CN115803050A

CN115803050A - 使用纳米颗粒疫苗的细菌免疫

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Publication number: CN115803050A
Application number: CN202180041894.7A
Authority: CN
Inventors: R·阿达莫; F·卡尔博尼; R·科齐; I·玛格丽塔·伊·罗斯; M·R·罗曼诺
Original assignee: Glaxosmithkline Biology Co ltd
Current assignee: Glaxosmithkline Biology Co ltd
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2023-03-14
Also published as: BR112022023261A2; EP4164681A1; JP2023529925A; WO2021250628A1; MX2022015860A; US20230210975A1; CA3185429A1

Abstract

诱导针对细菌多糖或寡糖的免疫应答的方法，以及用于这些方法中的构建体和组合物。

Description

使用纳米颗粒疫苗的细菌免疫

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2021年6月7日，命名为VU66934WO_SL.txt，且大小为13,971字节。

技术领域

本发明涉及诱导针对细菌多糖或寡糖的免疫原性反应的方法，以及用于这些方法中的构建体和组合物。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(也称为“B群链球菌”或“GBS”)是一种β-溶血性、带荚膜的革兰氏阳性微生物，其是新生儿脓毒症和脑膜炎的主要原因，特别是在携带细菌的妇女所生的婴儿中(Heath&Schuchat(2007))。分娩后期抗生素预防的使用减少了早发型新生儿疾病，但未显著影响晚发型(出生后7-90天)新生儿GBS病的发生率(参见，例如Baker，(2013))。设计用于妊娠期间母体施用的有效疫苗是预防婴儿GBS病所需的；目前还没有获得许可的GBS疫苗。

GBS荚膜是一种有助于细菌逃避人先天免疫防御的毒力因子。GBS荚膜由高分子量聚合物组成，所述高分子量聚合物由四至七个单糖的多个相同重复单元制成，并且包括唾液酸(N-乙酰神经氨酸)残基，称为荚膜多糖(CPS)。基于荚膜多糖重复单元的化学组成和糖苷键的模式，GBS可以分类为十种血清型(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX)。还已知存在不可分型的GBS菌株。对GBS CPS的结构的描述可以在公开的文献中找到(参见例如WO2012/035519)。不同GBS血清型的荚膜多糖是化学相关的，但在抗原上不同。

已经研究了GBS荚膜多糖(也称为荚膜糖)在疫苗中的应用。然而，糖是T非依赖性抗原，并且通常免疫原性差。糖与载体分子(如单体蛋白载体)的共价缀合可以将T非依赖性抗原转化为T依赖性抗原，从而增强记忆性应答并允许产生保护性免疫。免疫干扰是其中受试者接受含有相同载体蛋白的多种不同疫苗(同时或依次)的问题(参见，例如，Findlow和Borrow(2016)；Voysey等，(2016)；Dagan等，Infect.Immun.66:2093-2098(1998))。破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)和交叉反应物质197(CRM或CRM197)目前作为单体载体蛋白用于针对流感嗜血杆菌(H.influenzae)和多种脑膜炎球菌细菌菌株的市售疫苗中。CRM 197还存在于市售的多价肺炎球菌疫苗中。

与单体载体蛋白缀合的CPS血清型Ia、Ib、II、III、IV和V的GBS糖缀合物已单独地显示在人中具有免疫原性。多价GBS疫苗已经描述于例如WO2016-178123、WO2012-035519和WO2014-053612中。使用单价或二价GBS糖缀合物(糖+载体蛋白)疫苗的临床研究先前已经在非妊娠成人和妊娠女性中进行。参见，例如，Paoletti等(1996)；Baker等(1999)；Baker等，(2000)；Baker等(2003)；Baker等(2004)。

已经在I期试验(NCT03170609)中评价了五价GBS糖缀合物疫苗(血清型Ia、Ib、II、III和V，与单体载体蛋白缀合，且具有或不具有磷酸铝佐剂)。在1b/2期临床试验(NCT01193920)中评估了包含GBS CPS和单体载体蛋白CRM197的缀合物的GBS三价疫苗(血清型Ia、Ib和III)用于母体疫苗接种；据报道，与安慰剂组相比，疫苗接种的女性所生的婴儿具有更高的GBS血清型特异性抗体水平(经胎盘转移的抗体)直至90天龄(Madhi等，Clin.Infect.Dis.65(11):1897-1904(2017)。

用于与细菌糖抗原缀合以开发潜在疫苗的典型单体载体蛋白是破伤风类毒素(TT)、遗传脱毒的白喉类毒素(CRM197)和GBS菌毛蛋白(Nilo等，(2015a)和Nilo等，(2015b))。

持续需要抗原构建体和包含这种构建体的组合物，其能够在人受试者中诱导针对GBS和其它细菌病原体的免疫应答。

发明内容

本发明的第一实施方式是蛋白质纳米颗粒，如非病毒蛋白质纳米颗粒或病毒样颗粒(VLP)，其具有与其外表面缀合的抗原分子，其中该抗原分子是细菌糖，如多糖或寡糖。细菌糖可以是荚膜糖或O-抗原糖。细菌糖，如多糖或寡糖，可以选自以下的细菌种：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

在本发明的一个实施方式中，蛋白质纳米颗粒是由病毒蛋白质亚基制成的病毒样颗粒(VLP)。

在本发明的一个实施方式中，VLP是QβVLP。

在本发明的一个实施方式中，蛋白质纳米颗粒是由非病毒蛋白质亚基制成的非病毒纳米颗粒。

在一个实施方式中，非病毒纳米颗粒是铁蛋白纳米颗粒或mI3纳米颗粒。

在本发明的再一个实施方式中，VLP是具有与VLP外表面缀合的细菌荚膜多糖或寡糖的QβVLP。

本发明的再一个实施方式是包含纳米颗粒(如本发明的非病毒纳米颗粒或VLP)的免疫原性组合物或药物组合物。

在再一个实施方式中，本发明的纳米颗粒(如非病毒纳米颗粒或VLP)、本发明的免疫原性组合物或药物组合物，用于制备诱导免疫应答的药物，或用于在受试者中诱导免疫应答。

本发明的再一个实施方式是通过将免疫有效量的本发明的纳米颗粒(如非病毒纳米颗粒或VLP)、免疫原性组合物或药物组合物施用于人受试者在该受试者中诱导免疫应答的方法。

附图说明

图1说明了通过以下方式的GBS血清型II荚膜多糖的解聚来提供较短的寡糖：用NaOH的N-脱乙酰化，用NaNO₂氧化和N-乙酰化，然后使用脱盐柱纯化。

图2说明了用肼接头(ADH)和活性酯间隔物(SIDEA)修饰GBS血清型II短寡糖。

图3描绘了修饰的GBS血清型II短寡糖(如图2所示)与NP的缀合。

图4说明了使用NaIO₄氧化GBS血清型II荚膜多糖。

图5描绘了修饰的GBS血清型II多糖(如图3所示)与NP的缀合。

图6提供了GBS OSII-铁蛋白NP缀合物和GBS铁蛋白NP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图7提供了GBS PSII-铁蛋白NP缀合物和GBS铁蛋白NP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图8提供了GBS OSII-mI3 NP缀合物和mI3 NP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图9提供了GBS PSII-mI3 NP缀合物和mI3 NP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图10提供了GBS OSII-QβNP缀合物和QβNP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图11提供了GBS PSII-QβNP缀合物和QβNP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图12A显示了SDS-PAGE(MOPS中4-12％)的结果，其中泳道1是GBS铁蛋白NP，泳道2是OSII-GBS铁蛋白NP，泳道3是PSII-GBS铁蛋白NP，泳道4是mI3 NP，泳道5是OSII-mI3 NP，泳道6是PSII-mI3 NP，泳道7是Qβ纳米颗粒，泳道8是OSII-QβNP，和泳道9是PSII-QβNP。

图12B提供了Western印迹结果，其中泳道1是GBS铁蛋白NP，泳道2是OSII-GBS铁蛋白NP，泳道3是PSII-GBS铁蛋白NP，泳道4是mI3 NP，泳道5是OSII-mI3 NP，泳道6是PSII-mI3NP，泳道7是Qβ纳米颗粒，泳道8是OSII-QβNP，和泳道9是PSII-QβNP。

图13提供了GBS PSIa-QβNP缀合物和QβNP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析的图。

图14提供了与GBS PSIa缀合的Qβ纳米颗粒的负染色TEM图像，显示了直径约33nm的典型二十面体对称性。(比例尺＝200nm)

图15说明了制备肺炎链球菌多糖血清型12F与Qβ纳米颗粒或单体蛋白载体CRM197的缀合物的方法。

图16提供了肺炎链球菌PS12F-QβNP缀合物和QβNP(没有缀合的糖)的SE-HPLC分析。

图17提供了与肺炎链球菌PS12F缀合的Qβ纳米颗粒的负染色TEM图像。

序列

具体实施方式

本发明涉及在纳米颗粒外表面上展示细菌荚膜多糖或寡糖抗原分子的自组装蛋白质纳米颗粒(在本文中也称为纳米颗粒或NP)，涉及包含这种纳米颗粒的组合物，以及涉及使用这种纳米颗粒和组合物的方法。

用于本发明的NP能够从亚基蛋白自组装成纳米颗粒，即最大直径小于约100nm的颗粒。NP的自组装是指由非共价相互作用驱动多肽亚基寡聚以形成有序排列。在本发明的一个实施方式中，结构上限定的抗原表位的多个拷贝展示在NP的外表面上。

NP可以衍生自非病毒蛋白质亚基(非病毒NP)或衍生自来源于病毒的蛋白质亚基或噬菌体蛋白质亚基(病毒样颗粒，或VLP)。

在一个实施方式中，本发明的NP是QBeta(Qβ)噬菌体VLP。在一个具体实施方式中，QβVLP与外部NP表面上的荚膜多糖或寡糖抗原缀合。在另一个实施方式中，本发明的NP是在外部NP表面上展示细菌荚膜多糖或寡糖抗原的GBS铁蛋白或mI3纳米颗粒。

细菌荚膜多糖或寡糖可以选自不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

本发明的NP可用于任何合适的目的，如用于在受试者中诱导免疫应答。

本发明人惊奇地发现了展示细菌荚膜多糖或寡糖抗原的NP有效地诱导了特异性免疫应答，特别是抗体应答。这种应答可以在不存在佐剂的情况下诱导。使用某些NP构建体，在单次施用后获得了对展示的细菌荚膜多糖或寡糖抗原的强免疫应答，并且高于通过单次施用细菌糖-CRM197缀合物诱导的应答。与两个剂量的细菌糖-CRM197缀合物相比，展示细菌糖抗原的一些NP构建体在小鼠中在一个剂量后诱导相当或更高的免疫应答。

因此，本发明提供了与GBS糖抗原(如多糖或寡糖抗原)缀合的NP，其中NP能够在单个剂量后诱导针对糖抗原的免疫应答，并且其中免疫应答高于由单个剂量的展示相同GBS糖的单体蛋白载体(如CRM197)引发的免疫应答。在另一个实施方式中，NP能够在单个剂量后诱导针对GBS糖抗原的免疫应答，其中免疫应答与由两个剂量的展示相同GBS糖的单体蛋白载体(如CRM197)引发的免疫应答相当。

本发明提供了针对呈递细胞表面碳水化合物的多种细菌病原体的糖缀合物疫苗，所述细菌病原体包括GBS、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、大肠埃希氏菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等，其中在单次施用后可以获得有效的免疫应答。

NP和VLP

蛋白质NP，包括非病毒NP和VLP，已被描述为以高度有序的重复抗原阵列呈递与其连接的抗原的支架(参见，例如，WO02/056905)。VLP是由一种或多种类型的多个病毒蛋白分子(多肽亚基)构建的超分子结构。VLP缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。VLP通常可以通过重组表达方法大量产生。

VLP的实例包括由乙型肝炎病毒(Ulrich等，(1998))、麻疹病毒(Wames等，Gene160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利No.5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等，(1995))、诺沃克病毒(Jiang等，(1990)；Matsui等，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))、逆转录病毒GAG蛋白(WO 96/30523)、乙型肝炎病毒的表面蛋白(WO 92/11291)和人乳头瘤病毒(WO 98/15631)的病毒衣壳蛋白构成的那些。

VLP也可以由RNA-噬菌体的重组蛋白质制得，如由噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP、噬菌体MS2、噬菌体M11、噬菌体MX1、噬菌体NL95、噬菌体f2和噬菌体PP7制得。

还报道了由非病毒蛋白亚基制得的纳米颗粒能够在外表面上展示抗原分子。此类NP包括由天然自组装成NP的细菌、昆虫和哺乳动物蛋白制得的那些。已经研究了细菌二氧四氢蝶啶合酶(LS)用作携带抗原的蛋白质颗粒。Jardine等(2013)报道了来自细菌Aquifexaeolicus的LS与自组装成60-mer纳米颗粒的HIV gp120抗原融合。已经描述了编码细菌(幽门螺杆菌(H.pylori))铁蛋白亚基多肽和蛋白质抗原的融合体的核苷酸序列，例如，用于轮状病毒抗原、流感抗原和淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)抗原(Li等，(2019)；Kanekiyo等，(2013)；Wang等，(2017))。报道了重组表达和自组装成在NP外表面上展示抗原肽的NP。还描述了基于昆虫和人铁蛋白的纳米颗粒用于在NP表面上展示抗原(参见，例如，WO2018/005558；Kwong等(2018)；Li等(2006))。

重组表达时，来自GBS菌株的铁蛋白和铁蛋白样蛋白已显示自组装成12-mer纳米颗粒。这些GBS蛋白显示与化脓链球菌DPS样过氧化物抗性多肽亚基的同源性(参见，例如，GenBank KLL27267.1，来自GBS DK-PW-092菌株的蛋白质(SEQ ID NO:3)，来自GBS菌株14747的蛋白质(SEQ ID NO:4))。GBS铁蛋白或铁蛋白样亚基序列可以重组修饰以含有短氨基酸标签来帮助纯化，如本领域已知的组氨酸标签，其可以通过短肽接头与铁蛋白或铁蛋白样序列连接(参见SEQ ID NO:6，其是具有通过肽接头连接的C-末端组氨酸标签的SEQ IDNO:4)。也可以修饰GBS铁蛋白或铁蛋白样蛋白质来替换天然存在的半胱氨酸残基，其中建模表明半胱氨酸不会建立分子内或纳米颗粒内二硫桥。例如用丝氨酸残基替换此类半胱氨酸残基可避免NP产生期间的潜在聚集。替换SEQ ID NO:3的氨基酸位置124处的半胱氨酸残基提供SEQ ID NO:5，其还含有C-末端组氨酸标签。另外，可以修饰GBS铁蛋白或铁蛋白样分子以含有N-末端螺旋部分来提高NP的胶体稳定性和产率。例如，SEQ ID NO:7是SEQ ID NO:4(菌株14747)的修饰，其中SEQ ID NO:4的前(N-末端)三个氨基酸被化脓链球菌Dpr(SEQID NO:8)的N-末端25个氨基酸替换，以提供N-末端螺旋。SEQ ID NO:7还包含C-末端组氨酸标签。这样修饰的GBS铁蛋白或铁蛋白样多肽保持自组装成纳米颗粒蛋白质的能力，如由十二个拷贝的相同修饰的亚基多肽组成的纳米颗粒。SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7中的任一个的重组产生可用于提供NP。在NP表面暴露的赖氨酸或天冬酰胺残基可用于将聚糖缀合至NP表面。

在具体的实施方式中，提供了蛋白质纳米颗粒，其包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的亚基多肽，其中亚基蛋白能够自组装以形成纳米颗粒。

蛋白质NP，包括非病毒NP和VLP，可以通过在原核表达系统中的重组基因表达来产生。已经显示病毒衣壳蛋白在细菌宿主中表达后有效地自组装以形成VLP。美国专利No.9,657,065描述了从细菌宿主的匀浆中纯化重组表达的自组装VLP的方法，其中通过在细菌宿主中表达病毒衣壳蛋白来产生VLP。

在一个优选实施方式中，本发明利用NP，其是由来自大肠杆菌RNA噬菌体QBeta(Qβ)的衣壳蛋白制成的VLP。QβVLP具有直径约25nm的基本上二十面体的噬菌体样衣壳结构。该衣壳含有180个拷贝的衣壳蛋白，其通过二硫桥以共价五聚体和六聚体连接(Golmohammadi等，(1996))。然而，由重组Qβ衣壳蛋白制得的衣壳或VLP可以含有不通过二硫键与衣壳内的其他亚基连接或不完全连接的亚基，这意味着这样的VLP包含少于最大数量的可能的二硫键。

Qβ衣壳蛋白(CP)的基因含有“渗漏”终止密码子，其偶尔导致宿主核糖体通读，从而产生次要衣壳蛋白A₁。A₁由通过柔性接头连接到通读结构域(196个氨基酸的C-末端延伸)的全长衣壳结构域组成(Cui等，(2017)；Runnieks等，(2011))。

用于产生VLP的Qβ衣壳蛋白可以包括Qβ衣壳蛋白(CP)和QβAl蛋白，及其变体，包括其中N-末端甲硫氨酸被切割的变体蛋白；C-末端截短形式的QβA1缺失多达100、150或180个氨基酸；已经通过缺失或置换去除赖氨酸残基或通过置换或插入添加赖氨酸残基而修饰的变体蛋白(参见例如WO03/024481(US 8,691,209、US9,950,055)中公开的Qβ-240、Qβ-243、Qβ-250、Qβ-251和Qβ-259)。还参见例如WO02/056905、WO03/024480。通常，VLP中QβA1蛋白相对于CP的百分比受到限制以确保VLP形成。参见Qβ衣壳蛋白(CP)蛋白质信息资源(PIR)数据库，登录号VCBPQBeta；QβA1蛋白PIR数据库登录号AAA16663。

WO02/056905中提供了Qβ的VLP及其制备方法。在大肠杆菌中重组表达时，QβCP可以自组装成衣壳(Kozlovska等，(1993))，尽管可以除去QβCP的N-末端甲硫氨酸(Stoll等，(1977))。由QβCP组成的VLP(其中N-末端甲硫氨酸未被除去)，或包含QβCP混合物的VLP(其中N-末端甲硫氨酸被切割或存在)在本发明的范围内是有用的。

可以通过尺寸排阻色谱(Kozlovska等，1993)或通过分级硫酸铵沉淀和尺寸排阻色谱的组合(Vasiljeva等(1998)；Ciliens等(2000))从细菌匀浆中纯化在细菌表达系统中使用重组基因表达产生的重组QβVLP。

Qβ衣壳蛋白的VLP在其表面上展示赖氨酸残基。其中暴露的赖氨酸残基被精氨酸替换的Qβ突变体的VLP在本发明中也是有用的。

本发明的一个实施方式使用由QβCP组成或包含QβCP的NP或VLP，其中CP包含SEQID NO:1(133个氨基酸，包括位置1的甲硫氨酸)或由SEQ ID NO:1的氨基酸2-133组成或包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-133(不包括起始甲硫氨酸)。

Hsia等(2016)描述了从三聚体结构块(i301)自组装的二十面体纳米颗粒的计算设计。i301纳米笼基于来自超嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的2-酮-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸(KDPG)醛缩酶；与野生型蛋白质相比i301具有五个突变，并组装成更高阶的十二面体60-mer。进一步改变i301序列(两个半胱氨酸置换为丙氨酸，C76A和C100A)以提供“mi3”序列(SEQ ID NO:2)，其也能够组装成60-mer纳米颗粒。(Bruun等(2018))。

多肽和NP

VLP或NP亚基多肽可含有称为“标签”的氨基酸序列，其有助于纯化(例如允许在镍螯合树脂上纯化的多组氨酸标签)。亲和纯化标签的实例包括例如6xHis标签(六组氨酸，与金属离子结合)、8xHis标签；麦芽糖结合蛋白(MBP)(与直链淀粉结合)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(与谷胱甘肽结合)或本领域已知的其他标签。在某些实施方式中，标签可以直接连接在VLP或NP亚基多肽的N-末端，或通过短多肽接头序列与其连接。合适的多肽接头包括两个或更多个氨基酸的接头。说明性多肽接头是GGS或GSS的一个或多个多聚体，或其变体，如GGSGG(SEQ ID NO:39)或GSGGG(SEQ ID NO:63)。NP亚基多肽序列的几个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)N-末端氨基酸残基可以缺失并用接头序列替换。标签可以在NP或VLP组装前去除(酶促或通过其他方式)，或者可以保留在亚基上并因此包含在NP中。参考多肽序列的“变体”包括与参考序列相比具有一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失的氨基酸序列。变体可以包含与全长参考多肽至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

氨基酸置换可以是保守置换。氨基酸通常根据其侧链归类成不同的组。例如，一些侧链被认为是非极性的，即疏水性的，而一些其他侧链被认为是极性的，即亲水性的。丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)被认为是疏水性氨基酸，而丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)被认为是极性氨基酸。无论其疏水性，氨基酸也基于它们的侧链共有的共同性质被归类成亚组。例如，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被共同归类成芳香族氨基酸，并且将被认为是本发明含义内的芳香族氨基酸。天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)是酸性或带负电荷的氨基酸，而赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)是碱性或带正电荷的氨基酸，并且它们将在本发明的意义上被认为是这样的。疏水性标度是可用的，其利用20种氨基酸中的每一种的疏水性和亲水性，并为每种氨基酸分配疏水性评分，从而产生疏水性分级。仅作为说明性示例，可以使用Kyte和Dolittle标度(Kyte等(1982))。该标度允许本领域技术人员计算预定长度区段内的平均疏水性。

可以修饰NP多肽以引入本领域已知的能够与异源分子化学缀合的氨基酸残基，所述异源分子如抗原性细菌抗原，如细菌多肽、细菌多糖、细菌寡糖或细菌糖缀合物；例如GBS多肽、GBS多糖、GBS寡糖或GBS糖缀合物。

根据本发明，具有高度同一性的两个蛋白质具有至少80％相同、至少85％相同、至少87％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员将理解两个多肽序列(或多核苷酸序列)之间的相似性可以以序列之间的相似性表示，另外称为序列同一性。序列同一性通常根据同一性(或相似性)百分比来测量；百分比越高，两个序列的一级结构越相似。通常，两个多肽(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，由折叠和组装产生的高级结构越相似。确定序列同一性的方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman(1981)；Needleman和Wunsch(1970)；Higgins和Sharp(1988)；Higgins和Sharp(1989)；Corpet等(1988)；以及Pearson和Lipman(1988)。Altschul等(1994)给出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基础局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等(1990))可从若干来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。如何使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上的NCBI网站上获得。

多肽序列之间的序列同一性优选通过成对比对算法，使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch(1970))，使用默认参数(例如空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)来确定。这种算法在EMBOSS包中的Needle工具中方便地实现(Rice等，(2000))。应在多肽序列的整个长度上计算序列同一性。

表达方法

本发明中使用的NP亚基多肽可以通过任何合适的方式产生，包括通过重组表达或通过化学合成，并使用本领域已知的任何合适的方法纯化(如果需要)。可以使用本领域已知的方法分析NP产物，例如通过晶体学、动态光散射(DLS)、纳米差示扫描荧光测定法(Nano-DSF)和电子显微镜，以确认合适的纳米颗粒的产生。

适于生产NP亚基多肽的重组表达方法是本领域已知的。表达的多肽可以包括纯化标签。各种表达系统是本领域已知的，包括使用人(例如HeLa)宿主细胞、哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO))宿主细胞、原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或昆虫宿主细胞的表达系统。宿主细胞通常用编码所需多肽产物的重组核酸序列转化，在适于表达产物的条件下培养，并从细胞或培养基纯化产物。细胞培养条件对于细胞类型和表达载体是特定的，如本领域已知的。

宿主细胞可以在适当改良的常规营养培养基中培养，并且这对于本领域技术人员来说是显而易见的(例如，用于激活启动子)。可以使用本领域的知识确定培养条件，如温度、pH等，参见例如Freshney(1994)和其中引用的参考文献。在细菌宿主细胞系统中，许多表达载体是可用的，包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)或pET载体(Novagen，Madison WI)。在哺乳动物宿主细胞系统中，许多表达系统(包括质粒和基于病毒的系统)可商购获得。

表达NP亚基多肽的真核或微生物宿主细胞可以通过任何方便的方法(包括冻融循环、超声处理、机械破坏)破坏，并且多肽和/或自组装的NP可以通过本领域已知的任何合适的方法(包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱(例如，使用本文所述的任何标记系统)、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱)从重组细胞培养物中回收和纯化。在最终的纯化步骤中可以使用高效液相色谱(HPLC)。

通常，并且使用本领域已知的方法，重组编码的NP亚基多肽的表达涉及制备包含在一种或多种启动子控制下的重组多核苷酸的表达载体，使得启动子刺激多核苷酸的转录并促进编码的多肽的表达。如本文所用的“重组表达”是指这样的方法。

“重组表达载体”包含与能够影响基因产物表达的控制序列可操作地连接的重组核酸序列。“控制序列”是能够影响核酸分子表达并且不需要与该核酸序列邻接的核酸序列，只要它们起到指导其表达的功能。“重组宿主细胞”包含此类重组表达载体。

纯化

如本文所用的术语“纯化的”是指从含有其它组分的组合物(例如宿主细胞或宿主细胞培养基)中分离或分离确定的产物(例如重组表达的多肽)。已经分级以除去不需要的组分并且该组合物保留其生物活性的多肽组合物被认为是纯化的。纯化的多肽保留其生物活性。纯化是相对术语，并且不要求将所需产物与所有痕量的其他组分分离。换句话说，“纯化(purification)”或“提纯(purifying)”是指从组合物或宿主细胞或培养物中除去不需要的组分的过程。用于纯化多肽和NP的各种方法是本领域已知的，例如离心、透析、色谱、凝胶电泳、亲和纯化、过滤、沉淀、抗体捕获及其组合。多肽NP可以与可操作以用于亲和纯化的标签一起表达，如本领域已知的6x组氨酸标签。可以使用例如Ni-NTA柱色谱或使用与固体载体融合的抗6xHis抗体来纯化His标记的多肽。

因此，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，其旨在作为相对术语。多肽(或纳米颗粒)或核酸分子的“基本上纯的”制剂是其中所需组分占制剂的总多肽(或核酸)含量的至少50％的制剂。在某些实施方式中，基本上纯的制剂将含有制剂的总多肽(或核酸)含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％或更多。用于定量所表达多肽的纯化程度的方法是本领域已知的，并且包括例如确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的数量。

抗原展示

附着于本发明NP外表面的分子，包括抗原分子，在本文中可称为“展示”或“展示的”分子。抗原展示纳米颗粒优选以有序阵列展示多个拷贝的抗原分子。理论上，NP上递呈的多个有序抗原允许在NP和宿主细胞之间同时发生多个结合事件，这有利于诱导有效的宿主免疫应答。参见例如Lopez-Sagaseta等，(2016)。

抗原在NP上的呈递已被利用来改善亚基蛋白抗原的免疫原性(Jardine等，(2013)；Correira等，(2014))。特别地，Qβ纳米颗粒已被用作各种半抗原(包括烟酰胺/阿尔茨海默肽/血管紧张素)的支架(Lopez-Sagaseta等，(2015))。还已知Qβ纳米颗粒表现为短合成的癌症(Wu等，(2019))或细菌(Polonskaya等，(2017))碳水化合物抗原的支架。然而，中等长度碳水化合物(中等长度寡糖和长长度多糖本身在序列中暴露多个碳水化合物表位)的缀合对引发的免疫应答的开始的影响是不可预测的，并且从未被彻底研究过。

缀合

展示的分子可以通过任何合适的方式掺入或连接到本发明的NP上。

化学缀合：存在于NP亚基多肽上的官能团可用于展示分子的缀合。用于缀合的氨基酸侧链基团包括赖氨酸上的氨基、半胱氨酸上的硫醇、天冬氨酸和谷氨酸上的羧酸、酪氨酸上的羟基部分、精氨酸上的胍基部分、组氨酸上的咪唑部分和色氨酸上的吲哚基部分，其具有本领域已知的不同化学性质。同型或异双官能交联剂可用于缀合。赖氨酸残基的侧链氨基是亲核试剂，因此暴露在NP表面的赖氨酸残基具有大的溶剂可及性，并且可以用作与展示分子缀合的位点。

可以使用本领域已知的方法修饰亚基多肽序列内的一个或多个选择的氨基酸残基，以提供适合于在NP外表面处的化学缀合的位点，其中这样的修饰不破坏多肽活性。

本发明的一个实施方式是NP，其中一个或多个展示分子与存在于NP外表面的赖氨酸残基化学缀合。展示分子可以是细菌抗原，如细菌多肽、细菌多糖、细菌寡糖或细菌糖缀合物；例如GBS寡糖、GBS多糖、GBS聚糖或GBS糖缀合物，或其组合。

糖与单体载体蛋白的共价缀合增强了糖的免疫原性，因为将它们从T-非依赖性抗原转化为T-依赖性抗原，从而允许引发免疫记忆。缀合对于儿科疫苗特别有用(Ramsay等(2001))，并且是众所周知的技术(Lindberg(1999)；Buttery和Moxon(2000)；Ahmad和Chapnick(1999)；Goldblatt(1998)；欧洲专利0477508；美国专利No.5,306,492；WO 98/42721；Dick等，Conjugate Vaccines(1989)；Hermanson，(1996))。

细菌糖(如GBS糖)与单体载体蛋白的缀合已被广泛报道(Paoletti等(1990))。因此，如本文所用，术语“单体载体蛋白”或“载体蛋白”是指免疫原性蛋白，当与多糖(或寡糖)缀合并施用于动物时，其将增强动物中的免疫应答，特别是产生与缀合的多糖或寡糖特异性结合的抗体。用于产生细菌糖缀合物(如GBS糖缀合物)的典型现有技术方法通常涉及将纯化的糖还原胺化为单体载体蛋白，如破伤风类毒素(TT)或CRM197(Wessels等(1990))。还原胺化涉及单体载体中氨基酸侧链上的胺基和糖中的醛基。由于GBS荚膜糖在其天然形式中不包括醛基，则这通常在缀合前通过糖的唾液酸残基的一部分(例如5-40％之间)的氧化(例如高碘酸盐氧化)产生[Wessels等(1990)；美国专利No.4,356,170]。以这种方式制备的GBS糖缀合物疫苗已经显示出对于GBS血清型Ia、Ib、II、III和V中的每一种在人中是安全和免疫原性的(Paoletti&Kasper(2003)。可选的缀合方法涉及在糖中使用-NH₂基团(来自脱-N-乙酰化，或在引入胺后)，并结合双官能接头，如(WO2006/082530)所述的。另一种替代方法描述于WO96/40795和Michon等(2006)中。在这一方法中，来自通过脱-N-乙酰化/亚硝化的温和裂解的II型或III型荚膜糖的解聚的末端2,5-脱水-D-甘露糖残基的游离醛基团用于通过还原胺化的缀合。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物中的一种或多种缀合物已经以这种方式制备。

缀合方法可以依赖于用氰酸酯化学物质激活糖，如用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)，以形成氰酸酯。因此，激活的糖可以直接或通过间隔物(接头)基团与蛋白质纳米颗粒上的氨基偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖或寡糖，其可以通过与马来酰亚胺激活的蛋白质纳米颗粒(例如使用GMBS)或全乙酰化蛋白质纳米颗粒(例如使用碘乙酰亚胺或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯溴乙酸酯)反应后获得的硫醚键与蛋白质纳米颗粒偶联。任选地，氰酸酯(任选地通过CDAP化学制备)与己二胺或ADH偶联，并且使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学通过蛋白质纳米颗粒上的羧基将氨基衍生的糖与蛋白质纳米颗粒缀合。此类缀合方法描述于Uniformed Services University的PCT公开申请WO 93/15760以及WO 95/08348和WO 96/29094中。

其它合适的技术使用碳酰亚胺(carbiinide)、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于WO 98/42721中。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应来形成(Bethell等J.Biol.Chem.1979，254；2572-4，Hearn等J.Chromatogr.1981.218；509-18)，然后与蛋白质反应以形成氨基甲酸酯键。这可能涉及将异头末端还原为伯羟基，任选保护/脱保护伯羟基，伯羟基与CDI的反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体，和将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基偶联。

缀合(还原反应和任选的封端或猝灭反应)后，可以通过本领域技术人员已知的多种技术纯化糖缀合物(富集多糖-或寡糖-蛋白质缀合物的量)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤、超滤、沉淀/洗脱、柱色谱(离子交换色谱、多模离子交换色谱、DEAE或疏水相互作用色谱)和深度过滤。参见，例如，美国专利No.6,146,902。在一个实施方式中，通过渗滤或离子交换色谱或尺寸排阻色谱纯化糖缀合物。

缀合物也可以通过如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中所述的直接还原胺化方法制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。

另一种方法包括通过碳二亚胺缩合(Chu C.等，Infect.Immunity，1983 245256)，例如使用EDAC，将用己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰(或CDAP)激活的糖与蛋白质纳米颗粒偶联。

在一个实施方式中，糖上的羟基(任选激活的羟基，例如通过氰酸酯激活的羟基)直接或间接(通过接头)连接到蛋白质纳米颗粒上的氨基或羧基。在存在接头的情况中，糖上的羟基任选与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头(例如ADH)中的其它氨基可以与蛋白质纳米颗粒上的羧酸基团缀合，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方式中，细菌糖(如多糖或寡糖)首先与接头缀合，然后接头与蛋白质纳米颗粒缀合。或者，接头可以在与糖缀合之前与蛋白质纳米颗粒缀合。

通常，蛋白质纳米颗粒上的以下类型的化学基团可用于偶联/缀合：

-羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方式中，该基团与糖上的氨基直接连接，或用碳二亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的氨基连接。

-氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方式中，该基团与糖上的羧基直接连接或用碳二亚胺化学(例如用EDAC)与接头上的羧基连接。在另一个实施方式中，该基团与糖上用CDAP或CNBr激活的羟基直接连接或与接头上的此类基团连接；与具有醛基的糖或接头连接；与具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头连接。

-巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方式中，该基团通过马来酰亚胺化学与溴或氯乙酰化糖或接头连接。在一个实施方式中，该基团用双重氮联苯胺激活/修饰。

-羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方式中，该基团用双重氮联苯胺激活/修饰。

-咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方式中，该基团用双重氮联苯胺激活/修饰。

-胍基(例如经由精氨酸)。

-吲哚基(例如经由色氨酸)。

在糖上，通常以下基团可用于偶联：OH、COOH或NH2。醛基可以在本领域已知的不同处理后产生，如：高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等。

直接偶联方法包括但不限于：

-糖-OH+CNBr或CDAP----->氰酸酯+NH2-Prot----->缀合物

-糖-醛+NH2-Prot----->席夫碱+NaCNBH3----->缀合物

-糖-COOH+NH2-Prot+EDAC----->缀合物

-糖-NH2+COOH-Prot+EDAC----->缀合物

通过间隔物(接头)方法的间接偶联包括但不限于：

-糖-OH+CNBr或CDAP--->氰酸酯+NH2----NH2---->糖-NH2+COOH-Prot+EDAC--->缀合物

-糖-OH+CNBr或CDAP--->氰酸酯+NH2-----SH----->糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白质或例如通过SPDP修饰蛋白质的氨基后获得)----->糖-S-S-Prot

-糖-OH+CNBr或CDAP->氰酸酯+NH2----SH----->糖----SH+马来酰亚胺-Prot(氨基的修饰)---->缀合物

-糖-COOH+EDAC+NH2-----NH2--->糖-NH2+EDAC+COOH-Prot---->缀合物

-糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白质或通过例如SPDP修饰蛋白质的氨基后获得的)----->糖-S-S-Prot

-糖-COOH+EDAC+NH2----SH----->糖----SH+马来酰亚胺-Prot(氨基的修饰)---->缀合物

-糖-醛+NH2-----NH2---->糖---NH2+EDAC+COOH-Prot---->缀合物

抗原

本发明的一个实施方式是纳米颗粒，其在纳米颗粒的外表面上展示一种或多种细菌荚膜多糖或寡糖抗原，如GBS多糖或寡糖抗原，或GBS糖缀合物。

在本发明的一个实施方式中，在纳米颗粒外表面上展示的细菌荚膜多糖或寡糖抗原，如GBS多糖或寡糖抗原，不与载体蛋白(如TT、DT或CRM197)缀合。换句话说，细菌荚膜多糖或寡糖抗原，如GBS多糖或寡糖抗原，与构成NP的多肽缀合，但不与任何其他多肽缀合。

在本发明的一个实施方式中，NP上展示的抗原是GBS荚膜多糖或寡糖，或其免疫原性片段，或这些的组合。GBS荚膜多糖或寡糖可以选自任何血清型，包括Ia、Ib、II、III、IV和V。单个NP可以展示来自超过一种细菌血清型(如超过一种GBS血清型)的多糖或寡糖或其免疫原性片段。

在本发明的再一个实施方式中，NP上展示的抗原是来自选自以下的细菌种的多糖或寡糖抗原：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

产生NP的方法

本发明的再一个实施方式是一种产生NP的方法，所述NP包含在NP外表面上的细菌荚膜多糖或寡糖抗原，如GBS多聚或寡糖抗原。该方法包括以下步骤中的一个或多个：(a)在有利于多肽表达和NP自组装的条件下培养表达本发明的NP亚基多肽的重组宿主细胞；(b)视情况从宿主细胞或宿主细胞在其中生长的培养基收集或纯化组装的NP；(c)从细菌(如GBS细菌)提取和纯化天然多糖，(d)任选通过化学或酶促解聚或合成途径制备细菌寡糖，如GBS寡糖，和(e)将任选衍生的细菌多糖或寡糖抗原(如GBS多糖或寡糖抗原)缀合至NP的外部。

组合物

本发明的再一个实施方式是免疫原性组合物或药物组合物，如疫苗，其包含展示细菌多糖或寡糖抗原(如GBS寡糖或多糖抗原)的NP和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。在某些情况下，将免疫原性组合物施用于受试者以引发保护受试者免受病原体感染或减轻由病原体诱导的症状或病症的免疫应答。在本公开的上下文中，术语免疫原性组合物将被理解为涵盖旨在用于向受试者或受试者群体施用以引发对抗细菌病原体的保护性或姑息性免疫应答的组合物，所述细菌病原体如不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

“免疫原性组合物”是适于施用于人或非人哺乳动物受试者的物质的组合物，且其在以免疫有效量施用时引发特异性免疫应答，例如针对NP上展示的抗原的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可以包括一种或多种另外的组分，如赋形剂和/或佐剂。虽然在NP上展示的抗原的施用可以增强受试者对抗原的免疫应答(与不存在NP的情况下施用抗原相比)，但如本文所用的，纳米颗粒支架不被定义为佐剂。

许多药学上可接受的稀释剂和/或药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，并且描述于例如E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton，PA，第15版(1975)。形容词“药学上可接受的”表示稀释剂或赋形剂适于施用于受试者(例如，人或非人哺乳动物受试者)。通常，稀释剂和/或赋形剂的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为介质。在某些制剂(例如，固体组合物，如粉末形式)中，不使用液体稀释剂。在此类制剂中，可以使用无毒固体组分，包括例如药物级海藻糖、甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。合适的固体组分通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质(例如，纳米颗粒)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(如油滴或脂质体)和无活性病毒颗粒。

因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂以产生适于通过选择的施用途径递送给受试者的制剂。

本发明的免疫原性组合物可另外包括一种或多种佐剂。“佐剂”是以非特异性方式增强免疫应答产生的试剂。常见的佐剂包括矿物质(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬浮液；皂苷，如QS21；乳液，包括油包水和水包油(及其变体，包括双重乳液和可逆乳液)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸分子(如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll受体激动剂、Toll样受体激动剂(特别地，TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，以及这些组分的各种组合。出于本发明的目的，NP或VLP不被认为是佐剂。

在本发明的一个实施方式中，包含本发明的NP的免疫原性或药物组合物不进一步包含佐剂。

免疫原性组合物(如疫苗)的制备，包括施用于人受试者的那些，一般描述于Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach，Powell和Newman编辑，Plenum Press，1995。还参见New Trends andDevelopments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。

预防和治疗用途

细菌感染对公共健康有很大影响。例如，GBS是携带细菌的妇女所生婴儿的新生儿败血症和脑膜炎的主要原因。出生时，新生儿的免疫系统仍在发育，并且它们易受垂直获得的和出生后获得的GBS的感染。对女性受试者进行免疫以产生可以在妊娠期间通过胎盘被动转移至妊娠婴儿的抗体在本文中称为母体免疫、母体疫苗接种或母体施用的疫苗。参见，例如，Englund，2007。先前已经使用基于糖的疫苗(包括脑膜炎球菌疫苗)研究了母体免疫(参见，例如，Shahid等2002；Quimbao等2007；O'Dempsey等1996)。

在没有接受GBS疫苗的女性中，已经报道了分娩时天然存在的GBS血清型特异性IgG抗体水平与新生儿感染风险之间的反向关系。参见例如Lin等(2001)，Lin等(2004)，Baker等(2014)，Dangor等(2015)和Fabbrini等(2016)。Lin等(2001)报道了与IgG GBS Ia抗体水平≥5μg/mL的女性出生的新生儿相比发生类型特异性EOD的风险低88％(95％置信区间，7％-98％)。Baker等(2014)估算了如果母体CPS特异性抗体浓度等于或高于1μg/mL，则新生儿因血清型Ia、III和V而感染GBS EOD的绝对风险将降低70％。Fabbrini等(2016)报道了高于1μg/mL的母体抗荚膜IgG浓度在体外介导GBS杀伤，并且预测在欧洲GBS Ia和III早发性疾病的风险分别降低81％和78％。Dangor等(2015)报道了血清型Ia和III的母体抗体浓度分别≥6μg/mL和≥3μg/mL时，新生儿侵袭性GBS疾病的风险小于10％。然而，如Kobayashi等(2016)所述的，尚不清楚在观察研究中从天然免疫的评估可以推断出保护相关性的程度。

在一些抗GBS的母体免疫的先前研究中，在初免剂量后一个月(30天)施用加强剂量。参见Madhi等(2016)，Leroux-Roel等(2016)。WO2018/229708报道了初免和加强之间的延长时间段(超过30天)有益于引发可以转移至妊娠婴儿的GBS血清型特异性母体抗体，并且来自接种疫苗的女性的母体血清中的IgG滴度能预测针对GBS血清型的调理吞噬杀伤测定(OPKA)滴度，表明天然获得的和疫苗诱导的GBS抗体的功能活性相当。在Donders等(2016)报道的研究中，疫苗和安慰剂组中超过50％的女性(比利时和加拿大)的基线GBS抗体浓度低于Ia、Ib和III血清型的定量下限(LLOQ)。接种疫苗后，与基线时低于LLOQ的女性相比，基线时等于或高于LLOQ的女性的抗体GMC在统计学上更高。类似地，Heyderman(2016)报告了约69-80％的女性针对抗血清型Ia，1-6％的女性针对血清型Ib和34-43％的女性针对血清型III，在基线时不可检测的抗体浓度(<LLOQ)。疫苗接种后抗体GMC在基线抗体浓度>LLOQ的受试者中较高。

为了妊娠女性抗GBS和其它细菌病原体的有效接种，需要一种能够在基线时血清阴性的受试者中以单一剂量引发强烈抗体应答的疫苗。

本发明的再一个方面是在哺乳动物受试者(如人受试者)中诱导免疫应答的方法，其中所述免疫应答对本发明的NP的表面上展示的细菌抗原分子(如细菌多糖或寡糖抗原)具有特异性。该方法包括将免疫有效量的展示需要产生免疫应答的细菌抗原分子的NP施用于受试者。受试者在施用时可能具有细菌感染，或者可以向施用时不具有细菌感染的受试者预防性地给予施用。

在一个实施方式中，施用的NP展示至少一种细菌抗原分子，如选自至少一种致病菌种的细菌糖(例如多糖或寡糖)。在一些实施方式中，抗原分子是细菌糖，如多糖或寡糖。细菌糖可以是荚膜糖或O-抗原糖。细菌糖，如多糖或寡糖，可以选自以下细菌种：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

在一个实施方式中，所施用的NP展示来自至少两种(即，两种或更多种)致病细菌种或血清型的细菌糖抗原。这可以通过施用NP的混合物来实现，其中每种NP展示来自单一细菌种或血清型的细菌糖抗原，或通过施用展示来自多个(如2、3、4、5或更多个)的种或血清型的细菌糖的NP。

在一个实施方式中，施用的NP展示来自至少两种致病GBS血清型的GBS CPS抗原，如来自血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX中的任一种。这可以通过施用NP的混合物(其中每种NP展示单一GBS血清型抗原)或通过施用展示多种GBS血清型抗原的NP来实现。GBS抗原可以是荚膜多糖或其免疫原性片段、寡糖、GBS糖缀合物或其混合物。

本发明的再一个方面是一种诱导免疫应答以预防和/或治疗受试者的细菌感染的方法，包括将免疫有效量的本发明的NP施用于受试者，所述NP展示至少一种需要免疫应答的细菌抗原分子，其中所述至少一种抗原可诱导保护性或治疗性免疫应答。此类NP可以在如本文所述的免疫原性或药物组合物内。在具体实施方式中，施用是针对妊娠人受试者，或打算妊娠的受试者，并且该方法是通过母体抗体的经胎盘转移来预防受试者出生的婴儿中的细菌感染。在本发明的一个实施方式中，将单个剂量施用于受试者。剂量可以不含佐剂，或可以进一步包含佐剂。

本发明的再一个方面是一种诱导免疫应答以治疗和/或预防受试者的GBS感染的方法，其包括将免疫有效量的本发明的NP施用于受试者，所述NP展示需要免疫应答的GBS抗原分子，其中所述抗原可诱导保护性或治疗性免疫应答。此类NP可以在如本文所述的免疫原性或药物组合物内。在具体实施方式中，施用是针对妊娠人受试者，或打算妊娠的受试者，并且该方法是通过母体抗体的经胎盘转移来预防受试者出生的婴儿中的GBS感染。

在一个实施方式中，单个剂量的展示细菌抗原分子的NP能够诱导针对细菌感染的保护性或治疗性免疫应答。在本发明的另一个实施方式中，将单个剂量施用于受试者。在另一个实施方式中，以剂量之间至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年的间隔向受试者施用两个剂量。剂量可以不含佐剂，或可以进一步包含佐剂。

本发明的另一个实施方式是对人女性受试者免疫以降低受试者所生婴儿中B群链球菌(GBS)疾病的风险的方法，其中女性接受初免剂量和加强剂量的根据本发明的组合物，并且其中初免剂量和加强剂量各自在受试者中引发对相同致病B群链球菌血清型特异的IgG抗体。在一个实施方式中，在初免剂量后超过三十天施用加强剂量。在一个实施方式中，初免和/或加强剂量的GBS抗原组分包含来自至少两种致病GBS血清型(如选自血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX)的GBS CPS抗原。初免和/或加强剂量可以不含佐剂，或者任一或两者可以进一步包含佐剂。在本发明的一个实施方式中，将初免剂量施用于非妊娠女性受试者，并且将加强剂量施用于妊娠时的受试者。

因此，在一个实施方式中，本发明的NP和组合物用于对受试者免疫，以在受试者和(通过母体抗体的经胎盘转移)受试者出生的婴儿中实现保护性(预防性)免疫应答的方法中。

本发明的免疫原性组合物通常肠胃外施用，例如通过皮下、腹膜内、经皮或肌内注射。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。

本发明的再一个方面是在哺乳动物受试者(如人受试者)中诱导免疫应答的方法，其中所述免疫应答对本发明的NP表面上展示的细菌抗原分子是特异性的。所述方法包括将免疫有效量的展示需要免疫应答的细菌抗原分子的NP施用于需要免疫应答的受试者。受试者在施用时可能具有细菌感染，或者可以预防性地对在施用时不具有细菌感染的受试者给予施用。在一个实施方式中，施用的NP展示来自至少两种致病细菌血清型的细菌抗原。在另一个实施方式中，施用的NP展示来自至少两种致病细菌物的细菌抗原。这可以通过施用NP的混合物来实现，其中每个NP展示单一细菌血清型抗原或单一细菌种抗原，或通过施用展示多种细菌血清型抗原或多种细菌种抗原的NP。细菌抗原可以是细菌糖，例如多糖或寡糖。细菌糖可以是荚膜糖或O-抗原糖、其免疫原性片段、糖缀合物或前述中的两种或更多种的混合物。细菌抗原可以选自细菌种，所述细菌种选自：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

本发明的再一个方面是一种为了治疗和/或预防受试者的细菌感染的目的而诱导免疫应答的方法，其包括将免疫有效量的本发明的NP施用于受试者，所述NP展示需要免疫应答的细菌抗原分子，其中所述抗原可诱导保护性或治疗性免疫应答。此类NP可以在如本文所述的免疫原性或药物组合物内。在具体实施方式中，施用是针对妊娠的人受试者或打算妊娠的受试者，并且该方法是通过母体抗体的经胎盘转移来预防受试者所生婴儿的细菌感染。在本发明的一个实施方式中，将单个剂量施用于受试者。剂量可以不含佐剂，或者可以进一步包含佐剂。

本发明的另一个实施方式是使人受试者免疫的方法，其中受试者接受初免剂量和加强剂量的根据本发明的组合物，并且其中初免和加强剂量各自在受试者中引发对相同致病细菌血清型特异性的IgG抗体。在一个实施方式中，在初免剂量后超过三十天施用加强剂量。在一个实施方式中，初免和/或加强剂量的细菌抗原组分包含来自至少两种致病细菌血清型的细菌CPS抗原。初免和/或加强剂量可以不含佐剂，或者任一或两者可以进一步包含佐剂。

本发明的另一个实施方式是对人女性受试者免疫以降低受试者所生婴儿的细菌感染风险的方法，其中女性接受初免剂量和加强剂量的根据本发明的组合物，并且其中初免和加强剂量各自在受试者中引发对相同致病细菌血清型特异性的IgG抗体。在一个实施方式中，在初免剂量后超过三十天施用加强剂量。在一个实施方式中，初免和/或加强剂量的细菌抗原组分包含来自至少两种致病细菌血清型的细菌CPS抗原。初免和/或加强剂量可以不含佐剂，或者任一或两者可以进一步包含佐剂。在本发明的一个实施方式中，将初免剂量施用于非妊娠女性受试者，并且将加强剂量施用于妊娠时的该受试者。

在以上各个部分中提及的各种特征适当地适用于其他部分。因此，在一个部分中指定的特征可以适当地与其他部分中指定的特征组合。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方式(或本公开的方面)的许多等同物。本发明的实施方式包括：

C1.一种蛋白质纳米颗粒，其具有与其外表面缀合的抗原分子，其中抗原分子是细菌糖。

C2.C1的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖是多糖或寡糖。

C3.C1至C2任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖是荚膜糖或O-抗原糖。

C4.C1至C3任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖来自选自以下的细菌种：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

C5.C1至C4任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖来自选自无乳链球菌(B群链球菌或GBS)和肺炎链球菌的链球菌属的种。

C6.C1至C5任一项的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖来自选自血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX的GBS血清型。

C7.C1至C5任一项的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖来自选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、23F、33F的肺炎链球菌血清型。

C8.C1至C7任一项的蛋白质纳米颗粒，其中所述蛋白质纳米颗粒与来自至少两种细菌种或血清型的细菌糖缀合。

C9.C1至C8任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖不与单体载体蛋白缀合。

C10.C1至C9任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖与选自赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、酪氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸缀合。

C11.C1至C10任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖与蛋白质纳米颗粒直接缀合或通过间隔物(接头)基团缀合。

C12.C1至C11任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖通过选自以下的方法与蛋白质纳米颗粒缀合：(a)还原胺化；(b)碳二亚胺化学(例如EDAC或EDC)；(c)马来酰亚胺化学；和(d)氰基化化学(例如CDAP)。

C13.C1至C12任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖用肼接头修饰，例如己二酸二酰肼(ADH)。

C14.C1至C13任一项的蛋白质纳米颗粒，其中细菌糖包含活性酯间隔物，例如SIDEA。

C15.C1至C14任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒是非病毒蛋白质纳米颗粒或病毒样颗粒(VLP)。

C16.C1至C15任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒是选自GBS铁蛋白纳米颗粒或mI3纳米颗粒的非病毒蛋白质纳米颗粒。

C17.C1至C15任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒是噬菌体VLP。

C18.C1至C15任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒是QβVLP。

C19.C1至C18任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的亚基多肽，其中亚基蛋白能够自组装以形成纳米颗粒。

C20.C1至C19任一项的蛋白质纳米颗粒，其中蛋白质纳米颗粒选自：(a)具有与其外表面缀合的GBS糖的QβVLP；(b)具有缀合至其外表面的肺炎链球菌糖的QβVLP；(c)具有缀合至其外表面的GBS糖的GBS铁蛋白纳米颗粒；(d)具有缀合至其外表面的肺炎链球菌糖的GBS铁蛋白纳米颗粒；(e)具有缀合至其外表面的GBS糖的mI3纳米颗粒；(f)具有缀合至其外表面的肺炎链球菌糖的mI3纳米颗粒。

C21.C1至C20任一项的蛋白质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒能够在单个剂量后在受试者中引发保护性免疫应答。

C22.C1至C21任一项的蛋白质纳米颗粒，其中与一个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白质载体(如CRM197)后相比，所述纳米颗粒能够在一个剂量后引发更高的针对该细菌糖的免疫应答。

C23.C1至C22任一项的蛋白质纳米颗粒，其中与两个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白质载体(如CRM197)后相比，所述纳米颗粒能够在一个剂量后引发更高或相当的针对细菌糖的免疫应答。

C24.一种免疫原性组合物，其包含至少一种根据C1-C23任一项的蛋白质纳米颗粒。

C25.C24的免疫原性组合物，其中所述组合物包含至少两种纳米颗粒，其中每种纳米颗粒与不同的细菌糖缀合。

C26.C24或C25的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

C27.根据C24至C26任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自明矾、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、油包水乳液、水包油乳液、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸分子、脂质体和Toll受体或Toll样受体激动剂。

C28.C24或C25的免疫原性组合物，其不进一步包含佐剂。

C29.C24至C28任一项的免疫原性组合物，其不包含CRM197、白喉类毒素(DT)或破伤风类毒素(TT)。

C30.一种产生C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒的方法，包括以下步骤中的一个或多个：(a)在有利于多肽表达和NP自组装的条件下培养表达本发明的NP亚基多肽的重组宿主细胞；(b)从宿主细胞或宿主细胞在其中生长的培养基收集或纯化组装的NP，视情况而定；(c)从细菌提取和纯化天然多糖，(d)任选地制备细菌寡糖，和(e)将细菌多糖或寡糖抗原缀合至NP的外部。

C31.C30的方法，还包括在步骤(e)前使细菌多糖或寡糖衍生化的步骤。

C32.C30或C31的方法，其中步骤(e)包括将细菌糖与选自赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、酪氨酸残基、精氨酸残基、组氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸缀合。

C33.根据C30至C32任一项的方法，其中步骤(e)包括将细菌糖与蛋白质纳米颗粒直接缀合或通过间隔物(接头)基团缀合。

C34.根据C30至C33任一项的方法，其中步骤(e)包括通过选自以下的方法将细菌糖类与蛋白质纳米颗粒缀合：(a)还原胺化；(b)碳二亚胺化学(例如EDAC或EDC)；(c)马来酰亚胺化学；和(d)氰基化化学(例如CDAP)。

C35.根据C30至C34任一项的方法，其中细菌糖用肼接头修饰，例如己二酸二酰肼(ADH)。

C36.根据C30至C35任一项的方法，其中细菌糖包含活性酯间隔基，例如SIDEA。

C37.根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗人受试者中的细菌感染。

耶尔森氏菌C38.根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物在制备用于诱导人受试者的免疫应答的药物中的用途。

C39.根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物在预防或治疗人受试者的疾病中的用途。

C40.根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物在预防或治疗人受试者的细菌感染中的用途。

C41.根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物用于诱导受试者的免疫应答的用途。

C42.一种诱导人受试者的免疫应答的方法，包括将免疫有效量的根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物施用于受试者。

C43.一种预防或治疗人受试者的细菌感染的方法，包括将免疫有效量的根据C1至C23任一项的蛋白质纳米颗粒或根据C24至C29任一项的免疫原性组合物施用于受试者。

C44.根据C38至C41任一项的用途或根据C42或C43的方法，其中所述受试者接受所述蛋白质纳米颗粒或所述免疫原性组合物的单次施用。

C45.根据C38至C41任一项的用途或根据C42或C43的方法，其中所述受试者接受肌内施用。

C46.根据C38至C41任一项的用途或根据C42或C43的方法，其中与一个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白载体(例如CRM197)后相比，所述蛋白质纳米颗粒能够在一个剂量后引发更高的针对细菌糖的免疫应答。

C47.根据C38至C41或C44至C46任一项的用途，或根据C42或C43或C44至C46的方法，其中与两个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白质载体(如CRM197)后相比，所述蛋白质纳米颗粒在一个剂量后能够引发更高或相当的针对细菌糖的免疫应答。

术语

为了便于审查本公开的各种实施方案，提供了以下对这些术语的说明。在本公开的上下文中提供了另外的术语和解释。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，Oxford University Press出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd。出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

如本文所用，“纳米颗粒(NP)”是指尺寸小于约100nm的颗粒(对于球形或大致球形的颗粒，最大直径小于约100nm)。

“病毒样颗粒(VLP)”是模拟真正天然病毒的组织和构象但缺乏病毒基因组的多蛋白结构。出于本公开的目的，VLP被认为是NP。根据本发明的病毒样颗粒的典型实施方式是病毒或噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚基组成的大分子组装体，如60、120、180、240、300、360或超过360个病毒蛋白亚基。

如本文所用，“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的衣壳蛋白、其突变体或片段的病毒样颗粒，或优选基本上由RNA噬菌体的衣壳蛋白、其突变体或片段组成的病毒样颗粒组成，或由RNA噬菌体的衣壳蛋白、其突变体或片段组成的病毒样颗粒组成。

本文所用的术语“重组VLP”是指通过包括至少一个重组DNA技术的步骤的方法获得的VLP。

病毒“外壳(coat)蛋白”和“衣壳(capsid)蛋白”。术语病毒“外壳(coat)蛋白”在本文中可与病毒的“衣壳(capsid)蛋白”互换使用，并且是指能够并入到病毒衣壳或VLP中的蛋白质，如病毒的天然衣壳的亚基。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物称为“QβCP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”和“衣壳蛋白”包含QβCP以及A1蛋白。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。蛋白质或多肽序列是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的连续序列。本发明的蛋白质和多肽可包含L-氨基酸、D-氨基酸或其组合。

关于多肽(或多糖或寡糖)抗原的术语“片段”是指该多肽(或多糖)的连续部分(即子序列)。多肽、多糖或寡糖的“免疫原性片段”是指保留至少一个免疫原性表位(例如，主要免疫原性表位或中和表位)的片段。

如本文所用，纳米颗粒的“多肽亚基”或“亚基”是指与其它多肽亚基组合而自组装成纳米颗粒的多肽。亚基还可以包含从纳米颗粒表面延伸(即，由纳米颗粒“展示”)的多肽序列、纯化标签或本领域已知的并且不干扰自组装成纳米颗粒的能力的其他修饰。

如本文所用，“变体”多肽是指具有与参考序列相似但不相同的氨基酸序列的多肽，其中变体蛋白质的生物活性没有显著改变。序列中的此类变异可以是天然存在的变异，或者它们可以通过使用本领域技术人员已知的基因工程技术来工程化。此类技术的实例可见于例如Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，pp.9.31-9.57)或Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。

如本文所用，“融合多肽”或“嵌合多肽”是包含来自至少两个不相关蛋白的氨基酸序列的多肽，其通过肽键连接在一起以形成单个多肽。不相关的氨基酸序列可以彼此直接接合，或者它们可以使用接头序列接合。如本文所用，如果多肽的氨基酸序列通常在其天然环境中(例如，在细胞内)未被发现通过肽键连接在一起，则多肽是不相关的。例如，构成GBS铁蛋白的单体亚基的氨基酸序列和GBS表面蛋白的氨基酸序列被认为是不相关的。

如本文所用，“抗原”是通过在哺乳动物中产生抗体和/或T细胞反应来刺激免疫应答的分子(如蛋白质或糖)、化合物、组合物或物质，包括注射、吸收或以其它方式引入哺乳动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“表位”或“抗原决定簇”是指B和/或T细胞响应的抗原上的位点。“主要抗原表位”是对其产生功能上显著的宿主免疫反应(例如抗体反应或T细胞反应)的那些表位。因此，关于针对病原体的保护性免疫应答，主要抗原表位是被宿主免疫系统识别时导致保护免受由病原体引起的疾病的那些抗原部分。术语“T细胞表位”是指与适当的MHC分子结合时被T细胞特异性结合(通过T细胞受体)的表位。“B细胞表位”是被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。

如本文所用，术语“免疫原性”是指特定抗原或其特定区域在施用于哺乳动物受试者时引发针对该抗原或其区域的免疫应答的能力。免疫应答可以是体液的(由抗体介导)或细胞的(由免疫系统的细胞介导)，或其组合。

“免疫应答”是免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的反应。免疫应答可以是B细胞反答，其导致产生特异性抗体，如抗原特异性中和抗体。免疫应答也可以是T细胞反应，如CD4+反应或CD8+反应。在一些情况下，反应对特定抗原(如GBS抗原)是特异性的(即，“抗原特异性应答”)。“保护性免疫应答”是抑制病原体的有害功能或活性、防止个体中由病原体引起的感染，或减少由病原体感染引起的症状的免疫应答。保护性免疫应答可以例如通过测量对体内病原体攻击的抗性来测量。

“更高”的免疫应答意指高于参考处理的免疫应答的免疫应答。例如，通过众所周知的方法(如Mann-Whitney检验)计算时，如果IgG滴度在0.05或更低的p值(例如，p≤0.05、p≤0.01、p≤0.005或p≤0.001)下统计学上更高，则认为由本文所述的蛋白质纳米颗粒诱导的IgG滴度(例如，如通过Luminex/ELISA测量的)高于参考处理的IgG滴度。在与参考处理相比存在至少3倍的增加的情况中，在合并血清中测量的由本文所述的纳米颗粒引发的OPKA滴度被认为高于参考处理。

“相当的”免疫应答意指不满足较高(或较低)免疫应答的阈值的免疫应答。例如，治疗组之间相当的IgG滴度将是在p值为0.05或更低(例如，p<0.05，p<0.01，p<0.005，或p<0.001)时在统计学上不高于或低于参考治疗的免疫应答的那些。如果处理组之间的差异小于3倍，则认为治疗组之间的OPKA滴度相当。

“有效量”是指足以引起所述效果或结果的量。“有效量”可以凭经验确定，和使用与所述目的相关的已知技术以常规方式确定。“免疫有效量”是足以在受试者中引发免疫应答的免疫原性组合物的量(以单个剂量或系列)。通常，期望的结果是产生能够保护或有助于保护受试者对抗病原体的抗原(例如病原体)特异性免疫应答。获得对抗病原体的保护性免疫应答可能需要多次施用免疫原性组合物；优选地，需要单次施用。

如本文所用，“糖缀合物”是共价连接作为不同化学种类(例如蛋白质、肽、脂质或脂质)的部分的碳水化合物部分(例如多糖或寡糖)。如本文所用，“GBS糖缀合物”是指GBS荚膜糖分子和单体载体蛋白分子的缀合物，所述单体载体蛋白分子包括载体蛋白TT、DT和CRM197，但不包括与NP(包括非病毒NP或VLP)的多肽亚基缀合的GBS荚膜糖分子。

如本文所用，在核酸序列可操作地连接自然界中不与其缔合的另一多核苷酸分子的情况下，这两个序列可以被称为彼此“异源的”。类似地，多肽共价连接(包括通过接头或间插序列)在自然界中不与其缔合的另一种蛋白质或与其复合时，所述多肽可以被称为彼此“异源的”。与GBS“异源”的多肽(或核酸)序列是指在天然存在的GBS细胞中未发现的多肽(或核酸)序列。此外，当宿主细胞包含其不天然包含的核酸分子或多肽时，该核酸分子和多肽可以被称为与宿主细胞是“异源的”。出于本发明的目的，在来自相同宿主生物体(如GBS)的两种多肽的融合蛋白中，其中多肽彼此不天然共价结合，这两种多肽被认为彼此是异源的。因此，例如，包含附着于GBS铁蛋白纳米颗粒亚基的GBS表面蛋白抗原的蛋白质将被认为是两个异源多肽序列的融合蛋白。

“可操作地连接”是指例如在用于蛋白质表达的重组多核苷酸序列的构造中可操作地连接。在某些实施方式中，“可操作地连接”是指核酸组分的本领域公认的定位，使得实现预期的功能(例如，表达)。本领域普通技术人员将认识到，在某些情况下，“可操作地连接”在一起的两个或更多个组分在核酸或氨基酸序列中不一定彼此相邻。与控制序列(例如，启动子、增强子或IRES)“可操作地连接”的编码序列以使得编码序列的表达在控制序列的影响或控制下的方式连接，但这种连接不限于相邻连接。

“相邻”是指“紧挨着”或“并排”。“紧邻”意指在其间没有材料结构的相邻(例如，在氨基酸序列的上下文中，彼此“紧邻”的两个残基意指在两个残基之间存在足以形成多肽序列所必需的键的原子，但不存在第三氨基酸残基)。

“c-末端地”或“c-末端的”是指朝向c-末端。因此，“c-末端相邻”是指“紧邻”并且在c-末端侧(即，如果从左向右读取，则在右侧)。

“n-末端地”或“n-末端的”是指朝向n-末端。因此，“n-末端相邻”是指“紧邻”并且在n-末端侧(即，如果从左向右读取，则在左侧)。

如本文所用，提及蛋白质纳米颗粒时，“mer”例如指构成NP的亚基多肽的数目。亚基多肽不必是相同的。因此，60-mer NP由60个连接的多肽亚基组成。

如本文所用，“重组”或“工程化”细胞是指其中已引入外源DNA序列(如cDNA序列)的细胞。“宿主细胞”是含有这种外源DNA序列的细胞。如本文所用，描述多核苷酸的“重组”意指根据其来源或操作，这样的多核苷酸：(1)不与其天然相关的多核苷酸的全部或一部分结合；和/或(2)与其天然连接的多核苷酸以外的多核苷酸连接。关于蛋白质或多肽使用的术语“重组”意指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。

“受试者”是活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开的上下文中，受试者可以是实验对象，如非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠或非人灵长类动物。或者，受试者可以是人受试者。

除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。另外，关于物质(如抗原)的浓度或水平给出的数值限制旨在是近似的。因此，在表示浓度为至少(例如)200pg的情况中，旨在将浓度理解为至少大约(或“约”或“～”)200pg。

术语“包含(comprises)”意指“包括(includes)”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和变体，如“包含(comprise)”和“含有(comprising)”将被理解为暗示包括所述化合物或组合物(例如，核酸、多肽、抗原)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其他化合物、组合物、步骤，或其组。缩写“比如(e.g.)”在本文用于表示非限制性实例并且与术语“例如(for example)”同义。

还应当理解，对于核酸分子或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且提供用于描述。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。另外，关于物质(如抗原)的浓度或水平给出的数值限制旨在是近似的。因此，在浓度表示未至少(例如)200pg时，旨在将浓度理解为至少大约(或“约”或“～”)200pg。

在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括以下实施方式中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非特别说明，否则包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，组分可以以任何顺序混合。在存在三种组分的情况下，则可以将两种组分彼此组合，然后可以将该组合与第三种组分组合等。类似地，尽管方法的步骤可以编号(如(1)、(2)、(3)等，或(i)、(ii)、(iii))，步骤的编号并不意味着步骤必须以该顺序执行(即，步骤1然后步骤2然后步骤3等)。词语“随后”可以用于指定方法步骤的顺序。

本发明不限于本文所述的特定实施方式。应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施方式的所有组合具体地涵盖在本发明中，并且在本文中公开，如同每个组合单独地和明确地公开一样。此外，所有子组合也被本发明具体涵盖并且在本文中公开，如同每个这样的子组合在本文中单独地和明确地公开一样。

尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但下文描述了合适的方法和材料。

本文引用的公开的参考文献、专利和公开的专利申请的全部公开内容通过引用整体并入本文。

实施例

实施例1：NP的产生

比较了三种不同的纳米颗粒支架：1)GBS铁蛋白NP，其由24个单体形成，并且具有12-14nm的直径；2)mI3 NP，其由60个拷贝的工程化来自超嗜热细菌海栖热袍菌的2-酮-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸(KDPG)醛缩酶获得的三聚体结构块i301形成，并且具有25nm的直径(Hsia等人，(2016))；和3)QβNP，其具有基本上直径为约35nm的二十面体噬菌体样衣壳结构，并且由通过二硫键以共价五聚体和六聚体连接的180个拷贝的衣壳蛋白组成(Golmohammadi等，(1996))。

使用SEQ ID NO:1的多肽(PDB 5KIP)，通过在大肠杆菌细胞中表达产生QβNP：

MAKLETVTLG NIGKDGKQTL VLNPRGVNPT NGVASLSQAG AVPALEKRVT VSVSQPSRNR-60

KNYKVQVKIQ NPTACTANGS CDPSVTRQAY ADVTFSFTQY STDEERAFVR TELAALLASP-120

LLIDAIDQLN PAY-133

对编码SEQ ID NO:1的DNA序列进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并克隆到pET21a载体中。使转化的大肠杆菌(Stellar^TM，Takara Bio)宿主细胞生长，并提取质粒DNA和测序以确认序列同一性。将质粒转化到另外的大肠杆菌菌株BL21DE3tlr和ClearColi^TM(Lucigen)中，并培养细胞。材料使用用于离子交换色谱的CAPTO Q柱及用NaCl盐梯度纯化(从0至1M NaCl)进行纯化。合并含有Qβ多肽的级分和浓缩6次，并使用尺寸排阻色谱纯化进一步纯化。将级分在SDS page上运行，并收集含有Qβ多肽的那些级分。

使用SEQ ID NO:2的多肽产生MI3纳米颗粒(参见，例如，Bruun等，ACS Nano 12(9)：8855-8866(2018))：

MKMEELFKKH KIVAVLRANS VEEAKKKALA VFLGGVHLIE ITFTVPDADT VIKELSFLKE–60

MGAIIGAGTV TSVEQARKAV ESGAEFIVSP HLDEEISQFA KEKGVFYMPG VMTPTELVKA-120

MKLGHTILKL FPGEVVGPQF VKAMKGPFPN VKFVPTGGVN LDNVCEWFKA GVLAVGVGSA-180

LVKGTPVEVA EKAKAFVEKI RGCTE–205

将mI3多肽在其C-末端与肽接头(GSGSGSGSGS-SEQ ID NO:9)融合，随后是组氨酸标签，以产生SEQ ID NO:11的mI3多肽序列：MKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKKKALAVFLGGVHLIEITFTVPDADTVIKELSFLKEMGAIIGAGTVTSVEQARKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFAKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPVEVAEKAKAFVEKIRGCTEGSGSGSGSGSHHHHHH

对编码SEQ ID NO:11的DNA序列进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达，并克隆到pET 21a载体中。使转化的大肠杆菌(Stellar^TM，Takara Bio)宿主细胞生长，并提取质粒DNA和测序以确认序列同一性。将含有mI3-His的质粒进一步转化到大肠杆菌菌株BE21DE3tlr中并培养。用亲和色谱纯化表达的多肽，合并含有mI3的级分并通过尺寸排阻色谱纯化。

使用SEQ ID NO:5的多肽产生GBS铁蛋白NP，其含有来自DK-PW-092株的GBS铁蛋白(SEQ ID NO:5的氨基酸1-155)，随后是肽接头GSSGH(SEQ ID NO:10)和C-末端6×组氨酸标签，以产生SEQ ID NO:5的GBS铁蛋白NP序列：

MKFEKTKEIL NQLVADLSQF SVVIHQTHWY MRGPEFLTLH PQMDEYMDQI NEQLDVVSER–60

LITLDGSPFS TLREFAENTK IEDEIGNWDR TIPERMEKLV AGYRYLADLY AKGIEVSGEE-120

GDDSTQDIFI ANKTDIEKNI WMLQAKLGKA PGIDAGSSGH HHHHH–165

实施例2：GBS荚膜寡糖的产生以及与NP的缀合

GBS CPS血清型II寡糖(OS，分子量～10kDa)通过三步脱-N-乙酰化/亚硝化/再-N-乙酰化程序(Michon等(2006))解聚获得。

基于先前描述的程序(Wessels等(1990))纯化天然血清型II PS，然后如下进行部分N-脱酰基化。将多糖溶于0.5M NaOH中，在70℃下加热2-4h，然后在冰水浴中冷却。将冰醋酸添加到样品中以使pH达到4.5。通过加入5％(wt/vol)NaNO₂使部分N-脱酰基化的产物脱氨基并在4℃下搅拌2h。将该物质通过G25柱纯化，用水洗脱。

为了重构唾液酸残基的完全N-乙酰化，加入4.15μl/毫升乙酸酐在乙醇中的1:1稀释溶液，并将反应在室温下温育2h。将该物质通过G25柱纯化，用水洗脱。图1描绘了解聚过程，包括所获得的寡糖的结构。

使用FPLC系统通过阴离子交换色谱分离寡糖片段。以线性梯度增加洗脱缓冲液的NaCl百分比，可能分离平均长度为6-14个重复单元的寡糖。

用普鲁兰糖标准曲线，通过¹H NMR分析和SE-HPLC来测定寡糖的长度。通过HPAEC-PAD或比色测定(基于NeuNac)来定量总糖。

GBS血清型II短寡糖通过还原胺化用肼接头(ADH)修饰，然后加入活性酯间隔物(SIDEA)，如图2所示。然后将这些修饰的寡糖与NP缀合，如通过将衍生化的寡糖和高度浓缩的纳米颗粒(20-40mg/ml)以15:1或30:1(mol/mol)在室温下，在NaPi 10mM pH 7.2中温育大约16小时。通过连续离心过滤(100kDa)纯化与糖缀合的最终NP。

实施例3：GBS荚膜多糖与NP的缀合

产生GBS CPS血清型II的多糖(分子量～400kDa)。使用5％NaIO₄进行GBS血清型II荚膜多糖的氧化，如图4所示。使用脱盐柱纯化氧化的多糖。通过¹H NMR评估所得多糖的身份和结构符合性。使用HPAEC-PAD或比色测定(基于NeuNac)定量总糖。

然后通过在NaBH₃CN存在下还原胺化，使用糖和NP之间2:1至6:1的w/w比率将氧化的多糖与NP(5-10mg/ml)在37℃下缀合72小时，如图5所示。通过硫酸铵沉淀然后系列离心过滤(100kDa)来纯化与糖缀合的最终NP。

实施例4：GBS糖NP缀合物表征

HPAEC-PAD和BCA分别用于估计与GBS糖缀合的纯化NP的糖(总的和游离的)和蛋白质的相应含量，如以下表1所报告的。

表1

使用如下的缀合反应条件产生了OSII-铁蛋白NP缀合物(平均MW 8kDa)：OS:NP(mol/mol)30:1，NP 37mg/ml，室温，大约16小时。图6显示了GBS OSII-铁蛋白NP缀合物和GBS铁蛋白NP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用如下的缀合反应条件产生了PSII-铁蛋白NP缀合物：PS:NP(w/w)6:1，NP 6mg/ml，温度37℃，大约72小时。图7显示了GBS PSII-铁蛋白NP缀合物和GBS铁蛋白NP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用如下的缀合反应条件产生了OSII-mI3 NP缀合物(平均MW14kDa)：OS:NP(mol/mol)15:1，NP 23mg/ml，室温，大约16小时。图8显示了GBS OSII-mI3 NP缀合物和mI3 NP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用如下的缀合反应条件产生了PSII-mI3 NP缀合物：PS:NP(w/w)2:1，NP 6mg/ml，温度37℃，大约72小时。图9显示了GBS PSII-mI3 NP缀合物和mI3 NP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用如下的缀合反应条件产生了OSIT-QβNP缀合物(平均MW8kDa)：OS:NP(mol/mol)30:1，NP 23mg/ml，室温，大约16小时。图10显示了GBS OSII-QβNP缀合物和QβNP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用如下的缀合反应条件产生了PSII-QβNP缀合物：PS:NP(w/w)4:1，NP 6mg/ml，温度37℃，大约72小时。图11显示了GBS PSII-QβNP缀合物和QβNP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

通过SDS-PAGE和SE-HPLC对NP缀合物的纯度进行表征，通过SE-HPLC对其大小/结构进行表征，并通过使用11D3D2 PSII特异性鼠单克隆抗体的Western印迹实验对其身份进行表征。使用具有荧光检测(227nm激发和335nm发射)的Waters的偶联TSK4000PW+TSK6000PW柱进行SE-HPLC。运行条件为流速0.5mg/mL，运行时间70分钟，100mM NaPi，100mMNa2SO4，pH 7.2作为运行缓冲液，注射体积20μL。所有样品以基于0.3mg/mL蛋白质的蛋白质浓度注射。

图12A显示了SDS-PAGE(MOPS中4-12％)的结果，其中泳道1是GBS铁蛋白NP，泳道2是OSII-GBS铁蛋白NP，泳道3是PSII-GBS铁蛋白NP，泳道4是mI3 NP，泳道5是OSII-mI3 NP，泳道6是PSII-mI3 NP，泳道7是Qβ纳米颗粒，泳道8是OSII QβNP，和泳道9是PSII-QβNP。

还通过透射电子显微镜(TEM)分析，使用负染色(NS)和免疫金染色表征了与GBS糖缀合的NP。对于通过负染色的分析，将与GBS寡糖和多糖缀合的NP加载到通过辉光放电(Quorum Q150)赋予亲水性的碳/formvar(Agar Scientific)的铜300平方网眼网格上。使用Whatman滤纸No.1吸去过量的溶液，然后用NanoW将网格负染色。使用配备有CCD 2kx2k相机的Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜以87000x放大倍数获得显微照片。

对于通过免疫金染色的分析，将终浓度为20ng/μL的纯化的纳米颗粒缀合物吸附到300目镍网格(Agar Scientific)上，在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭，并与11D3D2PSII特异性鼠单克隆抗体(在含有0.5％BSA的PBS中1:1000或1:2000稀释)一起孵育1小时。将网格洗涤数次并与10-nM金标记的抗小鼠二抗(在含有0.5％BSA的PBS中1:40稀释)一起孵育1小时。用蒸馏水洗涤几次后，将网格用NanoW负染色，并使用TEM FEITecnai G2 Spirit显微镜观察，该显微镜在100kV下操作并配备有2Kx2K CCDEmsis Veleta相机(Emsis，德国)。使用iTem(OSIS，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan)软件获取和处理图像。

与GBS OSII缀合的铁蛋白NP的负染色TEM图像显示了典型的八面体对称性，直径约12nm。与GBS OSII缀合的铁蛋白NP的免疫金染色TEM图像显示了由鼠Mab11D3D2轻微标记的纳米颗粒。

与GBS PSII缀合的铁蛋白NP的负染色TEM图像显示了典型的八面体对称性，直径约12nm。与GBS PSII缀合的铁蛋白NP的免疫金染色TEM图像显示了由鼠Mab11D3D2重度标记的纳米颗粒。观察到在NP上存在细长的PSII金标记的附属物。

与GBS OSII缀合的mI3纳米颗粒的负染色TEM图像显示了典型的十二面体对称性，直径约18nm。通过以1:1000和1:2000稀释的金标记的结合鼠Mab11D3D2一抗的二抗标记时，免疫金染色TEM图像显示了十二面体MI3纳米颗粒的表面上的GBS OSII。

与GBS PSII缀合的mI3纳米颗粒的负染色TEM图像显示了典型的十二面体对称性，直径约18nm，在背景中可见对应于GBS PSII的一些薄的脱离的附属物。获得了与GBS PSII缀合的MI3纳米颗粒的免疫金染色TEM图像。

与GBS OSII缀合的Qβ纳米颗粒的负染色TEM图像显示了典型的二十面体对称性，直径约33nm。免疫金染色TEM图像显示了二十面体Qβ纳米颗粒表面上的GBS OSII被10nM金标记的结合鼠Mab11D3D2一抗的二抗标记。

与GBS PSII缀合的Qβ纳米颗粒的负染色TEM图像显示了典型的二十面体对称性，直径约33nm，具有对应于附着于Qβ表面的PSII的薄的细长附属物(长度达20nm)。在背景中可见一些脱离的附属物。免疫金染色TEM图像显示了由10nm金标记的结合鼠Mab11D3D2一抗的二抗标记的二十面体Qβ纳米颗粒表面上的GBS PSII。

因此，通过负染色透射电子显微镜(NS-TEM)可视化的GBS铁蛋白、mI3和Qβ纳米颗粒显示为高度对称的结构。八面体铁蛋白、十二面体MI3和二十面体Qβ的负染色电子显微镜显示了与其未缀合的对应物相比，所有缀合的纳米颗粒的直径增加。OSII缀合的纳米颗粒显示出薄且短的附属物，平均长度为8-15nm，大致对应于约6至10个GBS II型重复单元。OSII似乎分布在支架上，遵循不同的NP对称性。在PSII缀合的纳米颗粒中，可以发现PSII脱离并存在于背景中，或者作为平均长度为400nm的薄且长的附属物装饰纳米颗粒，对应于由约300个重复单元组成的GBS II型多糖。PSII在NP上的分布类似于对OSII观察到的。

实施例5：体内免疫

使用不同形式的GBS血清型II抗原进行体内小鼠免疫研究(研究1)，所述抗原与CRM 197载体蛋白缀合，或与两种不同的纳米颗粒之一mI3或Qβ缀合。免疫和抽血根据表2中列出的时间表进行。

表2

天	行动
		0	抽血1(免疫前)
1	免疫1
		21	抽血2(第一次免疫后)
22	免疫2
		36	最后一次抽血(第二次免疫后)

在研究1中，研究了12组，每组10只雌性小鼠(CD1品系，CharlesRiver)。每只小鼠用如表3中所示的制剂腹膜内免疫两次。在第1天和第22天进行免疫。在第0天(免疫前)、第21天和第36天从每只小鼠抽取血液，如表2中所述。

表4显示了研究1中通过Luminex测量的血清中的几何平均IgG滴度，以及用来自每组的合并血清获得的调理吞噬杀伤滴度。

表3

表4-研究1IgG滴度(合并的血清)

Luminex定量下限(LLOQ)＝20.4相对Luminex单位/ml；<LLOQ＝10.2

血清中的血清抗体滴度使用与生物素化的II型天然多糖偶联的链霉亲和素衍生的磁性微球(Radix Biosolutions，USA)(Buffi等，(2019))通过Luminex测定来分析。在RT下平衡后，将125万个微球转移到LoBind管(Eppendorf)中并在黑暗中置于磁性分离器中2min。用含有0.05％TWEEN^TM 20(Calbiochem)的PBS洗涤微球，并将生物素-PSII在PBS、0.05％TWEEN^TM 20、0.5％BSA(Sigma-Aldrich)中以1μg/ml的终浓度加入微球中。将生物素-PSII-微球在室温(RT)下在黑暗中孵育60分钟，并用PBS、0.05％TWEEN^TM 20洗涤两次。将偶联的微球悬浮于500μl PBS、0.05％TWEEN^TM 20、0.5％BSA中，并在4℃下储存。

在PBS，pH 7.2，0.05％TWEEN^TM 20，0.5％BSA中制备8个3倍系列稀释的标准超免疫血清或测试样品。每个血清稀释液(50ml)与等体积的缀合微球(3,000个微球/区域/孔)在96孔Greiner板(Millipore Corporation)中混合，并在RT下在黑暗中孵育60min。孵育后，将微球用200μl PBS洗涤三次。每个孔加载50μl在PBS，pH7.2，0.05％TWEEN^TM 20，0.5％BSA中的2.5μg/ml抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch)，并在连续振荡下孵育60min。洗涤后，将微球悬浮在100μL PBS中并振摇，然后用Luminex 200仪器分析。通过BioplexManager TM软件(BioRad)实时获取数据。

如前所述(Chatzikleanthous(2020))，通过调理吞噬杀伤试验(OPKA)测定血清的功能活性。将HL60细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中生长，在37℃，5％CO2下孵育。用0.78％二甲基甲酰胺(DMF)将HL-60细胞分化为嗜中性粒细胞，并在4-5天后用作吞噬细胞的来源。在96孔微量滴定板中以125μL/孔的总体积进行测定。每个反应含有热灭活的测试血清(12.5μL)、GBS II株5401(6×10⁴个菌落形成单位[CFU])、分化的HL-60细胞(2×10⁶个细胞)和在Hank's平衡盐溶液红(Gibco)中的10％幼兔补体(Cederlane)。对于每个血清样品，测试六个连续稀释液。阴性对照缺乏效应细胞，或含有阴性血清或热灭活的补体。在反应组装后，将平板在37℃下振荡孵育1小时。在温育之前(T0)和之后(T60)，将混合物在无菌水中稀释，并涂布于含有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂板(Becton Dickinson)中。然后将每个板在37℃下与5％CO₂孵育过夜；第二天计数CFU。OPKA滴度表示为导致50％细菌杀灭的血清稀释度的倒数，并且杀灭％计算如下：

其中对于每个血清稀释度的两个重复，T₀是在T₀时计数的CFU的平均值，而T₆₀是在T₆₀时计数的CFU的平均值。

注意到接受在明矾中配制的Qβ-PS或Qβ-OS缀合物的第10组和第12组中的Post-1IgG Luminex滴度显著高于接受明矾中的PSII-CRM的第2组的post-1滴度。在一个疫苗剂量后，来自接受一个剂量的Qβ缀合物(第10和12组)的动物的合并血清中的OPK滴度高于接受1个剂量的PSII-CRM(第2组)的动物的3倍，并且与接受两个疫苗剂量的相同组相比不差(相当)。

实施例6：体内免疫

根据表5中所示的时间表，使用表6中所示的制剂，通过腹膜内(IP)或肌内(IM)施用途径免疫6组CD1小鼠(研究2)。第1组和第2组(每组五只小鼠)仅接受氢氧化铝佐剂，没有任何GBS抗原。表7显示了通过如本文所述的Luminex测定测量的血清抗体IgG滴度(合并的血清)。

表5-研究2

表6-研究2

组	GBS抗原	抗原(GBSII)剂量	佐剂	途径
					1	无	无	明矾2mg/mL	IP
2	无	无	明矾2mg/mL	IM
					3	PS-CRM	0.5μg(糖)	明矾2mg/mL	IP
4	PS-CRM	0.5μg(糖)	明矾2mg/mL	IM
					5	OS-Qβ	0.5μg(糖)	明矾2mg/mL	IP
6	OS-Qβ	0.5μg(糖)	明矾2mg/mL	IM

表7-IgG滴度(合并的血清)-研究2

Luminex LLOQ＝20.4RLU/ml；<LLOQ＝10.2

注意到，通过IP接受OS-II缀合物的第5组中的post-1IgG Luminex滴度显著高于通过相同途径接受PSII-CRM的第3组的post-1滴度，并且与2剂量后的第3组相比不差(相当)。类似地，通过IM接受OS-II缀合物的第6组中的post-1IgG Luminex滴度显著高于通过相同途径接受PSII-CRM的第4组的post-1滴度，并且与2剂量后的第4组相比不差(相当)。

实施例7：体内免疫

两种不同的体内小鼠免疫研究(研究3和4)使用不同形式的GBS血清型II抗原(与CRM197载体蛋白缀合，或与三种不同纳米颗粒之一(GBS铁蛋白、mI3或Qβ)缀合)进行。根据表8中列出的时间表进行免疫和抽血。

表8-研究3和研究4

在研究3中，研究了9组，每组10只小鼠(CD1品系，Charles River)。每只小鼠用表9中所示的制剂肌内免疫两次。在第1天和第22天进行免疫。在第0天(免疫前)、第21天和第36天从每只小鼠抽取血液，如表8中所述。

表10显示了通过如本文所述的Luminex测定测量的血清抗体IgG滴度(合并的血清)。

表9-研究3

表10-研究3IgG滴度(合并的血清)

Luminex定量下限(LLOQ)＝20.4相对Luminex单位/ml；<LLOQ＝10.2

注意到，分别接受OS-Qβ和PS-Qβ而无明矾的缀合物的第7组和第8组中的post-1IgG Luminex滴度显著高于通过相同途径接受PSII-CRM而无明矾的第1组的post-1滴度，并且与2剂量后的第1组相比不差(相当)。

在研究4中，研究了8组，每组10只小鼠(CD1品系，Charles River)。每只小鼠用如表11中所示的制剂肌内免疫两次。在第1天和第22天进行免疫。在第0天(免疫前)、第21天和第36天从每只小鼠抽取血液，如表8中所述。

表12a显示了通过本文所述的Luminex测定测量的血清抗体IgG滴度(合并的血清)。

表11-研究4

组	抗原	抗原(GBSII)剂量	佐剂
				1	PSII-CRM	0.5μg	明矾2mg/mL
2	OSII-GBS铁蛋白	0.5μg	明矾2mg/mL
				3	PSII-GBS铁蛋白	0.5μg	明矾2mg/mL
4	OSII-mI3	0.5μg	明矾2mg/mL
				5	PSII-mI3	0.5μg	明矾2mg/mL
6	OSII-Qβ	0.5μg	明矾2mg/mL
				7	PSII-Qβ	0.5μg	明矾2mg/mL
8	PSII-CRM	0.5μg	明矾2mg/mL

表12a-研究4IgG滴度(合并的血清)

Luminex LLOQ＝20.4RLU/ml；<LLOQ＝10.2

注意到分别接受OS-Qβ和PS-Qβ明矾缀合物的第6组和第7组中的post-1IgGLuminex滴度显著高于通过相同途径接受含明矾的PSII-CRM的第1组的post-1滴度，并且与2剂量后第1组相比不差(相当)。

比较来自研究3和4的IgG滴度：

表12b-研究3和4的比较

实施例8：体内免疫

使用表14中所示的制剂，根据表13所示的方案，通过肌内给药免疫10组CD1小鼠(每组10只小鼠)。表15显示了通过如本文所述的Luminex测定测量的血清抗体IgG滴度(合并的血清)。

表13-体内免疫

表14-体内免疫

CRM＝CRM197

表15-IgG滴度(合并的血清)-体内免疫

Luminex LLOQ＝20.4RLU/mL；<LLOQ＝10.2

该剂量范围实验比较了以两剂量方案给予的0.1、0.5和1.0μgGBS糖抗原的给药。抗原作为多糖和CRM197的缀合物(PSII-CRM)、展示寡糖的QβNP(OSII-Qβ)或展示多糖的QβNP(PSII-Qβ)提供。所有施用都用明矾作为佐剂。

在接受PSII-CRM的小鼠中，在第一次施用后，与接受较小剂量的PSII-CRM相比，在接受最高(1.0μg)剂量的小鼠中抗CPSII IgG滴度较低。第二次施用后，抗CPSII IgG滴度随着剂量从0.1μg增加至1.0μg而降低。相反，在接受OSII-Qβ的小鼠中，抗CPSII IgG滴度以剂量依赖性方式增加。在接受PSII-Qβ的小鼠中，在第一次和第二次施用后，在接受最高(1.0μg)剂量的组中抗CPSII IgG滴度最高。

实施例10：GBS PSIa-Qβ缀合物

GBS荚膜多糖与QβVLP的缀合

产生GBS CPS血清型Ia的多糖(分子量～100kDa)。使用20％NaIO₄进行GBS血清型Ia荚膜多糖的氧化。使用脱盐柱纯化氧化的多糖。通过¹H NMR评估所得多糖的身份和结构符合性。使用HPAEC-PAD或比色测定(基于NeuNAc)定量总糖。

然后在NaBH3CN存在下，使用糖和NP之间2:1至6:1的w/w比率，通过还原胺化将氧化的多糖与QβVLP(5-10mg/ml)在37℃下缀合72小时。使用Hydrosart膜100kDa截留通过切向流过滤纯化与糖缀合的最终NP。

GBS糖VLP缀合物表征

HPAEC-PAD和BCA分别用于估计与GBS糖缀合的纯化QβVLP的糖(总的和游离的)和蛋白质含量，如下表16所报告的。

表16

使用如下的缀合条件：PS:NP(w/w)2:1，NP 6mg/ml，温度37℃，大约72小时，产生了PSIa-QβNP缀合物。图13显示了GBS PSIa-QβNP缀合物和QβNP(无缀合的糖)的SE-HPLC分析。

使用具有荧光检测(227nm激发和335nm发射)的SRT-C 2000柱进行SE-HPLC。运行条件为流速0.5mg/mL，运行时间40分钟，100mM NaPi，100mM Na2SO4，pH 7.2作为运行缓冲液，注射体积20μL。所有样品以基于蛋白质的0.3mg/mL蛋白质浓度注射。

还通过使用负染色(NS)的透射电子显微镜(TEM)分析来表征与GBS糖缀合的QβNP。为了分析，将与GBS寡糖和多糖缀合的NP加载到通过辉光放电(Quorum Q150)赋予亲水性的碳/formvar(Agar Scientific)的铜300平方网眼网格上。使用Whatman滤纸No.1吸去过量的溶液，然后用NanoW将网格负染色。使用配备有CCD2kx2k相机的Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜以87000x放大倍数获得显微照片。与GBS PSIa缀合的Qβ纳米颗粒的负染色TEM图像显示了典型的二十面体对称性，直径约33nm(图14)。

体内免疫

使用与CRM₁₉₇载体蛋白或与Qβ缀合的GBS血清型Ia多糖进行小鼠免疫研究。研究包括5组，每组10只雌性小鼠(CD1品系，Charles River)。小鼠用PSIa-CRM缀合物肌内免疫两次或用PSIa-Qβ缀合物免疫一次，如表17中所示。对于PSIa-CRM在第1天和第22天进行免疫，和对于PSIa-Qβ仅在第1天进行免疫。在第0天(免疫前)、第21天和第42天抽血。

表17

表18显示了来自属于每组小鼠的个体血清的几何平均IgG滴度，以及来自每组小鼠的合并血清中的调理吞噬杀伤滴度。

表18

使用与生物素化Ia型天然多糖偶联的链霉亲和素衍生的磁性微球(RadixBiosolutions，USA)，通过Luminex测定测量了血清抗体滴度(Buffi等，(2019))。在RT下平衡后，将125万个微球转移到LoBind管(Eppendorf)中并在黑暗中置于磁性分离器中2min。用含有0.05％Tween^TM 20(Calbiochem)的PBS洗涤微球，并将生物素-PSIa在PBS、0.05％Tween^TM 20、0.5％BSA(Sigma-Aldrich)中以1μg/ml的终浓度加入微球中。将生物素-PSIa-微球在室温(RT)下在黑暗中孵育60分钟，并用PBS、0.05％Tween^TM 20洗涤两次。将偶联的微球悬浮于500μl PBS、0.05％Tween^TM 20、0.5％BSA中，并在4℃下储存。

在PBS，pH 7.2，0.05％Tween^TM 20，0.5％BSA中制备标准超免疫血清或测试样品的8个3倍系列稀释液。将每种血清稀释液(50μl)与等体积的缀合的微球(3,000个微球/区域/孔)在96孔Greiner平板(Millipore Corporation)中混合，并在RT下在黑暗中孵育60min。孵育后，将微球用200μl PBS洗涤三次。每个孔中加载50μL在PBS，pH 7.2，0.05％Tween^TM20，0.5％BSA中的2.5μg/mL抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch)，并在连续振荡下孵育60min。洗涤后，将微球悬浮于100μL PBS中并振荡，然后用Luminex 200仪器分析。通过BioPlex Manager TM软件(BioRad)实时获取数据。

如前所述(Chatzikleanthous(2020))，通过调理吞噬杀伤试验(OPKA)测定血清的功能活性。将HL60细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中生长，在37℃，5％CO2下孵育。HL-60细胞用0.78％二甲基甲酰胺(DMF)分化成嗜中性粒细胞，并在4-5天后用作吞噬细胞的来源。在96孔微量滴定板中以125μL/孔的总体积进行测定。每个反应含有热灭活的测试血清(12.5μL)、GBS Ia株515(6×10⁴个菌落形成单位[CFU])、分化的HL-60细胞(2×10⁶个细胞)和Hank's平衡盐溶液红(Gibco)中的10％幼兔补体(Cederlane)。对于每个血清样品，测试了六个连续稀释液。阴性对照缺乏效应细胞，或含有阴性血清或热灭活的补体。在反应组装后，将板在37℃下振荡孵育1小时。在孵育之前(T₀)和之后(T₆₀)，将混合物在无菌水中稀释，并涂布于含有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂平板(Becton Dickinson)中。然后将每个板在37℃、5％CO₂下孵育过夜；第二天计数CFU。OPKA滴度表示为导致50％细菌杀灭的血清稀释度的倒数，并且杀灭％计算如下：

％杀伤＝(T₀-T₆₀)/T₀，

其中对于每个血清稀释度的两个重复，T₀是在T₀时计数的CFU的平均值，并且T₆₀是在T₆₀时计数的CFU的平均值。

在单剂量的PSIa-Qβ(第6-10组)后，在第42天测量的IgG和OPKA滴度不差于(相当于)两个剂量的PSIa-CRM(第1-5组)。

实施例11：肺炎链球菌荚膜多糖与NP的缀合

使用(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)和三氯异氰脲酸(TCC)氧化肺炎链球菌多糖血清型12F(Pn PS12F)。使用pH 855的NaHCO₃ 0.25M和Na₂CO₃ 0.025M缓冲液中的0.025当量的TEMPO和0.3当量的TCC进行氧化。使用脱盐柱纯化氧化的多糖。通过HPAEC-PAD分析评估所得多糖的定量和氧化百分比。

然后在NaBH₃CN存在下，使用0.5:1的糖与Qβ的w/w比，通过还原胺化将氧化的多糖与QβNP(5mg/ml)在37℃缀合72小时。通过硫酸铵沉淀然后系列离心过滤(100kDa)纯化最终的Qβ-Pn PS12F缀合物。平行地，使用相同的条件，但糖与CRM197的w/w比为1:1，将氧化的多糖缀合至单体载体蛋白CRM197。通过尺寸排阻色谱法(S500HP树脂)从游离蛋白质和糖纯化最终的CRM197-PN PS12F缀合物(图15)

Pneumo PS12F-Qβ和-CRM197缀合物表征

HPAEC-PAD和BCA分别用于估计纯化的Pn PS12F-Qβ和-CRM缀合物的糖(总的和游离的)和蛋白质含量，如下表19所报告的。

表19

图16显示Pneumo PS 12F-QβNP缀合物和QβNP(无缀合的糖)的SE-HPFC分析。

使用具有荧光检测(227nm激发和335nm发射)的SRT-C 2000柱进行SE-HPEC。运行条件为流速0.5mg/mL，运行时间40分钟，100mM NaPi，100mM Na2SO4，pH7.2作为运行缓冲液，注射体积20μL。所有样品以基于蛋白质的0.3mg/mL蛋白质浓度注射。

使用负染色(NS)，也通过透射电子显微镜(TEM)分析来表征Pn PS12F-Qβ缀合物。为了分析，将Qβ缀合物加载到通过辉光放电(Quorum Q150)赋予亲水性的碳/Formvar(AgarScientific)的铜300平方网格上。使用Whatman滤纸No.1吸去过量的溶液，然后用NanoW将网格负染色。使用配备有CCD 2kx2k相机的Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜在87000x放大倍数下获得显微照片(图17)。

体内免疫

使用与CRM₁₉₇载体蛋白缀合或与Qβ缀合的Pncumo血清型12F多糖进行体内小鼠免疫研究。根据表20中的时间表进行免疫和抽血。

表20

天	行动
		0	抽血1(免疫前)
1	免疫1
		21	抽血2(第一次免疫后)
22	免疫2
		42	最后一次抽血(第二次免疫后)

在体内研究中，研究了9组，每组10只雌性小鼠(CD1品系，Charles River)。每只小鼠用两个不同剂量(0.1和1μg，基于糖)的Pn PS12F-Qβ缀合物或Pn PS12F-CRM197缀合物肌内免疫一次或两次，如表21所示。在第1天和第22天进行免疫。在第0天(免疫前)、第21天和第42天从每只小鼠抽取血液，如表20中所述。

表21

通过ELISA测定血清中的血清抗体滴度。简言之，用Pneumo多糖血清型12F包被平板，并用血清的两倍连续稀释液然后用AP-缀合的二抗孵育。通过血清稀释度的倒数计算IgG滴度，得到等于0.5的光密度(OD)。表22显示了通过ELISA测量的用于体内研究的血清中的几何平均IgG滴度。

表22

第一剂量21天后，PnPS12F-Qβ缀合物组中的IgG滴度在统计学上优于接受PnPS12F-CRM缀合物的那些(Mann-Whitney检验)。与42天后获得的反应相比，这种差异变得更明显，其中由一次单次注射Qβ缀合物引发的特异性IgG抗Pn12F是用2个剂量的CRM缀合物获得的10倍以上。

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Claims

1.一种具有与其外表面缀合的抗原分子的蛋白质纳米颗粒，其中所述抗原分子是细菌糖，如多糖或寡糖。

2.根据权利要求1所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖来自选自以下的细菌种：不动杆菌属(Acinetobacter)的种、芽孢杆菌属(Bacillus)的种、博德特氏菌属(Bordetella)的种、疏螺旋体属(Borrelia)的种、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的种、假丝酵母属(Candida)的种、衣原体属(Chlamydia)的种、梭菌属(Clostridium)的种、棒状杆菌属(Corynebacterium)的种、肠球菌属(Enterococcus)的种、埃希氏菌属(Escherichia)的种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)的种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、螺杆菌属(Helicobacter)的种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)的种、军团菌属(Legionella)的种、李斯特氏菌属(Listeria)的种、奈瑟氏菌属(Neisseria)的种、变形杆菌属(Proteus)的种、假单胞菌属(Pseudomonas)的种、沙门氏菌属(Salmonella)的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的种、链球菌属(Streptococcus)的种、链霉菌属(Streptomyces)的种、弧菌属(Vibrio)的种和耶尔森氏菌属(Yersinia)的种。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖来自链球菌属的种，其选自无乳链球菌(B群链球菌或GBS)和肺炎链球菌。

4.根据权利要求1至3任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖直接缀合至所述蛋白质纳米颗粒或通过间隔物(接头)基团缀合至所述蛋白质纳米颗粒。

5.根据权利要求1至4任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述细菌糖通过选自以下的方法与所述蛋白质纳米颗粒缀合：(a)还原胺化；(b)碳二亚胺化学(例如EDAC或EDC)；(c)马来酰亚胺化学；和(d)氰基化化学(例如CDAP)。

6.根据权利要求1至5任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述蛋白质纳米颗粒是非病毒蛋白质纳米颗粒，如GBS铁蛋白纳米颗粒或mI3纳米颗粒。

7.根据权利要求1至6任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述蛋白质纳米颗粒是噬菌体VLP，如QβVLP。

8.根据权利要求1至7任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中所述蛋白质纳米颗粒包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7或SEQ ID NO:11中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的亚基多肽，其中所述亚基蛋白能够自组装以形成所述纳米颗粒。

9.根据权利要求1-8任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中与一个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白质载体如CRM197后相比，所述纳米颗粒能够在一个剂量后引发对所述细菌糖的更高的免疫应答。

10.根据权利要求1-9任一项所述的蛋白质纳米颗粒，其中与两个剂量的缀合至相同细菌糖的单体蛋白质载体如CRM197后相比，所述纳米颗粒能够在一个剂量后引发对所述细菌糖的更高或相当的免疫应答。

11.一种免疫原性组合物，其包含至少一种根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒。

12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。

13.一种产生权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒的方法，包括以下步骤中的一个或多个：(a)在有利于所述多肽的表达和所述NP的自组装的条件下培养表达本发明的NP亚基多肽的重组宿主细胞；(b)视情况从所述宿主细胞或所述宿主细胞在其中生长的培养基回收或纯化组装的NP；(c)从细菌提取和纯化天然多糖，(d)任选地制备细菌寡糖，和(e)将细菌多糖或寡糖抗原缀合至所述NP的外部。

14.根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒或权利要求11或12所述的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗人受试者中的细菌感染。

15.根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒或权利要求11或12的免疫原性组合物在制备用于诱导人受试者的免疫应答的药物中的用途。

16.根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒或权利要求11或12所述的免疫原性组合物用于诱导受试者的免疫应答的用途。

17.一种诱导人受试者的免疫应答的方法，包括将免疫有效量的根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒或权利要求11或12所述的免疫原性组合物施用于所述受试者。

18.一种预防或治疗人受试者的细菌感染的方法，包括将免疫有效量的根据权利要求1至10任一项所述的蛋白质纳米颗粒或权利要求11或12所述的免疫原性组合物施用于所述受试者。

19.根据权利要求15或16所述的用途或进根据权利要求17或18所述的方法，其中所述受试者接受所述蛋白质纳米颗粒或所述免疫原性组合物的单次施用。

20.根据权利要求15、16或19所述的用途，或者根据权利要求17、18或19所述的方法，其中所述受试者接受肌内施用。