CN115873231B - 一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，该类物质主要有三部分组成：聚乙二醇链部分（n arm PEG）、侨联部分（Linker）和氨基糖苷类部分（Aminoglycosides），经化学合成方法得到。可与药用辅料配置成不同药剂形式或附载在体外载体进行使用，可以有效降低感染性疾病和脓毒血症等血液病的动物死亡率，为临床治疗提供新的治疗药物。

Description

一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子及其制备方法和应用。

背景技术

脓毒症是指因各类感染(细菌或病毒等)引起的宿主反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。全球每年脓毒症患病人数超过1800万，即便医疗高度发达的今天，致死率仍然高达19.7％(Lancet.2020,395,200-211)。目前，临床上对脓毒症的治疗主要以综合治疗为主，包括：液体复苏治，机械通气治疗，抗感染治疗，糖皮质激素治疗，血管活性药物治疗，抗凝治疗，肾脏替代治疗以及镇静和镇痛治疗等(Intensive Care Med.2021,47,1181-1247)。虽然现在医疗已经取得长足进步，但由于脓毒症的发病机制复杂，至今依然没有一个针对脓毒症的特效药，因此，开发一种高效安全的脓毒症的特效药是当前临床急需解决的问题且具有重要的经济和社会价值。

氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides)是由氨基糖和氨基环醇通过氧桥连而成的糖苷，对各种需氧型革兰氏阴性杆菌具有较好的抗菌活性，对耐药金葡菌 (MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)也具有较好的抗菌活性。我们在探索高分子化氨基糖苷类抗生素的作用的研究中，意外发现聚乙二醇化氨基糖苷类分子对脓毒症模型小鼠具有极佳的治疗效果，有望成为脓毒症的特效药，填补该领域的空白。

发明内容

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子及其制备方法和应用，该类物质主要有三部分组成：聚乙二醇链部分(n arm PEG)、侨联部分(Linker) 和氨基糖苷类部分(Aminoglycosides)，经化学合成方法得到。可与药用辅料配置成不同药剂形式或附载在体外载体进行使用，可以有效降低感染性疾病和脓毒血症等血液病的动物死亡率，为临床治疗提供新的治疗药物。

本发明的技术方案是：

本发明的一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子由三部分组成：聚乙二醇链部分(narm PEG)，侨联部分(Linker)和氨基糖苷类部分(Aminoglycosides)，化学结构如式(I)所示。

n arm PEG-Linker-Aminoglycosides式(I)

该聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的具体结构如式(II)所示。

其中，n arm代表PEG的臂数，n的取值范围为大于等于1；更优选为4， 6，8；PEG的分子量为200～100000；更优选为1000～20000。m代表碳链的重复单元数，m的取值范围为1～20；更优选为1～4。X为C、N、O、S、Se五种元素中的至少一种。AG代表氨基糖苷类抗生素分子。

所述氨基糖苷类抗生素包括但不限于以下种类：奈替米星、阿米卡星、核糖霉素、西索米星、巴龙霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、安普霉素、新霉素、异帕米星、卷曲霉素、福提米星、阿贝卡星、潮霉素等。代表性氨基糖苷类抗生素的结构如式(III)：

本发明提供的一种制备所述的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的方法。 n armPEG-chain-AG式(II)按照下述方法合成：如式(IIII)所示，以n arm PEG-OH为原料，通过与不同链长的环状酸酐发生酯缩合反应，得到末端为羧酸官能团的n arm PEG-COOH，最后再与氨基糖苷类分子发生酸铵缩合反应，得到不同的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子n armPEG-chain-AG。

本发明提供的一种制备所述的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的方法包括如下步骤：

(1)环状酸酐的合成

将链状二酸置于反应容器中，加入乙酸酐，搅拌条件下反应，随后除去溶剂，得到环状酸酐Cyc-Anhydride；

(2)n arm PEG-COOH的合成

用有机溶剂溶解n arm PEG-OH，将步骤(1)所述的环状酸酐 Cyc-Anhydride加入有机溶剂中，混合均匀，然后在搅拌的条件下加入三乙胺，最后再将溶于有机溶剂中的4-二甲氨基吡啶加入上述溶液中，搅拌条件下反应，冰浴条件下加入酸性溶液中和反应，随后萃取，取有机层并浓缩，得到n arm PEG-COOH。

(3)n arm PEG-AG的合成

用有机溶剂溶解氨基糖苷类抗生素AG，然后在搅拌的条件下加入三乙胺，随后将步骤(2)所述的n arm PEG-COOH加入有机溶剂中，然后在搅拌的条件下缓慢将两者混合均匀，搅拌条件下反应，随后透析，取保留液，冻干，得到n arm PEG-AG。

进一步地，步骤(1)中，乙酸酐作为溶剂和脱水剂。

优选地，步骤(1)中，所述反应为无水无氧的条件，在惰性气体保护条件下进行。

进一步地，步骤(1)所述反应温度为0℃～60℃,

优选地，步骤(1)所述反应温度为20℃～40℃

进一步地，步骤(1)所述的链状二酸与乙酸酐的质量比为0.5～1.0:10～100，优选质量比0.5～1.0:20～40。

进一步地，步骤(1)所述反应时间为8h～72h

优选地，步骤(1)所述反应时间为12h～24h

进一步地，步骤(1)需要在0℃～30℃条件下除去溶剂。

优选地，步骤(1)需要在0℃～10℃条件下除去溶剂。

进一步地，步骤(2)中所述n arm PEG-OH中，n的取值范围为1，2， 3，4，6，8；n为1时，PEG的一端为甲氧基官能团，另一端为羟基官能团，n 为2，3，4，6，8时，末端官能团仅有羟基官能团。

进一步地，步骤(2)中所述n arm PEG-OH的分子量为200～100000

优选地，步骤(2)中所述n arm PEG-OH的分子量为1000～20000

进一步地，步骤(2)中所述环状酸酐结构如式(Ⅴ)所示：

其中，m代表碳链的重复单元数，m的取值范围为1～20；X为C、N、 O、S、Se五种元素中的中的至少一种或无任何元素。

优选地，m的取值范围为1～4；X为C、S、Se三种元素中的中的至少一种或无任何元素。

进一步地，步骤(2)中所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种。

优选地，步骤(2)中所述有机溶剂为二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种。

进一步地，步骤(2)中所述n arm PEG-OH和环状酸酐Cyc-Anhydride 的质量比为0.01～2.0:1.0～50.0；所述n arm PEG-OH和三乙胺的质量比为 10000～100000：0.01～50；所述n arm PEG-OH和4-二甲氨基吡啶的质量比为 0.1～100：0.05～10。

优选地，步骤(2)中所述n arm PEG-OH和环状酸酐Cyc-Anhydride的质量比为0.1～1.0:1.0～10.0；所述n arm PEG-OH和三乙胺的质量比为10000～ 20000：0.1～1.0；所述n arm PEG-OH和4-二甲氨基吡啶的质量比为1～10:0.1～1。

进一步地，步骤(2)中所述酸性溶液优选包括盐酸、醋酸、硫酸和硝酸中的至少一种。

优选地，步骤(2)中所述酸性溶液为盐酸、硫酸中的至少一种

进一步地，步骤(2)中所述萃取使用的溶剂优选包括乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇中的一种或多种。

优选地，步骤(2)中所述萃取使用的溶为乙酸乙酯、二氯甲烷中的至少一种。

进一步地，步骤(2)所述反应温度为0℃～60℃

优选地，步骤(2)所述反应温度为20℃～40℃

进一步地，步骤(2)所述反应时间为12h～96h

优选地，步骤(2)所述反应时间为24h～48h

进一步地，步骤(3)中所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种。

优选地，步骤(3)中所述有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

进一步地，步骤(3)中所述氨基糖苷类抗生素AG和步骤(2)中所述的n arm PEG-COOH质量比为0.1～400:0.1～20.0；所述AG和三乙胺的质量比为10000～100000：0.01～50。

优选地，步骤(3)中所述氨基糖苷类抗生素AG和步骤(2)中所述的 n arm PEG-COOH质量比为1～200:1.0～5.0；所述AG和三乙胺的质量比为 10000～20000：0.1～1.0。

进一步地，步骤(3)所述透析所采用的透析袋截留分子量为200～ 100000Da，所述透析时间为12h～96h；

优选地，步骤(3)中所述透析时间为24h～48h

优选地，步骤(3)中所述透析袋截留分子量为1000～20000

进一步地，步骤(3)所述反应温度为0℃～60℃,

优选地，步骤(3)所述反应温度为20℃～40℃

进一步地，步骤(3)所述反应时间为8h～120h

优选地，步骤(3)所述反应时间为12h～48h

进一步地，步骤(1)(2)(3)所述搅拌的条件为100～1500rpm

优选地，步骤1)(2)(3)所述搅拌的条件为300～800rpm

由以上制备方法得到一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子。

以上所述的一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子应用于治疗和或预防脓毒症。

本发明提供的制备方法采用具有生物相容性的n arm PEG-OH及其衍生物为原料，与具有抗菌作用的氨基糖苷类分子通过酰胺缩合反应，得到一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子。该制备工艺简单，操作方便，成本低廉，高效实现氨基糖苷类分子的聚乙二醇化，并且本发明制备的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子具有生物相容性高、安全性好实现了在脓毒症中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明提供的制备方法合成了一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，该制备方法简单，高效的实现了氨基糖苷类抗生素的聚乙二醇化。

(2)本发明提供的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子具有生物相容性高、安全性好、抗菌作用强等特点。

(3)与传统的抗生素相比，本发明提供的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子通过静脉给药形式，应用于治疗和或预防脓毒症，在小鼠脓毒症模型中展现出极佳的治疗效果，有望成为脓毒症的特效药，填补该领域的空白。

附图说明

图1为实施例1中8臂PEG化高分子氨基糖苷类的合成路线图

图2为实施例1中4臂PEG化高分子氨基糖苷类的合成路线图

图3为实施例1中2臂PEG化高分子氨基糖苷类的合成路线图

图4-图15为8臂PEG化高分子氨基糖苷类分子的¹H NMR图

图16-图26为4臂PEG化高分子氨基糖苷类分子的¹H NMR图

图27-图35为2臂PEG化高分子氨基糖苷类分子的¹H NMR图

图36为实施例4中化合物的MIC图

图37为实施例5中的细胞相容性图

图38为实施例6中的溶血性图

图39为实施例7中的CLP生存率图

图40为实施例7中的CLP临床评分图

图41为实施例7中的CLP体重变化图

图42为实施例7中的血液TNF-α含量变化图

图43为实施例7中的血液IL-6的含量变化图

图44为实施例7中的血液细菌含量图

图45为实施例7中的腹腔液细菌含量图

具体实施方式

为了便于理解本发明，结合以下具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述和说明，给出了本发明的较佳实施方式，但本发明的实施和保护不限于此；在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中。

需要指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均为本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的；本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；所有试剂或仪器未注明生产厂家的，均视为可通过市售购买得到的常规产品。

实施例1：一种8臂聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的制备路线如图1，具体的方法如

(1)辛二酸酐的合成

取辛二酸1g于150mL圆底球瓶中，干燥换气以去除水及氧气，氮气保护，搅拌中加入乙酸酐20mL，彻底溶解，室温搅拌反应12h。室温条件下使用真空泵抽走多余的乙酸酐及副产物乙酸，每隔1h加入甲苯10mL，加速溶液挥发，共加入甲苯3次即总量30mL左右后，彻底将溶剂抽干，产物为白色固体。

(2)8arm PEG-COOH的合成

取25mL圆底球瓶，加入1g(0.1mmol)8臂聚乙二醇(10k)和步骤 1合成的辛二酸酐156mg(1mmol)，溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺，随后在常温磁力搅拌条件下加入三乙胺224μL(0.4mmol)以及4-二甲氨基吡啶97.7 mg，在常温搅拌条件下反应24h。反应结束后，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤并使用硫酸钠进行干燥，通过旋转蒸发浓缩后所得产物为淡黄色粘稠油状物。

(3)八臂聚乙二醇氨基糖苷类(8arm AG)的合成(以妥布霉素为例)

取25mL圆底球瓶，瓶中加入妥布霉素234mg(0.5mmol)，三乙胺14μ L(0.1mmol)以及二甲基亚砜8mL，常温磁力搅拌10min溶解均匀；取步骤2 中合成的8arm PEG-COOH 50mg(0.005mmol)溶解于2mL二甲基亚砜中，随后缓慢地逐滴加入上述反应液中，常温磁力搅拌12h。反应完成后，使用纯水透析24h(MW：3000)，最后冻干得到相应产物。

实施例2：一种4臂聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的制备路线如图2，具体的方法如：

(1)辛二酸酐的合成

取辛二酸1g于150mL圆底球瓶中，干燥换气以去除水及氧气，氮气保护，搅拌中加入乙酸酐20mL，彻底溶解，室温搅拌反应12h。室温条件下使用真空泵抽走多余的乙酸酐及副产物乙酸，每隔1h加入甲苯10mL，加速溶液挥发，共加入甲苯3次即总量30mL左右后，彻底将溶剂抽干，产物为白色固体。

(2)4arm PEG-COOH的合成

取25mL圆底球瓶，加入1g(0.1mmol)四臂聚乙二醇(10k)和步骤 1合成的辛二酸酐312mg(2mmol)，溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺，随后在常温磁力搅拌条件下加入三乙胺112μL(0.8mmol)以及4-二甲氨基吡啶195.5 mg(1.6mmol，溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中)，在常温搅拌条件下反应24h。反应结束后，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤并使用硫酸钠进行干燥，通过旋转蒸发浓缩后所得产物为淡黄色粘稠油状物。

(3)4arm AGs的合成(以妥布霉素为例)

取25mL圆底球瓶，瓶中加入妥布霉素187mg(0.4mmol)，三乙胺7μ L(0.05mmol)以及二甲基亚砜8mL，常温磁力搅拌10min溶解均匀；取步骤 2合成的4arm PEG-COOH 50mg(0.005mmol)溶解于2mL二甲基亚砜中，随后缓慢地逐滴加入上述反应液中，常温磁力搅拌12h。反应完成后，使用纯水透析24h(MW：3000)，最后冻干得到相应产物。

实施例3：一种2臂聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的制备路线如图3，具体的方法如：

(1)辛二酸酐的合成

取辛二酸1g于150mL圆底球瓶中，干燥换气以去除水及氧气，氮气保护，搅拌中加入乙酸酐20mL，彻底溶解，室温搅拌反应12h。室温条件下使用真空泵抽走多余的乙酸酐及副产物乙酸，每隔1h加入甲苯10mL，加速溶液挥发，共加入甲苯3次即总量30mL左右后，彻底将溶剂抽干，产物为白色固体。

(2)2arm PEG-COOH的合成

取25mL圆底球瓶，加入1g(0.1mmol)二臂聚乙二醇(10k)和步骤 1合成的辛二酸酐156mg(1mmol)，溶解于5mL N,N-二甲基甲酰胺，随后在常温磁力搅拌条件下加入三乙胺56μL(0.4mmol)以及4-二甲氨基吡啶97.7mg (0.8mmol，溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中)，在常温搅拌条件下反应24h。反应结束后，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤并使用硫酸钠进行干燥，通过旋转蒸发浓缩后所得产物为淡黄色粘稠油状物。

(3)2arm AGs的合成(以妥布霉素为例)

取25mL圆底球瓶，瓶中加入妥布霉素117mg(0.25mmol)，三乙胺3μL (0.015mmol)以及二甲基亚砜8mL，常温磁力搅拌10min溶解均匀；取步骤 2合成的2arm PEG-COOH 50mg(0.005mmol)溶解于2mL二甲基亚砜中，随后缓慢地逐滴加入上述反应液中，常温磁力搅拌12h。反应完成后，使用纯水透析24h(MW：3000)，最后冻干得到相应产物。

实施例4：实施例1中的8arm AG对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)实验

(1)细菌培养

挑取平板上的单株大肠杆菌，置于20mL液体LB培养基中，于恒温摇床中37℃、220rpm培养12h，得到浓度足够的菌液。

(2)菌液配制

使用酶标仪检测菌液于600nm处的吸光度值，以1OD约为1×10⁹CFU/mL标准换算，使用液体LB培养基将菌液稀释至0.02OD即约2×10⁷CFU/mL。

(3)材料梯度浓度配制

实施例1中的8arm AG用LB培养基配制成浓度为1mmol/L的母液，然后使用2倍比稀释得到共7个梯度浓度(分别为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6μmol/L)。

(4)铺板

在96孔板上进行实验，以100μL液体LB培养基为空白组，以100μL浓度为1×10⁷CFU/mL的菌液为对照组，其余各个实验组加入50μL浓度为2×10⁷CFU/mL的菌液和50μL8arm AG的溶液。各孔的起始细菌浓度均为1×10⁷CFU/mL，各实验组的最终浓度梯度分别为500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8μmol/L。

(5)孵育

将96孔板置于恒温培养箱中37℃孵育12h。

(6)检测与数据处理得到最低抑菌浓度

使用酶标仪检测每孔液体于600nm处的吸光度，以1OD约为1×10⁹CFU/mL标准换算，与对照组比较，抑菌效率达到90％的最低浓度即为该材料的最低抑菌浓度(MIC)。

实施例5：实施例1中的8arm AG的细胞相容性实验

(1)8arm AG梯度浓度配制

使用DMEM培养基作为溶剂，将8arm AG配置为12.80mg/mL的母液，并使用2倍比稀释得到共7个梯度浓度(分别为12.80、6.40、3.20、1.60、0.80、 0.40、0.20mg/mL)。

(2)细胞悬液配制

取刚刚长成完整单层的HUVEC细胞一瓶，胰蛋白酶消化后将细胞吹打脱壁后收集细胞，使用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液使用台盼蓝染色后于显微镜下计数活细胞数目(且死细胞数不得超过5％)，用完全培养基(及含10％胎牛血清的DMEM培养基)将细胞悬液调整为约每毫升1×105个细胞(每孔约 200μL悬液即每孔约2×104个细胞)。

(3)细胞铺板

取96孔板，除最外侧一圈以及空白组不加入细胞悬液，每孔加入190μL 上述细胞悬液，最外侧一圈每孔加200μL的PBS。于细胞培养箱中37℃、5％二氧化碳环境培养12h孵育。

(4)加入材料

以200uL的完全培养基作为空白组，对照组即190μL细胞悬液加入10μL 完全培养基，实验组每孔加入10μL不同浓度梯度的各材料溶液，即各材料梯度浓度终浓度为640、320、160、80、40、20、10μg/mL，各组设置3个平行对照。于细胞培养箱中37℃、5％二氧化碳环境培养12h。

(5)加入MTT

每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL，使用pH为7.2的磷酸缓冲液配制)，继续培养4h。

(6)呈色并检测

终止培养后，小心地吸取弃掉孔中液体，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，与对照组比较得出细胞存活率。

实施例6：实施例1中的8arm AG的溶血实验

(1)8arm AG梯度浓度配制

使用生理盐水作为溶剂，将8arm AG配置为2560μg/mL的母液，并使用2倍比稀释得到共7个梯度浓度(分别为2560、1280、640、320、160、80、 40μg/mL)。

(2)红细胞悬液制备

大鼠腹主动脉取血，将血液置于玻璃烧杯中，使用面签缓慢搅拌以除去血液中的纤维蛋白，然后加入2倍血液量的生理盐水，轻轻混匀后于4℃、1500 rpm离心15分钟，小心弃去上清，保留红细胞沉淀，重复至上清液近乎无色透明，并以剩下的红细胞沉淀加入适量生理盐水配制成2％的红细胞悬液。

(3)溶血

以生理盐水作为阴性对照，纯水作为阳性对照，将1mL各浓度材料溶液与1mL的2％红细胞悬液于ep管中混合，即各管中最终红细胞浓度为1％，材料浓度梯度为1280、640、320、160、80、40、20μg/mL。轻轻摇动混匀后静置24h。随后，每管中取出100μL上清，使用酶标仪检测540nm处吸光度，并计算溶血率：溶血率＝(A实验-A生理盐水)/(A纯水-A生理盐水)。

实施例7：小鼠脓毒症盲肠结扎穿孔模型中的治疗效果

(1)小鼠脓毒症盲肠结扎穿孔模型(CLP模型)构建及治疗：

使用盲肠结扎穿孔术在Balb/c小鼠中诱导脓毒症。选择6～8周龄，体重18～22g，健康状态良好、无特定病原体的雄性Balb/c小鼠(购于华南理工大学实验动物中心)进行实验。将小鼠置于SPF洁净级别的动物饲养中心进行光照12h，黑夜12h，22℃和55％的相对湿度条件下饲育。手术前所有小鼠禁食 12h，12h后称重，分组，每组12只小鼠，分别设置Sham组、CLP组、8arm Ami 组和8arm Rib组。将禁食后20g左右的雄性Balb/c小鼠腹腔注射1％戊巴比妥 (每20g小鼠注射0.2mL 1％戊巴比妥)进行麻醉，等待约5min后，小鼠完全麻醉后沿小鼠腹中线向右偏约1mm为基准切口约0.8mm，小心地用手术剪刀剪开外皮和内皮，分层打开腹腔，用镊子小心地将盲肠外露，滴加少量生理盐水，使盲肠处于湿润状态，在距盲肠尖端约1.0cm处用3-0非吸收性外科缝线(购于杭州华威医疗用品有限公司)进行结扎(重度脓毒症模型：结扎100％盲肠并用 21号针头来回穿刺两次)，注意避开肠系膜，避免引起肠梗阻。然后用镊子轻轻地使盲肠内的粪便分布均匀，再用浸泡了75％酒精的21号针头将盲肠残端穿刺两次，挤出少量粪便，确保穿刺部位通畅，将挤出的粪便清理掉，然后再轻柔地将结扎后的盲肠放回腹腔，用6-0非吸收性外科缝线(购于杭州华威医疗用品有限公司)将由剪刀剪开的内皮与外皮进行缝合。每只小鼠皮下注射复苏用预热后的无菌生理盐水1mL。分别于盲肠结扎穿孔模型术后1h、12h和24h对各组小鼠进行静脉注射给药，各组小鼠的试验设置如下：

Sham组，即假手术组：仅仅打开腹腔而不进行结扎穿刺；CLP组，即 CLP模型组：给予相同剂量的生理盐水；8arm Ami组，即8臂PEG化的阿米卡星组：静脉注射给予10mg/kg的8arm Ami溶液；arm Rib组，即8臂PEG化的安普霉素组：静脉注射给予10mg/kg的arm Rib溶液；观察各组小鼠在168h内的存活率，并记录临床评分及体重变化。

(2)CLP模型给药后血液炎症因子的检测：

取血清：空白组、对照组以及治疗组CLP模型小鼠于造模24h后取全血，室温静置2h后3000rpm离心5min，取上层血清。

酶联免疫法检测血液中的TNF-α和IL-6的含量：使用酶联免疫检测试剂盒(TNF-αELISA试剂盒，美国Proteintech公司；IL-6 ELISA试剂盒,美国 Proteintech公司)检测上清中的炎症因子TNF-α和IL-6的含量，具体的操作按照试剂盒说明书进行。

(3)CLP模型给药后血液腹腔液细菌的检测：

取腹腔液、血液：空白组、对照组以及治疗组CLP模型小鼠于超净台无菌环境中取腹腔液及血液。

腹腔液及血液稀释：以去除的腹腔液、血液作为原液，用10倍比稀释将其用液体LP培养基稀释为共6个梯度浓度，分别为原液、1×10倍稀释液、1×10²倍稀释液、1×10³倍稀释液、1×10⁴倍稀释液、1×10⁵倍稀释液。

平板涂布：各组及各浓度的腹腔液、血液分别取10μL滴于固体LB培养基平板中间，使用涂布棒将液滴均匀涂布，再于细菌培养箱中37℃孵育12h，每个设置3个平行对照。

菌落统计：12h后将LB平板取出，统计细菌菌落数量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，仅用于解释本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，其特征在于，所述的分子由氨基糖苷类抗生素通过侨联部分连接在多臂聚乙二醇上得到，其中多臂聚乙二醇的每一臂上连接一分子氨基糖苷类抗生素；所述的多臂聚乙二醇的臂数大于1，所述的多臂聚乙二醇中聚乙二醇的分子量为200～100000。

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，其特征在于，所述的侨联部分为不同链长的环状酸酐，链长为1～20；链中含有C、N、O、S、Se五种元素中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，其特征在于，所述的不同链长的环状酸酐中，环状酸酐链重复，链单元重复数为1～20。

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子，其特征在于所述的氨基糖苷类抗生素包括奈替米星、阿米卡星、核糖霉素、西索米星、巴龙霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、安普霉素、新霉素、异帕米星、福提米星、阿贝卡星和潮霉素中的至少一种。

5.权利要求1～4中任一项所述的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用有机溶剂溶解多臂聚乙二醇，将侨联部分加入有机溶剂中，混合均匀，然后在搅拌的条件下加入三乙胺；最后再将溶于有机溶剂中的4-二甲氨基吡啶加入上述溶液中，搅拌条件下反应，冰浴条件下加入酸性溶液中和反应，随后萃取，取有机层并浓缩，得到多臂聚乙二醇每一臂上连接了侨联部分的化合物；

(2)用有机溶剂溶解氨基糖苷类抗生素，在搅拌的条件下加入三乙胺，随后加入步骤(1)得到的多臂聚乙二醇每一臂上连接了侨联部分的化合物，在搅拌的条件下缓慢将两者混合均匀，搅拌条件下反应，随后透析，取保留液，冻干，得到权利要求1～4中任一项所述的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中所述的侨联部分的制备包括以下步骤：

S1.将链状二酸置于反应容器中，加入乙酸酐搅拌，反应，随后除去溶剂得到环状酸酐；

步骤S1中所述的反应的条件为无水无氧；

步骤S1中所述的反应的温度为0℃～60℃；

步骤S1中所述的反应的时间为8h～72h；

步骤S1中所述的链状二酸与乙酸酐的质量比为0.5～1.0:10～100。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述的有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯中的一种或多种；

步骤(1)中所述的多臂聚乙二醇与侨联部分的质量比为0.01～2.0:1.0～50.0；

步骤(1)中所述的多臂聚乙二醇和三乙胺的质量比为10000～100000：0.01～50；

步骤(1)中所述的多臂聚乙二醇和4-二甲氨基吡啶的质量比为0.1～100：0.05～10；

步骤(1)中所述的酸性溶液包括盐酸、醋酸、硫酸和硝酸中的至少一种；

步骤(1)中所述的萃取使用的溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇中的一种或多种；

步骤(1)中所述的反应的温度为0℃～60℃；

步骤(1)中所述的反应的时间为12h～96h。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

步骤(2)中所述的氨基糖苷类抗生素和多臂聚乙二醇每一臂上连接了侨联部分的化合物的质量比为0.1～400:0.1～20.0；

步骤(2)中所述的氨基糖苷类抗生素和三乙胺的质量比为10000～100000：0.01～50；

步骤(2)中所述的透析所采用的透析袋截留分子量为200～100000Da，透析时间为12h～96h；

步骤(2)中所述的反应的温度为0℃～60℃；

步骤(2)中所述的反应的时间为8h～120h；

步骤(2)中所述的搅拌条件为100～1500rpm。

9.权利要求1～4中任一项所述的聚乙二醇修饰的氨基糖苷类分子在制备治疗感染性疾病的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的产品包括药物、灌流柱、吸附装置中的至少一种；所述的感染性疾病包括脓毒血症。