CN115895977B

CN115895977B - 一种副干酪乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115895977B
Application number: CN202211702657.3A
Authority: CN
Inventors: 董艳美; 王冠凤; 李梦娇; 徐焕焕; 郭学平
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2042-12-29
Also published as: CN115895977A

Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌及其应用，该副干酪乳杆菌对芸豆进行发酵后，能显著提升芸豆中α—淀粉酶抑制剂的提取率，提高芸豆发酵提取物的淀粉酶抑制率。本发明得到的芸豆提取物中主要成分为α—淀粉酶抑制剂，该芸豆提取物为芸豆的单纯乳杆菌发酵产物，无其他成分添加，无刺激性副产物，提高了芸豆的利用率，节省了农业资源并产生卓越的经济效益。该芸豆提取物能降低淀粉降解代谢能力，降低餐后能量摄入和血糖提升，利于体重控制和血糖控制，特别有利于超重人士和糖尿病患者的症状缓解，具有广阔的应用前景。

Description

一种副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种乳杆菌，具体涉及一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），还涉及该副干酪乳杆菌在发酵制备白芸豆等芸豆提取物中的应用，还涉及一种芸豆发酵提取物及该提取物在制备α—淀粉酶抑制剂中的应用。

背景技术

近年来，随饮食结构及生活方式的变化，超重/肥胖症和糖尿病患者人数逐渐增多并居高不下，高糖饮食造成的慢性病越来越多。

大白芸豆，属于我国古老的一种名贵食用豆类，种植历史悠久。近年来由于白芸豆种子中含有较高活性的α—淀粉酶抑制剂(α-AI)而受到广泛关注。α淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor）是2019年全国科学技术名词审定委员会公布的植物学名词，出自《植物学名词》第二版，是能抑制α淀粉酶活性的物质的统称。通常，a-淀粉酶抑制剂都是些有机化合物，它们与酶形成酶抑制剂复合物而使酶失活，在化学结构上，它们可以是蛋白质、多肽和碳水化合物。a-淀粉酶抑制剂因来源不同而化学物理特性不同。于芸豆中提取的淀粉酶抑制剂能特异性地抑制人体唾液和肠道内α-淀粉酶活力，从而阻碍或延缓食物中碳水化合物的水解和消化，在等量淀粉摄入下，有效降低餐后血糖浓度并减少糖类吸收，降低人体热量摄入。经动物及人体实验研究，白芸豆中含有较高活性的α—淀粉酶抑制剂，且白芸豆提取物同时具有较高的生物安全性，适合于糖尿病患者或者需要体重管理、体态调整人士的食用。除大白芸豆外，其它种类芸豆也有部分含有α—淀粉酶抑制剂，同样适合制备α—淀粉酶抑制剂。

目前，芸豆提取物多通过单纯的植物提取法来提取，提取物中α—淀粉酶抑制剂含量较低，对淀粉酶的抑制率较低。例如论文《白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取及其性能研究》、《白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的制备及性质研究》中分别通过水提和酸提制备白芸豆提取物，这些提取方法操作复杂，需要用到酸等化学试剂，存在安全风险，且所得的芸豆提取物淀粉酶抑制率较低。专利CN 112961883 A中提到用乳酸菌发酵辅助制备白芸豆提取物，但其制备工艺中，乳酸菌发酵的作用为通过发酵降低白芸豆提取物中植物凝集素含量，对α—淀粉酶抑制剂的提取率无明显提升，且该专利中的方法较为繁琐，需要调酸、调碱、超高压等操作，存在安全风险，不利于工业化生产。

发明内容

针对从芸豆中提取α—淀粉酶抑制剂提取率较低、所得芸豆提取物淀粉酶抑制率不高的问题，本发明提供了一种新筛选的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），采用该副干酪乳杆菌对白芸豆等芸豆进行发酵可以得到芸豆提取物，该芸豆提取物中含有α—淀粉酶抑制剂，α—淀粉酶抑制剂的提取率高，对淀粉酶的抑制率高，本发明关于副干酪乳杆菌的研发促进了芸豆中α—淀粉酶抑制剂的充分提取利用，节约了芸豆资源并提升了其经济效益。

本发明提供的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）命名为BYD-R1，为实验室自行分离的菌株，分离自健康人体口腔（山东济南）。该菌株已于2022年11月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）进行保藏，地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 26055。

本发明还提供了一种菌剂，该菌剂中包含上述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1。进一步的，所述菌剂既可以为固体制剂，也可以为液体制剂。

本发明还提供了上述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或者上述菌剂在制备发酵产品中的应用。该应用中，一般是将副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或者上述菌剂加入底物中进行发酵，得到发酵产品。

在现有技术中公开了乳杆菌在多种领域的发酵用途，本发明副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或者上述菌剂在这些现有公开的领域中均可以使用，具体的发酵方法可以参照现有技术。

优选的，本发明副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或上述菌剂用于从芸豆中提取α—淀粉酶抑制剂，或者是用于制备芸豆发酵产品。所述芸豆发酵产品是使用副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或上述菌剂对芸豆原料的浆液进行发酵所得的产品。芸豆具有大白芸豆、大黑花芸豆、黄芸豆、奶花芸豆、红花芸豆等多个品种，用于提取α—淀粉酶抑制剂时，选择的芸豆是含有α—淀粉酶抑制剂的芸豆品种，用于制备芸豆发酵产品时，可以选择各种对人体无害、生物安全性高的芸豆品种。

本发明还提供了一种芸豆提取物的制备方法，该制备方法包括使用副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1对芸豆进行发酵得到芸豆提取物的步骤。该芸豆提取物中，含有较高含量的α—淀粉酶抑制剂，对淀粉酶的抑制作用高。

进一步的，上述制备方法具体包括以下步骤：

（1）将芸豆浆液接种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1进行厌氧发酵培养，得到发酵的芸豆浆；

（2）将发酵的芸豆浆去除不溶物，得到芸豆发酵滤液；

（3）将芸豆发酵滤液进行蛋白变性，除去变性后不溶物；

（4）将步骤（3）变性除杂后的芸豆发酵滤液进行醇沉并收集醇沉物；

（5）将醇沉物干燥，即为芸豆提取物，也可以叫做芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品。

进一步的，本发明使用的芸豆可以是芸豆鲜品，也可以是芸豆干品，芸豆可以选择各种芸豆品种，例如大白芸豆、奶花芸豆、红花芸豆、黑花芸豆等，优选为大白芸豆、红花芸豆、奶花芸豆。

进一步的，芸豆浆液由芸豆制备得到，当芸豆为鲜品时，可以直接加水打浆，或者先将其进行干燥，然后再粉碎，干燥温度为40℃-60℃。当芸豆为干品时，可以直接粉碎。芸豆粉末可以用破壁机、粉碎机等制备。

进一步的，上述步骤（1）中，当芸豆为粉末时，先用水浸泡，芸豆粉末在水中的含量为2.5-15wt%。优选的，芸豆粉末先进行灭菌，灭菌方式优选为辐照灭菌。进一步优选的，将芸豆粉末加入水中后，静置处理1-2h，使芸豆粉末充分吸水湿润。

进一步的，上述步骤（1）中，灭菌后的芸豆粉末加水配成芸豆浆液，当芸豆粉末充分吸水湿润后，加入菌种种子液进行厌氧发酵。发酵的温度为28℃-35℃，例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。发酵时间为24h～48h，例如24 h、25 h、26 h、27 h、28h、29 h、30 h、31 h、32 h、33 h、34 h、35 h、36 h、37 h、38 h、39 h、40 h、41 h、42 h、43 h、44 h、45 h、46 h、47 h、48 h。

进一步的，上述步骤（1）中，菌种种子液是通过将菌种重悬在水中形成的，种子液中OD₆₀₀约5.0-10.0，例如5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。种子液接种量一般为芸豆浆液体积的2～5%，例如2%、3%、4%、5%。菌种可以在MRS液体培养基中进行扩大培养，以得到种子液所需量的菌种，MRS液体培养基的组成为：蛋白胨 8.0-12.0 g/L、牛肉膏 8.0-12.0 g/L、酵母膏4.0-6.0 g/L、柠檬酸氢二铵 1.0-3.0 g/L、葡萄糖15.0-25.0 g/L、吐温80 0.5-1.5 ml/L，乙酸钠4.0-6.0 g/L、磷酸氢二钾1.0-3.0 g/L、硫酸镁 0.4-0.6 g/L、硫酸锰0.1-0.4 g/L。

在本发明某一具体实施方式中，MRS液体培养基的组成为：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉膏 10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵 2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 ml/L、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L。

进一步的，上述步骤（2）中，所述将发酵的芸豆浆去除不溶物的方式为：将发酵的芸豆浆先离心然后过滤，以去除固体残渣、菌体等不溶物。优选的，离心转速为5000-8000rpm，离心时间为5-20 min。具体地，离心转速可以为5000 rpm、5500 rpm、6000 rpm、6500rpm、7000 rpm、7500 rpm、8000 rpm；离心时间可以为5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10min、11 min、12 min、13 min、14 min、15 min、16 min、17 min、18 min、19 min、20 min。

进一步的，上述步骤（3）中，将芸豆发酵滤液进行蛋白变性，蛋白变性的温度范围为68℃-80℃，例如68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃；变性时间为20～40 min，例如20 min、21 min、22 min、23 min、24 min、25 min、26min、27min、28 min、29 min、30 min、31 min、32 min、33 min、34 min、35 min、36 min、37min、38 min、39 min、40 min。蛋白变性后，采用过滤、离心等方式除去变性的蛋白不溶物，例如通过0.8微米或0.65微米或0.22微米滤板进行过滤，或者8000 rpm～13000 rpm离心5～20 min。

进一步的，上述步骤（4）中，蛋白变性除杂后的芸豆发酵滤液进行醇沉，所述醇优选为乙醇，乙醇在发酵滤液中的浓度优选为60wt%～80wt%，例如60wt%、65wt%、70wt%、75wt%、80wt%。

进一步的，上述步骤（4）中，醇沉物的收集方法为离心或过滤。离心条件为5000rpm～13000 rpm离心5～20 min，优选为8000 rpm～10000 rpm离心8-12 min。过滤条件为过2.0微米或1.2微米或0.8微米或0.65微米或0.22微米滤板或滤膜过滤，优选为过0.8微米滤板收集。

进一步的，上述步骤（5）中，醇沉物即为芸豆提取物，将醇沉物干燥，干燥条件优选为-20℃～60℃温度内负压干燥，真空度0.02 MPa～0.12 MPa。具体地，负压干燥温度可以为-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、-0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃；真空度可以为0.02 MPa、0.19 MPa、0.18 MPa、0.17 MPa、0.16 MPa、0.15MPa、0.14 MPa、0.13 MPa、0.12 MPa。

进一步的，步骤（5）中，醇沉主要是将蛋白类的α—淀粉酶抑制剂沉淀出来，因此得到的醇沉物主要成分为α—淀粉酶抑制剂，但同时也含有芸豆中的其他成分，因此也可以称之为α—淀粉酶抑制剂粗品。因为芸豆中的成分对人体无害，安全，因此该α—淀粉酶抑制剂粗品可以不经过纯化，直接使用。也可以以该芸豆提取物为原料，进一步制备纯度较高的α—淀粉酶抑制剂。

本发明还提供了按照上述方法制得的芸豆提取物，该芸豆提取物中主要成分为α—淀粉酶抑制剂，该芸豆提取物为芸豆的单纯乳杆菌发酵产物，无其他成分添加，无刺激性副产物，通过乳杆菌发酵代谢提高了芸豆中α—淀粉酶抑制剂的释放和提取，提高了其提取率，提高了芸豆的利用率，节省了农业资源并产生卓越的经济效益。该芸豆提取物具有优越的降低哺乳动物α—淀粉酶活性的作用，能与哺乳动物α—淀粉酶进行非竞争性结合，造成降低哺乳动物α—淀粉酶构象改变，从而降低其淀粉降解代谢能力，降低餐后能量摄入和血糖提升，利于体重控制和血糖控制，特别有利于超重人士和糖尿病患者的症状缓解，具有广阔的应用前景。

本发明还提供了一种组合物，该组合物包含上述保藏编号为CGMCC No.26055的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1、上述菌剂或者上述芸豆提取物。该组合物具有降低哺乳动物淀粉降解代谢能力的作用。

本发明具有以下优点：

1、本发明通过筛选得到了一种适合对芸豆进行发酵的乳杆菌——副干酪乳杆菌，该副干酪乳杆菌对芸豆进行发酵后，能显著提升芸豆中 α—淀粉酶抑制剂的提取率，提高芸豆发酵提取物中α—淀粉酶抑制剂的含量，提高芸豆发酵提取物的淀粉酶抑制率。

2、本发明所得芸豆提取物为未经炮制芸豆基质的单纯乳杆菌发酵产物，无其他成分添加，无刺激性副产物，安全性高。

3、本发明所得芸豆提取物具有显著的降低α—淀粉酶活性的作用，其最大抑制效果高于现有其他方法所得芸豆α—淀粉酶抑制剂。

保藏信息

本发明副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC No.26055，保藏日期为2022 年11月07日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，其中实验所用芸豆为大白芸豆（产地云南）、奶花芸豆（黑龙江）、红花芸豆（黑龙江）。

下述实施例中，如无特别说明，所述浓度均为质量百分浓度。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1 副干酪乳杆菌的筛选及鉴定过程

健康人体以灭菌后纯化水漱口，所得含菌漱口水采用常规的十倍稀释分离法将漱口水稀释分离，划平板获得单菌落，将单菌落转接斜面培养，镜检菌体。再次进行稀释分离倒平板获得单菌落，如此重复，直至获得单一菌株。共收集到16株菌。

对上述菌株进行初筛：将上述单菌落分别接种至100 mL MRS液体培养基中，培养基组成为：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉膏 10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵 2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 Ml/L、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L。接入后，在200 rpm、37℃下摇瓶培养24 h，然后5000 rpm离心10 min，沉淀菌体倾去上清液，然后以纯化水重悬，获得种子液，其OD₆₀₀约5.0。取新鲜的大白芸豆，40℃烘干至含水量<6％后粉碎，过筛，收集大白芸豆粉末，辐照灭菌。无菌条件下称取大白芸豆粉末，加入灭菌纯化水定容，配成大白芸豆干物质含量2.5wt%的大白芸豆浆液，配置量1 L，大白芸豆浆液静置1h使大白芸豆粉末充分吸水。在无菌条件下，将上述种子液接入灭菌的大白芸豆浆液中，接种量为大白芸豆浆液体积的2%，200 rpm，37℃厌氧摇瓶培养24 h，得到大白芸豆副干酪乳杆菌发酵液，5000 rpm，离心5 min收集发酵液上清，并检测大白芸豆提取物抑制α—淀粉酶活性能力，共获得α—淀粉酶活性抑制活性较高的5株菌株，再按照初筛的步骤进行复筛，最终筛选出能显著提高芸豆α—淀粉酶抑制剂提取率的1株菌，命名为BYD-R1，将该菌株进行菌种保藏及菌种鉴定。

最终筛选得到的菌种的生理生化特征及遗传学特征如下：

(1)菌体特征：菌体杆状，无芽孢；

(2)菌落特征：菌落白色或乳白色、菌落奶油状，中间略有凸起，表面光滑，不透明，边缘光滑；

(3)遗传学特征：委托北京六合华大基因科技有限公司对菌种进行基因组测序鉴定，结果显示菌种为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。将该菌种送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.26055，16SrDNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的乳杆菌发酵制备

取新鲜的大白芸豆，40℃烘干至含水量<6％后粉碎，过筛，收集大白芸豆粉末，辐照灭菌。无菌条件下称取大白芸豆粉末，加入灭菌纯化水定容，配成大白芸豆干物质含量2.5wt%的大白芸豆浆液，配置量1 L。

大白芸豆浆液静置1h使大白芸豆粉末充分吸水后，将实施例1新筛选的副干酪乳杆菌BYD-R1的单菌落接种至100 mL MRS液体培养基中，培养基组成为：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉膏 10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵 2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0Ml/L、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L。接入后，在200 rpm、37℃下摇瓶培养24 h，然后5000 rpm离心10 min，沉淀菌体倾去上清液，然后以纯化水重悬，获得种子液，其OD₆₀₀约5.0；在无菌条件下，将种子液接入灭菌的大白芸豆浆液中，接种量为大白芸豆浆液体积的2%，200 rpm，37℃厌氧摇瓶培养24 h，得到大白芸豆副干酪乳杆菌发酵液，5000 rpm，离心5 min收集发酵液上清，将滤液上清68℃变性20 min，0.8微米过滤板除去变性后杂质得到变性后滤液，在滤液中添加乙醇至乙醇浓度为60%，充分醇沉后，过0.8微米滤板收集醇沉物，将醇沉物-20℃真空干燥，获得大白芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品，也即大白芸豆提取物。

实施例3大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的乳杆菌发酵制备

取新鲜的大白芸豆，40℃烘干至含水量<6％后粉碎，过筛，收集大白芸豆粉末，辐照灭菌。无菌条件下称取大白芸豆粉末，加入灭菌纯化水定容，配成大白芸豆干物质含量10wt%的大白芸豆浆液，配置量1L。

大白芸豆浆液静置2h使白芸豆粉末充分吸水后，将实施例1新筛选的副干酪乳杆菌BYD-R1的单菌落接种至100mL MRS液体培养基中，培养基组成为：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉膏 10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、柠檬酸氢二铵 2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 Ml/L、乙酸钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L。接入后，在200rpm、37℃下摇瓶培养24h，然后5000rpm离心10min，沉淀菌体倾去上清液，然后以纯化水重悬，获得种子液，其OD₆₀₀约5.0；在无菌条件下，将种子液接入灭菌的大白芸豆浆液中，接种量为大白芸豆浆液体积的5%，200rpm，37℃厌氧摇瓶培养48h，得到大白芸豆副干酪乳杆菌发酵液，8000rpm，离心20min收集发酵液上清，将滤液上清80℃变性20min，0.8微米过滤板除去变性后杂质得到变性后滤液，在滤液中添加乙醇至乙醇浓度为80%，充分醇沉后，过0.8微米滤板收集醇沉物，将醇沉物60℃真空干燥获得大白芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品。

实施例4 奶花芸豆α—淀粉酶抑制剂的乳杆菌发酵制备

制备方法同实施例3，不同在于选用新鲜的奶花芸豆。

实施例5 红花芸豆α—淀粉酶抑制剂的乳杆菌发酵制备

制备方法同实施例3，不同在于选用新鲜的红花芸豆。

对比例1 大白芸豆α—淀粉酶抑制剂植提制备

大白芸豆浆液静置2h使大白芸豆粉末充分吸水后，将大白芸豆浆液200rpm，37℃孵化提取24h，得到大白芸豆植提液，8000rpm，离心20min收集发酵液上清，将滤液上清80℃变性20min，0.8微米过滤板除去变性后杂质得到变性后滤液，在滤液中添加乙醇至乙醇浓度为80%，充分醇沉后，过0.8微米滤板收集醇沉物，将醇沉物60℃真空干燥获得大白芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品。

对比例2 大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的酵母菌发酵制备

制备方法同实施例3，不同在于选用酿酒酵母（CICC1053）进行发酵。

对比例3 大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的乳酸菌发酵制备

制备方法同实施例3，不同在于选用乳酸菌（ATCC8014）进行发酵。

对比例4大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的其它乳杆菌发酵制备

制备方法同实施例3，不同在于选用副干酪乳杆菌（ATCC11578）进行发酵。

对比例5 奶花芸豆α—淀粉酶抑制剂的植提制备

制备方法同对比例1，不同在于选用奶花芸豆。

对比例6红花芸豆α—淀粉酶抑制剂的植提制备

制备方法同对比例1，不同在于选用红花芸豆。

试验例1 芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品对α-淀粉酶的抑制率测定

1.实验材料

实验样品：分别用1L纯化水将实施例2-5以及对比例1-6制备的芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品重溶，使得芸豆干物质提取比例均为10wt% （干物质提取比例的计算方式是：芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品以芸豆粉末质量计在纯化水中的浓度）。

实验试剂：芸豆（产地云南）、α-淀粉酶（猪胰腺，14u/mg，上海源叶生物）、DNS试剂（NY/T法，北京雷根生物）、可溶性淀粉（上海麦克林）等。

2. 仪器设备

紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱等。

3．实验过程及评价标准

3.1. 溶液配制：

α-淀粉酶溶液：0.3g α-淀粉酶溶于50 mL纯化水，充分溶解后过0.22μm膜备用；

可溶性淀粉溶液：2g溶性淀粉用少量蒸馏水调匀,倒入已沸蒸馏水,在水浴中煮沸至透明,冷却后定容至100ml。

DNS溶液：称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g(化学纯)，加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45 ℃。然后逐步加入100 mL 0.2g/ mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g，继续45 ℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL，用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后使用。

3.2 检测方法：

样品管：精确吸取 0.5 mL实验样品溶液（实验样品溶液过0.22μm膜）和0.5 mLα-淀粉酶溶液，充分混匀，在37 ℃水浴反应15 min，然后加入1 mL质量分数为2%的可溶性淀粉溶液，在37 ℃水浴中准确反应5 min，再加入2 mL配制好的 DNS溶液，在沸水浴中反应5min，之后立即用流动自来水冷却，适量稀释（稀释50倍），在波长470 nm处测定吸光度值，记为OD470 nm。

对照管：用蒸馏水替代实验样品溶液，其他条件同上，记为OD’470 nm。

空白管：用蒸馏水替代实验样品溶液和α-淀粉酶，其他条件同上，记为OD”470 nm。

芸豆α—淀粉酶抑制剂粗品的α-淀粉酶抑制率计算公式为：

4、实验结果

本实验所用的样品中，芸豆粉末干物质的质量相同，因此实验样品α—淀粉酶抑制率越高，说明从芸豆粉末干物质中提取的α—淀粉酶抑制剂越多，α—淀粉酶抑制剂提取率越高。实施例2-3所得大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的抑制率显著高于对比例1，这说明本发明副干酪乳杆菌发酵所得的大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的提取率显著高于普通植提方法所得大白芸豆中α—淀粉酶抑制剂的提取率。实施例2-3所得大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的抑制率显著高于对比例2、3、4，这说明本发明筛选得到的副干酪乳杆菌对大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的提取率高于酿酒酵母、乳酸菌和其它副干酪乳杆菌，并且从对比例1和对比例2-4看，采用普通植提法得到的大白芸豆α—淀粉酶抑制剂的抑制率与对比例2-4中采用菌种发酵得到类似，说明对比例2-4的菌种对α—淀粉酶抑制剂提取率的提升作用不大。实施例4、5和对比例5、6相比说明本发明副干酪乳杆菌发酵不仅能显著提高大白芸豆中α—淀粉酶抑制剂的提取率，也能显著提升奶花芸豆和红花芸豆中α—淀粉酶抑制剂的提取率。

由此可知，本发明筛选到的副干酪乳杆菌用于发酵制备芸豆α—淀粉酶抑制剂有其卓越性和独特性，能显著提升α—淀粉酶抑制剂的提取率，适用于芸豆中α—淀粉酶抑制剂的提取。

Claims

1.一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1，其特征是：其保藏编号为CGMCC No.26055。

2.一种菌剂，其特征是：包含权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1。

3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或权利要求2所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1或菌剂用于制备芸豆发酵产品。

5.一种芸豆提取物的制备方法，其特征是：包括使用权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1对芸豆进行发酵得到芸豆提取物的步骤，具体操作如下：

（2）将发酵的芸豆浆去除不溶物，得到芸豆发酵滤液；

（3）将芸豆发酵滤液进行蛋白变性，除去变性后不溶物；

（5）将醇沉物干燥，得芸豆提取物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：所述芸豆提取物中含有α—淀粉酶抑制剂。

7.按照权利要求5或6所述的芸豆提取物的制备方法制得的芸豆提取物。

8.权利要求7所述的芸豆提取物在制备α—淀粉酶抑制剂中的应用。

9.一种组合物，其特征是：包含权利要求1所述的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BYD-R1、权利要求2所述的菌剂或权利要求7所述的芸豆提取物。