CN115838799A - 检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。本发明研究人员研究发现，通过检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平，能够提高对结直肠癌的检测灵敏度和特异性，从而提高结直肠癌的早期检出率，为患者争取治疗时间，且检测过程对患者造成的痛苦较小。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。
背景技术
在世界范围内，结直肠癌是第三大常见的恶性肿瘤，其在癌症相关的死亡统计中排名第二。据统计，2020年全球约有190万的新发病例，虽然结直肠癌进展缓慢，从一个腺瘤发展为恶性癌变需要长达8～10年的时间，但结直肠癌的早期筛查和诊断效果并不理想，大部分患者在首次确诊时已经处于癌症中晚期，错失了最佳的治疗时机。
据报道，使用粪便潜血检测和肠道内窥镜检查来进行结直肠的筛查可以有效降低结直肠癌的死亡率。然而，无论是直接进行肠镜检查，还是先进行粪便潜血检测随后再进行肠镜复查，其都要进行侵入性操作，患者的痛苦程度较高，依从性很差。但目前尚没有患者依从性较好且灵敏度较高的检测手段。
发明内容
基于此，本发明提供一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。此外，还提供了一种诊断结直肠癌的核酸产品及试剂盒，该核酸产品和试剂盒能够实现对结直肠癌高灵敏度的诊断，且对患者创伤小。
在其中一个实施例中，以GRCh.38p14为参考基因组，所述试剂能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述试剂能够检测Chr1:1033914-1033829区域、Chr1:1033937-1033844区域和Chr1:1033941-1033844区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平，以及Chr8:71843952-71843823区域、Chr8:71843970-71843842区域和Chr8:71843999-71843905区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平。
一种诊断结直肠癌的核酸产品，所述核酸产品能够检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述核酸产品能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对和能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对；其中：
所述能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr1:1033914-1033829区域的全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对，用于检测Chr1:1033937-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对，和用于检测Chr1:1033941-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对中的至少一对；及/或，
所述能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr8:71843952-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对，用于检测Chr8:71843970-71843842区域的全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对，和用于检测Chr8:71843999-71843905区域的全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对中的至少一对。
在其中一个实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；及/或，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示；及/或，所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示；及/或，所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11所示；及/或，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；及/或，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示。
在其中一个实施例中，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，与所述第一引物对对应的第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；及/或，与所述第二引物对对应的第二检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；及/或，与所述第三引物对对应的第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；及/或，与所述第四引物对对应的第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；及/或，与所述第五引物对对应的第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；及/或，与所述第六引物对对应的第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
一种诊断结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂。
在其中一个实施例中，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在其中一个实施例中，所述用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂包括上述任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，所述用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”或“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文所述的“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。所述的“进一步”或“更进一步”用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本文所述的“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
所述的“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
所述的“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化，或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
所述的“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。
所述的“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
所述的“TaqMan探针”是指包含5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本申请一实施方式提供了一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。
本发明研究人员研究发现，通过检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平，能够提高对结直肠癌的检测灵敏度和特异性，从而提高结直肠癌的早期检出率，为患者争取治疗时间，且检测过程对患者造成的痛苦较小。
在其中一个实施例中，以GRCh.38p14为参考基因组，上述试剂能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
进一步地，上述试剂能够检测Chr1:1033914-1033829区域、Chr1:1033937-1033844区域和Chr1:1033941-1033844区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平，以及Chr8:71843952-71843823区域、Chr8:71843970-71843842区域和Chr8:71843999-71843905区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平。
优选地，上述试剂能够检测Chr1:1033914-1033829区域和Chr8:71843999-71843905区域的甲基化水平。
经过探究，检测Chr1:1033914-1033829区域和Chr8:71843999-71843905区域的甲基化水平对进展期腺瘤和结直肠癌都能实现最优的诊断灵敏度和特异性。
可以理解的是，染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构。需要说明的是，在本文中，对于区域“Chr1:1033941-1033829”和“Chr1:1033941-1033829的负链”都表示在1号染色体上位置为“1033829-1033941”的DNA的负链。其他区域的位置写法与此相同，且本文均以GRCh.38p14为参考基因组。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种诊断结直肠癌的核酸产品，该核酸产品能够检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，上述核酸产品能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
进一步地，上述核酸产品能够检测Chr1:1033914-1033829区域、Chr1:1033937-1033844区域和Chr1:1033941-1033844区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平，以及Chr8:71843952-71843823区域、Chr8:71843970-71843842区域和Chr8:71843999-71843905区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平。
在其中一个实施例中，所述核酸产品包括能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对和能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对。
在其中一个实施例中，能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr1:1033914-1033829区域的全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对，用于检测Chr1:1033937-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对，和用于检测Chr1:1033941-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对中的至少一对。
在其中一个实施例中，能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr8:71843952-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对，用于检测Chr8:71843970-71843842区域的全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对，和用于检测Chr8:71843999-71843905区域的全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对中的至少一对。
优选地，能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr1:1033914-1033829区域的全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对，用于检测Chr1:1033937-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对，和用于检测Chr1:1033941-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对中的至少一对；及，能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr8:71843952-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对，用于检测Chr8:71843970-71843842区域的全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对，和用于检测Chr8:71843999-71843905区域的全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对中的至少一对。
更优选地，能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr1:1033914-1033829区域的全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对，及，能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr8:71843999-71843905区域的全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对。
在其中一个实施例中，第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；及/或，第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示；及/或，第三引物对的核苷酸序列如SEQID NO:7～8所示；及/或，第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11所示；及/或，第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；及/或，第六引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:16～17所示。
进一步地，上述核酸产品还包括与引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中，与第一引物对对应的第一检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；及/或，与第二引物对对应的第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；及/或，与第三引物对对应的第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；及/或，与第四引物对对应的第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；及/或，与第五引物对对应的第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；及/或，与第六引物对对应的第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在其中一个实施例中，上述检测探针为TaqMan荧光探针。检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。荧光报告基团可以是选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、NED和Texas Red中的一种，荧光淬灭基团可以是选自TAMRA、BHQ和MGB中的一种。可以理解的是，对目标区域甲基化的检测与对内参基因的检测可以在同一个反应孔中进行也可以在不同反应孔中进行，根据实际情况来合理选择检测探针的荧光基团。
基于上述，本申请一实施方式还提供了一种诊断结直肠癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂。
在其中一个实施例中，上述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在其中一个实施例中，用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂包括上述任一实施例所述的核酸产品。
在其中一个实施例中，用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂。
在其中一个实施例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，质控试剂包括阳性参考品和阴性参考品。
在一些实施例中，上述试剂盒适用的样本包括但不限于粪便样本、组织样本或血液样本。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.样本的收集
收集280例经肠镜检查和病理活检确认的不同病程的组织样本，所有样本均为经过福尔马林浸泡和石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。组织样本的信息如表1所示：
表1
2.样本DNA的提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本中的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的亚硫酸氢盐转化
将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.定量甲基化特异性PCR(qMSP)
对Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的DNA分子分别设计了多对甲基化引物对和检测探针，经过筛选，每个基因分别保留了3对高扩增效率且高特异性的引物对和探针，引物对和探针的核苷酸序列如表2所示。每对引物对和探针所检测的经亚硫酸氢盐转化后的目标序列和未转化的DNA序列以及其对应的染色体位置如表3所示。每对引物对和探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表4所示。可以理解的是，在一段DNA分子片段内，不同位点的CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化程度是不同的，在CpG二核苷酸密集的区域，若扩增子发生变动，其检测的CpG二核苷酸位点也有变动，则此区域的甲基化程度也会发生变化。因此，在进行PCR扩增时，本发明研究人员尝试将Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的引物对和探针的进行组合筛选，具体的组合方式见表5。
表2
表3
表4
表5
将亚硫酸氢盐转化后的样本DNA进行qMSP反应以检测各个待测样本在Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的甲基化状态。进行PCR反应时，在一个PCR管中，首先需加入反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、模板等必须的成分；然后需加入引物对和探针的组合物，如加入检测Chr1:1033941-1033829区域(AGRN基因的CpG岛区域)甲基化水平的引物对和探针1～3中的一种，和检测Chr8:71843999-71843823区域(MSC基因的CpG岛区域)甲基化水平的引物对和探针4～6中的一种；此外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针(SEQ ID NO.19～21)。这里用到的检测探针为Taqman探针，AGRN基因目标区域的检测探针5’端的报告基团为FAM，3’端淬灭基团为MGB，MSC目标区域的检测探针5’端的报告基团为ROX，3’端淬灭基团为MGB，ACTB基因的检测探针其5’端的报告基团为VIC，3’端淬灭基团为BHQ1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表6所示，按照表7展示的扩增程序进行PCR扩增。
表6
表7
按照不同的引物对和探针组合方式进行PCR检测时，应同时进行阴性对照和阳性对照的检测。对于同一种引物对和探针的组合方式，阴性对照和阳性对照与其它待测样本孔的区别在于添加的模板不同。阴性对照为TE缓冲液。阳性对照的模板制备方法如下：将AGRN基因的目标区域如SEQ ID NO.23、25和27进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒；将MSC基因的目标区域如SEQ ID NO.29、31和33进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒；将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。PCR检测时，根据表5中的组合方式，选择阳性对照孔需要加入的模板，阳性对照孔的DNA模板为：103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含SEQ ID NO.23、25和27之一的人工合成质粒、103拷贝/微升的含SEQ ID NO.29、31和33之一的人工合成质粒，三者1:1:1混合而成。
5.结果分析
1)Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
2)质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)结果分析和判读方法：
对于待测的组织样本，若其在某一检测区域的Ct值≤38，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。
按照表5的检测引物对和探针的组合方式，若待测样本在同时检测的2个目的区域中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为结直肠癌或癌前病变阳性样本。当且仅当待测样本在同时检测的2个目的区域都为甲基化阴性，则该样本为结直肠癌阴性样本。根据Ct值分析qMSP法诊断肠组织样本的性能，结果如表8所示，其中，灵敏度为肠镜结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为肠镜结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表8
由表8可以看出，利用qMSP的方法对Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域进行甲基化检测进而来区分结直肠癌前病变和癌变组织样本的效果良好。所有的引物对和探针的组合方式对进展期腺瘤组织样本有一定的检出率，且对结直肠癌组织样本有较好的检出效果。引物对和探针的组合方式A～I检测进展期腺瘤组织样本的灵敏度范围为50％～64.29％，其在腺瘤旁组织中的特异性均高于85.7％；其检测结直肠癌组织样本的灵敏度范围为75％～86.9％，其检测癌旁组织样本的特异性均高于82.14％。此外，引物对和探针的组合方式A～I对Ⅰ期结直肠癌也有较好的检出率，其诊断早期结直肠癌组织样本的灵敏度范围为65.79％～78.95％。进一步地，组合方式C的引物对和探针(可同时检测Chr1:1033914-1033829区域和Chr8:71843999-71843905区域DNA甲基化水平)对进展期腺瘤和结直肠癌组织样本的诊断性能最佳。
实施例2
1.样本的收集
共收集156例经肠镜检查和病理活检确认的结直肠癌患者的粪便样本，以及185例进行常规体检的健康人的粪便样本。每份粪便样本的质量大于1g。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。粪便样本的信息如表9所示。
表9
2.样本DNA的提取
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(Cat：AA07)提取粪便样本中的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的亚硫酸氢盐转化
将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.定量甲基化特异性PCR(qMSP)
对经过亚硫酸氢盐转化的样本DNA进行qMSP反应，其具体步骤、所用引物和探针以及检测位点与实施例1中步骤4相同。
5.结果分析
对qMSP反应的结果的Ct值读取方法以及质量控制方法与实施例1中步骤5的Ct值读取方法以及质量控制方法相同。
对于待测的粪便样本，若其在某一检测区域的Ct值≤38，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。
按照表5的检测引物对和探针的组合方式，若待测样本在同时检测的2个目的区域中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为结直肠癌或癌前病变阳性样本。当且仅当待测样本在同时检测的2个目的区域都为甲基化阴性，则该样本为结直肠癌阴性样本。根据Ct值分析qMSP法诊断粪便样本的性能，结果如表10所示，其中，灵敏度为肠镜结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为肠镜结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表10
由表10可以看出，也可以通过qMSP的方法检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的甲基化水平进而来区分结直肠癌患者和健康人的粪便样本。总体看来，不同引物对和探针的组合方式检测结直肠癌患者粪便样本的灵敏度均较高，其最低为74.36％，最高可达85.9％；其检测健康人粪便样本的特异性均高于89.19％，最高可达95.68％。而且引物对和探针组合A～I对早期结直肠癌患者的粪便样本也有较好的检出率，其诊断早期结直肠癌患者粪便样本的灵敏度范围为72％～82.67％。同组织样本相似，组合物C诊断效果最佳。
实施例3
1.样本的收集
收集经肠镜检查和病理活检确认的患有进展期结直肠腺瘤的患者的血液样本139例，具体信息如表11所示。其中，患有结直肠癌的患者的血液样本303例，健康人血液样本295例。每份血液样本的体积大于8mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
表11
2.样本DNA的提取
使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(Cat：DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的亚硫酸氢盐转化
将提取好的样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.定量甲基化特异性PCR(qMSP)
对经过亚硫酸氢盐转化的样本DNA进行qMSP反应，其具体步骤、所用引物和探针以及检测位点与实施例1中步骤4相同。
5.结果分析
对qMSP反应的结果的Ct值读取方法以及质量控制方法与实施例1中步骤5的Ct值读取方法以及质量控制方法相同。
对于待测的血液样本，若其在某一检测区域的Ct值≤45，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>45，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。
按照表5的检测引物对和探针的组合方式，若待测样本在同时检测的2个目的区域中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为结直肠癌或癌前病变阳性样本。当且仅当待测样本在同时检测的2个目的区域都为甲基化阴性，则该样本为结直肠癌阴性样本。根据Ct值分析qMSP法诊断血液样本的性能，结果如表12所示，其中，灵敏度为肠镜结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为肠镜结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表12
由表12可以看出，通过qMSP的方法检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的甲基化水平进而来区分结直肠腺瘤患者、结直肠癌患者和健康人的血液样本的诊断效果良好。不同引物对和探针的组合方式检测结直肠腺瘤患者血液样本的灵敏度范围为46.76％～56.83％；其检测早期结直肠癌患者血液样本的灵敏度范围为68.97％～80.69％，其检测结直肠癌患者血液样本的总体灵敏度都高于76.24％，最高可达86.47％，其检测健康人血液样本的特异性都高于89.49％，最高可达95.25％。同样的，引物对和探针组合C诊断效果最好。
从上述实施例可以看出，虽然不同的引物对和探针的组合检测癌前病变和癌变的效果略有不同，但是可以发现，检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的引物对和探针都能够显著提高结直肠癌的早期检出率，可以选择最佳的组合方式用于临床诊断结直肠癌或癌前病变，提高患者的生活质量和延长生命。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以GRCh.38p14为参考基因组，所述试剂能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂能够检测Chr1:1033914-1033829区域、Chr1:1033937-1033844区域和Chr1:1033941-1033844区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平，以及Chr8:71843952-71843823区域、Chr8:71843970-71843842区域和Chr8:71843999-71843905区域中的至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平。
4.一种诊断结直肠癌的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品能够检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平。
5.根据权利要求4所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品能够检测Chr1:1033941-1033829区域和Chr8:71843999-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平。
6.根据权利要求4或5所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对和能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对；其中：
所述能够检测AGRN基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr1:1033914-1033829区域的全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1:1033937-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对、和用于检测Chr1:1033941-1033844区域的全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对中的至少一对；及/或，
所述能够检测MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的引物对包括用于检测Chr8:71843952-71843823区域的全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr8:71843970-71843842区域的全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对、和用于检测Chr8:71843999-71843905区域的全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对中的至少一对。
7.根据权利要求6所述的核酸产品，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQID NO:1～2所示；及/或，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示；及/或，所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示；及/或，所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11所示；及/或，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；及/或，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示。
8.根据权利要求7所述的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针；
进一步地，与所述第一引物对对应的第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；及/或，与所述第二引物对对应的第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；及/或，与所述第三引物对对应的第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；及/或，与所述第四引物对对应的第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；及/或，与所述第五引物对对应的第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；及/或，与所述第六引物对对应的第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
9.一种诊断结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过下述方法中的至少一种检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR法、荧光定量PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法；
进一步地，所述用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂包括权利要求4～8任一项所述的核酸产品。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测AGRN基因的CpG岛区域和MSC基因的CpG岛区域的甲基化水平的试剂还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的至少一种。
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| CN202210799765.0A Pending CN115838799A (zh) | 2022-07-08 | 2022-07-08 | 检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115838799A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1852974A (zh) * | 2003-06-09 | 2006-10-25 | 密歇根大学董事会 | 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法 |
| US20130022974A1 (en) * | 2011-06-17 | 2013-01-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Dna methylation profiles in cancer |
| CN106232833A (zh) * | 2014-01-30 | 2016-12-14 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于非侵入性诊断的甲基化单体型分析(monod) |
| US20210115519A1 (en) * | 2018-04-19 | 2021-04-22 | The University Of Chicago | Methods and kits for diagnosis and triage of patients with colorectal liver metastases |
-
2022
- 2022-07-08 CN CN202210799765.0A patent/CN115838799A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1852974A (zh) * | 2003-06-09 | 2006-10-25 | 密歇根大学董事会 | 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LUDOVIC BARAULT等: "Discovery Of Methylated Circulating DNA Biomarkers For Comprehensive Non-Invasive Monitoring Of Treatment Response In Metastatic Colorectal Cancer", GUT., vol. 67, no. 11, pages 1995 - 2005, XP093024614, DOI: 10.1136/gutjnl-2016-313372 * |
| 张威;叶颖江;任仙文;黄晶;申占龙;: "利用转录组二代测序探索直肠癌术前放化疗的敏感性分子特征", 北京大学学报(医学版), no. 03 * |
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