CN115850415B - 一种PbCaM7基因、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PbCaM7基因、蛋白及其应用。属于生物技术领域。核苷酸序列如序列表SEQ.ID.NO.1所示，并提供了具体的应用。本发明通过植物基因工程技术，从梨果皮中克隆出PbCaM7基因完整编码区段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达PbCaM7基因后梨果皮显著变红。

Description

一种PbCaM7基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种PbCaM7基因、蛋白及其应用。

背景技术

果实着红色及着色程度是影响梨外在品质的重要性状，东方梨果皮主要以绿色、黄色和褐色为主，能够着红色的品种占比很少。而市场上红梨深受消费者的喜爱。生产中常采用杂交育种的方式栽培红梨品种，但其生产周期长，不易于推广。

花青苷是组成果皮红色的重要天然要素，通过促进花青苷积累能够显著增加果皮红色，提高梨的经济价值。花青苷合成结构基因受各种外界因素的调控。在众多因素中，光是梨花青苷生物合成不可或缺的因素。

Calmodμlin-7(CaM7)是光信号通路中最保守和独特的转录因子。CaM7最初被报道为光诱导基因的转录因子和光形态发生的正调节因子。它不仅在物理上与光形态发生的关键调节器相互作用，而且通过调节下游基因的转录来传递光信号的信息。在拟南芥中CaM7参与光形态建成、激素响应、胁迫响应和免疫反应等多条作用通路。这些结果表明，CaM7转录因子在光诱导的品质形成和生长发育中发挥重要作用。

研究并探索PbCaM7基因在梨果实花青苷合成过程中的作用机制，并将其应用到红色梨新品种的选育中，得到一种更简洁高效的提高梨果皮着红色的育种方法，是本领域人员待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种PbCaM7基因、蛋白及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种PbCaM7基因，核苷酸序列如序列表SEQ.ID.NO.1所示。

本发明还提供了一种梨的PbCaM7蛋白质，PbCaM7蛋白质由上述的PbCaM7基因编码，氨基酸序列如序列表SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还提供了含有上述基因或上述蛋白质的生物材料，生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。

本发明还提供了上述基因或上述蛋白质或上述生物材料在农业生产中的应用。

优选的：用于育种。

优选的：对PbCaM7进行过表达，提高梨果皮着红色。

进一步的，PbCaM7基因在芽、果实、叶片、子房、花、萼片、茎均能表达；在梨果中，利用强启动子对PbCaM7进行超表达，果实表面超表达部位着红色，PbCaM7基因过表达能够提高梨果皮中花青苷含量。

优选的：提高梨果皮中的花青苷含量。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种PbCaM7基因、蛋白及其应用，取得的技术效果为通过植物基因工程技术，从梨果皮中克隆出PbCaM7基因完整编码区段，并验证了该基因的功能，发现采用超量表达PbCaM7基因后梨果皮显著变红。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的PbCaM7在梨不同组织基因表达图。

图2附图为本发明提供的PbCaM7在红、绿、白梨中基因表达图。

图3附图为本发明提供的PbCaM7的PCR扩增产物电泳图，其中，左侧泳道为5000marker；右侧泳道为PbCaM7基因完整编码区段。

图4附图为本发明提供的PbCaM7在白果中瞬时过表达情况，其中Control为空白对照，OE-PbCaM7为PbCaM7过表达。

图5附图为本发明提供的果皮过表达区域花青苷含量测定图，其中，Control为空白对照，OE-PbCaM7为PbCaM7过表达。

图6附图为本发明提供的PbCaM7果皮过表达区域PbCaM7基因表达图，其中，Control为空白对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种PbCaM7基因、蛋白及其应用。

实施例1

一、PbCaM7基因转录分析

转录组测序样品为“新绮红”梨的芽、果实、叶片、子房、花、萼片、茎。三次生物学重复进行实时定量PCR分析。

结果表明，参见附图1，PbCaM7基因在‘新绮红’红梨的芽、果实、叶片、子房、花、萼片、茎中均表达，PbCaM7基因在茎中的表达量最高，其次是芽、叶片、果实、花、萼片和子房。

二、PbCaM7基因在不同颜色梨中的表达情况

在新绮红收获前的不同时间点取出三种类型的水果袋(棕黑色袋(BB-B)、黄白色袋(YW-B)和白色袋(W-B))。处理40天后，BB-B果袋包封后果实呈白色，YW-B果袋处理后果实呈绿色，W-B果袋套袋后果实呈红色。通过转录组测序检测PbCaM7基因在这三种果袋不同颜色梨中的基因表达情况，三次生物学重复进行转录组学测序和分析。

结果表明，参见附图2，与白梨和绿梨相比，PbCaM7基因在红梨中表达量高。

实施例2

梨PbCaM7基因的克隆

一、梨果皮RNA提取及反转录

1、植物组织总RNA采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根)提取，步骤包括：

(1)匀浆：取100mg梨植物组织叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μLSL(含25％的β-巯基乙醇)，立即剧烈混匀(涡旋震荡)；

(2)离心2min(12000rpm)；

(3)将上清液转移至装有收集管的CS过滤柱上，离心2min(12000rpm)，将收集管中的上清液转移至新的RNase-Free的离心管中，尽量避免吸头吸入收集管中的细胞碎片沉淀；

(4)在上清中缓慢加入无水乙醇(0.4倍的上清体积)，混匀后，将得到的溶液和沉淀一起转入CR3吸附柱之中，离心15sec(12000rpm)，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；

(5)向CR3吸附柱中加入350μL的去蛋白液RW1，离心15sec(12000rpm)，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；

(6)配制DNaseI工作液：取10μL的DNaseI储存液放入新RNase-Free离心管之中，加入70μL的RDD缓冲溶液，轻柔地混匀；

(7)向CR3吸附柱中央加入80μL的DNaseI工作液，在室温中放置15min；

(8)向CR3吸附柱中加入350μL的去蛋白液RW1，离心15sec(12000rpm)，弃掉收集管中的废液，将CR3吸附柱放回到收集管中；

(9)向CR3吸附柱中加入500μL的漂洗液RW(含无水乙醇)，离心15sec(12000rpm)，丢掉收集管中的废液，将CR3吸附柱放回到收集管中；

(10)重复步骤(9)；

(11)离心2min(12000rpm)，将CR3吸附柱放入新RNase-Free离心管中，悬空滴加30～50μL的ddH₂O(RNase-Free)至吸附膜中间，在室温中放置2min，离心1min(12000rpm)，离心所得即为提取的RNA溶液。

2、反转录cDNA第一条链的合成

使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的RT-qPCR专用预混液IIIAll-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR进行，反应体系如下：

(1)在RNase-Free离心管中配置如下混合液：

RNase-free ddH₂O to 20μl；

5×All-in-one qRT SuperMix 4μl；

Enzyme Mix 1μl；

梨RNA Total RNA：1pg～1μg。

(2)将上述体系用移液器轻轻吹打8～10次至充分混匀，短暂离心收集至管底。按下列条件进行反转录反应：50℃15min，然后在85℃加热5sec，后立即冰浴。

二、cDNA全长序列获得

使用宝日医生物技术(北京)有限公司的Max DNA Pol ymeraseDNA高保真酶对PbCaM7基因进行PCR扩增，引物序列如下：

PbCaM7-F：ATGGCGGATCAACTGACCG，SEQ.ID.NO.3；

PbCaM7-R：TCACTTAGCCATCATCACCTTGAC，SEQ.ID.NO.4；

反应体系及步骤如下：

(1)反应液的配制(冰浴)：

Max DNA Polymerase 12.5μl；

PbCaM7-F 1μl；

PbCaM7-R 1μl；

梨cDNA 2μl；

RNase-free ddH₂O 8.5μl；

(2)PCR反应条件为：95℃变性15sec；60℃退火15sec；72℃延伸10sec；30个循环，72℃终延伸5min；

(3)1％琼脂糖凝胶用于PCR结果的凝胶电泳检测，电泳结果如图3所示，克隆PbCaM7的PCR产物在500marker位置；

(4)琼脂糖凝胶电泳产物回收，采用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行琼脂糖凝胶电泳产物的回收，操作步骤按说明书进行。

实施例3

梨PbCaM7基因的过量表达

一、PbCaM7基因表达载体的构建

为研究PbCaM7基因的功能，将包含有PbCaM7基因编码区在内的共450bp片段正确插入pGreen 0029 62-sk(实验室保存)表达载体上。

使用NEB(北京)有限公司New England Biolabs(Beijing)的内切酶Hi ndIII和BamHI酶切pGreen 0029 62-sk表达载体质粒，酶切反应体系：

HindIII内切酶 1μl；

BamHI内切酶 1μl；

Cutsmart 5μl；

pGreen 0029 62-sk 10μl；

RNase-free ddH₂O 33μl；

37℃酶切30min，对酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察后切胶回收。

将基因胶回收产物与表达载体胶回收连接，反应采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的II One Step Cloning Kit非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，反应体系参照说明书。

热击转化：将混合物轻柔混匀后，于37℃反应30～60min，冰浴5min。使用热激法进行大肠杆菌感受态细胞转化：将10μL连接产物与50μL感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激60sec，冰浴2min。加入无抗生素液体LB培养基200μL，置于37℃恒温培养箱培养10min，再放入37℃摇床中180rpm振荡培养45min。

抗性培养：取50μL上述转化菌液涂布在抗性LB平板上(LB液体培养基+50mg/mLkana)，倒置在37℃恒温培养箱中过夜培养。

菌落PCR：用10μl枪头在超净工作台内挑取单菌落，进行菌落PCR，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火20sec，72℃延伸2min 30sec，35个循环，72℃终延伸10min。

使用天根质粒提取试剂盒提取pGreen 0029 62-sk-PbCaM7的质粒(操作步骤按照天根质粒小提试剂盒说明书进行)，于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，剩余质粒置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

测序结果表明，PbCaM7基因的开放阅读框有450bp(atggcggatcaactgaccgacgatcagatctctgagttcaaggaagccttcagtctattcgacaaggatggagatggctgtatcacaactaaggagcttggcactgtcatgagatcattggggcagaacccgactgaggcagagctccaggacatgatcaatgaagtggatgctgatggtaatgggaccattgactttcctgagttcttaaacctcatggccaggaagatgaaggacacggactctgaggaggagctgaaagaggctttcagagtgtttgacaaggatcagaatggcttcatttcagctgcggagctccgccatgtgatgaccaatcttggggagaagctcacagatgaggaagtggatgagatgatccgggaggctgatgttgatggggatgggcagataaattatgaggagtttgtcaaggtgatgatggctaagtga如SEQ.ID.NO.1所示)，编码149个氨基酸(MetAlaAspGlnLeuThrAspAspGlnIleSerGluPheLysGluAlaPheSerLeuPheAspLysAspGlyAspGlyCysIleThrThrLysGluLeuGlyThrValMetArgSerLeuGlyGlnAsnProThrGluAlaGluLeuGlnAspMetIleAsnGluValAspAlaAspGlyAsnGlyThrIleAspPheProGluPheLeuAsnLeuMetAlaArgLysMetLysAspThrAspSerGluGluGluLeuLysGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlnAsnGlyPheIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuGlyGluLysLeuThrAspGluGluValAspGluMetIleArgGluAlaAspValAspGlyAspGlyGlnIleAsnTyrGluGluPheValLysValMetMetAlaLys如SEQ.ID.NO.2所示)。

质粒转农杆菌：提取10μl上述质粒加进50μl农杆菌感受态EHA(唯地生物)中，按照如下程序进行操作：

冰浴 30min；

液氮 5min；

37℃水浴 5min；

冰浴 10min；

在混合液体中加入700μl的空白LB溶液，在28℃的摇床中摇4～5h。取100μl液体涂抹在LB+kana+Rif(kana浓度为50mg/ml，Rif浓度为25mg/ml)抗性平板中，在28℃恒温培养箱中放置2d。挑单克隆菌在1.5ml离心管中，加入500μl LB+kana+Rif(kana浓度为50mg/ml，Rif浓度为25mg/ml)液体培养基，放入28℃摇床中摇2h，后转入20ml LB+kana+Rif(kana浓度为50mg/ml，Rif浓度为25mg/ml)液体培养基，放入28℃摇床中摇2d。置于-20℃保存，用于后续功能验证实验。

二、PbCaM7在梨中过量表达

1、前期准备

菌活化：将上述菌通过LB(kana+Rif)双抗固体培养基进行一次活化。48～72h后在新LB固体培养基进行二次活化。

配置侵染液：MES(10mM)+MgCl₂(10mM)+AS(150μM)pH＝5.6，121℃高压灭菌20min；

菌悬浮：倒少许侵染液于二次活化菌的培养基中，用高压灭菌棉签刮菌到50ml离心管里，添加适量侵染液，密封好离心管，在摇床(90～100rpm)中室温孵育2～4h；

OD₆₀₀调节：在菌液中添加侵染液稀释至0.6～0.8；

2、田间注射

选取大小均一、经过套袋处理果皮呈白色的‘琴岛红’梨果，在相同位置进行注射，观察注射区域‘琴岛红’果实颜色恢复情况。3天后进行拍照观察及取样，放-80℃冰箱冷冻保存。

结果表明，参见附图4，与对照相比，在‘琴岛红’果实中过表达PbCaM7基因的区域表现为红色，说明过表达PbCaM7基因能够促进梨果皮着红色。

三、花青苷含量测定

取0.2g保存于-80℃冰箱的梨果皮置于液氮预冷的研磨器皿中，充分研磨，将粉末重悬混匀于1mL的0.1％盐酸甲醇(以甲醇为溶剂，配制为0.1％的浓盐酸)中，并于4℃避光放置24h，12，000×rpm离心20min后取上层清液备用。使用酶标仪分别测定上清液在530nm、620nm、650nm波长下的光密度值。根据以下的计算方程式计算花青苷含量：OD＝(A530-A620)-0.1(A650-A620)。花青苷的提取与测定都进行了3次生物学重复。

结果表明，参见附图5、6。与对照相比，过表达CaM7基因的梨果肉中花青苷含量及CaM7基因表达量显著高于对照组。因此，过表达CaM7能够提高梨花青苷的积累，进而调控梨果皮着红色。

综上，从梨中分离到了PbCaM7基因，通过超表达分析发现，PbCaM7在提高果皮着红色方面具有显著效果，对于梨新品种的选育具有重要意义。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.PbCaM7基因或梨的PbCaM7蛋白质或含有PbCaM7基因或梨的PbCaM7蛋白质的生物材料在农业生产中的应用，其特征在于，用于育种，对PbCaM7进行过表达，提高梨果皮着红色；

PbCaM7基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

梨的PbCaM7蛋白质由所述的PbCaM7基因编码，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述生物材料为表达载体、克隆载体或工程菌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，提高梨果皮中的花青苷含量。