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CN115851831A - 一种高效表达外源蛋白的cho细胞株的构建方法及其应用 - Google Patents

一种高效表达外源蛋白的cho细胞株的构建方法及其应用 Download PDF

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CN115851831A
CN115851831A CN202210982902.4A CN202210982902A CN115851831A CN 115851831 A CN115851831 A CN 115851831A CN 202210982902 A CN202210982902 A CN 202210982902A CN 115851831 A CN115851831 A CN 115851831A
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CN
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seq
virus
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cho cell
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Application number
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田克恭
谭菲菲
张许科
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Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Original Assignee
Pulaike Biological Engineering Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种高效表达外源蛋白的CHO细胞的构建方法及其应用，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加所述信号肽序列的所述外源蛋白与Fc通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。本发明还涉及使用所构建的CHO细胞表达外源蛋白的方法，以及包括该外源蛋白的疫苗组合物。

Description

一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用
本申请是中国专利申请号202010055178.1，申请日2020年01月17日，发明名称是“一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于细胞系及其制备方法领域，特别涉及经引入外来遗传物质而修饰的细胞及其构建方法和应用。
背景技术
CHO细胞是从成年雌性仓鼠卵巢中分离获得，为上皮贴壁细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于真核生物天然蛋白；(2)既可贴壁生长，又可悬浮培养，且耐受较高的剪切力和渗透压；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化。
然而，如何提高CHO表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是针对具体外源基因进行特定改造来实现提高外源蛋白表达量，不适合其他的外源蛋白的高效表达，当应用到其他的外源蛋白时，需要对其他外源蛋白的基因重新进行改造，程序繁琐。因此，现实生产中需要一种适用于不同外源蛋白的，操作简单的高效表达方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加信号肽序列的外源蛋白序列与Fc序列通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。
在步骤(4)中，包括筛选产量较高的克隆株；对所得克隆株进行稳定性评估和产率评估，以便选择稳定性较好且细胞生长特性好、蛋白产量较高的克隆株用于生产。
本发明方法使得外源蛋白高效表达，能较CHO常规表达显著提高外源蛋白的表达量，且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于多种兽医疫苗蛋白，无需对外源蛋白的基因进行优化，具有广泛的适用范围。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)中信号肽序列如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示。如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示的信号肽可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的信号肽序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(2)中Fc序列如SEQ ID.No.15或SEQ ID.No.16所示。如SEQ ID.No.15所示的Fc序列和如SEQID.No.16所示的Fc序列可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的Fc序列。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)中所述外源蛋白基因包括非洲猪瘟病毒CD2v蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸虫GALE蛋白、日本血吸虫Wnt5蛋白。
本发明还涉及所述的方法制备/构建的高效表达外源蛋白的CHO细胞。
本发明还涉及一种高效表达外源蛋白的方法，其中，所述方法使用所述的CHO细胞表达所述外源蛋白。
本发明还涉及所构建的CHO细胞在制备外源蛋白中的应用。
本发明还涉及所述高效表达外源蛋白的方法在制备外源蛋白中的应用。
本发明还涉及一种疫苗组合物，包括上述方法制备的外源蛋白，以及药学上可接受的载体。特别地，所述疫苗组合物是亚单位疫苗组合物。
本发明制备方法制备的外源蛋白，在生物安全性上、免疫原性和免疫效力、对动物的生长发育无不良反应，可以制备亚单位疫苗。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、嵌段共聚物(Block co-polymer)、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100。
所述佐剂含量为5％-70％V/V。
所述佐剂的含量可以任意选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V。
本发明还涉及所述制备的外源蛋白制备的疫苗组合物，使用本发明上述方法制备的外源蛋白，加入药学上可接受的载体，制备亚单位疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)MontanideTMGel。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的亚单位疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
可以根据本发明的疫苗组合物特别是亚单位疫苗组合物为口服剂型或非口服剂型。
优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1高效表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的CHO细胞株的构建方法
1.CD2v蛋白基因序列的合成
将SEQ ID.No.17所示CD2v蛋白基因进行序列合成，并在CD2v序列N端添加SEQID.No.1所示信号肽序列。
2.CD2v融合Fc的表达载体构建
设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.1所示信号肽序列的CD2v与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起，首先通过引物SF1(5’GCTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGATCC3’)/SR1(5’GTAGGTCCCCTTGGCTCGTACAGTTTGAAGAAAG3’)扩增CD2v基因，再通过引物SF2(5’CTTTCTTCAAACTGTACGAGCCAAGGGGACCTAC3’)/SR2(5’GCAAGCTTTTACTTGCCGGGTGTCCTAGAAAAGG3’)扩增Fc，再以前面两轮PCR产物为模板，以引物SF1/SR2进行融合产物CD2v-mFc的扩增。扩增产物用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后与pCAGGS载体连接，连接产物经测序鉴定，序列正确的质粒命名为pCAGGS-CD2v-Fc。
3.转染CHO-S细胞用于稳定蛋白表达
将测序正确的质粒pCAGGS-CD2v-Fc转化后用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒，测定质粒浓度，浓度至少1μg/μl。使用NruI内切酶对提取的质粒进行线性化。
转染时细胞活率高于95％，按照1×106个活细胞/ml的密度接种至125ml培养瓶中，补加CD FortiCHO完全培养基至30ml。将50μg线性化的质粒加入OptiPRO SFM培养基中，使最终体积为1.5ml，轻轻混匀。将50μl FreeStyle MAX转染试剂加入1.45ml OptiPRO SFM中，使最终体积为1.5ml，轻轻混匀。立即将稀释的FreeStyle MAX试剂溶液加入质粒DNA稀释溶液中，混匀，室温孵育混合物10分钟，形成DNA-脂质复合物，逐滴加入3ml含有转染试剂的OptiPRO SFM培养基至含有细胞的125ml培养瓶中。将转染细胞培养物置于37℃含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上孵育。48小时后，开始进行药物筛选。
离心细胞，并重悬细胞，接种两个T-150培养瓶，接种密度为5×105个活细胞/ml。在第1个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为10μg/ml，加入MTX(甲氨蝶呤)至100nmol/L。在第2个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为20μg/ml，加入MTX至200nmol/L。然后将T-培养瓶置于37℃、含5％CO2的静置培养箱中孵育。待细胞显示复苏迹象，将细胞转移至125ml摇瓶中，接种密度为3×105个活细胞/ml。将细胞置于37℃含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上孵育。每3-4天传代培养瓶中的细胞，每次传代的接种密度为3×105个活细胞/ml。当细胞存活率超过85％，活细胞密度超过1×106个活细胞/ml时，完成药物筛选阶段1。
筛选阶段1的每种细胞池分别接种2个新的125ml摇瓶，接种密度为按照4×105个活细胞/ml。在第1个摇瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为30μg/ml，加入MTX至500nmol/L。在第2个摇瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为50μg/ml，加入MTX至1000nmol/L。将细胞置于37℃含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上孵育。每3-4天取样计数，待细胞显示复苏迹象，每3-4天传代培养瓶中的细胞，接种密度为3×105个活细胞/ml。当细胞存活率达到90％时，完成第2阶段筛选。
复苏第2阶段获得的每种细胞池的细胞，待细胞活率＞90％后，按照3×105个活细胞/ml的密度接种至含有30ml新鲜培养基的125ml摇瓶中，将细胞置于37℃含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上进行孵育。定期(第0、3、5、7、10、12、14天)取样，直至培养物活率降至50％以下。取样后在培养物中加入葡萄糖：第3天、5天、7天分别加入4g/L、4g/L、6g/L的葡萄糖。利用点杂交和Western Blot鉴定不同细胞池的表达产量，选择表达量较高的5个细胞池用于下一步的有限稀释。
在不含嘌呤霉素和MTX的选择培养基中复苏上述步骤筛选出的5个细胞池的细胞，2-5天后待细胞活率达到＞90％时，进行有限稀释。使用克隆培养基(添加6mM L-谷氨酰胺的CD FortiCHO培养基)，在37℃、含5％～8％CO2的静置培养箱中静置孵育培养。经三次筛选，选取产量较高的15株克隆用于下一步的稳定性评估。
复苏15株高产率克隆至125ml摇瓶中，在37℃含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床孵育。每3天传代1次，接种密度为1.5×105个活细胞/ml。追踪克隆的产率：在新的培养瓶中传代接种后，仍然对旧的培养瓶中的细胞进行补料，添加5g/L葡萄糖，孵育培养瓶至第7天，然后取样检测蛋白产量。继续传代并在第7天进行产率评估，连续传至30代，选择稳定性较好且细胞生长特性好、蛋白产量较高的克隆株用于生产。
实施例2非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的制备
将实施例1构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白非洲猪瘟病毒CD2v蛋白得到表达。参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，蛋白含量为0.5g/L。而不添加信号肽序列和Fc序列的CD2v基因在CHO细胞中没有表达。
实施例3猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗的制备
参照实施例1的方法，构建高效表达猪伪狂犬病病毒gD蛋白的CHO细胞株，猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因序列如SEQ.ID NO 18所示。其中在gD序列N端添加SEQ ID.No.2所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.2所示信号肽序列的gD与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪伪狂犬病病毒gD蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，gD蛋白含量为3g/L。
将上述CHO细胞株表达的猪伪狂犬病病毒gD蛋白与206佐剂按比例混匀，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟，4℃保存，即为猪伪狂犬病毒gD蛋白亚单位疫苗组合物。具体配比见表1。
表1猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗配比
组分 疫苗1 疫苗2
gD蛋白(μg/ml) 20 100
206佐剂(V/V％) 46 46
实施例4猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
将21日龄PRV抗原抗体阴性仔猪12头随机分成3组，4头/组，第1组、第2组分别经肌肉注射实施例3制备的疫苗1和疫苗2，免疫剂量为2ml/头，第3组对照组注射DMEM培养基2ml/头。免疫后28日，用猪伪狂犬病病毒HN1201株(猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCC NO.V 201311；保藏单位为中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，公开于中国专利申请CN104004774A)病毒液通过肌肉注射攻击，剂量为2×108.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表2。
表2猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
组别 临床症状及死亡情况 保护率
1 体温升高1-2天，食欲正常，基本没有精神症状，存活 100％(4/4)
2 体温升高1-2天，食欲正常，基本没有精神症状，存活 100％(4/4)
3 有明显的症状，攻毒后2天死2头，3天全部死亡 0％(0/4)
结果显示，猪伪狂犬病病毒gD蛋白亚单位疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，显示出很好的免疫保护。
实施例5禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗的制备
参照实施例1方法，构建高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的CHO细胞株，禽腺病毒Fiber-2基因序列如SEQ.ID NO 19所示。其中在Fiber-2序列N端添加SEQ ID.No.3所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.3所示信号肽序列的Fiber-2与SEQID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白禽腺病毒Fiber-2蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，Fiber-2蛋白的AGP效价达到1:128。
将CHO细胞株表达的禽腺病毒Fiber-2蛋白与矿物油佐剂按比例混匀，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表3。
表3禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗配比
组分 疫苗3 疫苗4
Fiber-2蛋白(AGP效价) 1:4 1:32
矿物油佐剂(V/V％) 66％ 66％
实施例6禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第4组～第5组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗3和疫苗4，免疫剂量为0.3ml，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日，公开于中国专利申请CN107523556A)病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表4。
表4禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
Figure BDA0003800896740000111
结果显示，第6组攻毒对照组全部发病死亡，而第4组～第5组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护，免疫效果良好。表明本发明方法制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗可对鸡群提供有效的免疫保护。
实施例7禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗的制备
参照实施例1方法，构建高效表达禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白的CHO细胞株，禽减蛋综合征病毒tFiber基因序列如SEQ.ID NO 20所示。其中在tFiber序列N端添加SEQID.No.4所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.4所示信号肽序列的tFiber与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，tFiber蛋白的AGP效价达到1:512。
将CHO细胞株表达的禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白与矿物油佐剂按比例混匀，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表5。
表5禽减蛋综合征病毒Fiber蛋白亚单位疫苗配比
组分 疫苗5 疫苗6
tFiber蛋白(AGP效价) 1:8 1:64
矿物油佐剂(V/V％) 66％ 66％
实施例8禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
取21日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第7组～第8组分别经颈部皮下注射免疫实施例7制备的疫苗5和疫苗6，免疫剂量为0.5ml，第9组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征HI抗体效价。结果见表6。
表6禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
Figure BDA0003800896740000121
上述结果显示，第9组对照组免后21日HI抗体效价为0，而第7组～第8组免疫组对免疫鸡均产生了较高的HI抗体效价,免疫效果良好。表明本发明方法制备的禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白亚单位疫苗可对鸡群提供有效的免疫保护。
实施例9鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的CHO细胞株，鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列公开于中国专利申请CN103849631A。其中在VP2序列N端添加SEQ ID.No.5所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.5所示信号肽序列的VP2与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，VP2蛋白的AGP效价达到1:128。
实施例10兔瘟病毒VP60蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达兔瘟病毒VP60蛋白的CHO细胞株，兔瘟病毒VP60基因序列如SEQ.ID NO 21所示。其中在VP60序列N端添加SEQ ID.No.6所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.6所示信号肽序列的VP60与SEQ ID.No.16所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白兔瘟病毒VP60蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，VP60蛋白的HA效价达到16log2。
实施例11猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗的制备
参照实施例1方法，构建高效表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的CHO细胞株，猪圆环病毒3型Cap基因序列如SEQ.ID NO 22所示。其中在Cap序列N端添加SEQ ID.No.7所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.7所示信号肽序列的Cap与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪圆环病毒3型Cap蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，蛋白含量为0.5g/L。
将CHO细胞株表达的猪圆环病毒3型Cap蛋白与水溶性佐剂Gel佐剂(法国赛比克公司)按比例混匀，即为猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗组合物。具体配比见表7。
表7猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗配比
组分 疫苗7 疫苗8
Cap蛋白(μg/ml) 25 100
Gel佐剂(V/V％) 10％ 10％
实施例12猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验
将28～30日龄经ELISA检测PCV2、PCV3抗原、抗体阴性的健康仔猪15头随机分成3组，5头/组，免疫实施例11制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗。第10～11组分别免疫疫苗7～8，第12组不免疫作为攻毒对照组。各免疫组注射疫苗2ml/头，对照组接种生理盐水2ml/头。免疫后28日进行攻毒，攻毒剂量为SG株猪圆环病毒(猪圆环病毒3型SG株(PorcineCircovirus type 3，strain SG)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201712，保藏日期为2017年3月23日，保藏地址：中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请CN108660115A)105.0TCID50/头，攻毒后连续观察各仔猪，根据各仔猪临床症状、病理变化和病毒检测结果进行判定，具体结果见表8。
表8猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果
Figure BDA0003800896740000151
结果显示，猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗免疫仔猪后，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照仔猪攻毒后全部发病。表明本发明方法制备的猪圆环病毒3型Cap蛋白亚单位疫苗可对猪群提供有效的免疫保护。
实施例13猪圆环病毒2型Cap蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO细胞株，猪圆环病毒2型Cap基因序列公开于中国专利申请CN101920012A。其中在Cap序列N端添加SEQID.No.8所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.8所示信号肽序列的Cap与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪圆环病毒2型Cap蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，蛋白含量为0.6g/L。
实施例14猪细小病毒VP2蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达猪细小病毒VP2蛋白的CHO细胞株，猪细小病毒VP2基因序列公开于中国专利申请CN103908664A。其中在VP2序列N端添加SEQ ID.No.9所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.9所示信号肽序列的VP2与SEQID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪细小病毒VP2蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，蛋白含量为2.2g/L。
实施例15猪瘟病毒E2蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达猪瘟病毒E2蛋白的CHO细胞株，猪瘟病毒E2基因序列公开于中国专利申请CN105527442A。其中在E2序列N端添加SEQ ID.No.10所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.10所示信号肽序列的E2与SEQ ID.No.15所示Fc基因连接在一起。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白猪瘟病毒E2蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，蛋白含量为2.7g/L。
实施例16日本血吸虫GALE蛋白的制备
参照实施例1方法，构建高效表达日本血吸虫GALE蛋白的CHO细胞株，日本血吸虫GALE基因序列公开于中国专利申请CN102079783A。其中在GALE序列N端添加SEQ ID.No.14所示信号肽序列；设计引物通过融合将添加了SEQ ID.No.14所示信号肽序列的GALE与SEQID.No.16所示Fc基因连接在一起。在本实施例中，使用了SEQ ID.No.14所示信号肽序列，但是也可以使用SEQ ID.No.1-13所示的任一其他信号肽序列。这也适用于其他实施例。SEQID.No.15和SEQ ID.No.16所示Fc基因序列同样可以任选地应用到各个实施例中。
将构建筛选的CHO细胞株，接种至含有Dynamis培养基的生物反应器中，接种密度为3×105个活细胞/ml。参数设置pH7.1～7.2，溶氧40％，温度37℃，搅拌速度为130rpm。从第3天开始每天取样，检测葡萄糖、乳酸的浓度，并进行细胞计数。当葡萄糖水平低于2g/L时，补料葡萄糖至6g/L。
同时分别在接种后第3天、第5天、第7天、第10天添加1×CD Efficient C+AGT添加剂，每次添加量为培养液体积的10％。培养至细胞活率降到80％左右时，收获细胞培养物，离心获得的上清进行Western Blot确认目的蛋白日本血吸虫GALE蛋白得到表达。目的蛋白含量较高，蛋白含量为1.2g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种表达外源蛋白的CHO细胞的构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加所述信号肽序列的所述外源蛋白序列与Fc序列通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)所述外源蛋白的收获。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中信号肽序列如SEQ ID.No.1、SEQID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQID.No.14所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(2)中Fc序列如SEQ ID.No.15或SEQID.No.16所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中所述外源蛋白基因包括非洲猪瘟病毒CD2v蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber-2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸虫GALE蛋白、日本血吸虫Wnt5蛋白。
5.通过权利要求1-4任一项所述的方法构建的表达外源蛋白的CHO细胞。
6.一种表达外源蛋白的方法，其中，所述方法使用权利要求5所述的CHO细胞表达所述外源蛋白。
7.权利要求5所述的CHO细胞或者权利要求6所述方法在制备外源蛋白中的应用。
8.一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包括使用权利要求6所述的方法制备的外源蛋白，以及药学上可接受的载体；特别地，所述疫苗组合物是亚单位疫苗组合物。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述药学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、嵌段共聚物、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为QuilA、QS-21、GPI-0100；
优选地，所述佐剂的含量为5％-70％V/V；
优选地，所述佐剂的含量选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V；
可选地，所述疫苗组合物还包含由以下试剂组成的组中的一种或多种：药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；其中免疫刺激剂例如是α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和白介素2。
10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物为口服剂型或非口服剂型；
优选地，所述疫苗组合物是通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。
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