CN115786267A - 肿瘤类器官耐药模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种肿瘤类器官耐药模型及其构建方法，基于不同肿瘤类器官模型对药物敏感性差异，建立以IC50为参考的循环体外诱导耐药方法。通过测定类器官对药物的敏感性，计算获得IC50后，以IC50值作为起始药物筛选浓度进行耐药株筛选后扩增。取部分类器官进行药物敏感性检测，获得新的IC50，再以新的IC50开始下一次耐药筛选周期，以此反复后获得肿瘤类器官的耐药模型。本申请解决了不同肿瘤类器官对相同药物敏感性差异，科学地解决了药物诱导的起始浓度。其次，基于不同肿瘤类器官的药物诱导后敏感性变化差异，以每一次诱导后产生的真实IC50作为新的药物诱导剂量，循环往复，逐步提高，相比于传统人为设定的浓度，更具有科学性，有利于提高诱导成功率。

Description

肿瘤类器官耐药模型及其构建方法

技术领域

本申请属于细胞工程技术领域，具体涉及一种肿瘤类器官耐药模型及其构建方法。

背景技术

传统的体外耐药模型大多是利用肿瘤细胞系诱导产生的。而采用细胞系的缺陷和不足表现在它经过多次传代，已经丢失了原肿瘤的许多特征，而且其生理状态也会为了适应体外二维的培养环境而发生改变，同时，细胞系基因组在长期体外培养过程中累积了大量基因突变，所以无法准确反映、代表肿瘤细胞的体内状态，也不具备临床相关性。此外，细胞系都是由单一族群细胞组成的，无法反映肿瘤的异质性，而肿瘤的异质性对抗癌药物效果也起着关键的决定因素。因此，细胞系耐药模型对于肿瘤耐药的真实世界研究有很大的局限性。

并且基于细胞系模型的体外诱导耐药，传统方法为高浓度间断给药法和间歇逐步增加药物浓度刺激法，由于细胞系本身就存在细胞单一性，在面临高浓度药物刺激的时候，高浓度间断给药法很可能造成细胞的死亡，导致诱导失败。而对于逐步增加药物浓度刺激法，通过提前预设的药物浓度梯度，具有人为主观性，有的是两倍浓度梯度，有的是十倍，浓度过低导致诱导无效或者时间成本增加，浓度过高可能造成细胞大量死亡而失败。传统的基于细胞系建立的体外耐药模型存在局限性且成功率低等技术难题。

肿瘤类器官是由术后或活检肿瘤组织在体外培养时形成的，保留自身肿瘤组织3D结构，以及各项肿瘤学特征的微型培养物。相比于2D肿瘤细胞系，肿瘤类器官更类似于其来源肿瘤组织，能更好的还原其原位肿瘤的生物学特性；肿瘤类器官包含多种细胞类型以及空间组织结构，可以更好的模拟研究细胞间相互作用；肿瘤类器官可以长时间的培养，并维持基因组稳定性，便于长时间内对“类原代细胞”进行机制研究。因此，肿瘤类器官模型非常适合于长时间的药物筛选。其次，肿瘤类器官衍生自不同个体组织，保留不同的细胞亚群，对相同的药物存在明显的敏感性差异。同时，诱导不同个体来源的肿瘤类器官模型也需要充分考虑药物敏感性差异，基于肿瘤类器官自身的药物敏感性差异，建立相适应的耐药株诱导方法十分必要的。然而，基于肿瘤类器官模型进行体外诱导耐药的研究，目前暂未发现有相关文献和专利报道。

发明内容

基于此，本申请提供一种肿瘤类器官耐药模型及其构建方法，以解决现有的耐药模型研究局限以及在模型建立过程中诱导方式存在成功率低的技术问题。

本申请一方面提供一种基于肿瘤类器官模型的体外诱导耐药方法，包括以下步骤：

步骤S1：取部分肿瘤类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，离心，收集细胞。

步骤S2：将收集的细胞用1.5v/v%~2.5v/v%的基质胶重悬并于培养容器中培养22h~26h后，加入设有浓度梯度的抗肿瘤药物，培养4~6天后，对类器官进行药物检测计算IC50值。

步骤S3：余下的类器官接种至新的孔板中，加入所测得的IC50值对应浓度的药物进行诱导处理，2~4天后，更换不含药物的培养基，恢复并扩增获得下一代类器官。

步骤S4：重复步骤S1~S3，获得新的IC50值及新一代类器官，以此反复3~5个耐药筛选周期。

在其中一个实施例中，步骤S3加入所述药物后培养70h~74h。

在其中一个实施例中，步骤S3~S4中加入所述药物进行培养的检测组共设置有n个，n≥3。

在其中一个实施例中，步骤S2中还设置m个不添加药物进行培养的对照组，m≥3。

在其中一个实施例中，步骤S2所述培养容器为细胞培养板。在其中一个实施例中，步骤S2中所述药物检测为加入检测试剂后，将培养容器避光摇床15min~25min，检测吸光度值并计算IC50值。

在其中一个实施例中，步骤S2中所述抗肿瘤药物的浓度梯度依次为0.032μM、0.16μM、0.8μM、4μM和20μM。

在其中一个实施例中，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

在其中一个实施例中，所述胰酶的工作浓度为0.05w/v%~0.25w/v%。

本申请另一方面提供一种肿瘤类器官的耐药模型，所述肿瘤类器官耐药模型的制备方法包括上述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法中的步骤。

本申请基于不同肿瘤类器官模型对药物敏感性差异，建立以IC50为参考的循环体外诱导耐药方法。具体地，通过测定类器官对药物的敏感性，计算获得IC50后，以IC50值作为起始药物筛选浓度进行耐药株筛选2~4天，之后更换新鲜培养液，待细胞球恢复并扩增。取部分类器官进行药物敏感性检测，获得新的IC50，再以新的IC50开始下一次耐药筛选周期，以此反复后获得肿瘤类器官的耐药模型。本申请解决了不同肿瘤类器官对相同药物敏感性差异，科学地解决了药物诱导的起始浓度。

其次，基于不同肿瘤类器官的药物诱导后敏感性变化差异，以每一次诱导后产生的真实IC50作为新的药物诱导剂量，循环往复，逐步提高，既体现了药物的充分杀伤作用，又始终保留了至少半数的存活细胞，相比于传统人为设定的浓度，更具有科学性，有利于提高诱导成功率。通过本申请的方法构建的耐药类器官能为研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、分析化疗药物敏感性、相关癌症的耐药机制、肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌药物等提供最接近临床特性的细胞模型，具有广阔的基础科研价值和临床转化价值。

附图说明

图1 本申请一实施例构建耐药模型的具体技术路线；

图2 膀胱类器官-吉西他滨耐药模型P1和P5代的IC50变化曲线；

图3 膀胱类器官-顺铂耐药模型P1和P5代的IC50变化曲线；

图4 结直肠癌-紫杉醇耐药模型P1和P5代的IC50变化曲线；

图5 肺癌-5-Fu耐药模型P1和P5代的IC50变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

术语

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

肿瘤类器官（Tumor Organoids）：由术后或活检肿瘤组织在体外培养时形成的，保留自身肿瘤组织3D结构，以及各项肿瘤学特征的微型培养物（Patient-derivedorganoids，PDOs）。作为体外微小肿瘤替身，肿瘤类器官在基础研究，肿瘤个体化治疗，生物标志物发掘与验证，药物开发等领域均具有巨大的应用潜力。

耐药：是造成肿瘤复发和患者死亡的重要原因。肿瘤耐药的机制分为原发性耐药和继发性耐药。原发性耐药是由于肿瘤组织中本身就已存在相关的耐药性突变或细胞亚群，而继发性耐药是由于新的原癌基因的激活，或者新突变的产生，以及肿瘤微环境的改变等原因造成。这两种机制在肿瘤的进展和治疗过程中可同时存在。

IC50 (half maximal inhibitory concentration) ：是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度。

吉西他滨（Gemcitabine）：为一种新的胞嘧啶核苷衍生物，化学式为C9H11F2N3O4。和阿糖胞苷一样，进入人体内后由脱氧胞嘧啶激酶活化，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢。吉西他滨为嘧啶类抗肿瘤药物，作用机制和阿糖胞苷相同，其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期。但不同的是双氟脱氧胞苷除了掺入DNA以外，还能抑制核苷酸还原酶，导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少；和阿糖胞苷另一不同点是它能抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶减少细胞内代谢物的降解，具有自我增效的作用。

顺铂：又名顺式-二氯二氨合铂，是一种含铂的抗癌药物，呈橙黄色或黄色结晶性粉末，微溶于水、易溶于二甲基甲酰胺，在水溶液中可逐渐转化成反式和水解。临床上对卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。

紫杉醇：一种天然抗癌药物，分子式为C47H51NO14，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。

5-FU：胸苷酸合成酶抑制药，是尿嘧啶5位上的氢被氟取代的衍生物。5-FU在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（dUMP）甲基化转变为脱氧胸苷酸（dTMP），从而影响DNA的合成。此外，5-FU在体内可转化为5-氟尿嘧啶核苷，以伪代谢产物形式掺入RNA中干扰蛋白质的合成，故对其他各期细胞也有作用。

酶标仪：即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附试验的专用仪器又称微孔板检测器。可简单地分为半自动和全自动两大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计,即用比色法来进行分析。测定一般要求测试液的最终体积在250μL以下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。

胶原酶：化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，它对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。

胰酶：是一种自猪胰中提取的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶、胰淀粉酶与胰脂肪酶。其通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身部细胞骨架的力作用下成为球形，从而使细胞分开。

基质胶：是从富含胞外基质蛋白EHS小鼠肿瘤中提取出的可溶性基底膜制备物，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等组成，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子。

本申请的技术方案是提供一种基于肿瘤类器官模型的体外诱导耐药方法，包括以下步骤：

步骤S1：取部分肿瘤类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，离心，收集细胞。

步骤S2：将收集的细胞用1.5v/v%~2.5v/v%的基质胶重悬并于培养容器中培养22h~26h后，加入设有浓度梯度的抗肿瘤药物，培养4~6天后，对类器官进行药物检测计算IC50值。

步骤S3：余下的类器官接种至新的孔板中，加入所测得的IC50值对应浓度的药物进行诱导处理，2~4天后，更换不含药物的培养基，恢复并扩增获得下一代类器官。

步骤S4：重复步骤S1~S3，获得新的IC50值及新一代类器官，以此反复3~5个耐药筛选周期。

其中，IC50值可以用来衡量药物杀伤细胞的能力，即杀伤能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

在一个具体的示例中，步骤S3加入IC50对应浓度的所述药物后培养70h~74h，例如可以是70h、71h、72h、73h、74h。

可选地，步骤S2中加入所述药物进行培养的检测组共设置有n个，n≥3，例如3个检测组、4个检测组、5个检测组。

进一步可选地，步骤S2中还设置m个不添加药物进行培养的对照组，m≥3，例如3个对照组、4个对照组、5个对照组。

在一个具体的示例中，步骤S2所述培养容器为细胞培养板。例如96孔圆底细胞培养板。其中，步骤S2中所述药物检测为加入检测试剂后，将培养容器避光摇床15min~25min，检测吸光度值并计算IC50值。例如摇床15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min。

可选地，步骤S2中所述抗肿瘤药物的浓度梯度依次为0.032μM、0.16μM、0.8μM、4μM和20μM。

在一个具体的示例中，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

可选地，所述胰酶的工作浓度为0.05w/v%~0.25w/v%，例如0.05w/v%、0.10w/v%、0.15w/v%、0.20w/v%、0.25w/v%。

本申请另一方面提供一种肿瘤类器官的耐药模型，该肿瘤类器官耐药模型的制备方法包括上述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法中的步骤。

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

（一）肿瘤类器官的培养

（1）将获取的肿瘤组织剪碎至肉糜状后移入离心管中，并加入5mL胶原酶消化液，37℃恒温震荡消化45min。

（2）300g离心5min，轻轻吸弃上清；加入5 mL胰酶，37℃恒温震荡消化5min。

（3）加入5mL的10 v/v % FBS DMEM，300g离心5min，轻轻吸弃上清。

（4）用10mL的PBS重悬消化后的细胞，用70μm细胞滤网过滤；300g离心5min，弃上清。

（5）取50μL类器官完全培养基重悬底部细胞，并放置于冰上预冷。将枪头插入预冷的PBS中反复吹打几次预冷枪头，吸取250μL基质胶加入重悬的细胞中，轻轻吹打混匀，避免气泡产生。

（6）预冷枪头后吸30μL每滴细胞悬液接种至细胞孔板中。

（7）迅速将细胞孔板翻转，置于37℃，5%的CO₂培养箱内孵育10min~15min使基质胶凝固。

（8）加液培养：待基质胶凝固后加入2.5mL类器官培养基，并置于37℃，5%CO₂培养箱内培养；根据类器官生长状况，2~3天换一次液。

（二）肿瘤类器官的药物敏感性测试

（1）收集部分含肿瘤类器官的基质胶滴，移入15mL离心管，300g，离心5min，轻轻吸弃上清。

（2）加入3mL胰酶于37℃消化3min，期间轻轻颠倒混匀5次。

（3）加入6 mL 10 v/v % FBS的DMEM，300g离心5min，弃上清。

（4）从冰箱中拿出冷的类器官培养基，根据100μL/孔取适量培养基重悬底部细胞，混匀后置于冰上预冷。

（5）用预冷的PBS润洗枪头后，吸取适量基质胶加入细胞悬液中，使其浓度为2 v/v%，混匀并置于冰上预冷。

（6）混匀以100μL/孔快速分至96孔圆底低吸附板中。置于37℃，5%的CO₂加湿培养箱内培养。

（7）待肿瘤类器官细胞培养24h后，观察类器官状态，待类器官聚集成球，进行记录。

（8）将待测药物按需求配置相应浓度梯度，分别以50μL/孔加入至各检测孔中，每个药物至少设置3个重复孔，并同时设置好对照孔。

（9）加药后，置于37℃，5%的CO₂加湿培养箱内培养5天进行药物检测。

（10）药物作用5天后，加入100μL/孔检测试剂，将培养板放暗盒里放摇床20min。

（11）用排枪轻轻吸上清100μL/孔转至黑色96孔板中，并用酶标仪检测。

（12）根据细胞活性数值计算IC50。

（三）肿瘤类器官的药物诱导

（1）将余下基质胶团，接种至新的孔板。

（2）加入所测得的IC50值对应浓度的药物，置于37℃，5%的CO₂加湿培养箱内培养，3天后更换不含药物的培养基，继续培养1天使其恢复。

（四）肿瘤类器官的传代

（1）收集基质胶团，与液体一起转入15mL离心管中，轻轻吹打几次后，300g离心5min，弃上清。

（2）加入3mL类器官消化液于37℃消化3min，期间颠倒混匀5次。

（3）加入6mL DMEM/F12(10 v/v %FBS)，于300g离心5min，弃上清。

（4）将枪头插入预冷的PBS中反复吹打几次预冷枪头，吸300μL基质胶加入重悬的细胞中，轻轻吹打混匀，避免气泡产生。

（5）将枪头插入预冷的PBS中反复吹打几次预冷枪头，吸30μL每滴细胞悬液滴入孔板中。为防止基质胶凝固，操作时应当迅速。

（6）将板翻转置于37℃，5%的CO₂加湿培养箱内孵育10分钟使基质胶凝固。

（7）沿孔壁加入2.5 mL培养基，切勿直接对着基质胶微滴加培养基，因为这样会破坏基质胶的微滴结构。将培养板置于37℃，5%的CO₂加湿培养箱内，根据类器官生长状况2~3天换一次液。

（五）药物循环诱导肿瘤类器官的过程

P1：测定初代类器官对于药物的IC50；

P2：以P1的IC50对应的药物浓度进行筛选3天，再换用培养基维持培养至恢复，再扩增；测定类器官对药物的IC50值；

P3：以P2的IC50对应的药物浓度进行筛选3天，再换用培养基维持培养至恢复，再扩增；测定类器官对药物的IC50值；

P4：以P3的IC50对应的药物浓度进行筛选3天，再换用培养基维持培养至恢复，再扩增；测定类器官对药物的IC50值；

P5：以P4的IC50对应的药物浓度进行筛选3天，再换用培养基维持培养至恢复，再扩增；测定类器官对药物的IC50值。

具体的流程如图1所示，分别对初代类器官和诱导后类器官进行药敏检测，扩增并冻存。不同种类与不同药物测定如表1所示。

表1

具体IC50的变化如图2~图5所示。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：取部分肿瘤类器官进行消化处理，将所述类器官的组成细胞分散，离心，收集细胞；

步骤S2：将收集的细胞用1.5v/v%~2.5v/v%的基质胶重悬并于培养容器中培养22h~26h后，加入设有浓度梯度的抗肿瘤药物，培养4~6天后，对类器官进行药物敏感性检测计算IC50值；

步骤S3：余下的类器官接种至新的孔板，加入所测得的IC50值对应浓度的药物进行诱导处理，2~4天后，更换不含药物的培养基，恢复并扩增获得下一代类器官；

步骤S4：重复步骤S1~S3，获得新的IC50值及新一代类器官，以此反复3~5个耐药筛选周期。

2.根据权利要求1所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S3加入所述药物后培养70h~74h。

3.根据权利要求1所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S2中加入所述药物进行培养的检测组共设置有n个，n≥3。

4.根据权利要求1所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S2中还设置m个不添加药物进行培养的对照组，m≥3。

5.根据权利要求1~4任一项所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S2所述培养容器为96孔圆底低吸附细胞培养板。

6.根据权利要求1~4任一项所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S2中所述药物检测为加入检测试剂后，将培养容器避光摇床15min~25min，检测吸光度值并计算IC50值。

7.根据权利要求1~4任一项所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S2中所述抗肿瘤药物的浓度梯度依次为0.032μM、0.16μM、0.8μM、4μM和20μM。

8.根据权利要求1~4任一项所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，步骤S1中所述消化处理为采用胰酶进行处理。

9.根据权利要求8所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法，其特征在于，所述胰酶的工作浓度为0.05w/v%~0.25w/v%。

10.一种肿瘤类器官的耐药模型，其特征在于，所述肿瘤类器官耐药模型的制备方法包括权利要求1~9任一项所述的构建肿瘤类器官耐药模型的方法中的步骤。

Images