CN115845042B

CN115845042B - 重组新型冠状病毒s蛋白三聚体疫苗组合物及其应用

Info

Publication number: CN115845042B
Application number: CN202210822998.8A
Authority: CN
Inventors: 许文波; 侯占军; 曹蕾; 赵维佳; 李海; 郭晋源; 张燕; 任虎
Original assignee: Huapu Biotechnology Hebei Co ltd; Huasu Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: Huapu Biotechnology Hebei Co ltd; Huasu Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-07-07
Filing date: 2022-07-07
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-07-07
Also published as: CN115845042A

Abstract

本发明公开了重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物及其应用。所述疫苗组合物含有重组新型冠状病毒S蛋白三聚体和免疫佐剂(CpG佐剂和/或铝佐剂)。利用本发明重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗组合物能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定中和抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(Wild‑type株、Beta突变株、Delta突变株)中和抗体滴度高，对上述野生株和变异株均具有中和保护效果。可用于预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染和/或治疗由新型冠状病毒所致疾病，为新型冠状病毒SARS‑CoV‑2疫情的防控提供技术保障。

Description

重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体地说，涉及一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：S蛋白(spike protein，)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)。此外，还有若干附属蛋白：3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：N端结构域(NTD)、受体结合结构域(RBD)、C端结构域1(CTD1)和C端结构域2(CTD2)，其中RBD主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme2，ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。

根据WHO划分的“关切变异株”(VOC)和“关注变异株”(VOI)，其中VOC有5种，分别是在英国发现的B.1.1.7(Alpha)、在南非发现的B.1.351(Beta)、在巴西发现的P.1(Gamma)、在印度发现的B.1.617.2(Delta)以及在南非发现的B.1.1.529(Omicron)。经过密切的监测以及现有疫苗对新冠变异株保护效果的研究发现，这些变异株的S蛋白稳定遗传了多种氨基酸突变组合，可导致病毒传播力、致病性增强以及对治疗性抗体和对现有疫苗及恢复期病人血清产生不同程度的免疫逃逸现象。尽管如此，有一些氨基酸突变在多个VOC和VOI病毒株中交叉出现或同时出现，提示病毒在不断适应宿主过程中出现的适应性改变和进化规律。

新冠病毒属于RNA病毒，较易发生突变，全球已经报道了30000多个新冠病毒突变株，主要突变株包括：Alpha(B.1.1.7)突变株、Beta(B.1.351)突变株、Gamma(P1)突变株、Epsilon(B.1.429)突变株、Delta(B.1.617.2)突变株、Kappa(B.1.617.1)突变株、Omicron(B.1.1.529)突变株。这些突变株的突变位点主要位于S蛋白的氨基酸序列上。因此，突变可能会提高病毒与ACE2受体的亲和力，减弱中和抗体效应，进而增强病毒毒力和传染力，加速病毒逃逸，降低疫苗保护效果。因此，亟待开发一种针对多种新冠病毒流行株的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物，所述疫苗组合物含有重组新型冠状病毒S蛋白三聚体和免疫佐剂。

所述免疫佐剂为CpG佐剂和/或铝佐剂。

所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备方法如下：利用原核表达系统或真核表达系统表达重组新型冠状病毒S蛋白，重组新型冠状病毒S蛋白自组装得到重组新型冠状病毒S蛋白三聚体。

所述重组新型冠状病毒S蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

进一步地，所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备方法如下：

1)根据重组新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列，通过密码子对应关系和宿主表达频率，利用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，获得并优化编码所述重组新型冠状病毒S蛋白的核酸；

2)将核酸克隆入表达载体，再转化或转染宿主细胞，随宿主细胞的增殖，从而实现重组新型冠状病毒S蛋白在宿主细胞中的表达，重组新型冠状病毒S蛋白自组装得到重组新型冠状病毒S蛋白三聚体；

3)从细胞培养物中分离纯化重组新型冠状病毒S蛋白三聚体。

其中，所述宿主细胞为大肠杆菌，酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选CHO细胞。

优选地，编码所述重组新型冠状病毒S蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述CpG佐剂为含CpG的单链脱氧核苷酸，优选地，所述单链脱氧核苷酸的序列为：5′-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3′(5′-dTsdCsdGsdAsdCsdGsdTsdTsdCsdGsdTsdCsdGsdTsdTsdCsdGsdTsdCsdGsdTsdTsdCs-3′)。

所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂。

进一步地，所述疫苗组合物中所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的含量为2.5-250ug/ml。

进一步地，所述疫苗组合物中所述CpG佐剂的含量为0.1-0.7mg/ml。

进一步地，所述疫苗组合物中所述铝佐剂的含量为0.4-1.2mg/ml。

第二方面，本发明提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染以及由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒野毒株和突变株。

进一步地，所述突变株包括但不限于Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Epsilon突变株、Delta突变株、Kappa突变株、Omicron突变株。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用本发明重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗组合物能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(Wild-type株、Beta突变株、Delta突变株)中和抗体滴度高，对上述野生株和变异株均具有中和保护效果。可用于预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或治疗由新型冠状病毒所致疾病，为新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情的防控提供技术保障。

(二)重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物中重组新型冠状病毒S蛋白三聚体与CpG佐剂和/或铝佐剂的组合可诱导产生协同的免疫效果。

(三)通过测定重组新型冠状病毒S蛋白结合效价、ACE2竞争结合、中和抗体滴度，结果显示该疫苗可以IgG产生水平高(普遍高于200000)、竞争结合高、针对不同新冠毒株中和抗体滴度高(Beta突变株高于4000，Wild-type株高于2000，Delta突变株高于1400)；通过测定INF-γ\IL2\IL4\IL6细胞因子，结果显示细胞免疫原性好；进一步对K-18转基因小鼠进行攻毒试验，结果显示在对Beta突变株和Delta突变株保护率高，中和抗体滴度好，肺部和脑部病毒基因拷贝数对比下降明显，高于3个log值。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中预测的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体结构。

图2为本发明较佳实施例中ZYB0029表达质粒(ZYB0029-B)图谱。

图3为本发明较佳实施例中S蛋白抗原透射电镜照片。

图4为本发明较佳实施例中S蛋白抗原2D分类结果。

具体实施方式

本发明提供一种重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物，其包含CpG和铝佐剂。

本发明还提供所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明还提供CpG和铝佐剂作为重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗的免疫增强剂或免疫佐剂的应用，或者在提高重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗的抗原或疫苗的免疫原性中的应用。

本发明采用如下技术方案：

1、抗原的设计

选择新冠病毒Spike蛋白全长(胞外区域)作为靶标抗原，利用CHO真核表达系统进行稳定细胞系的筛选和表达。疫苗抗原是基于VOC 202012/01(Alpha株)、501Y.V2(Beta株)以及P.1变异株(Gamma株)三种VOC变异株对引起抗体产生逃逸和现有疫苗产生抗体交叉中和保护有所下降的S蛋白突变位点所设计，为了保持新冠病毒S蛋白天然的三聚体构象，通过对特定区域进行氨基酸的突变以阻止病毒发生融合后构象改变以及维持其三聚体结构的外源基因的加入，使得S蛋白处于稳定的融合前三聚体构象。

2、化学名称和结构

重组新型冠状病毒S蛋白单体(ZYB0029)分子式：C₆₀₉₀H₉₃₂₉N₁₅₉₇O₁₈₃₃S₄₀，理论分子量：135.5kD。

三聚体分子式：C₁₈₂₇₀H₂₇₉₈₇N₄₇₉₁O₅₄₉₉S₁₂₀，理论分子量：406.6kD。

预测的三聚体结构如图1所示，ZYB0029单体由1224个氨基酸组成，包括新冠病毒(SARS-CoV-2)Spike蛋白(S蛋白)和T4噬菌体纤维蛋白结构域(Foldon)。

具体地，ZYB0029单体是基于Beta(B.1.351lineage)突变株关键突变位点所设计的，可以使S蛋白处于稳定的融合前三聚体构象(除去跨膜区，TM)，S蛋白相对原始株SARS-CoV-2突变设计如下：

(1)涵盖Beta(B.1.351lineage)突变株S蛋白区域突变位点：L18F、D80A、D215G、Del-L241L242A243、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V。

(2)在S1和S2之间的Furin蛋白酶切位点处引入三个突变(S蛋白第682～685位氨基酸由RRAR突变为QQAQ)，以阻断抗原制备表达过程中及人体内Furin蛋白酶对本品酶切；以使其维持在融合前构象。

(3)在S2片段引入K986P和V987P突变，提高S蛋白的稳定性。

(4)加入T4 Foldon基序：替换S蛋白TM跨膜区，利用GS Linker连接T4 Foldon基序，使其有助于蛋白形成三聚体结构。

利用所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体制备的疫苗，可有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。通过测定抗体滴度，结果显示该疫苗可以产生高水平IgG，针对不同新冠毒株(Wild-type株、Beta突变株、Delta突变株)中和抗体滴度高。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1重组新型冠状病毒S蛋白三聚体目的基因的合成与载体构建

在优化后的序列(SEQ ID NO：2)两端分别引入EcoRI、HindIII酶切位点进行合成，为方便试验顺利操作进行，质粒构建过程中使用到的工具载体ZY-CDMO(由北京昭衍生物技术有限公司自行构建，参见CN201910738072.9)经突变酶切位点及功能原件改造后，将合成的ZYB0029序列5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有HindIII酶切位点，插入到载体的EcoRI和HindIII之间，构建获得ZYB0029表达质粒。提取的质粒，用EcoRI/HindIII进行酶切鉴定，琼脂糖电泳鉴定结果显示阳性克隆可以酶切出大小约为5925bp和3748bp的目的片段。经酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序正确的克隆命名为ZYB0029-B。ZYB0029表达质粒(即ZYB0029-B)图谱见图2，主要构建元件见表1。S蛋白抗原透射电镜照片见图3。S蛋白抗原2D分类结果见图4。

表1 ZYB0029表达载体主要构建元件描述

实施例2重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备

1、表达重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的重组CHO细胞的构建

将含有ZYB0029目的基因序列的表达质粒，通过电转方式导入CHO-K1宿主细胞，24-48小时后，用含蛋氨酸亚砜75μM(MSX)的筛选培养基进行有限稀释，按1×10⁴-1.5×10⁴cell/孔铺板96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱静止培养。培养约两周后，显微镜下观察96孔培养板中细胞形状和大小，通过ELISA筛选，将高表达克隆转移至24孔板中，采用同样的方法进行6孔板的筛选和扩增，ZYB0029工程细胞株的建立共进行4个批次的稳定转染，经过96孔板、24孔板及6孔板的ELISA筛选共筛选出8株pool细胞进行下一步实验。根据蛋白表达和细胞生长状况，从6孔板中挑选8个pool细胞进行亚克隆，采用单细胞打印机及克隆成像方法，以每孔1个细胞铺96孔板，静止培养后分别于Dayl(铺板当日)、Day2、Day3、Day7、Dayl3进行克隆成像；通过克隆成像数据挑选合格的单克隆进行ELISA筛选，将高表达单克隆转移至24孔板中。采用同样的方法进行6孔板和摇瓶的筛选和扩增。经96孔板、24孔板、6孔板和摇瓶梯度筛选后，从8株pool细胞中共筛选出28株单克隆株单克隆细胞。筛选出的28株单克隆通过SDS-PAGE检测筛选出9株单克隆进行细胞基因组测序，以确定筛选的细胞株正确表达目的基因。筛选出来的单克隆细胞，在Advanced CHO Fed-batch medium+50μM MSX培养液中培养。当细胞数量足够时，保存于90％新鲜培养基+20％DMSO冻存液中，以1.0×10⁷vc/ml/支的细胞密度制备细胞库。

2、重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的表达及纯化

(1)细胞复苏培养：通过使用直接解冻法解冻1支细胞，用1mL基础培养基重悬后将细胞加入含有24mL基础培养基的无菌一次性培养摇瓶(125mL)。初始活细胞密度为0.2×10⁶-0.7×10⁶/mL。125mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0×10⁶-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，进行细胞传代。传代至一次性培养摇瓶(500ml)后体积为100-150ml，传代的接种活细胞密度应为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。500mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，进行细胞传代。传代至一次性培养摇瓶(2000L)，工作体积在400-600ml，传代的接种活细胞密度应为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。2000mL摇瓶在37.0℃、5.0％CO₂和80％相对湿度(RH)的条件下于摇床中培养4天。当活细胞密度达到2.0×10⁶-6.0×10⁶/mL且细胞存活率大于95％时，补充培养基至1200ml，继续培养3天，最终细胞密度达到4.0×10⁶-8.0×10⁶/mL。进行细胞传代。相同的基础培养基，培养条件和传代标准适用于整个摇瓶传代阶段。取工作细胞株进行复苏培养，得到细胞复苏培养物。

(2)细胞扩增培养：在摇瓶传代结束后，将摇瓶培养后的细胞置于生物反应器进行扩增培养，使用50L生物反应器(工作体积10～20L)，使用基础培养基，接种活细胞密度为0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL。细胞于生物反应器培养4天后，当细胞密度达到2.0×10⁶～6.0×10⁶/mL，活率＞95％时，补加基础培养基，将细胞密度稀释至0.5×10⁶-1.5×10⁶/mL，完成基础培养基添加，培养体积20-35L。在生物反应器中培养2天后当细胞密度达到2.0×10⁶～6.0×10⁶/mL，活率＞95％时，准备接种到200升生物反应器。

(3)罐培养：将生物反应器中的细胞接种到200L生物反应器中，此时反应器的工作体积60-105L，使用相同的基础培养基进行补料分批生产，接种活细胞密度应为1.5±0.3×10⁶/mL。温度控制策略为35.0±0.5℃，维持此温度至最终收获；溶氧控制在50±5％；pH控制在7.2±0.2。监测细胞液液面泡沫高度并适当补加消泡剂。每48小时添加培养基体积5％的浓缩培养基，细胞培养周期为14天，或细胞活率低于80％时终止培养。最终收获体积80-140L，细胞密度在0.5×10⁷-1.3×10⁷/mL。

(4)纯化：采用全自动深层过滤系统去除200L生物反应器细胞培养液中的细胞和细胞碎片，然后进行澄清过滤、分子筛、病毒灭活、疏水层析、超滤/渗滤、阴离子交换层析、除病毒过滤即得到蛋白原液，最终经0.2μm过滤器过滤后，放入无菌预组装冷冻袋中，在-70℃以下长期冷冻保存。

预测的重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的结构如图4所示。

实施例3重组新型冠状病毒S蛋白三聚体与不同佐剂配伍的免疫效果比较

1、实验目的：比较氢氧化铝佐剂加CpG佐剂，氢氧化铝佐剂，角鲨烯成份SWE佐剂，聚肌胞，皂苷佐剂配伍对疫苗的作用。

以下各疫苗中，CpG寡聚脱氧核苷酸(佐剂)的序列为：5′-dTsdCsdGsdAsdCsdGsdTsdTsdCsdGsdTsdCsdGsdTsdTsdCsdGsdTsdCsdGsdTsdTsdCs-3′。

(1)氢氧化铝佐剂+CpG佐剂疫苗

将CpG佐剂和氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使CpG佐剂浓度为0.1mg/ml，氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。将本疫苗编号记为B1；

将CpG佐剂和氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使CpG佐剂浓度为0.1mg/ml，氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。将本疫苗编号记为B2；

将CpG佐剂和氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使CpG佐剂浓度为0.1mg/ml，氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。将本疫苗编号记为B3；

将CpG佐剂和氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使CpG佐剂浓度为0.1mg/ml，氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。将本疫苗编号记为B4；

将CpG佐剂和氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使CpG佐剂浓度为0.1mg/ml，氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。将本疫苗编号记为B5。

(2)角鲨烯成份SWE佐剂疫苗

将SWE佐剂加入疫苗原液，使SWE佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。将本疫苗编号记为A1；

将SWE佐剂加入疫苗原液，使SWE佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。将本疫苗编号记为A2；

将SWE佐剂加入疫苗原液，使SWE佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。将本疫苗编号记为A3；

将SWE佐剂加入疫苗原液，使SWE佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。将本疫苗编号记为A4；

将SWE佐剂加入疫苗原液，使SWE佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。将本疫苗编号记为A5。

(3)铝佐剂疫苗

将氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使氢氧化铝佐剂浓度为1mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。将本疫苗编号记为C1；

将氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使氢氧化铝佐剂浓度为1mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。将本疫苗编号记为C2；

将氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使氢氧化铝佐剂浓度为1mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。将本疫苗编号记为C3；

将氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使氢氧化铝佐剂浓度为1mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。将本疫苗编号记为C4；

将氢氧化铝佐剂加入疫苗原液，使氢氧化铝佐剂浓度为1mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。将本疫苗编号记为C5。

(4)聚肌胞佐剂疫苗

将聚肌胞佐剂加入疫苗原液，使聚肌胞佐剂浓度为0.8mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。将本疫苗编号记为D1；

将聚肌胞佐剂加入疫苗原液，使聚肌胞佐剂浓度为0.8mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。将本疫苗编号记为D2；

将聚肌胞佐剂加入疫苗原液，使聚肌胞佐剂浓度为0.8mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。将本疫苗编号记为D3；

将聚肌胞佐剂加入疫苗原液，使聚肌胞佐剂浓度为0.8mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。将本疫苗编号记为D4；

将聚肌胞佐剂加入疫苗原液，使聚肌胞佐剂浓度为0.8mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。将本疫苗编号记为D5。

(3)皂苷佐剂疫苗

将皂苷佐剂加入疫苗原液，使皂苷佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。将本疫苗编号记为E1；

将皂苷佐剂加入疫苗原液，使皂苷佐剂浓度为0.5mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。将本疫苗编号记为E2。

2、实验方法：将制备的不同佐剂和不同抗原含量的疫苗，分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，SPF级，雌性，7-8周龄)，分别在0、21d各免疫1针，剂量100μl，分别在14d和35d取血清，测量动物血清与抗原结合效价、ACE2竞争结合、中和抗体滴度。SARS-CoV-2VOC不同变异Beta株(GD2021，B.1.351)、Wild-type株(Hub01，lineage B)、Delta株(CQ2021，B.1.617.2)和Omicron株(BA.1strain(Omi-2))均由中国疾控中心病毒病所分离并保存。

表2统计结果表明，在结合效价指标上，加入佐剂后可以有效刺激小鼠体内产生更高的抗体水平，CpG+铝佐剂+抗原组高于SWE佐剂组，高于铝佐剂+抗原组；相比只配伍铝佐剂组，SWE和CpG+铝佐剂可以明显降低抗原的使用剂量。

实施例5疫苗不同抗原剂量和免疫方案的免疫学效果评价

将CpG含量为0.1mg/ml和氢氧化铝佐剂含量为1mg/ml，且分别含有18ug/ml、36ug/ml、72ug/ml重组新型冠状病毒S蛋白三聚体抗原的疫苗，分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，SPF级，雌性，6-8周龄)，免疫和取材具体时间见表3。处死的小鼠取外周血血清和脾脏，制备脾单细胞悬液，开展IFN-γ，IL-4，IL-2和IL-6ELISPOT分析。

不同时间点各组疫苗免疫小鼠脾细胞中分泌细胞因子的抗原特异性T细胞频数汇总见表4。

免疫期间，小鼠对所有疫苗产品均表现出很好的耐受性，各组小鼠体重正常，无异常表现，一般状态良好。

关于ELISPOT结果，各佐剂配伍抗原免疫小鼠可诱导非常明显的细胞免疫应答。从剂量方面看，抗原剂量3是最佳剂量。佐剂配伍抗原免疫可以更好的诱导偏向Th1的免疫反应，且减少和平衡Th2的免疫反应。

表3动物免疫方案

表4抗原特异性T细胞频数汇总表(平均值±标准差)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.重组新型冠状病毒S蛋白三聚体疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有重组新型冠状病毒S蛋白三聚体和免疫佐剂；

所述免疫佐剂为CpG佐剂和/或铝佐剂；

所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备方法如下：利用原核表达系统或真核表达系统表达重组新型冠状病毒S蛋白，重组新型冠状病毒S蛋白自组装得到重组新型冠状病毒S蛋白三聚体；

所述重组新型冠状病毒S蛋白由如下的氨基酸序列组成：

i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的制备方法如下：

1）根据重组新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列，通过密码子对应关系和宿主表达频率，利用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，获得并优化编码所述重组新型冠状病毒S蛋白的核酸；

2）将核酸克隆入表达载体，再转化或转染宿主细胞，随宿主细胞的增殖，从而实现重组新型冠状病毒S蛋白在宿主细胞中的表达，重组新型冠状病毒S蛋白自组装得到重组新型冠状病毒S蛋白三聚体；

3）从细胞培养物中分离纯化重组新型冠状病毒S蛋白三聚体；

其中，所述宿主细胞为大肠杆菌，酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，编码所述重组新型冠状病毒S蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述CpG佐剂为含CpG的单链脱氧核苷酸，所述单链脱氧核苷酸的序列为：5′-TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC-3′。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中所述重组新型冠状病毒S蛋白三聚体的含量为2.5-250ug/ml。

7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中所述CpG佐剂的含量为0.1-0.7mg/ml，所述铝佐剂的含量为0.4-1.2mg/ml。

8.权利要求1-7任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染以及由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒野毒株和突变株。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述突变株包括Alpha突变株、Beta突变株、Gamma突变株、Epsilon突变株、Delta突变株、Kappa突变株、Omicron突变株。