CN115873113B

CN115873113B - 靶向CaSR的纳米抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115873113B
Application number: CN202111146196.1A
Authority: CN
Inventors: 耿勇; 王璐
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2024-06-18
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN115873113A

Abstract

本发明公开了靶向人体细胞外钙敏感受体(Human extracellularcalcium‑sensing receptor,CaSR)的纳米抗体及其制备方法和应用。具体地，本发明公开了靶向CaSR的纳米抗体及其衍生蛋白、编码它们的基因序列、用于生产它们的表达载体和表达体系。本发明的纳米抗体可作用于CaSR的胞外段，并具有较高的亲和力。靶向CaSR胞外段的纳米抗体可以治疗炎症，如哮喘及体内钙离子紊乱相关疾病，如ADH1。

Description

靶向CaSR的纳米抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及靶向钙敏感受体(CaSR)的纳米抗体及其制备、鉴定和应用。

背景技术

钙离子在人体内广泛分布，参与机体各项生命活动，因此维持机体钙离子代谢平衡非常重要。在钙离子的稳态系统中，人体细胞外钙敏感受体(Human extracellularcalcium-sensing receptor,CaSR)是最为重要的组成元素，它能检测血液中钙离子浓度的微小变化，并使系统中其它元素功能发生改变，使整个体系的钙离子浓度回复到正常水平。因此，细胞外钙敏感受体(CaSR)是钙离子的稳态平衡体系调控的中心枢纽。

以钙敏感受体为靶点的药物试剂分为两类，一种叫拟钙剂(calcimimetic)，另外一种是钙拮抗剂(Calcilytic)。拟钙剂是指能激活钙敏感受体的所有试剂，包括激动剂和正向别构调节剂，药物Cinacalcet是CaSR的正向别构调节剂，Etelcalcetide是激动剂。临床上使用的Cinacalcet和Etelcalcetide治疗慢性肾病患者(chronic kidney disease,CKD)的继发性甲状旁腺功能亢进症(secondary hyperparathyroidism,SHPT)。Calcilytic是钙敏感受体的拮抗剂，能刺激分泌PTH，理论上可以用于治疗低钙血症和高钙尿症。

常染色体显性低钙血症1型(ADH1)是由钙感应受体(CaSR)的种系功能获得突变引起的，可能导致症状性低钙血症、血清甲状旁腺激素浓度过低和高钙尿。目前，钙拮抗剂已被证明在体外与ADH导致的CaSR突变相关的功能获得正常化有一定的功能，并代表ADH1的潜在靶向治疗方法。

单克隆抗体在疾病的诊断和靶向治疗中取得了巨大成功。然而，传统单克隆抗体有以下缺点：其分子量较大，组织穿透力差，导致治疗部位的药物浓度较低；其往往具有较高的免疫原性，有一定安全风险；其稳定性不足，生产成本高。

因此，本领域迫切需要开发一种分子量更小、稳定性更好、免疫原性低且易于制备的CaSR药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高亲和力和潜在抗炎症作用的靶向CaSR的纳米抗体。

本发明的另一目的在于提供靶向CaSR的纳米抗体应用，特别是作为稳定CaSR结构的多肽小分子及在治疗和/或诊断CaSR相关疾病如常染色体显性低钙血症1型(ADH1)中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种靶向CaSR的纳米抗体，所述的纳米抗体的VHH链的互补决定区(CDR)为选自下组的一种或多种：

(1)由SEQ ID NO:1所示的CDR1,SEQ ID NO:2所示的CDR2,SEQ ID NO:3所示的CDR3(对应抗体株2D11的CDRs)；

(2)由SEQ ID NO:4所示的CDR1,SEQ ID NO:5所示的CDR2,SEQ ID NO:6所示的CDR3(对应抗体株NB32的CDRs)；

(3)由SEQ ID NO:7所示的CDR1,SEQ ID NO:8所示的CDR2,SEQ ID NO:9所示的CDR3(对应抗体株NB88的CDRs)；

(4)由SEQ ID NO:10所示的CDR1,SEQ ID NO:11所示的CDR2,SEQ ID NO:12所示的CDR3(对应抗体株2D4的CDRs)；

(5)由SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:14所示的CDR2,SEQ ID NO:15所示的CDR3(对应抗体株1C12的CDRs)。

在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与SEQ ID NO:1-15中任一具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相似性的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的纳米抗体VHH链CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-15中任一相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与CaSR特异性结合能力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。

在另一优选例中，所述纳米抗体能够特异性结合CaSR。

在另一优选例中，所述纳米抗体能够特异性结合CaSR胞外段。

在另一优选例中，所述纳米抗体能够特异性结合地阻断PD1和CaSR的相互作用。

在另一优选例中，所述CaSR为人或非人哺乳动物的CaSR。

在另一优选例中，所述CaSR为人、小鼠、大鼠CaSR。

在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)，所述的框架区为：

SEQ ID NO:16所示的FR1、SEQ ID NO:17所示的FR2、SEQ ID NO:18所示的FR3、和SEQ ID NO:19所示的FR4。

在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:20-24所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述纳米抗体的VHH链具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种靶向CaSR的抗体，所述的抗体包括一个或多个本发明第一方面所述的纳米抗体的VHH链。

在另一优选例中，所述的靶向CaSR的抗体可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体或本发明第二方面所述的靶向CaSR的抗体。

在另一优选例中，所述多核苷酸为组合形式。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有如SEQ ID NO:20-24所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸包括RNA、DNA或cDNA。

在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明第三方面的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒载体、病毒载体或其组合。

在另一优选例中，所述的病毒载体包括杆状病毒载体、慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、转座子表达载体、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、和哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞包括HEK293系列细胞、CH0细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种生产靶向CaSR的纳米抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述靶向CaSR的纳米抗体的培养物；以及

(b)从所述培养物中分离或回收所述的靶向CaSR的纳米抗体；及任选的

(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的靶向CaSR的纳米抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体，或如本发明第二发明所述的靶向CaSR的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：小分子化合物、PEG、荧光素、放射性同位素、造影剂、脂肪酸链、蛋白片段、或其组合。

在另一优选例中,所述的组分(a)和(b)可操作性连接。

在另一优选例中，所述的偶联部分为化学标记和生物标记。

在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。

在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。

在另一优选例中，所述小分子化合物包括但不限于有明确或潜在治疗或辅助治疗CaSR相关疾病的药物或毒素。

在另一优选例中，所述的放射性同位素包括：

(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或

(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。

在另一优选例中，所述的放射性同位素包括但不限于碘131、铟111和镥177。

在另一优选例中，所述的造影剂用于MRI或CT。

在另一优选例中，所述的蛋白片段包括但不限于抗体Fc、生物素、亲和素、HRP、抗体、酶、细胞因子及其他生物活性蛋白或多肽。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。

在本发明的第八方面，提供了一种经修饰的靶向CaSR的纳米抗体，所述修饰包括偶联和/或连接小分子化合物、PEG、荧光素、放射性同位素、造影剂、脂肪酸链、蛋白片段等。

在另一优选例中，所述的修饰包括本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体VHH链中的一种或多种的串联表达及多聚体形式表达。

在本发明的第九方面，提供了一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含第一抗原结合区，第一抗原结合区含有：如本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体，或如本发明第二方面所述的靶向CaSR的抗体。

在另一优选例中，多特异性抗体还包括靶向选自下组的靶点的第二抗原结合区：IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、TIGIT、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二抗原结合区为纳米抗体。

在另一优选例中，所述多特异性抗体包括一个或多个第二抗原结合区。

在另一优选例中，所述多特异性抗体还包含抗体的Fc段。

在本发明的第十方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含：

(i)如本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体，或如本发明第二发明所述的靶向CaSR的抗体；

(ii)任选的具有治疗功能的多肽分子或片段。

在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：靶向IL-4R、IL-4Rα、TNF-α、VEGF、4-1BB、CD47、TIM3、CTLA4、IL-17A、CD19、CD22、CD38、IL-5、TSLP、BCMA、GLP-1、Trop2、或TIGIT的多肽分子或片段。

在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子。

在另一优选例中，所述具有治疗功能的多肽分子或片段包括纳米抗体、单链抗体(scFv)、双链抗体、单克隆抗体、或嵌合抗体。

在另一优选例中，所述融合蛋白还包含协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：6His标签、GGGS序列、FLAG标签。

在另一优选例中，所述的融合蛋白包括双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体。

在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含：

(i)如本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体、如本发明第二发明所述的靶向CaSR的抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第九方面的多特异性抗体或如本发明第十方面所述的融合蛋白；

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包含其他生物活性物质，如治疗ADH1的药物。

在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方式选自下组：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自下组：液态、固体、或凝胶态。

在本发明的第十二方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体、如本发明第二发明所述的靶向CaSR的抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白、或其组合，用于制备(i)治疗CaSR相关疾病的药物；(ii)用于检测CaSR分子的试剂。

在另一优选例中，所述CaSR相关疾病选自下组：1型家族性低尿钙性高钙血症(FHH1)、新生儿严重甲状旁腺亢进症(NSHPT)、成年人原发性甲状旁腺功能亢进症(PHPT)、低血钙疾病如常染色体显性低钙血症1型(ADH1)和V型巴特综合征等。

在另一优选例中，所述的检测包括流式细胞检测、细胞免疫荧光检测，或其组合。

在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中CaSR分子的方法，包括步骤：

(1)将样品与本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

在本发明的第十四方面，提供了一种治疗CaSR相关疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第一方面所述的靶向CaSR的纳米抗体、如本发明第二发明所述的靶向CaSR的抗体、如本发明第七方面所述的免疫偶联物、如本发明第九方面的多特异性抗体、如本发明第十方面所述的融合蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述有需要的受试者选自下组：人类或非人类哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CaSR蛋白的纯化与鉴定。其中A显示了CaSR蛋白质分子排阻层析纯化示意图；B显示了CaSR蛋白质分子SDS-PAGE示意图。

图2显示了Octet测定了候选纳米抗体高亲和力结合CaSR蛋白。其中，A，B，C，D，E分别显示了纳米抗体NB32、NB88、2D11、2D4、1C12的亲和力。

图3显示了钙流测定了候选纳米抗体抑制钙离子对CaSR的激活作用的浓度梯度稀释动力学图和IC50曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究,纯化CaSR蛋白并用于免疫骆驼，随后，建立噬菌体展示纳米抗体库，并基于该库对靶向CaSR的纳米抗体进行筛选和分子和细胞水平的鉴定，首次制备得到高亲和力与高特异性的靶向CaSR的纳米抗体；并且通过体外和体内研究，验证了这些纳米抗体对ADH1的治疗作用，该研究涉及一种称为Nuf的小鼠模型，该模型含有功能获得性CaSR突变，Leu723Gln，体外给予纳米抗体以剂量依赖性方式降低表达突变Gln723 CaSR的HEK293细胞的细胞内钙反应，从而纠正与Nuf小鼠CaSR突变相关的功能获得。因而本发明在检测CaSR分子、治疗或诊断ADH1及相关疾病方面有潜在的应用前景。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的靶向CaSR的纳米抗体”、“本发明的抗CaSR纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CaSR(包括人CaSR)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20-24所示的纳米抗体，最优选的是具有SEQ ID NO:20所示的VHH链的纳米抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。

纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的靶向CaSR的抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CaSR的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有CaSR结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合CaSR蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

检测方法

本发明还涉及检测CaSR蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中CaSR蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

应用

如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与CaSR相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对CaSR的临床诊断和靶向治疗。

本发明提供了抗CaSR纳米抗体在诊断和治疗CaSR相关疾病中的应用，具体地，所述CaSR相关疾病包括但不限于：1型家族性低尿钙性高钙血症(FHH1)、新生儿严重甲状旁腺亢进症(NSHPT)、成年人原发性甲状旁腺功能亢进症(PHPT)、低血钙疾病如常染色体显性低钙血症1型(ADH1)和V型巴特综合征等。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明克服了GPCR(G蛋白偶联受体)稳定性差；本发明的纳米抗体能结合在抗原的狭缝中，对蛋白起到稳定作用，而传统的抗体不具备这些特征。

(b)本发明首次获取了高亲和力的靶向CaSR的纳米抗体，其中靶向CaSR胞外段的纳米抗体通过小鼠体哮喘药效实验初步验证了CaSR作为炎症治疗靶点的潜力。

(c)本发明获取的纳米抗体可作为CaSR药物研究的一个新的尝试。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：针对CaSR蛋白的纳米抗体筛选

1.1CaSR蛋白表达及包装

构建CaSR-CMV载体，转化进DH10感受态里，通过蓝白斑筛选挑取白色克隆，提取杆粒并鉴定浓度和质量。根据bac-to-bac实验方法，使用sf9昆虫细胞扩增杆状病毒，并将CaSR转染HEK293S细胞，在37℃,8％CO2中培养48h后收取细胞。

使用重悬溶液重悬细胞并高压破碎，超速离心，收集沉淀使用表面活性剂溶膜，离心分离上清，通过M2 column纯化，SDS-PAGE鉴定CaSR蛋白的得率和纯度。之后经superdex200-24mL column分离得到性质稳定、峰形较好的CaSR蛋白。

结果如附图1所示，纯化后能够得到峰形较好、性质较稳定的CaSR蛋白，通过SDS-PAGE显示蛋白仍然是以复合物形式存在且纯度较高。

1.2免疫动物

选取成年骆驼，分7次免疫。免疫结束后3-5天内，从骆驼身上抽取外周血，分离淋巴细胞，Trizol法手工提取RNA，反转录得到cDNA。

1.3建库

使用特异性引物CALL001和CALL002从cDNA上扩增编码抗体重链的核酸片段，一轮扩增后，1％核酸电泳鉴定，其中700bp的核酸片段对应的是重链片段，从胶上分离重链核酸片段并使用胶回收试剂盒纯化。再用VHH-Back和VHH-For从重链片段上扩增纳米抗体(VHHs)编码核酸片段，回收该片段并通过限制性酶PstI和Eco91I酶切连接到pMES4载体上。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态TG1中，构建针对CaSR的重链单域抗体文库并对文库进行检定，通过稀释涂板，计算得到文库的库容大小为3.57×10⁸。

第一轮PCR:

上游引物CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC(SEQ ID NO:25)；

下游引物CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:26)。

第二轮PCR:

以第一轮PCR产物作模板，

上游引物VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:27)；

下游引物VHH-For：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:28)。

1.4免疫淘选

在开始淘选之前，向10倍库容的纳米抗体库中加入辅助噬菌体扩增得到抗体展示噬菌体，测定滴度为3×10¹²cfv/mL。MaxiSorp 96Immunoplates用5μg/mL NeutrAvidin溶液(每孔100μL)包被，4℃,700rpm,过夜。第二天，用2％脱脂奶粉室温封闭2h，用20mM HEPES(PH7.5),150mM NaCl溶液洗5次。之后设置对照组和实验组，加入100μL 200nM Biotin-CaSR蛋白稀释液，室温振荡(700rpm)孵育15min，用20mM HEPES(PH7.5),150mM NaCl溶液洗5次。之后加入100μL噬菌体稀释液(1×10¹³cfv/mL)，室温振荡(700rpm)孵育2h，用20mMHEPES(PH7.5),150mM NaCl溶液洗5次除去不结合的噬菌体。之后加入100μL0.25mg/mL的胰酶室温振荡(700rpm)消化30min将特异性结合的噬菌体解离下，之后加入抑制剂终止消化。将洗脱的噬菌体感染TG1感受态细胞，以便第二轮panning使用。重复上述操作2-3轮，直至阳性克隆被富集。

1.5ELISA鉴定阳性克隆

几轮淘选过后，将洗脱下来的噬菌体感染处于生长对数期的TG1感受态，梯度稀释并涂布在平板上培养过夜。分别挑取96个克隆接种到每孔100μL培养基的96孔圆底板中静置过夜作为母板，之后吸取10μL过夜培养的菌液到每孔1mL培养基的96孔深底板中，诱导纳米抗体表达并粗纯。

MaxiSorp 96Immunoplates用5μg/mL NeutrAvidin溶液(每孔100μL)包被，4℃,700rpm,过夜。第二天，加入2％脱脂奶粉室温封闭板子，用含BSA的溶液洗3次。加入100μL 3μg/mL Biotin-CaSR蛋白室温孵育30min后洗涤，加入粗提的纳米抗体室温孵育1h后洗涤，加入小鼠抗HA一抗室温孵育1h后洗涤，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记二抗室温孵育1h后洗涤，加入碱性磷酸酶显色液反应10min，在405nm处检测吸收值，初步判定吸收值是对照组吸收值的3倍以上的即为阳性孔，将阳性克隆转移到摇菌管中培养以便提取质粒并进行测序。

实施例2：针对CaSR纳米抗体的初步评价鉴定

2.1纳米抗体在大肠杆菌中的表达、纯化

将测序正确的50个质粒转化进Top10F’感受态里，涂布在含有100μg/mL氨苄的LB平板上，37℃静置过夜培养。挑取单克隆接种并培养过夜，之后接种到1L培养基里，37℃,220rpm培养至OD值达到0.6-0.8，1mM IPTG诱导，28℃,220rpm培养过夜。第二天，4500rpm离心15min收菌，超声破碎，之后过镍离子亲和层析柱纯化抗体蛋白。

结果显示筛选出来的纳米抗体中有140个能够表达，其余的纳米抗体因存在移码突变或者蛋白本身性质不稳定等未知原因导致不表达。

2.2检测候选纳米抗体对于CaSR蛋白的特异性结合

MaxiSorp 96Immunoplates用5μg/mL NeutrAvidin溶液(每孔100μL)包被，4℃,700rpm,过夜。第二天，加入2％脱脂奶粉室温封闭板子，用含BSA的溶液洗3次。加入100μL 3μg/mL Biotin-CaSR蛋白室温孵育30min后洗涤，加入纯化好的纳米抗体室温孵育1h后洗涤，加入小鼠抗HA一抗室温孵育1h后洗涤，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记二抗室温孵育1h后洗涤，加入碱性磷酸酶显色液反应10min，在405nm处检测吸收值。

结果见表1，结果显示能够结合CaSR蛋白的140个纳米抗体中有5个纳米抗体能够抑制CaSR蛋白的激活作用，其余的不能够抑制CaSR蛋白的激活。

表1

2.3 ELISA推测纳米抗体对于CaSR蛋白的结合曲线

MaxiSorp 96Immunoplates用5μg/mL NeutrAvidin溶液(每孔100μL)包被，4℃,700rpm,过夜。第二天，加入2％脱脂奶粉室温封闭板子，用含BSA的溶液洗3次。加入100μL 3μg/mL Biotin-CaSR蛋白室温孵育30min后洗涤，分别加入10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6(mol/l)等梯度稀释后的纳米抗体室温孵育1h后洗涤，加入小鼠抗HA一抗室温孵育1h后洗涤，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记二抗室温孵育1h后洗涤，加入碱性磷酸酶显色液反应10min，在405nm处检测吸收值。之后计算EC50值，数值见表2。

表2

Nanobody	pEC50
		NB32	3.0
NB88	1.0
		2D11	1.9
2D4	0.9
		1C12	2.1

2.4 Octet测定纳米抗体结合CaSR蛋白的亲和力

纳米抗体和CaSR蛋白的结合动力学可以在Octet-Red96 device上通过生物膜干涉测量进行测定，将Biotin-CaSR通过20mM HEPES,150mM NaCl溶液稀释至20μg/mL固定在活化后的Streptavidin生物探针上来测定蛋白亲和力。

该实验步骤如下：(1)平衡(2)上样，即将蛋白固定在探针上(3)基线(4)抗体结合测定k_on(5)抗体解离测定k_off(6)用ForteBio数据分析软件处理数据，数据见附图2，亲和力数值见表3。

结果如图2和表3所示，通过拟合曲线进行计算，得出纳米抗体NB32,NB88,2D11,2D4,1C12的亲和力分别为3.2×10^-9、3.9×10^-9、2.4×10^-10、4.6×10^-10、9×10^-10M。

表3

nanobody	Octet(M)
		NB32	3.2×10^-9
NB88	3.9×10^-9
		2D11	2.4×10^-10
2D4	4.6×10^-10
		1C12	9×10^-10

2.5钙流实验测定纳米抗体对CaSR受钙离子激活的抑制作用

用细胞内钙流实验检测140个纳米抗体的活性，筛选出5个对CaSR功能有抑制作用的纳米抗体，为了检测纳米抗体对CaSR抑制作用的强弱，在细胞外钙离子浓度1.2mM的情况下，检测五个纳米抗体对细胞内钙流的影响。

如图3所示，纳米抗体NB32、NB88、2D11、2D4、1C12均能够抑制CaSR受钙离子的激活作用，IC50值分别为301nM、101nM、41nM、65nM、107nM。

讨论

纳米抗体是目前最小的抗体分子，除了具有单克隆抗体的特异性外，还具有组织穿透能力强、免疫原性低、稳定性好、人源化简单、易于制备等优势。

GPCR稳定性很差，纳米抗体能结合在抗原的狭缝中，对蛋白起到稳定作用，而传统的抗体不具备这些特征，纳米抗体似乎是稳定GPCR特定构象的最佳选择，因此纳米抗体可作为CaSR药物研究的一个新的尝试。

钙离子的稳态系统对维持正常生命活动极为重要，CaSR是调控这个系统的中心元素。因此，解析CaSR受体的全长结构以及与其下游效应分子复合物的结构，以增加对这个受体的结构和功能的理解非常重要。以CaSR受体的结构为基础，可为开发药物干预钙离子紊乱导致的疾病提供结构信息。由于这个受体构象的复杂性，因此试图研究和开发纳米抗体，以扑捉不同构象，有助于CaSR蛋白的结构研究和纳米抗体药物的开发。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列

>SEQ ID NO:1抗体株2D11 CDR1

GFPISTYD

>SEQ ID NO:2抗体株2D11 CDR2

ITDSFSI

>SEQ ID NO:3抗体株2D11 CDR3

AAGDARWSLLLRAEQYNY

>SEQ ID NO:4抗体株NB32 CDR1

KHRYSTYS

>SEQ ID NO:5抗体株NB32 CDR2

IYSDGGT

>SEQ ID NO:6抗体株NB32 CDR3

AASQTFRGWYPYEYNY

>SEQ ID NO:7抗体株NB88 CDR1

RYGYSRNW

>SEQ ID NO:8抗体株NB88 CDR2

IYTGGSKT

>SEQ ID NO:9抗体株NB88 CDR3

AAGLVAYGRRWSPEAYKY

>SEQ ID NO:10抗体株2D4 CDR1

YMRYSSFC

>SEQ ID NO:11抗体株2D4 CDR2

IDSGRRT

>SEQ ID NO:12抗体株2D4 CDR3

AARDVGYCGGYWARRDFAYWG

>SEQ ID NO:13抗体株1C12 CDR1

RYTYNSPL

>SEQ ID NO:14抗体株1C12 CDR2

IDSDGSI

>SEQ ID NO:15抗体株1C12 CDR3

AADPLHRWSHRLEAIGYRYWG

>SEQ ID NO:16抗体株框架区FR1

QLQESGGGSVQAGGSLTLSCAASEY

>SEQ ID NO:17抗体株框架区FR2

MGWFRQAPGKEREGVAA

>SEQ ID NO:18抗体株框架区FR3

RYADSVKGRFTISKDNAKSTLYLLMNSLKPEDTAMYYC

>SEQ ID NO:19抗体株框架区FR4

WGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH

>SEQ ID NO:20抗体株2D11序列

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFPISTYDMGWFRQAPGKEREGVVGITDSFSIKYEDSVKGRFTISRDNAKNALYLQMNSLKPEDTGMYYCAAGDARWSLLLRAEQYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH

>SEQ ID NO:21抗体株NB32序列

QVQLQESGGGSVQAGGSLTLSCAASEYKHRYSTYSMGWFRQAPGKEREGVAAIYSDGGTRYADSVKGRFTISKDNAKSTLYLLMNSLKPEDTAMYYCAASQTFRGWYPYEYNYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH

>SEQ ID NO:22抗体株NB88序列

QVQLQESGGGSVQAGESLRLSCAASRYGYSRNWMGWFRQPPGKEREGVAVIYTGGSKTAYADAVKGRFIISLDNANNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAGLVAYGRRWSPEAYKYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH

>SEQ ID NO:23抗体株2D4序列

LQESGGGSVQIGGSLRLSCAASGYTYMRYSSFCMGWFRQAPGKEREGVAAIDSGRRTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARDVGYCGGYWARRDFAYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH

>SEQ ID NO:24抗体株1C12序列

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCTASRYTYNSPLYMAWFRQAPGKEREGVAHIDSDGSITYTDSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNNLNPEDTAMYYCAADPLHRWSHRLEAIGYRYWGQGTQVTVSSAAAYPYDVPDYGSHHHHHH。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

<120> 靶向CaSR的纳米抗体及其制备方法和应用

<130> P2021-2378

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 1

Gly Phe Pro Ile Ser Thr Tyr Asp

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 2

Ile Thr Asp Ser Phe Ser Ile

1 5

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 3

Ala Ala Gly Asp Ala Arg Trp Ser Leu Leu Leu Arg Ala Glu Gln Tyr

1 5 10 15

Asn Tyr

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 4

Lys His Arg Tyr Ser Thr Tyr Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 5

Ile Tyr Ser Asp Gly Gly Thr

1 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 6

Ala Ala Ser Gln Thr Phe Arg Gly Trp Tyr Pro Tyr Glu Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 7

Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Asn Trp

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 8

Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Thr

1 5

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 9

Ala Ala Gly Leu Val Ala Tyr Gly Arg Arg Trp Ser Pro Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Lys Tyr

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 10

Tyr Met Arg Tyr Ser Ser Phe Cys

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 11

Ile Asp Ser Gly Arg Arg Thr

1 5

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 12

Ala Ala Arg Asp Val Gly Tyr Cys Gly Gly Tyr Trp Ala Arg Arg Asp

1 5 10 15

Phe Ala Tyr Trp Gly

20

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 13

Arg Tyr Thr Tyr Asn Ser Pro Leu

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 14

Ile Asp Ser Asp Gly Ser Ile

1 5

<210> 15

<211> 21

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 15

Ala Ala Asp Pro Leu His Arg Trp Ser His Arg Leu Glu Ala Ile Gly

1 5 10 15

Tyr Arg Tyr Trp Gly

20

<210> 16

<211> 25

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 16

Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr

20 25

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 17

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 18

<211> 38

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 18

Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 19

<211> 30

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 19

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr Pro

1 5 10 15

Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His His

20 25 30

<210> 20

<211> 143

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Gly Ile Thr Asp Ser Phe Ser Ile Lys Tyr Glu Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Gly Asp Ala Arg Trp Ser Leu Leu Leu Arg Ala Glu Gln Tyr Asn

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 21

<211> 143

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Lys His Arg Tyr Ser

20 25 30

Thr Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Val Ala Ala Ile Tyr Ser Asp Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ser Gln Thr Phe Arg Gly Trp Tyr Pro Tyr Glu Tyr Asn

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 22

<211> 144

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Asn

20 25 30

Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Val Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Thr Ala Tyr Ala Asp Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Leu Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Leu Val Ala Tyr Gly Arg Arg Trp Ser Pro Glu Ala Tyr

100 105 110

Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 23

<211> 144

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 23

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Met Arg Tyr Ser Ser Phe

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Ser Gly Arg Arg Thr Thr His Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Arg Asp Val Gly Tyr Cys Gly Gly Tyr Trp Ala Arg Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 24

<211> 145

<212> PRT

<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Arg Tyr Thr Tyr Asn Ser Pro

20 25 30

Leu Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ala His Ile Asp Ser Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Pro Leu His Arg Trp Ser His Arg Leu Glu Ala Ile Gly

100 105 110

Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Gly Ser His His His His His

130 135 140

His

145

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

gtcctggctg ctcttctaca aggc 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

ggactagtgc ggccgctgga gacggtgacc tgggt 35

Claims

1.一种靶向CaSR的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链包括选自下组的互补决定区(CDR)：

如SEQ ID NO:1所示的CDR1,SEQ ID NO:2所示的CDR2,SEQ ID NO:3所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链还包括框架区(FR)，所述的框架区为：

如SEQ ID NO:16所示的FR1，SEQ ID NO:17所示的FR2，SEQ ID NO:18所示的FR3，和SEQID NO:19所示的FR4。

3. 如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合CaSR，且所述纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一项所述的纳米抗体。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种生产靶向CaSR的纳米抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而获得含靶向CaSR的纳米抗体的培养物；

(b) 从所述培养物中分离和/或回收所述的靶向CaSR的纳米抗体；和

(c) 任选地，纯化和/或修饰步骤(b)所获得的靶向CaSR的纳米抗体。

8.一种靶向CaSR的抗体，其特征在于，所述的抗体包括一个或多个权利要求1所述的纳米抗体的VHH链。

9. 一种免疫偶联物，其特征在于，所述的免疫偶联物含有：

(a) 如权利要求1所述的靶向CaSR的纳米抗体；和

(b) 选自下组的偶联部分：小分子化合物、PEG、荧光素、放射性同位素、造影剂、脂肪酸链、蛋白片段、或其组合。

10.如权利要求9所述的免疫偶联物,其特征在于，所述小分子化合物包括治疗或辅助治疗CaSR相关疾病的药物或毒素；

其中，所述CaSR相关疾病选自下组：1型家族性低尿钙性高钙血症（FHH1）、新生儿严重甲状旁腺亢进症(NSHPT)、成年人原发性甲状旁腺功能亢进症(PHPT)、低血钙疾病如常染色体显性低钙血症1型（ADH1）、V型巴特综合征或其组合。

11.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的蛋白片段包括抗体Fc、生物素、亲和素、HRP、抗体、酶、细胞因子及其他生物活性蛋白或多肽。

12.一种多特异性抗体，所述的多特异性抗体包含第一抗原结合区，第一抗原结合区含有：如权利要求1所述的靶向CaSR的纳米抗体，或如权利要求8所述的靶向CaSR的抗体。

13.一种药物组合物，所述的药物组合物包含：

(i) 如权利要求1所述的靶向CaSR的纳米抗体、如权利要求8所述的靶向CaSR的抗体、如权利要求9所述的免疫偶联物、如权利要求12的多特异性抗体；

(ii) 药学上可接受的载体。

14.一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：如权利要求1所述的靶向CaSR的纳米抗体、权利要求8所述所述的靶向CaSR的抗体、权利要求9所述的免疫偶联物，或其组合，所述活性成分用于制备治疗和/或诊断CaSR相关疾病的药物；

15.一种体外非诊断和非治疗性的检测样品中CaSR分子的方法，包括步骤：

(1) 将样品与如权利要求9所述的免疫偶联物接触；

(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物。