CN115792208A - 蛋白磁珠包被物及其制备方法、应用和目标抗体检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛋白磁珠包被物，包括：磁性基球单元；蛋白质或多肽单元；聚乙二醇链，所述聚乙二醇链的一侧末端通过硫醚键与所述磁性基球单元连接，另一侧末端通过碳氮双键与所述蛋白质或多肽单元的末端连接。该蛋白磁珠包被物中由于聚乙二醇链远离蛋白质或多肽单元的活性位点，在对蛋白质或多肽单元对应的抗体或抗原进行检测时，可避免由于出现由于蛋白质或多肽单元的活性位点被遮盖而导致的检出率下降问题，提高检出率；同时由于聚乙二醇链具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，可提高蛋白质或多肽单元的结构稳定性，避免蛋白质或多肽单元在偶联过程中发生构象变化。
Description
技术领域
本发明涉及技术领域，特别是涉及一种蛋白磁珠包被物及其制备方法、应用和目标抗体检测方法。
背景技术
化学发光平台的免疫检测和免疫诊断所使用的方法是使抗原或抗体通过物理吸附或者化学交联的方式结合到纳米磁珠表面，并保持其免疫学活性。在测定时受检标本按不同的步骤与磁珠表面的抗原或者抗体进行免疫反应，再与标记了示踪物的抗原或抗体形成复合物，根据发光进行定量或者定性研究。
在生物医药中，聚乙二醇(PEG)因具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，故而广泛的被应用与蛋白质或者多肽共价偶联来改变其生物化学特性。但是，进行检测时存在阳性信号值受到抑制，信噪比和检出率不能满足性能需求的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高检测时的信噪比和检出率的蛋白磁珠包被物及其制备方法、应用和目标抗体检测方法。
本发明的第一方面提供了一种蛋白磁珠包被物，包括：
磁性基球单元；
蛋白质或多肽单元；
聚乙二醇链，所述聚乙二醇链的一侧末端通过硫醚键与所述磁性基球单元连接，另一侧末端通过碳氮双键与所述蛋白质或多肽单元的末端连接。
在一些实施例中，所述聚乙二醇链含有的碳原子的个数为偶数；
可选地，所述聚乙二醇含有的碳原子的个数为2～24。
在一些实施例中，所述蛋白磁珠包被物的制备原料包括表面连接有氨基的磁性基球、末端连接有α氨基的蛋白质或多肽以及两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛。
在一些实施例中，所述硫醚键由所述聚乙二醇醛一侧末端连接的巯基与所述磁性基球表面连接的氨基反应生成；所述碳氮双键由所述聚乙二醇醛另一侧末端连接的醛基与所述蛋白质或多肽末端连接的α氨基反应生成。
在一些实施例中，所述蛋白质或多肽包括gp210抗原、sp100抗原、甲状腺球蛋白和组蛋白中的一种或多种。
本发明的第二方面提供了一种蛋白磁珠包被物的制备方法，包括如下步骤：
将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与末端连接有α氨基的蛋白质或多肽在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；
将所述中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备所述蛋白磁珠包被物。
在一些实施例中，制备所述中间体时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述蛋白质或多肽、所述聚乙二醇醛及所述还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；
(2)所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种；
(3)所述第一反应采用的用于溶解所述聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种；
(4)所述第一反应的反应pH值为4～5；
(5)所述第一反应的反应温度为4℃，反应时间为16～18h；或所述第一反应的反应温度为25℃，反应时间为6～8h。
在一些实施例中，进行第二反应时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种；
(2)所述磁性基球与所述交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；
(3)所述中间体中含有的蛋白质或多肽与所述磁性基球的质量比为(5～40):1000；
(4)所述第二反应具体包括：
将溶解后的所述交联剂与所述磁性基球混合得混合物，将所述混合物活化；
将活化后的所述混合物与所述中间体混合，以使所述磁性基球与所述中间体发生偶联；
将偶联后的产物进行封闭处理。
本发明的第三方面提供了一种上述的蛋白磁珠包被物在制备诊断试剂中的应用。
本发明的第四方面提供了一种诊断试剂，包括上述的蛋白磁珠包被物或上述的方法制得的蛋白磁珠包被物。
本发明的第五方面提供了一种目标抗体的检测方法，包括如下步骤：
将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与目标抗原在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；其中，所述目标抗原为与目标抗体相对应的抗原，所述目标抗原的末端连接有α氨基；
将所述中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备抗原磁珠包被物；
采用所述抗原磁珠包被物检测待测样溶液中含有的目标抗体。
在一些实施例中，制备所述中间体时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述目标抗原、所述聚乙二醇醛及所述还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；
(2)所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种；
(3)所述第一反应采用的用于溶解所述聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种；
(4)所述第一反应的反应pH值为4～5；
(5)所述第一反应的反应温度为4℃，反应时间为16～18h；或所述第一反应的反应温度为25℃，反应时间为6～8h。
在一些实施例中，进行第二反应时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种；
(2)所述磁性基球与所述交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；
(3)所述中间体中含有的目标抗原与所述磁性基球的质量比为(5～40):1000；
(4)所述第二反应具体包括：
将溶解后的所述交联剂与所述磁性基球混合得混合物，将所述混合物活化；
将活化后的所述混合物与所述中间体混合，以使所述磁性基球与所述中间体发生偶联；
将偶联后的产物进行封闭处理。
上述提供的蛋白磁珠包被物及其制备方法、应用和目标抗体检测方法，蛋白磁珠包被物中的聚乙二醇链的一侧末端与蛋白质或多肽单元的末端连接，实现了对于蛋白质或多肽单元的均一修饰；由于聚乙二醇链远离蛋白质或多肽单元的活性位点，在对蛋白质或多肽单元对应的抗体或抗原进行检测时，可避免由于出现由于蛋白质或多肽单元的活性位点被遮盖而导致的检出率下降问题，提高检出率；同时由于聚乙二醇链具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，可提高蛋白质或多肽单元的结构稳定性，避免蛋白质或多肽单元在偶联过程中发生构象变化。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。下述实施例中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，6～8h表示左端点“6”和右端点“8”的单位都是h(小时)。
本文仅具体地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任意上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，每个单独公开的点或单个数值自身可以作为下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在发明的描述中，“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。
如果没有特别的说明，本发明的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。如果没有特别的说明，本发明的所有技术特征以及可选技术特征可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别的说明，本申请的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，优选是顺序进行的。
在生物医药中，聚乙二醇(PEG)因具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，故而广泛的被应用与蛋白质或者多肽共价偶联来改变其生物化学特性。目前，修饰多肽和蛋白质是利用其氨基和PEG链上羧基的自由缩合反应，稳定其蛋白质结构，然后将该修饰产物再与磁珠偶联得到磁珠包被物，最后进行检测。进行检测时存在阳性信号值受到抑制，信噪比和检出率不能满足性能需求的问题。技术人员分析其原因可能是由于，蛋白质表面含有丰富的自由氨基，随机的修饰会使其活性位点被遮盖，导致检出率的下降。
例如，常用的PEG修饰方式多以赖氨酸的ε-NH2或α-NH2为修饰目标，修饰会引起蛋白质中多个赖氨酸被修饰，得到的产物是聚乙二醇化修饰异构体的混合物，由于该修饰方式结构不明确，随机性大，容易遮盖抗体抗原结合位点，得到的目标结合物比例也相对较低，使得该产物虽稳定性增加，但阳性信号值会受到抑制，导致信噪比和检出率不能满足性能需求。
为了解决该问题，本发明提供了一种蛋白磁珠包被物，包括磁性基球单元、蛋白质或多肽单元以及聚乙二醇链，聚乙二醇链的一侧末端通过硫醚键与所述磁性基球单元连接，另一侧末端通过碳氮双键与所述蛋白质或多肽单元的末端连接。
需要说明的是，蛋白质或多肽单元是指由蛋白质组成的单元，或者由多肽组成的单元，或者由蛋白质和多肽共同组成的单元。
蛋白磁珠包被物中含有一个磁性基球；蛋白磁珠包被物中蛋白质或多肽单元的数量可以为1个，也可以为多个；聚乙二醇链的数量可以为1个，也可以为多个；各蛋白质或多肽单元可以通过1个聚乙二醇链与磁性基球单元偶联，可以以通过多个聚乙二醇链与磁性基球单元偶联，具体不做限定。
可理解地，蛋白磁珠包被物中的聚乙二醇链的一侧末端与蛋白质或多肽单元的末端连接，实现了对于蛋白质或多肽单元的均一修饰；由于聚乙二醇链远离蛋白质或多肽单元的活性位点，在对蛋白质或多肽单元对应的抗体或抗原进行检测时，可避免由于出现由于蛋白质或多肽单元的活性位点被遮盖而导致的检出率下降问题，提高检出率；同时由于聚乙二醇链具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，可提高蛋白质或多肽单元的结构稳定性，避免蛋白质或多肽单元在偶联过程中发生构象变化。
在一些实施方式中，聚乙二醇链含有的碳原子的个数为偶数。可选地，聚乙二醇链含有的碳原子的个数为2～24；例如，可以为4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24等，具体不做限定。优选聚乙二醇链为线形结构。
在一些实施方式中，蛋白磁珠包被物的制备原料包括表面连接有氨基的磁性基球、末端连接有α氨基的蛋白质或多肽以及两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛。
需要说明的是，聚乙二醇醛的一侧末端连接有巯基，另一侧末端连接有醛基；优选聚乙二醇醛为线形结构。
在蛋白质或多肽骨架中，末端氨基酸残疾的α-NH2的pKa值通常低于赖氨酸的ε-NH2或α-NH2的pKa值，故而在弱酸条件中，聚乙二醇醛更易与末端氨基酸残基的α-NH2的发生还原胺化反应；采用末端连接有α氨基的蛋白质或多肽、表面连接有氨基的磁性基球以及两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛制备蛋白磁珠包被物时，聚乙二醇醛末端的醛基在弱酸性环境下与蛋白质或多肽末端的α氨基发生还原胺化反应形成碳氮双键，可实现在蛋白质或多肽的非活性位点定向修饰PEG的效果，从而在提高蛋白质或多肽单元的结构稳定性的同时，避免采用该蛋白磁珠包被物进行抗原或抗体检测时出现检出率下降的问题。
在一些实施方式中，硫醚键由聚乙二醇醛一侧末端连接的巯基与磁性基球表面连接的氨基反应生成；碳氮双键由聚乙二醇醛另一侧末端连接的醛基与蛋白质或多肽末端连接的α氨基反应生成。
在一些实施方式中，蛋白质或多肽包括gp210抗原、sp100抗原、甲状腺球蛋白和组蛋白中的一种或多种。
本发明还提供了一种蛋白磁珠包被物的制备方法，包括如下步骤：
将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与末端连接有α氨基的蛋白质或多肽在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；
将中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备所述蛋白磁珠包被物。
本发明中进行制备蛋白磁珠包被物时，通过聚乙二醇醛一侧末端的醛基与蛋白质或多肽末端的α氨基进行还原胺化形成碳氮双键，从而两者之间偶联，实现对蛋白质或多肽在非活性位点的定向修饰；然后，聚乙二醇醛另一侧末端的巯基与磁性基球表面的氨基发生加成反应形成稳定的巯醚键，从而实现磁性基球、聚乙二醇醛及蛋白质或多肽之间的偶联，制得蛋白质或多肽单元结构稳定且检出率高的蛋白磁珠包被物。
需要说明的是，巯基和氨基之间的加成反应需要在交联剂的催化作用下进行，在不存在交联剂时巯基和氨基之间无法发生反应，因此聚乙二醇醛与蛋白质或多肽之间进行反应时，聚乙二醇末端的巯基并不会影响醛基和氨基之间的还原胺化，可实现对于蛋白质或多肽的高纯度且均一化修饰，得到纯化且均一的修饰产物。
可理解地，第一反应为还原胺化反应，第二反应为加成反应。
在一些实施方式中，制备中间体时，蛋白质或多肽、聚乙二醇醛及还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；例如，可以为1:(5～35):200、1:(5～30):200、1:(5～25):200、1:(5～20):200、1:(5～15):200、1:(5～10):200、1:(5～9):200、1:(5～8):200、1:(5～7):200或1:(5～6):200等。优选为1:(5～10):200。蛋白质或多肽、聚乙二醇醛及还原剂的摩尔比在上述范围内时，聚乙二醇醛可有效用于修饰蛋白质或多肽。
在一些实施方式中，制备中间体时，还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种。优选为氰基硼氢化钠。
在一些实施方式中，制备中间体时，第一反应采用的用于溶解聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种。
在一些实施方式中，第一反应的反应pH值为4～5；例如，可以为4.1～5、4.2～5、4.3～5、4.4～5、4.5～5、4.6～5、4.7～5、4.8～5或4.9～5等。优选为5。在弱酸性的环境中进行第一反应，可使聚乙二醇醛末端的醛基选择性地与蛋白质或多肽末端氨基酸残基的α氨基发生还原胺化反应，实现对于蛋白质或多肽在非活性位点的定向修饰。
在一些实施方式中，第一反应可在4℃下反应16～18h，或者在25℃下反应6～8h。
作为示例，制备中间体时可采用下述方法进行：称取一定量的聚乙二醇醛干粉，溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为1mg/mL的聚乙二醇醛溶液；配制pH为5、浓度为40mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液用作反应缓冲液；将蛋白质、聚乙二醇醛、还原剂按照一定的摩尔比，于4℃反应16～18h，或于25℃反应6～8h，反应结束后将中间体进行超滤纯化。可选地，可将超滤纯化后的中间体保存至20mmol/L pH为7.4的磷酸盐缓冲液中备用。
在一些实施方式中，进行第二反应时采用的交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种。优选为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方式中，进行第二反应时磁性基球与交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；例如，可以为1:(0.05～0.18)、1:(0.05～0.15)、1:(0.05～0.12)、1:(0.05～0.1)或1:(0.05～0.08)等，具体不做限定。磁性基球与交联剂的质量比在上述范围内时，交联剂可更加充分地活化磁性基球表面的基团。
在一些实施方式中，进行第二反应时中间体中含有的蛋白质或多肽与磁性基球的质量比为(5～40):1000；例如，可以为(5～35):1000、(10～30):1000、(15～25):1000、(15～20):1000或(20～25):1000等，具体不做限定。中间体中含有的蛋白质或多肽与磁性基球的质量比在上述范围内时，即可保证有足够量的蛋白质或多肽偶联到磁性基球上，同时又不会发生由于蛋白质过量使得空间位阻增大，从而导致偶联效率下降的问题。
在一些实施方式中，第二反应具体包括：将溶解后的交联剂与磁性基球混合得混合物，将混合物活化；将活化后的混合物与中间体混合，以使磁性基球与中间体发生偶联；将偶联后的产物进行封闭处理。
作为示例，对混合物进行活化时可采用下述方法：将交联剂溶解于二甲基亚砜中，配制成浓度为10mg/mL的交联剂溶液，然后按照磁性基球与4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的质量比为1:0.05的比例，将50μL交联剂溶液加入到磁性基球的溶液中，于25℃恒温箱中活化60min。
作为示例，磁性基球与中间体发生偶联时可采用下述方法：将活化后的磁性基球和交联剂的混合物进行磁分离，弃去上清得固体，将固体用pH为7.0、浓度为0.02mol/L的HEPES缓冲液清洗一次，再用pH为7.0、浓度为0.02mol/L的HEPES缓冲液重悬，加入中间体，混匀，置于25℃恒温箱中，混合反应3h。
作为示例，将偶联后的产物进行封闭处理可采用下述方法：将偶联后产物进行磁分离，弃去上清得固体，加入pH为7.4、浓度为0.15mol/L含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液作为封闭缓冲液，25℃恒温箱中混合封闭2h。
在一些方式中，封闭缓冲液中可以含有蛋白、非蛋白、抗体和血清中的一种或多种作为封闭剂；优选为蛋白。
在一些实施方式中，制得中间体后还包括对中间体进行纯化的步骤；可选地，可以采用脱盐、超滤和透析的方式对中间体进行纯化；优选超滤。
本发明还提供了一种上述的蛋白磁珠包被物在制备诊断试剂中的应用。
本发明还提供了一种诊断试剂，包括上述的蛋白磁珠包被物或上述的方法制备得到的蛋白磁珠包被物。
本发明还提供了一种目标抗体的检测方法，包括如下步骤：将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与目标抗原在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；其中，目标抗原为与目标抗体相对应的抗原，目标抗原的末端连接有α氨基；将中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备抗原磁珠包被物；采用抗原磁珠包被物检测待测样溶液中含有的目标抗体。
本发明中进行目标抗体的检测时，通过聚乙二醇醛一侧末端的醛基与目标抗原末端的α氨基进行还原胺化形成碳氮双键，从而两者之间偶联，实现对目标抗原在非活性位点的定向修饰；然后，聚乙二醇醛另一侧末端的巯基与磁性基球表面的氨基发生加成反应形成稳定的巯醚键，从而实现磁性基球、聚乙二醇醛及目标抗原之间的偶联，制得目标抗原结构稳定且检出率高的蛋白磁珠包被物。
可理解，对目标抗体进行检测时，首先对与目标抗体对应的目标抗原进行PEG修饰，然后再与磁性基球偶联在制备抗原磁珠包被物；由于PEG具有亲和性和亲水性，以及良好的安全性和生物相容性，采用PEG修饰目标抗原可稳定目标抗原的结构，避免目标抗原在偶联过程中发生构象变化。同时PEG在目标抗原的末端对其进行定点修饰，远离目标抗原的活性位点，得到较为均一的修饰产物，且可避免由于修饰带来的检出率下降问题。
与未对目标抗原进行修饰或采用其他的PEG衍生物对目标抗原进行修饰相比，当采用本发明的抗原磁珠包被物对目标抗体进行检测时，可有效提高目标抗体的检出率。
在一些实施方式中，制备中间体时，目标抗原、聚乙二醇醛及还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；例如，可以为1:(5～35):200、1:(5～30):200、1:(5～25):200、1:(5～20):200、1:(5～15):200、1:(5～10):200、1:(5～9):200、1:(5～8):200、1:(5～7):200或1:(5～6):200等。优选为1:(5～10):200。
在一些实施方式中，制备中间体时，还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种。优选为氰基硼氢化钠。
在一些实施方式中，制备中间体时，第一反应采用的用于溶解聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种。
在一些实施方式中，第一反应的反应pH值为4～5；例如，可以为4.1～5、4.2～5、4.3～5、4.4～5、4.5～5、4.6～5、4.7～5、4.8～5或4.9～5等。优选为5。在弱酸性的环境中进行第一反应，可使聚乙二醇醛末端的醛基选择性地与目标抗原末端的α氨基发生还原胺化反应，实现对于蛋白质或多肽在非活性位点的定向修饰。
在一些实施方式中，第一反应可在4℃下反应16～18h，或者在25℃下反应6～8h。
在一些实施方式中，进行第二反应时采用的交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种。优选为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方式中，进行第二反应时磁性基球与交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；例如，可以为1:(0.05～0.18)、1:(0.05～0.15)、1:(0.05～0.12)、1:(0.05～0.1)或1:(0.05～0.08)等，具体不做限定。
在一些实施方式中，进行第二反应时中间体中含有的目标抗原与磁性基球的质量比为(5～40):1000；例如，可以为(5～35):1000、(10～30):1000、(15～25):1000、(15～20):1000或(20～25):1000等，具体不做限定。
在一些实施方式中，第二反应具体包括：将溶解后的交联剂与磁性基球混合得混合物，将混合物活化；将活化后的混合物与中间体混合，以使磁性基球与中间体发生偶联；将偶联后的产物进行封闭处理。
下述结合具体实施例对技术方案进行说明。
一、抗原磁珠包被物的制备
需要说明的是，下述各实施例和对比例中以检测抗gp210抗体为例，其靶抗原为位于核孔复合物上的210kD跨膜糖蛋白，抗gp210抗体在自身免疫性肝炎的患者诊断中有辅助性的诊断作用，如果患者出现抗核抗体以及抗gp210抗体为阳性，多考虑患者有自身免疫性肝炎或者原发性胆汁淤积性肝炎。
下述各实施例和对比例中涉及的HS-PEG-CHO为两侧末端分别具有醛基和巯基的聚乙二醇醛；DMSO为二甲基亚砜；PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；SMCC指4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
实施例1
1、HS-PEG-CHO修饰gp210抗原
将相对分子质量为1000的HS-PEG-CHO溶于DMSO中，配制得到浓度为1mg/mL的HS-PEG-CHO溶液；
取100μg相对分子质量为210kDa的gp210抗原加入到300μL pH为5.0、浓度40mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液中；然后加入6μL浓度为1mg/mL的氰基硼氢化钠水溶液，得抗原混合液；
向抗原混合液中加入2.38μL HS-PEG-CHO溶液，混匀，制备成gp210抗原、HS-PEG-CHO、氰基硼氢化钠的摩尔比为1:5:200的反应体系，于4℃反应16～18h；
反应结束后制得HS-PEG-CHO修饰gp210抗原(即为中间体)，将HS-PEG-CHO修饰gp210抗原超滤纯化，保存在20mmol/L pH7.4的PBS缓冲液中。
2、修饰后抗原磁珠包被物的制备
取10mg表面连接有氨基的磁珠，用0.02mol/L pH7.4的PBS缓冲液清洗3次后，加入0.4mL PBS缓冲液重悬；
将SMCC溶于DMSO中配置成浓度为10mg/mL的SMCC溶液，然后按照磁珠与SMCC的质量比为1:0.05，将50μL SMCC溶液加入到磁珠中，于25℃恒温箱中活化60min；
将活化后的上述溶液进行磁分离，弃去上清，采用1mL浓度为0.02mol/L、pH为7.0的HEPES缓冲液，清洗一次，再用HEPES缓冲液重悬，加入100μgHS-PEG-CHO修饰gp210抗原，混匀，置于25℃恒温箱中，混合反应3h；
反应完成后，将反应产物磁分离，加入pH为7.4、浓度为0.15mol/L含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，25℃恒温箱中混合封闭2h，制得修饰后抗原磁珠包被物；
封闭反应完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，浓度为10mg/mL，4℃保存待用。
实施例2
实施例2和实施例1的区别在于：gp210抗原、HS-PEG-CHO、氰基硼氢化钠的摩尔比，其他均相同。具体如下：
1、HS-PEG-CHO修饰gp210抗原
将相对分子质量为1000的HS-PEG-CHO溶于DMSO中，配制得到浓度为1mg/mL的HS-PEG-CHO溶液；
取100μg相对分子质量为210kDa的gp210抗原加入到300μL pH为5.0、浓度0.04mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液中；然后加入6μL浓度为1mg/mL的氰基硼氢化钠水溶液，得抗原混合液；
向抗原混合液中加入4.76μL HS-PEG-CHO溶液，混匀，制备成gp210抗原、HS-PEG-CHO、氰基硼氢化钠的摩尔比为1:10:200的反应体系，于4℃反应16～18h；
反应结束后制得HS-PEG-CHO修饰gp210抗原(即为中间体)，将HS-PEG-CHO修饰gp210抗原超滤纯化，保存在20mmol/L pH7.4的PBS缓冲液中。
2、修饰后抗原磁珠包被物的制备同实施例1。
实施例3
实施例3和实施例1的区别在于：制备HS-PEG-CHO修饰gp210抗原时的反应温度及反应时间不同，其他均相同。具体如下：
1、HS-PEG-CHO修饰gp210抗原
将相对分子质量为1000的HS-PEG-CHO溶于DMSO中，配制得到浓度为1mg/mL的HS-PEG-CHO溶液；
取100μg相对分子质量为210kDa的gp210抗原加入到300μL pH为5.0、浓度0.04mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液中；然后加入6μL浓度为1mg/mL的氰基硼氢化钠水溶液，得抗原混合液；
向抗原混合液中加入2.38μL HS-PEG-CHO溶液，混匀，制备成gp210抗原、HS-PEG-CHO、氰基硼氢化钠的摩尔比为1:5:200的反应体系，于25℃反应6～8h；
反应结束后制得HS-PEG-CHO修饰gp210抗原(即为中间体)，将HS-PEG-CHO修饰gp210抗原超滤纯化，保存在20mmol/L pH7.4的PBS缓冲液中。
2、修饰后抗原磁珠包被物的制备同实施例1。
对比例1
对比例1和实施例1的区别在于：用于修饰的gp210抗原的PEG衍生剂不同。具体如下：
1、HS-PEG-CHO修饰gp210抗原
将相对分子质量为333.3的H3C-PEG-NHS酯溶于DMSO中，配制得到浓度为1mg/mL的H3C-PEG-NHS酯溶液；
取100μg gp210抗原加入到300μL pH为7.0、浓度0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液中；
向抗原混合液中加入1.6μL H3C-PEG-NHS酯溶液，混匀，制备成gp210抗原、H3C-PEG-NHS酯的摩尔比为1:10的反应体系，于25℃反应30min；
反应结束后制得H3C-PEG-NHS酯修饰gp210抗原(即为中间体)，将H3C-PEG-NHS酯修饰gp210抗原超滤纯化，保存在20mmol/L pH7.4的PBS缓冲液中。
2、修饰后抗原磁珠包被物的制备同实施例1。
对比例2
对比例2和实施例1的区别在于：未对gp210抗原进行修饰，直接将其与磁珠偶联。具体如下：
取10mg表面连接有羧基的磁珠，用0.015mol/L pH6.0的MES缓冲液清洗3次后，加入0.4mL MES缓冲液重悬；
按照磁珠、碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为1:0.1:0.1的比例，将碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺加入上述磁珠溶液中，并于室温(25℃)反应30min；
磁分离，弃上清，随后加入0.015mol/L pH6.0的MES缓冲液清洗后重悬，制得浓度为10mg/mL的活化后的磁珠溶液；
加入100μg相对分子质量为210kDa的gp210抗原，混匀，将磁珠置于25℃恒温箱中混合反应3h；
反应完成后，磁分离，加入pH为7.4、浓度为0.15mol/L含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，25℃恒温箱中混合封闭2h；
封闭反应完后，磁分离，用pH为7.4、浓度为0.15mol/L含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，浓度为10mg/mL，4℃保存待用。
二、抗gp210抗体测试
1.收集6例梯度阳性样本对实施例1～3及对比例2中的磁珠包被物进行测试
将各实施例和对比例2中制得的磁珠包被物分别稀释至0.1mg/mL，分别取50μL的磁珠包被物稀释液，加入100μL的测试样本液并于37℃下孵育10min，然后进行磁分离，得到第一反应物。将第一反应物用pH7.4的PBS缓冲液清洗2次，加入100μL 200ng/mL的吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体，于37℃下孵育10min，然后进行磁分离，得到第二反应物。将第二反应物用pH7.4的PBS缓冲液进行清洗2次，加入200μL发光液，通过化学发光测定仪测量发光信号值，重复测试2次，并计算发光信号值的平均值及偏差。结果如表1所示。
表1
由表1中实施例1～3和对比例2的结果比对可知，经过PEG定点修饰的抗原在包被上磁珠后测试待测物的信号值，要普遍高于抗原与磁珠直接偶联后测试待测物的信号值。
由实施例1和实施例2的结果可知，当将gp210抗原与聚乙二醇醛的摩尔比例从1:5提高到1：10时，PEG对gp210抗原的修饰效率会进一步提高，测试信号值也相应的有提升。由实施例1和实施例3的结果可知，制备HS-PEG-CHO修饰gp210抗原时的反应温度由4℃提高到25℃时，PEG对gp210抗原的修饰效率也会进一步提高，测试信号值也相应的有所提升。表明在PEG定点修饰抗原时，不同的处理条件也会影响修饰的效果以及最后的测试值。
2.将实施例1、对比例1和对比例2的磁珠包被物稀释至工作浓度0.10mg/mL；收集8例阳性梯度样本和100例随机样本测试实施例1、对比例1、对比例2的磁珠包被物用于检测抗gp210抗体时的特异性和灵敏度；具体过程同1中。特异性测试结果如表2所示，灵敏度测试结果如表3所示。
表2
| 项目 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 |
| 特异性 | 98.0％ | 93.0％ | 95.0％ |
表3
由表2和表3中结果可知，经过PEG定点修饰的抗原磁珠包被物，其特异性和灵敏度明显好于无修饰的抗原磁珠包被物的特异性和灵敏度，同样也明显好于随机修饰的抗原磁珠包被物的特异性和灵敏度。
3.收集5例阳性样本和5例随机样本测试实施例1、对比例1和2的磁珠包被物用于检测gp210抗原时的稳定性，具体过程同1。测试结果如表4所示。
表4
由表4中结果可知，经过7天的加速验证，实施例1和对比例1的信号值掉值均值分别是-18.4％和-18.7％，对比例2的信号值掉值均值在-45％；表明经PEG定点修饰后的抗原，其在加速稳定性上得到了明显的提升。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种蛋白磁珠包被物，其特征在于，包括：
磁性基球单元；
蛋白质或多肽单元；
聚乙二醇链，所述聚乙二醇链的一侧末端通过硫醚键与所述磁性基球单元连接，另一侧末端通过碳氮双键与所述蛋白质或多肽单元的末端连接。
2.如权利要求1所述的蛋白磁珠包被物，其特征在于，所述聚乙二醇链含有的碳原子的个数为偶数；
可选地，所述聚乙二醇含有的碳原子的个数为2～24。
3.如权利要求1～2中任一项所述的蛋白磁珠包被物，其特征在于，所述蛋白磁珠包被物的制备原料包括表面连接有氨基的磁性基球、末端连接有α氨基的蛋白质或多肽以及两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛；
其中，所述硫醚键由所述聚乙二醇醛一侧末端连接的巯基与所述磁性基球表面连接的氨基反应生成；所述碳氮双键由所述聚乙二醇醛另一侧末端连接的醛基与所述蛋白质或多肽末端连接的α氨基反应生成。
4.如权利要求3所述的蛋白磁珠包被物，其特征在于，所述蛋白质或多肽包括gp210抗原、sp100抗原、甲状腺球蛋白和组蛋白中的一种或多种。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的蛋白磁珠包被物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与末端连接有α氨基的蛋白质或多肽在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；
将所述中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备所述蛋白磁珠包被物。
6.如权利要求5所述的蛋白磁珠包被物的制备方法，其特征在于，制备所述中间体时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述蛋白质或多肽、所述聚乙二醇醛及所述还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；
(2)所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种；
(3)所述第一反应采用的用于溶解所述聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种；
(4)所述第一反应的反应pH值为4～5；
(5)所述第一反应的反应温度为4℃，反应时间为16～18h；或所述第一反应的反应温度为25℃，反应时间为6～8h；
进行第二反应时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种；
(2)所述磁性基球与所述交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；
(3)所述中间体中含有的蛋白质或多肽与所述磁性基球的质量比为(5～40):1000；
(4)所述第二反应具体包括：
将溶解后的所述交联剂与所述磁性基球混合得混合物，将所述混合物活化；
将活化后的所述混合物与所述中间体混合，以使所述磁性基球与所述中间体发生偶联；
将偶联后的产物进行封闭处理。
7.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白磁珠包被物在制备诊断试剂中的应用。
8.一种诊断试剂，其特征在于，包括如权利要求1～4中任一项所述的蛋白磁珠包被物或如权利要求5～6中任一项所述的方法制得的蛋白磁珠包被物。
9.一种目标抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将两侧末端分别连接有巯基和醛基的聚乙二醇醛与目标抗原在还原剂的作用下发生第一反应，制备中间体；其中，所述目标抗原为与目标抗体相对应的抗原，所述目标抗原的末端连接有α氨基；
将所述中间体与表面连接有氨基的磁性基球在交联剂的作用下发生第二反应，制备抗原磁珠包被物；
采用所述抗原磁珠包被物检测待测样溶液中含有的目标抗体。
10.如权利要求9所述的目标抗体的检测方法，其特征在于，制备所述中间体时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述目标抗原、所述聚乙二醇醛及所述还原剂的摩尔比为1:(5～40):200；
(2)所述还原剂包括硼氢化钠、醋酸硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种；
(3)所述第一反应采用的用于溶解所述聚乙二醇醛的溶剂包括水、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或多种；
(4)所述第一反应的反应pH值为4～5；
(5)所述第一反应的反应温度为4℃，反应时间为16～18h；或所述第一反应的反应温度为25℃，反应时间为6～8h；
进行第二反应时包括如下条件中的至少一项：
(1)所述交联剂包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐中的一种或多种；
(2)所述磁性基球与所述交联剂的质量比为1:(0.05～0.2)；
(3)所述中间体中含有的目标抗原与所述磁性基球的质量比为(5～40):1000；
(4)所述第二反应具体包括：
将溶解后的所述交联剂与所述磁性基球混合得混合物，将所述混合物活化；
将活化后的所述混合物与所述中间体混合，以使所述磁性基球与所述中间体发生偶联；
将偶联后的产物进行封闭处理。
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| CN112899231B (zh) * | 2021-01-15 | 2024-07-16 | 中山大学 | 一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用 |
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Cited By (1)
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