供矢车菊苷配质寡聚体通过多价螯合或运输对生理过程和疾病非常重要的阳离子在体外和体内发挥生理作用的证据。
采用的方法如实施例15中所述。简而言之，将2μl 10mM的硫酸锌二水合物，氯化钙，硫酸镁，氯化亚铁六水合物，硫酸亚铁七水合物以及硫酸铜溶液分别与4μl如实施例14所述纯化至表观均一的三聚体(10mg/mL)混合，并加入44μl DHB。
结果(图58A-F)表明铜和铁(铁和亚铁)的[金属-三聚体+H]+离子，其m/z值等于理论计算质量的±1amu标准偏差值。钙和镁的[金属-三聚体+H]+的质量不能明确地从钠和钾的[金属-三聚体+H]+的质量中消除，其m/z值在±1amu标准偏差值中。未能检测到[Zn+2-三聚体+H]+离子。由于一些阳离子为多价的，因此多金属-寡聚体配体种类和/或金属-多寡聚体种类的可能性是可能的。然而，筛选为其预计质量的这些加合物证明是不成功的。
考虑一些因素，如氧化状态以及讨论的离子在元素周期表中的相对位置，上面所示的对于铜，铁，钙，镁和锌的结果可被用作用于后面分析其它金属离子和本发明化合物之间的反应的常规技术。
实施例36. 高分子量矢车菊苷配质寡聚体的MALDI-TOF/MS分析
在与如实施例3，方法A中制备的高分子量矢车菊苷配质寡聚体相关的GPC洗脱物中进行分析实验。目的是确定n＞12的矢车菊苷配质寡聚体是否存在。如果存在，这些寡聚体代替本发明另外的化合物。调整现有的分离方法，本发明中包含的分离和纯化可被用来获得用于后面体外和体内评价抗癌，抗肿瘤或抗瘤活性，抗氧化剂活性的这些寡聚体，抑制DNA拓扑异构酶II，抑制DNA的氧化损伤，并具有抗微生物，NO或NO-合成酶，编程性细胞死亡，血小板凝聚，和血液或体内葡萄糖调节活性，以及作为非类固醇抗炎剂的功效。
图59代表上述GPC洗脱样品的MALDI-TOF质谱图。表征以四聚体至八聚体为代表的矢车菊苷配质寡聚体的[M+Na]+和/或[M+K]+和/或[M+2Na]+离子是清楚易见的。
认识到酸和热处理将导致矢车菊苷配质寡聚体的水解。因此，本发明包括作为制备较低分子量的矢车菊苷配质寡聚体(如当n为2至12)方法的高分子量矢车菊苷配质寡聚体的受控制的水解。
实施例37. 矢车菊苷配质寡聚体与犬类和猫类细胞系的剂量应答关系
评价矢车菊苷配质寡聚体对几种犬类和猫类细胞系的剂量应答作用，其中所述细胞系从Waltham Center for Pet Nutrition，Walthamon-the-Wolds，Melton Mowbray，Leicestershire，U.K.获得。这些细胞系为产生在实施例8，方法A中描述的条件下培养的白血病病毒的
狗正常肾GH细胞系；
狗正常肾MDCK细胞系；
猫正常肾CRFK细胞系；及
猫淋巴母细胞FeA细胞系。
如实施例14，方法D中描述地纯化单体和其中n为2-10的矢车菊苷配质寡聚体。还通过如实施例14，方法C所描述的分析正相HPLC检测寡聚体，其中获得下面结果。
矢车菊苷配质         HPLC纯度％
单体                 95.4
二聚体               98.0
三聚体               92.6
四聚体               92.6
五聚体               93.2
六聚体               89.2(含4.4％五聚体)
七聚体               78.8(含18.0％六聚体)
八聚体               76.3(含16.4％七聚体)
九聚体               60.3(含27.6％八聚体)
十聚体               39.8(含22.2％九聚体，16.5％八聚体
                     和13.6％七聚体)
在寡聚体纯度小于90％的那些情况下，本发明包含的方法可用于它们的纯化。
以10μg/mL，50μg/mL和100μg/mL对各种细胞系给药单体和各种矢车菊苷配质寡聚体。结果示于图60-63中。如图中所示，各种寡聚体的高剂量(100μg/mL)的给药对猫FeA淋巴母细胞和猫正常肾CRFK细胞系产生类似的抑制效果。在这些情况下，用四聚体出现细胞毒性，增加更高的寡聚体产生增加更大的细胞毒性效果。相反，对狗GH和MDCK正常肾细胞系的各寡聚体的高剂量(100μg/mL)给药需要一个更高的寡聚体以启动细胞毒性的出现。对于狗GH正常肾细胞系，用五聚体出现细胞毒性。对于狗MDCK正常肾细胞系，用六聚体出现细胞毒性。在这两种情况下，给药较高寡聚体产生增加程度的细胞毒性。
实施例38. 片剂
使用通过被本文引作参考的于1996年9月6日提出的美国申请系列号08/709,406中描述的方法获得的可可固体来制备片剂。简而言之，通过对它们在传统加工的可可中发现的水平而言的增加本发明化合物天然存在的方法来制备该可食用材料，这样在未加工的豆中发现的本发明化合物的起始量与加工后获得的量的比例小于或等于2。为了简单起见，该可可固体材料在本文称为CP-可可固体。例如为分离和/或纯化形式的本发明的化合物或多种化合物可被以如本实施例中所描述的片剂使用，以代替或与CP-可可固体一起结合使用。
片剂制剂包含下面成分(百分数以重量百分数表示)：
CP-可可固体                           24.0％
4倍天然香草提取物
(Bush Boake Allen)                    1.5％
硬脂酸镁
(干燥润滑剂)(AerChem，Inc.)           0.5％
狄派克压片糖
(Amstar Sugar Corp.)                  37.0％
木糖醇(American Xyrofin，Inc.)        37.0％
                                      100.0％
在食物加工机中将CP-可可固体和香草提取物在一起混合2分钟。将糖和硬脂酸镁轻轻地混在一起，接着在CP-可可固体/香草提取物混合物中混合。最大压力下，将该材料经过Manesty Tablet Press(B3B)并挤压产生圆形片剂(15mm×5m)。其重量为1.5-1.8g。用可商购的低脂肪天然可可粉(11％脂肪)代替CP-可可固体(11％脂肪)来制备上述形式的另一种片剂。两种片剂制剂产生具有可接受香味特征和结构特性的产品。
使用实施例4方法2中描述的方法进行两种片剂制剂的分析。在这种情况下，分析集中在五聚体的浓度以及单体和下面报导的其中n为2-12的本发明化合物的总水平。
片剂样品  五聚体(μg/g)   总计(μg/g)   五聚体(μg/1.8g一份样品)   总计(μg/1.8g一份样品)
含CP-可可固体的片剂  239   8,277   430   14,989
含商品低脂可可粉末的片剂  ND   868   ND   1563
ND＝未检测
数据清楚表明了CP-可可固体片剂比其它片剂制剂更高的五聚体水平和本发明化合物的总水平。因此，用CP-可可固体制备的片剂制剂是用于药物，添加物和食品应用中的口服给药本发明化合物的理想的运送赋形剂。
本领域普通技术人员可容易地制备包含广范围的香料，色料，赋形剂，维生素，矿物质，OTC药物，糖类填料，紫外线保护剂(如二氧化钛，着色剂等)，粘合剂，水凝胶等的除开将不可逆地结合本发明化合物或化合物的混合物的聚乙烯吡咯烷酮的其它片剂制剂。糖填料的量可被调节以控制本发明化合物或化合物混合物的剂量。
在不背离实施例的实质及范围时，许多对上面的明显改变是不言而喻及可能的。
实施例39. 胶囊剂
用由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂，如甘油制成的软密封胶囊进行对用于口服运送本发明化合物的实施例38的修改。该推入配合胶囊包含如实施例38和40所描述的，为可任选地与填料，如乳糖或蔗糖混合以控制本发明化合物剂量的粉末形式的本发明化合物或化合物混合物或CP-可可固体。在软胶囊中，本发明化合物或化合物的混合物或CP-可可固体被悬浮在适宜液体中，如脂肪油或可可油或其混合物中。由于本发明化合物或化合物混合物可能对光敏感，如对紫外线敏感，因此胶囊可包含紫外线保护剂，如二氧化钛或适宜色料以保护免于紫外线。该胶囊还可包含填料，如在前面实施例中提到的那些。
在不背离实施例的实质和范围时，对上面进行的许多明显的改变对本领域技术人员来讲是不言而喻及可能的。
实施例40. 鉴定标准(SOI)和非鉴定标准(非-SOI)的黑巧克力 及牛奶巧克力制剂
由本发明包含的方法产生的本发明化合物或化合物混合物制剂可被制备成作为人及兽医用途的黑巧克力及牛奶巧克力。参考本文引作参考的于1996年9月6日提出的悬而末决的美国申请系列号08/709,406。USSN 08/709,406涉及一种使用加工步骤的独特组合制备具有恒定水平的来自可可豆的本发明化合物的可可油和/或可可固体的方法。简而言之，由该方法获得的可食用可可固体对它们在传统加工的可可中发现的水平而言保留了本发明化合物的天然存在。这样在末加工豆中发现的本发明化合物的起始量与加工后获得的量的比例小于或等于2。为了简单起见，该可可固体材料在本文被称为CP-可可固体。CP-可可固体被以粉末或溶液形式使用以制备SOI和非-SOI巧克力，饮料，小吃，烘焙物以及作为营养用途中的一种成分。
本文所采用的术语“SOI巧克力”指根据联邦食品，药品，化妆品条例，通过由美国食品和药品管理委员会提出的鉴定标准的在美国用于食品中的任何巧克力。对于各种类型的巧克力的美国定义及标准已很好地建立了。本文所采用的术语“非-SOI巧克力”指具有落在标准化巧克力的特定范围之外的组成的任何非标准化巧克力。
当可可油或牛奶脂肪被部分或完全取代时；或当营养性碳水化合物增甜剂被部分或完全取代时；或加入香料模仿牛奶，黄油，可可粉或巧克力，或制剂中进行的其它加入或删除在针对巧克力或其混合物的美国FDA品质标准之外。
作为混合制品，巧克力可采用巧克力固体块的形式，如棒状或新颖的形状，且可被以作为其它更为复杂的混合药剂的一种成分的形式掺入，其中巧克力任选与任何香料和提取物生产商协会(FEMA)物质，天然汁液，调味品，药草及被分类为天然香料物质；具天然本质的物质；以及由FEMA GRAS列出的，FEMA和FDA列出的，欧洲议会(CoE)列出的，FAO/WHO Food Standard Programme，CodexAlimentarius采纳的香料工业国际组织(IOFI)和Food ChemicalsCodex规定的人造香料物质混合，并且通常包含其它食物，如焦糖，牛轧糖，小果块，坚果，饼片等。这些食品特征在于在65-85°F，正常空气条件下为微生物贮存稳定的。其它复杂的混合制品从用巧克力软包裹物包围而产生，如浸果酒樱桃或花生酱。其它复杂的混合制品从用巧克力涂覆冰淇淋或其它冷冻或冷藏点心而制成。通常，用来涂覆或包围食品的巧克力必须比用于普通巧克力固体棒或新鲜形状的巧克力流动性更大。
另外，巧克力也可为包含脂肪和非脂肪固体，具有营养性碳水化合物增甜剂和可食用乳化剂的低脂肪巧克力。对于低脂肪巧克力，参考美国专利号4,810,516，4,701,337，5,464,649，5,474,795和WO 96/19923。
黑巧克力它的黑色来自在任何给定制剂中的巧克力溶液，或碱化溶液或可可固体或碱化可可固体的量。然而，由于实施例27，表13教导本发明化合物的损失是由于碱化过程，因此，碱化可可固体或溶液的使用将不用在本发明的黑巧克力制品中。
SOI和非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力制品的实施例示在表16和17。在这些制品中，存在于CP-可可固体中的本发明化合物的量类似于存在于可商购可可固体中的本发明化合物。
下面描述用于制备这些巧克力制品的加工步骤。
用于非-SOI黑巧克力的方法
1.让整个过程中涉及的所有混合机和匀料机避光。
2.分批将除开40％流动脂肪(可可油和脱水牛奶脂肪)的所有成分保持在30-35℃之间的温度下。
3.精研至20微米。
4.35℃下，在制巧克力机中干燥2小时。
5.在制巧克力机中的湿循环开始时加入全部卵磷脂和10％可可油，并在制巧克力机中湿润1小时。
6.加入所有剩余脂肪，如果需要进行校准，并在35℃下混合1小时。
7.回火，压制并包装巧克力。
用于SOI黑巧克力的方法
1.分批将除开牛奶脂肪的所有成分保持在60℃的温度下。
2.精研至20微米。
3.60℃下，在制巧克力机中干燥3.5小时。
4.加入卵磷脂和牛奶脂肪并在60℃下在制巧克力机中湿润1小时。
5.如果需要进行标准化并在35℃下混合1小时。回火，压制并包装巧克力。
用于非-SOI牛奶巧克力的方法
1.让整个过程涉及的所有混合机和匀料机避光。
2.75℃下，分批将糖，全脂奶粉，加入麦芽糖的如粉以及66％的可可油在制巧克力机中加工2小时。
3.分批冷却至35℃，加入可可粉，乙基香草醛，可可溶液和21％可可油，35℃下混合20分钟。
4.精研至20微米。
5.加入剩余的可可油，35℃下，在制巧克力机中干燥1.5小时。
6.加入脱水牛奶脂肪和卵磷脂，35℃下，在制巧克力机中湿润1小时。
7.标准化，回火，压制并包装巧克力。
用于SOI牛奶巧克力的方法
1.分批将除开65％可可油和牛奶脂肪的所有成分保持在60℃的温度下。
2.精研至20微米。
3.60℃下，在巧克力机中干燥3.5小时。
4.加入卵磷脂，10％可可油和脱水牛奶脂肪；60℃下，在巧克力机中湿润1小时。
5.加入剩余的可可油，如果需要进行标准化并在35℃下混合1小时。
6.回火，压制并包装巧克力。
在掺入制品之前，如实施例4方法4中所描述的，分析用于制品中的CP-可可固体和商品巧克力溶液中的五聚体以及单体和其中n为2-12的本发明化合物的总水平。接着将这些值用来评价如表16和17所示的各种巧克力制剂的预期水平。在为非-SOI黑巧克力和非-SOI牛奶巧克力的情况下，类似地分析其产品中的五聚体以及单体和其中n为2-12的本发明化合物的总水平。结果示于表16和17。
来自这些制品实施例的结果表明用CP-可可固体配得的SOI和非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力在SOI和非-SOI黑巧克力中分别包含大约多于6.5倍的预期的五聚体，和多于3.5倍的预期总水平；以及在SOI和非-SOI牛奶巧克力中为大约多于4.5；7.0倍的预期的五聚体和多于2.5；3.5倍的预期的总水平。
由于存在于用CP-可可固体制备的最终巧克力中的本发明化合物的预期水平明显高于用可商购的可可固体制备的那些制剂，所有没有分析一些巧克力产品。然而，在非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力产品中评价了加工效果。如表中所示，产生25-50％的五聚体的损失，而仅观察到总水平的很小的不同。希望不被任何理论所约束，认为这些损失是由于加热和/或来自牛奶成分(如乙酸，丙酸和丁酸)的可水解寡聚体(如三聚体可水解为单体和二聚体)的短链脂肪酸。另外，耗时的加工步骤可允许本发明化合物的氧化或与制剂中的蛋白质来源不可逆地结合。因此，本发明包括巧克力制品的改进方法以及实现这些效果以预防或使这些损失最少的加工方法。
技术人员将知晓这些实施例中的覆盖广范围的制剂，成分，加工及混合物以合理调节用于各种巧克力用途的本发明化合物的天然产生水平的许多变化。
表16.用未碱化可可成分制备的黑巧克力制品
使用CP-可可固体的非-SOI黑巧克力 使用CP-可可固体的SOI黑巧克力 使用商品可可固体的SOI黑巧克力
制剂： 制剂： 制剂：
41.49％糖3％全奶粉26％CP-可可固体4.5％普通溶液21.75％可可油2.75％无水牛奶脂肪0.01％香草醛0.5％卵磷脂 41.49％糖3％全奶粉52.65％CP-溶液2.35％无水牛奶脂肪0.01％香草醛0.5％卵磷脂 41.49％糖3％全奶粉52.65％普通溶液2.35％无水牛奶脂肪0.01％香草醛0.5％卵磷脂
总脂肪：31％ 总脂肪：31％ 总脂肪：31％
颗粒大小：20微米 颗粒大小：20微米 颗粒大小：20微米
五聚体和全部寡聚体矢车菊苷配质的预期水平(单体和n＝2-12，单位为μg/g)
五聚体：1205 五聚体：1300 五聚体：185
全部：13748 全部：14646 全部：3948
五聚体和全部寡聚体矢车菊苷配质的实际水平(单体和n＝2-12，单位为μg/g)
五聚体：561 未进行 未进行
全部：14097
表17.用未碱化可可成分制备的牛奶巧克力制品
使用CP-可可固体的非-SOI牛奶巧克力 使用CP-可可固体的SOI牛奶巧克力 使用商品可可固体的SOI牛奶巧克力
制剂： 制剂： 制剂：
46.9965％糖15.5％全奶粉4.5％CP-可可固体5.5％普通溶液21.4％可可油1.6％无水牛奶脂肪0.035％香草醛0.5％卵磷脂4.0％加入麦芽糖的奶粉 46.9965％糖15.5％全奶粉13.9％CP-溶液1.6％无水牛奶脂肪0.0035％香草醛0.5％卵磷脂17.5％可可油4.0％加入麦芽糖的奶粉 46.9965％糖15.5％全奶粉13.9％普通溶液1.60％无水牛奶脂肪0.0035％香草醛0.5％卵磷脂17.5％可可油4.0％加入麦芽糖的奶粉
总脂肪：31.75％ 总脂肪：31.75％ 总脂肪：31.75％
颗粒大小：20微米 颗粒大小：20微米 颗粒大小：20微米
五聚体和全部寡聚体矢车菊苷配质的预期水平(单体和n＝2-12，单位为μg/g)
五聚体：225 五聚体：343 五聚体：49
全部：  2734 全部：3867 全部：1042
五聚体和全部寡聚体矢车菊苷配质的实际水平(单体和n＝2-12，单位为μg/g)
五聚体：163 未进行 未进行
全部：2399
实施例41. 矢车菊苷配质寡聚体的水解
实施例14方法D描述了纯化本发明化合物的制备正相HPLC法。获得寡聚体作为溶解在流动相中的级分。接着在Rotovap设置上用标准真空蒸馏(20-29英寸高：40℃)除去溶剂。当延长真空蒸馏停留时间或采用＞40℃的温度时，观察到特定寡聚体的损失与较小寡聚体的增加一起发生。
特定寡聚体的损失与伴随性的较小寡聚体的增加是由于来自于存在于流动相溶剂混合物中的剩余乙酸的时间-温度酸水解。通过其中将100mg六聚体溶解在50mL含二氯甲烷，乙酸，水和甲醇(参见实施例14，方法D的溶剂部分)的流动相并进行时间-温度依赖性蒸馏的下面的实验而得以证实这种观察。在特定的时间处，如实施例4方法2中所描述的，取出等分样品以用于分析正相HPLC分析。结果图解在图64和65中，其中六聚体水平以时间-温度依赖的方式降低。图65图解以时间-温度依赖的方式出现的一种水解产物(三聚体)。单体和其它寡聚体(二聚体至五聚体)也以时间-温度依赖方式出现。
这些结果表明在处理本发明聚合化合物时必须注意极其小心和谨慎。
上述结果和在实施例5、15、18、19、20和29中的发现一起证明上述方法可被用来和本发明中包括的其它方法相配合证明本发明中给出的任何寡聚物。
例如，任何给定的只产生(+)-儿茶酸或(-)-表儿茶酸的寡聚物的完全水解消除了许多“混合”单体基的寡聚物结构的可能性，并降低构成任何给定寡聚物的每个单体的特征性立体化学键合的可能性。
另外，任何给定的以特定比例产生(+)-儿茶酸和(-)-表儿茶酸的寡聚物的完全水解给本领域专业人员提供关于任何给定寡聚物的单体组成并因此构成该寡聚物的每个单体的特征性立体化学键合的可能性的信息。
本领域专业人员应该认识到，可以发生单个单体的酸催化差向立体异构作用，并应该考虑合适的控制措施和不活波的水解作用(例如使用有机酸如乙酸代替浓盐酸、硝酸等)。
因此，因为已详细描述了本发明优选的实施方案，所以应该明白通过所附权利要求限定的本发明并不受上述描述中的个别细节的限制，并且在未偏离本发明的宗旨和范围下可以进行各种显而易见的改变。
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Claims (53)

1.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂的对象的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100021
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
2.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要NO调制剂的对象的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
3.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要NO合酶调制剂的对象的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100032
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，
但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
4.权利要求2或3的用途，其中氧化氮合成得到提高。
5.权利要求4的用途，其中氧化氮合成通过在哺乳动物中诱导可诱导的氧化氮合成酶(iNOS)而得到提高。
6.权利要求2-5任何一项的用途，其中所述对象患有NO影响的高胆固醇血症。
7.权利要求2-5任何一项的用途，其中所述对象患有动脉硬化、血栓症、心脏病发作、中风或血管循环疾病。
8.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于在哺乳动物的单核细胞和/或巨噬细胞中诱导iNOS的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
9.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于刺激哺乳动物单核细胞和/或巨噬细胞NO产生的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100051
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
10.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要用葡萄糖调制剂治疗的对象的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
11.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要非甾类抗炎剂的对象的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100071
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
12.选自由三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物组成的组中的化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗需要齿龈炎治疗的哺乳动物的药物、兽药组合物或食品的用途，其中，三聚物选自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物选自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分。
13.选自由三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物组成的组中的化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于减少哺乳动物炎性牙周疾病发展的药物、兽药组合物或食品的用途，其中，三聚物选自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物选自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分。
14.选自由三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物组成的组中的化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗炎性牙周疾病的药物、兽药组合物或食品的用途，其中，三聚物选自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物选自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分。
15.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于调制哺乳动物血小板聚集的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100091
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
16.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于调制编程性细胞死亡的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100101
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
17.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于抑制DNA氧化性损伤的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
18.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于治疗、预防或减少哺乳动物动脉粥样硬化或再狭窄的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100112
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
19.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于抑制哺乳动物LDL氧化的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100121
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
20.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于调制哺乳动物血栓形成的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
21.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于调制环加氧酶-1(COX-1)用于治疗炎性肠疾病的药物、兽药组合物或食品的用途，
其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100141
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
22.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于抑制哺乳动物细菌生长的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
23.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于降低哺乳动物高血压的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100151
其中，
n是2～12的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
24.式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物用于制造用于调制哺乳动物肾脏功能的药物、兽药组合物或食品的用途，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100161
其中，
n是2～12的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
25.一种鉴定通过式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物诱导或抑制的至少一种基因的方法，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100171
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖；
所述的方法包括使所述的至少一种基因或基因产物与聚合化合物接触，进行基因表达测定。
26.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中n是5～12。
27.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中n是5。
28.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中糖选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
29.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、転酸、羟基苯甲酸和芥子酸。
30.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中在式An的化合物中，键合发生在相邻单体的C-4和C-6之间或相邻单体的C-4和C-8之间；和
X、Y和Z各自是氢、糖或相邻单体，但条件是，如果X和Y是相邻单体，那么Z是H或糖，如果X和Z是相邻单体，那么Y是H和糖，以及条件是对于二个末端单体至少之一来说，相邻单体的键合在C-4上以及任选地，Y＝Z＝氢。
31.权利要求1-11或15-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中该化合物选自由三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物组成的该组中，其中三聚物选自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物选自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分。
32.权利要求1-24任何一项的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品选自液体、悬浮液、聚合物缓释体系、片剂、胶囊、单位标准巧克力或非单位标准巧克力。
33.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中所述的聚合化合物基本上是来自可可树属或Herrania属或它们的种间或种内的杂种的纯化合物。
34.权利要求1-24任何一项的用途或权利要求25的方法，其中所述聚合化合物的末端单体单元的R是O-β-D-葡萄糖或O-R′，其中R′是転酸部分。
35.权利要求1的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品进一步包含至少一种附加的环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂。
36.权利要求2-7任何一项的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品进一步包含至少一种附加的NO或NO合酶调制剂。
37.权利要求23的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品进一步包含至少一种降低高血压的试剂。
38.权利要求10的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品进一步包含至少一种附加的葡萄糖调制剂。
39.权利要求11的用途，其中所述药物、兽药组合物或食品进一步包含至少一种附加的非甾类抗炎剂。
40.根据权利要求25的方法，其中所述的基因表达测定选自差别显示、cDNA库的序列测定、基因表达的系列分析和通过与高密度寡核苷酸排列杂交进行的表达监测。
41.含巧克力的巧克力组合物，其包括有效抗氧化剂量的式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
其中糖是未取代的糖或通过酯键被酚部分取代的糖。
42.权利要求41的巧克力组合物，其中n是5～12。
43.权利要求41的巧克力组合物，其中n是5。
44.权利要求41-43任何一项的巧克力组合物，其中糖选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
45.权利要求41-44任何一项的巧克力组合物，其中酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、転酸、羟基苯甲酸和芥子酸。
46.权利要求41-45任何一项的巧克力组合物，其中在式An的化合物中，键合发生在相邻单体的C-4和C-6之间或相邻单体的C-4和C-8之间；和X、Y和Z各自是氢、糖或相邻单体，但条件是，如果X和Y是相邻单体，那么Z是H或糖，如果X和Z是相邻单体，那么Y是H和糖，以及条件是对于二个末端单体至少之一来说，相邻单体的键合在C-4上以及任选地，Y＝Z＝氢。
47.权利要求41-46任何一项的巧克力组合物，其中所述聚合化合物选自由三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物组成的该组中，其中三聚物选自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物选自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分。
48.权利要求41-47任何一项的巧克力组合物，其具有选自液体、悬浮液、聚合物缓释体系、片剂、胶囊、单位标准巧克力或非单位标准巧克力的形式。
49.权利要求41-48任何一项的巧克力组合物，其中所述的聚合化合物基本上是来自可可树属或Herrania属或它们的种间或种内的杂种的纯化合物。
50.权利要求41-48任何一项的巧克力组合物，其中所述聚合化合物的末端单体单元的R是O-β-D-葡萄糖或O-R′，其中R′是転酸部分。
51.一种试剂盒，其以混合物形式或在分立的容器中包含以下物质：
(a)式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物，其中A是具有以下结构式的单体：
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
和药物学、兽医学或食品科学可接受的载体；和
(b)选自以下的附加的试剂：NO或NO合酶调制剂、环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂、非甾类抗炎剂、血小板聚集调制剂和血液或体内葡萄糖调制剂。
52.一种试剂盒，其以混合物形式或在分立的容器中包含以下物质：
(a)式An的聚合化合物或其衍生物或氧化产物，其中A是具有以下结构式的单体：
Figure C9719518100221
其中，
n是2～18的正整数；
R和X各自具有α或β立体化学构型；
R是OH或O-糖；
C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，单体单元的键合发生在C-4、C-6和C-8位上；
当C-4、C-6和C-8均未键合到另一单体单元时，X、Y和Z是氢，或Z和Y是糖和X是氢，或者X是糖和Z和Y是H，或它们的组合，但条件是当第二单体单元键合到所述的第一单体单元的C-4上时，第一单体单元的Y和Z是氢；
和药物学、兽医学或食品科学可接受的载体；和
(b)选自以下的降低或减轻试剂不良作用的附加的试剂：NO或NO合酶调制剂、环加氧酶和/或脂氧化酶调制剂、非甾类抗炎剂、血小板聚集调制剂和血液或体内葡萄糖调制剂。
53.一种化合物，其选自由五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物组成的组中，其中，五聚物选自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物选自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物选自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物选自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物选自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物选自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，十一聚物选自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，十二聚物选自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C；其中“EC”表示表儿茶素部分，“C”表示儿茶素部分；其中五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物末端单体单元的3位是由転酸酯或β-D-葡萄糖衍生的。
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