CN115838662A - 一株具有缓解克罗恩病潜力的两歧双歧杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有缓解克罗恩病潜力的两歧双歧杆菌，属于微生物以及医药技术领域。本发明提供了一株两歧双歧杆菌CCFM1284，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62886。本发明提供的两歧双歧杆菌CCFM1284具有抗炎特性；所述两歧双歧杆菌CCFM1284能够缓解TNBS诱导的克罗恩病(CD)小鼠的宏观疾病表征症状；减轻克罗恩病(CD)小鼠结肠病理损伤、抑制结肠纤维化沉积、抑制肠道炎症、增强肠道屏障；达到有效防治TNBS诱导的小鼠克罗恩病的目的。

Description

一株具有缓解克罗恩病潜力的两歧双歧杆菌

技术领域

本发明涉及一株具有缓解克罗恩病潜力的两歧双歧杆菌，属于微生物以及医药技术领域。

背景技术

克罗恩病(Crohn’s disease,CD)以慢性复发性肠道炎症为特征，在全球尤其是在新兴经济体中发病率呈显著上升趋势。其致病因素十分复杂，包括基因突变、不良饮食、肠道菌群失衡、免疫亢进等。该疾病还会导致狭窄、瘘管甚至肿瘤等严重的并发症。虽然氨基水杨酸、类固醇或免疫抑制剂和生物制剂(如英夫利昔单抗和维多利单抗)被广泛用于治疗患者，但这些措施并不能完全预防CD或其术后复发。目前，这些疗法往往价格昂贵，还会引发感染、对肝脏和骨骼的毒性等不良反应(公开在Cushing et al.2021,325(1):69-80.)。因此，早期有效的炎症管理和预防至关重要。

鉴于传统治疗方法的局限性和存在的多种问题，针对克罗恩病寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。目前益生菌随着肠道微生态科学的发展逐渐走进大众的视野，其价格相对低廉，副作用少，易于广大民众接受，抗CD菌株的研究以及相关制剂的开发已成为目前的研究热点。比如已经公布的有解纤维素拟杆菌DSM 14838T、解淀粉芽孢杆菌TITI、枯草芽孢杆菌、长双歧杆菌DM21062等能够预防CD或减轻肠炎症状；益生菌组合制剂VSL#3具有抗炎作用，可减少克罗恩病手术后的内镜复发(公开在Fedorak et al.ClinicalGastroenterology and Hepatology,2015,13(5):928-935.e2.)；益生菌和益生元联合疗法可安全有效地用于减轻活动期CD病人临床症状(公开在Fujimori et al.Journal ofgastroenterology and hepatology,2007,22(8):1199-1204.)。益生菌有望越来越多的CD患者获益。

两歧双歧杆菌也是一种广泛受关注的益生菌，因其对人体胃酸和胆盐有较强的适应力，对宿主来源粘蛋白具有良好的利用能力，使得其在作为益生菌的使用过程中能够更好地发挥有益作用。大量证据表明两歧双歧杆菌或其灭活菌体缓解多项胃肠道疾病，达到改善宿主胃肠道健康的功效。两歧双歧杆菌CGMCC NO.13632显著改善小鼠便秘病理指标,起到预防和治疗便秘的效果(公开在CN106834187B)；两歧双歧杆菌GDMCC No.60255显著地减轻结直肠癌模型小鼠结直肠部位的炎症反应，并减少肿瘤数量(公开在CN107629988A)。两歧双歧杆菌BGN4能在溃烂性结肠炎小鼠中抑制氧化应激、减轻上皮屏障损伤和发挥疾病症状缓解作用(公开在Lee et al.Journal of medicinal food,2022,25(2):146-157.)。此外，两歧双歧杆菌MIMBb75缓解人体多种胃肠道疾病状态下疼痛、腹胀、腹胀、急迫、消化紊乱(公开在AU2012213576B2；IN2013DN06748A；CN103476273A；Andresen V,GschossmannJ,Layer P.The lancet Gastroenterology&hepatology,2020,5(7):658-666.)；非活性的两歧双歧杆菌DSM 24514能显著改善IBS病人的胃肠症状(公开在CN 112312920 A)。

益生菌在缓解疾病方面具有菌株特异性，必须对具有疾病缓解作用的菌株进行有效筛选。TNBS诱导的慢性结肠炎以Th1及Th17型炎症反应为特征，肠道组织病理表现为肠壁增厚，纤维化(公开在Nature protocols,2017,12(7):1295-1309.)。相比于急性模型，其类似于人体克罗恩病的临床反应。TNBS型慢性结肠炎已经成为筛选克罗恩病治疗药物的主要动物模型。此外，能够治疗克罗恩病的益生菌的微生态制剂开发还非常有限，因此本专利具有广阔的市场应用前景。

发明内容

本发明提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1284，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62886。

所述两歧双歧杆菌CCFM1284采集江苏省无锡市一位健康男性的粪便样本，提取所筛选双歧杆菌的基因组，将其16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株均为两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌CCFM1284。

所述两歧双歧杆菌CCFM1284的菌体特征：革兰氏染色阳性杆状细菌，极少以分叉状、弯杆状的形态呈现，无芽孢形成。菌落特征：在MRSc固体培养基上的菌落呈瓷白色，圆形凸起，湿润，边缘整齐光滑。生长特性：该菌株为严格厌氧菌，对氧气敏感，在37℃生长最佳。所述两歧双歧杆菌CCFM1284在MLN细胞模型具有免疫调节作用，能够诱导IL-10的大量产生。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中，含有上述两歧双歧杆菌CCFM1284或其发酵液，或含有所述两歧双歧杆菌CCFM1284的冻干粉或裂解物。

在本发明的一种实施方式中，所述冻干粉是将含有所述两歧双歧杆菌CCFM1284的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其他工艺制备所得到的粉剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，所述两歧双歧杆菌CCFM1284活菌数不低于10⁹CFU/g或10⁹CFU/mL。

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述两歧双歧杆菌CCFM1284或含有上述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述食品可为饮料、酸奶、果冻、益生菌粉等。

在本发明的一种实施方式中，所述药品中含有上述两歧双歧杆菌CCFM1284、药学上可接受的载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体是一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。所选载体能满足双歧杆菌生存即可，具体根据实际需要。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型等。

在本发明的一种实施方式中，所述填充剂应该理解为用于增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂，或以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。

在本发明的一种实施方式中，所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。

在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂应该理解为原料药物本身无粘性或粘性不足，需加入粘性物质以便于制粒。所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂应该理解为原料药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。所述润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。

在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂应该理解为一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。所述崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。

在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂应该理解为一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，有利于片剂脱模的化学物质。所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂应该理解为在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道的药用辅料。所述的矫味剂选自如单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸或碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

本发明提供了上述两歧双歧杆菌CCFM1284或上述微生物菌剂在制备预防和/或缓解慢性结肠损伤或慢性克罗恩病的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述食品可为饮料、酸奶、果冻、益生菌粉等。

在本发明的一种实施方式中，所述药品中含有上述两歧双歧杆菌CCFM1284、药学上可接受的载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体是一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。所选载体能满足双歧杆菌生存即可，具体根据实际需要。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型等。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

本发明还提供了上述两歧双歧杆菌CCFM1284或上述微生物菌剂在制备预防和/或缓解TNBS诱导炎症的产品、降低结肠病理损伤的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述药品中含有上述两歧双歧杆菌CCFM1284、药学上可接受的载体和/或药用辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述食品可为饮料、酸奶、果冻、益生菌粉等。

在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的载体是一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。所选载体能满足双歧杆菌生存即可，具体根据实际需要。

在本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型等。

本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将两歧双歧杆菌CCFM1284接种到含有0.5％半胱氨酸的MRS液体培养基37℃厌氧培养，收获达到稳定期的菌体；

(2)离心收集菌体，用无菌PBS洗涤3次；

(3)用无菌PBS调整菌体浓度到5×10⁹cfu/mL；

有益效果

本发明提供的两歧双歧杆菌CCFM1284具有下列性质：

1、在体外肠系膜淋巴结(MLN)共培养模型中，本发明的两歧双歧杆菌CCFM1284具有独特的抗炎特性；

2、由于克罗恩病(CD)是一种慢性病，为了更加的贴近病症，本发明通过先采用TNBS诱导进行致敏，然后灌肠TNBS溶液，得到了克罗恩病(CD)模型，而采用本发明的两歧双歧杆菌CCFM1284能够缓解克罗恩病(CD)的症状，具体如下：

(1)所述两歧双歧杆菌CCFM1284能够缓解TNBS诱导的克罗恩病(CD)小鼠的宏观疾病表征症状；

(3)所述两歧双歧杆菌CCFM1284减轻克罗恩病(CD)小鼠结肠病理损伤，并抑制结肠纤维化沉积；

(4)所述两歧双歧杆菌CCFM1284降低克罗恩病(CD)小鼠肠道炎症因子的表达，抑制肠道炎症；

(5)促进克罗恩病(CD)小鼠结肠紧密连接蛋白以及粘蛋白的表达，从而增强肠道屏障；

(6)所述两歧双歧杆菌CCFM1284促进克罗恩病(CD)小鼠MLN中Treg细胞的增殖，达到有效防治TNBS诱导的小鼠克罗恩病的目的。

综上，本发明提供的两歧双歧杆菌CCFM1284能够有效的缓解TNBS诱导的克罗恩病(CD)。

生物材料保藏

一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1284，分类学命名为Bifidobacterium bifidum，已于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62886，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

附图说明

图1：动物模型造模示意图。

图2：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠体重变化的影响。

图3：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠生存率的影响。

图4：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠结肠长度的影响。

图5：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠结肠组织病理的影响。

图6：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠结肠组织纤维化的影响。

图7：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠结肠紧密连接蛋白的影响。

图8：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠结肠组织炎症因子的影响。

图9：不同两歧双歧杆菌对CD小鼠肠系膜淋巴结调节性T细胞的影响。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的两歧双歧杆菌FXJWS17M4、FHeNJZ3M6和粪肠球菌FJSWX25M1保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心。

下述实施例中涉及的培养基如下：

双歧杆菌特异性筛选培养基(g/L)：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二铵、0.1g七水硫酸镁、0.05g一水硫酸锰、蒸馏水：1000mL；pH：6.2-6.4；115℃灭菌20分钟。配制固体培养基时，添加15g琼脂，并在倒平板前，分别按1‰、0.5‰培养基的体积加入无菌的莫匹罗星和无菌的制霉菌素，即终浓度分别为100μg/mL莫匹罗星、25U/mL制霉菌素。

含半胱氨酸MRS培养基配制：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温-80 1mL/L，半胱氨酸1％，pH 6.4，115℃、20分钟灭菌。

实施例1：两歧双歧杆菌CCFM1284的筛选及鉴定

1、样品采集

采集江苏省无锡市一位健康男性的粪便样本，置于装有30％甘油的样品采集管中，保存在装有冰袋的保温盒，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。

2、菌株的分离纯化

(1)稀释涂布：取保存于30％甘油管中的粪便样本约0.5g，无菌条件下与4.5mL生理盐水在10mL离心管中混匀，得到10^-1稀释液，重复上述操作，依次得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液；

(2)涂布培养：分别吸取100μL步骤(1)中10^-4、10^-5、10^-6三个梯度稀释液于双歧杆菌特异性筛选培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48h，得到稀释涂布平板；

(3)纯化培养：取菌落数在30-300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个瓷白色，表面光滑湿润，边缘整齐的菌落在改良MRS固体培养基上划线，然后置于37℃厌氧条件下培养48h，得到单菌落。接着将单菌落接种于改良MRS液体培养基中，置于37℃厌氧条件下培养24h，得到的即为纯化后的培养液。

3、菌种保藏与鉴定

提取所筛选双歧杆菌的基因组，将其16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株均为两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌CCFM1284。

实施例2：动物实验用两歧双歧杆菌菌剂的制备。

具体步骤如下：

(1)两歧双歧杆菌CCFM1284的活化：吸取10μL保存于甘油中的两歧双歧杆菌菌悬液，涂布于含0.1％半胱氨酸的MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h；

(2)挑取活化后的CCFM1284单菌落接种于10mL液体含半胱氨酸MRS培养基中，37℃厌氧培养48h，得到种子液。

将上述两歧双歧杆菌CCFM1284种子液在7000g条件下离心10min，收集新鲜菌体，经过无菌PBS洗涤3次后，用无菌PBS调菌体浓度到5×10⁹cfu/mL，制备得到两歧双歧杆菌CCFM1284菌剂。

按照上述方法，制备得到两歧双歧杆菌FXJWS17M4菌剂和两歧双歧杆菌FHeNJZ3M6菌剂。

实施例3：两歧双歧杆菌CCFM1284的体外免疫调节能力

具体步骤如下：

(1)从SPF级6～8周龄雄性C57BL/6小鼠取出MLN(肠系膜淋巴结)，经研磨、过滤后，添加含胎牛血清(10％)、庆大霉素(1％)及双抗(1％)的RPIM1640完全培养基，使用血球计数板计数，并调整MLN细胞(肠系膜淋巴细胞)浓度约为1×10⁶/mL，制备得到肠系膜淋巴细胞菌悬液；

(2)菌悬液的制备：分别将双歧杆菌、粪肠球菌菌体采用无菌PBS洗涤3次后，用无菌PBS调菌体浓度到OD 600nm＝0.5，分别制备得到双歧杆菌菌悬液、粪肠球菌菌悬液；

(3)向步骤(1)得到的肠系膜淋巴细胞菌悬液中补充HEPEs(10mmol/L)、β-巯基乙醇(0.05mmol/L)、L-谷氨酰胺(3mmol/L)、anti-CD3抗体(1mmol/L)和anti-CD28(1mmol/L)抗体，充分混匀后，将MLN细胞按照每孔200μL接种于96孔板；

再分别将制备好的双歧杆菌菌悬液、粪肠球菌菌悬液按照每孔20μL加入(MLN细胞数目：菌体细胞数目＝1:10)，混匀，置于37℃的二氧化碳恒温培养箱中，培养72h。

以PBS和MLN单细胞悬液的共培养作为空白对照。

待培养结束，在4℃，12000r/min条件下离心5min，收取上清，用于测定细胞因子IL-10、IL-17和IL-12的含量，具体测定方法参照R&D小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒说明书，结果如表1所示。

表1：不同两歧双歧杆菌在MLN共培养模型的免疫调节能力比较

从表1可以看出，与粪肠球菌FJSWX25M1相比，所有两歧双歧杆菌均能诱导一定量的IL-10，其中，两歧双歧杆菌CCFM1284的诱导能力最强；三株菌在IL-12的诱导能力上没有显著差异。

实施例4：慢性TNBS建立慢性克罗恩病小鼠模型及干预实验设计

1、具体步骤如下：

(1)将50只6-8周雄性BALB/c小鼠，随机分成5组(空白组，造模组和三个益生菌干预组：两歧双歧杆菌FXJWS17M4组、两歧双歧杆菌FHeNJZ3M6组、两歧双歧杆菌CCFM1284组)，每组10只。

将所有小鼠禁食24h后，逐一置于异氟烷呼吸麻醉机中，待其充分麻醉后，使用剃毛机在小鼠背部(1.5×1.5cm)剃光被毛，涂抹150μL预敏溶液进行预敏。预敏溶液配置：丙酮和橄榄油以体积比4:1混合，将质量分数为5％ TNBS水溶液稀释成1％。空白对照组涂抹不含TNBS的相应溶液。

(2)一周后，使用1mL无菌注射器连接塑料软管进行直肠灌注TNBS溶液(50μL/只)，灌注完成后迅速将小鼠倒置1～2min以防止药液外流，随后将小鼠放回笼盒中。

如图1所示，TNBS灌注每周一次，共持续4周，TNBS浓度依次升高(即：第一周灌胃的浓度为1％，第二周灌胃的浓度为1.5％，第三周灌胃的浓度为2％，第四周灌胃的浓度为2.5％)；直肠插入3～4cm，实验组和空白对照组灌注溶液分别为含TNBS的35％乙醇水溶液和35％乙醇水溶液。

提前一周开始灌胃实施例2制备得到的两歧双歧杆菌菌剂(200μL/只/天)，连续整个实验周期，菌剂浓度为5×10⁹CFU/mL。

(3)最后一次造模后，每天观察小鼠状况，称重，测定隐血，记录疾病活动指数；3天后进行安乐死；

取各组小鼠的结肠，并测定结肠长度；选取1cm远端结肠，保存至4％多聚甲醛固定液(用于病理切片)；选取0.5cm结肠保存于Trizol保护液(用于提取RNA)；剩余结肠组织保存于PBS(用于测定细胞因子)；取淋巴结保存至RPMI 1640细胞培养液(用于Treg细胞测定)。

所有实验动物小鼠，购于北京维通利华实验动物有限公司，饲养在环境温度为23±2℃，相对湿度为50±10％的SPF级屏障环境中。

2、分别检测实验结束后各组小鼠：体重变化、结肠长度、生存率、炎症因子、Treg细胞，并制作病理切片及Masson染色，实验结果如下所示：

(1)由图2可以看出，空白组小鼠，体重为：23.60g，模型组小鼠体重为：19.90g，体重下降16％，而两歧双歧杆菌FXJWS17M4组、两歧双歧杆菌FHeNJZ3M6组、两歧双歧杆菌CCFM1284组小鼠，体重分别下降6.8％、1.8％、0.8％。

可见，慢性TNBS造模后，小鼠体重显著下降，双歧杆菌CCFM1284干预导致体重的下降显著恢复。而双歧杆菌FXJWS17M4干预并未得到显著恢复。

(2)由图3可以看出，慢性TNBS造模导致小鼠50％的致死率，FXJWS17M4组、FHeNJZ3M6组、CCFM1284组致死率分别为40％，40％，30％。可见，相比与其他双歧杆菌，CCFM1284干预后显著降低了致死率。

(3)由图4可以看出，空白组小鼠，结肠长度为11.11cm，模型组为8cm，慢性TNBS造模导致小鼠结肠长度显著降低，双歧杆菌CCFM1284和FHeNJZ3M6干预后结肠长度得到了显著恢复(分别为10.39和9.77cm)。而双歧杆菌FXJWS17M4干预并未得到显著恢复(8.98cm)。

(4)由图5可以看出，慢性TNBS造模后，小鼠结肠固有层多数的肠腺消失，被增生的结缔组织取代，杯状细胞数量明显减少，周围并伴有大量的淋巴细胞浸润(蓝色箭头)；局部固有层结缔组织轻度增生，增生至肌层(黑色箭头)，肌层局部断裂(橙色箭头)，黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层均可见少量的粒细胞浸润(绿色箭头)。

与模型组小鼠相比，CCFM1284组小鼠肠黏膜上皮完整；仅局部固有层内可见少量的粒细胞浸润，病理情况得到显著改善。

FXJWS17M4组小鼠固有层局部肠腺消失被增生的结缔组织取代，杯状细胞数量轻度减少，较多的淋巴细胞呈灶性浸润(蓝色箭头)，周围肠腺排列不规则。FHeNJZ3M6组小鼠固有层局部结缔组织轻度增生，并伴有少量的粒细胞浸润(蓝色箭头)，周围肠腺排列不规则，个别粒细胞浸润至黏膜下层(绿色箭头)；固有层偶见肠腺轻度扩张，上皮扁平化。

(5)由图6Masson染色结果可以看出，空白组小鼠结肠组织未见胶原浸润，慢性TNBS造模后，肠组织胶原浸润程度较深，且肠道组织形态异常，可见绒毛水肿，肠壁增厚，此症状类似于CD病人的肠道病理特征。

干预组胶原浸润均有所下降：CCFM1284干预后组织胶原浸润程度下降最为显著，表明本发明菌剂最具缓解克罗恩病的潜力。

(6)由图7可以看出，慢性TNBS造模后，结肠粘蛋白Mucin-2、紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1基因相对表达量显著下降(分别为0.19、0.55和0.29)，益生菌干预后，CCFM1284组表达量显著提高(分别为1.27、0.98和0.64)。可见两歧双歧杆菌CCFM1284降低了TNBS对小鼠肠道物理屏障的损害。

(7)由图8可以看出，空白组结肠组织匀浆IL-17含量为1825pg/mL，造模组为3942pg/mL，FXJWS17M4、FHeNJZ3M6、CCFM1284干预组分别为2207pg/mL、1177pg/mL、1920pg/mL；空白组回肠组织匀浆IL-17含量为1294pg/mL，造模组为2039pg/mL，FXJWS17M4、FHeNJZ3M6、CCFM1284干预组分别为1650pg/mL、1859pg/mL、1044pg/mL。

可见，慢性TNBS造模后，结肠和回肠炎症因子显著升高，益生菌干预后炎症因子含量均有所下降，其中，CCFM1284干预效果最好。

(8)由图9可以看出，空白组小鼠肠系膜淋巴结调节性T细胞(Treg)含量为15％，慢性TNBS造模后，Treg显著减少(7.67％)，干预后，FXJWS17M4组、FHeNJZ3M6组、CCFM1284组肠系膜淋巴结中Treg比例均有一定的提高，分别为12.7％、14.9％和17.9％，只有CCFM1284干预效果显著。可见，与其他两株菌比较而言，本发明菌剂最具有控制炎症，缓解克罗恩病的潜力。

实施例5：制备含有本发明微生态制剂制备片剂

分别称取采用冷冻干燥方法制备的双歧杆菌CCFM1284菌粉制剂25.7重量份、酵母β-葡聚糖55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用中南制药机械厂生产的压片机进行压片，使用青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机进行干燥，再包装得到本发明的片剂。

实施例6：制备含有本发明微生态制剂的胶囊制品

将本发明的双歧杆菌CCFM1284在改良MRS培养基中于37℃厌氧培养24小时，在4℃于5000rpm条件下离心15min，用无菌的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗1-2次，使用保护剂重悬菌体使菌体终浓度达到10¹⁰CFU/mL。冷冻干燥48小时，得到含双歧杆菌CCFM1284粉剂，将该粉剂装入市售的药用胶囊，即得胶囊制品。

保护剂的成分包含：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖和10g/L L-谷氨酸钠。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1284，于2022年10月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62886。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，含有权利要求1所述的两歧双歧杆菌CCFM1284或其发酵液，或含有所述两歧双歧杆菌CCFM1284的冻干粉。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

4.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的两歧双歧杆菌CCFM1284或含有权利要求2或3所述的微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。

6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

7.权利要求1所述两歧双歧杆菌CCFM1284或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备预防和/或缓解慢性结肠损伤或慢性克罗恩病的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为药品或保健品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品中，两歧双歧杆菌CCFM1284的活菌数至少为：10⁹CFU/g。

10.权利要求1所述两歧双歧杆菌CCFM1284或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备预防和/或缓解TNBS诱导炎症的产品、降低结肠病理损伤的产品中的应用。

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