CN115786181A - 一株湖南假单胞菌株pad-1、废水处理剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株湖南假单胞菌株PAD‑1、废水处理剂及其应用。本发明提供了一株湖南假单胞菌株PAD‑1(Pseudomonashunanensis strainPAD‑1)，所述的湖南假单胞菌株PAD‑1的保藏编号为CCTCCNO:M20221381。本发明所述湖南假单胞菌株PAD‑1具有好氧反硝化能力，同时还具有成本低、绿色环保的优势。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株湖南假单胞菌株PAD-1、废水处理剂及其应用。
背景技术
目前，由于人类生产活动造成了大量的硝酸盐进入生态系统，导致湖泊河流的富营养化。为了解决这一生态问题，各地政府建设了大量污水处理厂。在这些污水处理厂中，生物脱氮是去除硝酸盐最有效的措施。通常，为了保证生物脱氮的高效率，相关技术人员会添加额外的有机碳源来维持污水处理系统的反硝化活性。但是，有机碳源的添加不仅增加了污水处理厂运行成本还会造成严重二次污染。
许多研究报道，Fe(II)可以促进反硝化细菌的生长，提高反硝化速率。研究人员还观察到Fe(II)的加入有利于血红素的合成，提高了反硝化功能基因的相对丰度，从而促进反硝化速率。然而，这些研究大多关注于亚铁盐和铁屑，这导致运行成本较高。
如今大宗商品价格的急剧上涨，因此需要一种低成本且绿色环保的高效脱氮技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株湖南假单胞菌株PAD-1、废水处理剂及其应用。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1具有好氧反硝化能力，同时还具有成本低、绿色环保的优势。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一株湖南假单胞菌株PAD-1(Pseudomonas hunanensis strainPAD-1)，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的保藏编号为CCTCC NO:M 20221381。
本发明提供了一种废水处理剂，所述废水处理剂的有效成分包括上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1和/或湖南假单胞菌株PAD-1制备物。
优选的，所述湖南假单胞菌株PAD-1制备物包括湖南假单胞菌株PAD-1培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清和发酵液提取物中的一种或多种。
优选的，所述废水处理剂中湖南假单胞菌株PAD-1的OD600＝0.91～1.63。
优选的，所述废水处理剂的有效成分还包括黄铁矿。
优选的，所述废水处理剂中黄铁矿的浓度为0.8～3.2g/L。
本发明提供了上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂在废水处理中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂在富氮废水处理中的应用。
本发明提供了一种废水的处理方法，所述处理方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂与废水混合，进行废水处理。
优选的，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的接种量为废水体积的0.1％～1％。
有益效果：本发明提供了一株湖南假单胞菌株(Pseudomonas hunanensisstrain)PAD-1，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的保藏编号为CCTCC NO:M20221381。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1具有好氧反硝化能力，可直接将硝氮转化为气体产物，亚硝氮和氨氮积累量较少，进一步达到了有效处理低C/N废水的效果，同时还具有成本低、绿色环保的优势。在处理低碳废水中该菌株表现优异的性能，其培养方法操作简单，能耗和成本低。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。
而且，本发明还提供了一种废水处理剂，本发明所述的菌株能够与黄铁矿耦合处理低C/N废水的菌株，本发明所述的菌株在黄铁矿的协同作用下有更强的脱氮效率，同时也有更好的碳源利用率，并且本发明所述废水处理剂还具有使用方便，操作简单的优势，降低了污水处理成本，因此，本发明所述菌株能够达到有效处理废水的效果，而且本发明所述菌株能与黄铁矿耦合后处理低C/N废水的处理效果更显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为菌株PAD-1的菌落形态图；
图2为菌株PAD-1的系统发育树；
图3为湖南假单胞菌PAD-1氮通路相关基因的扩增结果；
图4为好氧培养下，菌株湖南假单胞菌PAD-1以氨氮为唯一氮源时的生长及氨氮、硝氮和亚硝氮的变化图；
图5为好氧培养下，菌株湖南假单胞菌PAD-1以硝氮为唯一氮源时的生长及氨氮、硝氮和亚硝氮的变化图；
图6为好氧培养下，不同含量的黄铁矿对菌株湖南假单胞菌PAD-1反硝化脱氮的影响，其中a为总氮，b为硝氮，c为亚硝氮，d为氨氮；
图7为好氧培养下，在不同C/N下黄铁矿对湖南假单胞菌PAD-1反硝化脱氮强化作用，其中a为总氮，b为硝氮，c为亚硝氮，d为氨氮；
图8为好氧培养下，黄铁矿对湖南假单胞菌PAD-1呼吸作用和氮转化率的影响，其中左侧图片为呼吸作用，右侧图片为氮转化率；
图9为好氧培养下，黄铁矿对南假单胞菌PAD-1电子传递链的影响，其中a为Zeta电位，b为NADH的含量，c为电化学阻抗谱(EIS图谱)，d为ETSA的含量，Control为对照组(无黄铁矿添加)，Pyrite为含黄铁矿的处理组；
图10为好氧培养下，黄铁矿对南假单胞菌PAD-1酶活的影响，其中a为蛋白质含量，b为Complex I的活性，c为Complex III的活性，d为Cyt C的活性，Control为对照组(无黄铁矿添加)，Pyrite为含黄铁矿的处理组，protien concentration为蛋白质浓度；
图11为黄铁矿强化电子传递机理图。
生物保藏信息
湖南假单胞菌株(Pseudomonas hunanensis strain)PAD-1，与2022年09月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M 20221381，保藏邮编为430072。
具体实施方式
本发明中，“C/N比”是碳氮比，C是指碳，carbon的简称；N是指氮，nitrogen的简称。碳氮比，是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比值。
本发明中，“培养物”是指将菌接种于任何合适的培养基进行制备的产物，培养基的类型可以根据不同的需求进行替换，也包括对常用培养基的成分优化。
本发明中，“制备物”指通过本发明菌株制备的产物，其制备方式可以是任何现有技术中的方式或者未来任何可能的方式，其特点在于通过本发明的菌株进行制备，制备方式可以多样。
本发明中，“富氮废水”指含有较多氮元素的废水，氮元素的形式包括但不限于硝氮、亚硝氮、氨氮。
本发明提供了一株湖南假单胞菌株PAD-1(Pseudomonas hunanensis strainPAD-1)，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的保藏编号为CCTCC NO:M 20221381。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1的菌落形态为菌落呈圆形，白色，湿润，表面光滑，菌体呈杆状，约0.1～0.2×1～2.0μm。本发明提供湖南假单胞菌株菌株PAD-1具有好氧反硝化的功能，可直接将硝氮转化为气体产物，亚硝氮和氨氮积累量较少，能够有效处理废水。
湖南假单胞菌株PAD-1生长性能与实验室前期分离的好氧反硝化菌株Methylobacteriumgregans DC-1、PseudomonasstutzeriAD-1相似。湖南假单胞菌株PAD-1有更高的去除率，在60h内，NO3 --N含量从初始值200mg/L下降到21.21mg/L，去除速率达2.98mg/L/h，高于好氧反硝化菌株Methylobacterium gregans DC-1去除率、Pseudomonasstutzeri AD-1去除率及已报道的菌株Rhodococcus sp.CPZ24、Pannonibacterphragmitetus B1和Enterobacter cloacae HW-15，好氧反硝化菌株Methylobacterium gregans DC-1的去除率为2.73mg/L/h，Pseudomonas stutzeriAD-1的去除率为2.08mg/L/h，Rhodococcus sp.CPZ24的去除率仅为0.93mg/L/h，Pannonibacterphragmitetus B1的去除率为0.81mg/L/h，Enterobactercloacae HW-15的去除率为0.28mg/L/h。因此，上述结果表明湖南假单胞菌株PAD-1对NO3 --N具有较高的去除效率，在废水处理系统中的生物修复中具有潜在的应用前景。
其中好氧反硝化菌株Methylobacterium gregans DC-1公开于《Oscar OmondiDonde,Bangding Xiao.Efficacy of zero nitrous oxide emitting aerobicdenitrifying bacterium,Methylobacterium gregans DC-1 in nitrate removal withstrong auto-aggregationproperty.Bioresource Technology》(Pei Hong,Yilin Shu,Xingqiang Wu,Chunbo Wang,Cuicui Tian,Hailong Wu,Oscar Omondi Donde,BangdingXiao.Efficacy of zero nitrous oxide emitting aerobic denitrifying bacterium,Methylobacterium gregans DC-1 in nitrate removal with strong auto-aggregationproperty.Bioresource Technology,2019,293)，Pseudomonas stutzeriAD-1公开于《Novel heterotrophic nitrogen removal and assimilation characteristic of thenewly isolated bacterium Pseudomonas stutzeri AD-1.Journal of Bioscience andBioengineering》(Hui Qing,Oscar Omondi Donde,Cuicui Tian,Chunbo Wang,XingqiangWu,Shanshan Feng,Yao Liu,Bangding Xiao.Novel heterotrophic nitrogen removaland assimilation characteristic of the newly isolated bacterium Pseudomonasstutzeri AD-1.Journal of Bioscience and Bioengineering,2018,126:339-345)，Rhodococcus sp.CPZ24公开于《Simultaneous heterotrophic nitrification andaerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp.CPZ24.Bioresour.Technol.》(P.Chen,J.Li,Q.X.Li,Y.Wang,S.Li,T.Ren,L.Wang.Simultaneous heterotrophicnitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcussp.CPZ24.Bioresour.Technol.,2012,116:266-270)，Pannonibacter phragmitetus B1公开于《High-efficiency inorganic nitrogen removal by newly isolatedPannonibacter phragmitetus B1.Bioresour.Technol.》(H.Bai,S.Liao,A.Wang,J.Huang,W.Shu,J.Ye.High-efficiency inorganic nitrogen removal by newlyisolated Pannonibacter phragmitetus B1.Bioresour.Technol.,2019,271:91-99)，Enterobacter cloacae HW-15公开于《Removal of nitrogen and phosphorus byHeterotrophic nitrification-aerobic denitrification of a denitrifyingphosphorus-accumulatingbacterium Enterobacter cloacae HW-15.》(W.J.Wan,D.L.He,Z.J.Xue.Removal of nitrogen and phosphorus by Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification of a denitrifying phosphorus-accumulatingbacteriumEnterobacter cloacae HW-15.Ecol.Eng.,2014,99:199-208)。
本发明还优选提供了上述技术方案所述湖南假单胞菌株PAD-1的培养方法，包括以下步骤：将所述湖南假单胞菌株PAD-1接种于培养基中培养，得到湖南假单胞菌株PAD-1种子液；将湖南假单胞菌株PAD-1种子液接种到DBM培养基进行扩大培养，得到扩繁的湖南假单胞菌株PAD-1。本发明所述培养基优选包括但不限于：反硝化富集培养基(简称DBM)、溴百里酚蓝培养基(简称BTB)和好氧反硝化测试培养基(简称ADM)；所述湖南假单胞菌株PAD-1的接种量优选为培养基体积的1％～5％，更优选为2～4％；在本发明具体实施例中，所述南假单胞菌株PAD-1的接种量优选为培养基体积的1％或5％；所述培养的时间优选为2.5d～7d，还优选为3～6d，更优选为4～5d，温度为25～30℃，转速为200r/min。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1种子液的接种量优选为DBM培养基体积的1％；所述扩大培养的的时间优选为5d～7d，温度优选为25～30℃，还优选为26～29℃，更优选为27～28℃；所述DBM的组分及用量优选如表1所示，DBM也称为反硝化富集培养基。
表1反硝化富集培养基的组成
注：每升微量元素溶液包含1.80gFeCl2·4H2O、0.70gMnCl2·4H2O、0.50gZnCl2、0.50gH3BO3、0.25gCoCl2·6H2O、0.03gNa2MoO4·2H2O、0.01gNiCl2·6H2O、0.01gNa2SeO3·5H2O和0.01g CuCl2·2H2O。
本发明提供了一种废水处理剂，所述废水处理剂的有效成分包括上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1和/或湖南假单胞菌株PAD-1制备物。本发明所述废水处理剂中湖南假单胞菌株PAD-1的OD600优选为0.91～1.63，进一步优选为1～1.63，更优选为1.5～1.63，最优选为1.63。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1制备物优选包括湖南假单胞菌株PAD-1培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清和发酵液提取物中的一种或多种，更优选包括湖南假单胞菌株PAD-1冻干粉或湖南假单胞菌株PAD-1发酵液。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
本发明所述废水处理剂的有效成分还优选包括黄铁矿，更优选为黄铁矿。本发明所述废水处理剂中黄铁矿的浓度优选为0.8～3.2g/L，更优选为0.8～1.6g/L，最优选为1.6g/L。
本发明提供了上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂在废水处理中的应用，进一步的本发明提供了上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂在富氮废水处理中的应用。本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1或所述废水处理剂能够处理的富氮废水中硝氮的浓度为10～200mg/L，更优选为200mg/L，亚硝氮的浓度为10～200mg/L，氨氮的浓度优选为10～200mg/L，总氮的浓度优选为10～200mg/L；所述富氮废水的pH值优选为5～9，更优选为6～8。
本发明提供了一种废水的处理方法，所述处理方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的湖南假单胞菌株PAD-1或上述技术方案所述废水处理剂与废水混合，进行废水处理。
本发明所述的湖南假单胞菌株PAD-1的接种量优选为废水体积的1％～5％，更优选为2～4％；所述废水处理剂的体积优选为废水的体积的1％～5％，更优选为2～4％；在本发明具体实施例中，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的接种量优选为废水体积的1％或5％。本发明所述废水处理的方式优选为好氧培养，也称为自然富氧培养；所述好氧培养的时间优选为2.5d～7d，温度为25～30℃。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
培养基准备：
好氧反硝化测试培养基(ADM)成分如下：1.44g/L KNO3，1.50g/LKH2PO4，16.67g/LC4H4Na2O4·6H2O，5.27g/LNa2HPO4·12H2O，0.10g/LMgSO4，2mL微量元素溶液；每升微量元素溶液包含1.80g FeCl2·4H2O、0.70g MnCl2·4H2O、0.50g ZnCl2、0.50g H3BO3、0.25gCoCl2·6H2O、0.03g Na2MoO4·2H2O、0.01g NiCl2·6H2O、0.01g Na2SeO3·5H2O和0.01gCuCl2·2H2O。
溴百里酚蓝培养基(BTB)如下：C6H5Na3O78.50 g/L、KNO31.00 g/L、KH2PO41.00g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L、CaCl20.20 g/L、MgSO4·7H2O 1.00g/L、1％溴百里香酚蓝1mL和Agar20g/L。
实施例1菌株的筛选与分离
样品采集：取自滇池沉积物。
菌株的富集培养与分离：取5g沉积物加入100mL的反硝化富集培养基(DBM)中，置于30℃、120r/min摇床中培养1周。取10mL富集液涂布于溴百里酚蓝培养基(BTB)做成的平板上，倒置于30℃恒温培养箱中培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取不同的单菌落进行分离纯化并编号。
菌株筛选：将分离纯化的菌种分别接种于反硝化测试培养基(ADM)中，接种量为反硝化测试培养基(ADM)体积的5％，于30℃、200r/min培养。24h后，测定培养基中总氮(TN)浓度。最终筛选得到具有高效脱氮能力的菌株20株(24小时内的总氮率高于95％)，并通过肉眼观察发现其中有一株新菌的胞外分泌物显著高于其他细菌，该菌株能与黄铁矿形成大絮体，因此选取该菌属作为后续实验研究对象，并将其记为菌株PAD-1。
实施例2菌株PAD-1形态学和分子生物学鉴定
利用扫描电镜观察菌株PAD-1的菌落形态和细胞形态，由图1可知，菌株PAD-1菌落形态：菌落呈圆形，白色，湿润，表面光滑，菌体呈杆状，约0.1～0.2×1～2.0μm。
将菌株PAD-1接种于好氧反硝化测试培养基(ADM)中，接种量为富氮废水培养基体积的5％，在30℃下200r/min恒温振荡培养100h，得到种子液。
分子生物学鉴定：检测公司武汉艾康健生物科技有限公司，具体步骤为：利用16SrDNA基因的扩增通用引物，具体为：primers 27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，SEQ IDNO:1，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，SEQ ID NO:2；以菌株PAD-1的种子液作为模板进行PCR扩增，PCR扩增的具体方法参考《一株异养硝化-好氧反硝化菌的分离鉴定及其对养殖废水中氮的去除特性》(陈猛,李安章,张明霞,等.一株异养硝化-好氧反硝化菌的分离鉴定及其对养殖废水中氮的去除特性[J].农业资源与环境学报,2020,37(2):10.)，得到PCR产物，共有1424bp，如SEQ ID NO.3所示，具体为：GATGGCTACGGCTACCATGCAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGATAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGAGGACGTAGCCAT；该序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST检索程序系统进行序列同源性分析，发现与该菌株(Pseudomonas hunanensis,MN946623)的16S rDNA基因序列相似度为99％，并根据该菌株的16S r DNA基因构建的系统发育树，如图2所示，图2中的Strain PAD-1为菌株PAD-1。
根据菌株PAD-1的形态特征、生理生化性质和分子生物学鉴定特征，鉴定菌株PAD-1属于湖南假单胞菌，并命名为湖南假单胞菌PAD-1。
实施例3湖南假单胞菌PAD-1的培养方法
将湖南假单胞菌PAD-1接种于好氧反硝化测试培养基(ADM)中，接种量为富氮废水培养基体积的5％，在30℃下200r/min恒温振荡培养100h，得到种子液；
将种子液接种到DBM培养基中进行扩大培养，扩大培养的时间为7d，温度为30℃，接种量为DBM培养基体积的1％，得湖南假单胞菌PAD-1菌液。
实施例4湖南假单胞菌PAD-1氮通路相关基因的扩增
以实施例3培养的得到的湖南假单胞菌PAD-1菌液为模板，对湖南假单胞菌PAD-1中氮通路相关基因进行扩增，相关基因为：NapA，NarG，NirS，NorB和NosZ基因，扩增引物见表2。
表2扩增引物的具体信息
注：NapA为周质硝酸盐还原酶基因，NarG为硝酸盐还原酶基因、NirS为亚硝酸盐还原酶基因、NorB为一氧化氮还原酶基因、NosZ为氧化亚氮还原酶基因。
扩增体系为25μL体系，其中包括：2xES Taq MasterMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1.0μL，模板0.5μL，double-distilled water 10μL；
扩增条件为：95℃预变性5min，然后进行35个循环：94℃，30s；退火20S，其中NapA的退火温度为62℃，NarG的退火温度为57℃，NirS的退火温度为57℃，NorB的退火温度为58℃，NosZ的退火温度为57℃；72℃延伸5min。
扩增结果见图3，其中M为Marker。表明，湖南假单胞菌PAD-1呈现较为完整的反硝化通路，成功扩增出周质硝酸盐还原酶基因、硝酸盐还原酶基因、亚硝酸盐还原酶基因和氧化亚氮还原酶基因。
实施例5
将湖南假单胞菌PAD-1接种于500mL以氨氮为唯一氮源的培养基中进行好氧培养，接种量为以氨氮为唯一氮源的培养基体积的1％，以氨氮为唯一氮源的培养基的组分为0.76g/LNH4 +-N，1.50g/LKH2PO4，16.67g/L C4H4Na2O4·6H2O，5.27g/LNa2HPO4·12H2O，0.10g/L MgSO4，2mL的微量元素；每升微量元素包含1.80g FeCl2·4H2O、0.70g MnCl2·4H2O、0.50gZnCl2、0.50g H3BO3、0.25g CoCl2·6H2O、0.03g Na2MoO4·2H2O、0.01g NiCl2·6H2O、0.01gNa2SeO3·5H2O和0.01g CuCl2·2H2O，氨氮的浓度为200mg/L，好氧培养的时间为120h，温度为30℃。
实施例6
将湖南假单胞菌PAD-1接种于500mL以硝氮为唯一氮源的培养基中进行好氧培养，接种量为以硝氮为唯一氮源的培养基体积的1％，以硝氮为唯一氮源的培养基的组分为1.44g/LKNO3，1.50g/LKH2PO4，16.67g/L C4H4Na2O4·6H2O，5.27g/LNa2HPO4·12H2O，0.10g/LMgSO4，2mL的微量元素；每升微量元素包含1.80g FeCl2·4H2O、0.70g MnCl2·4H2O、0.50gZnCl2、0.50g H3BO3、0.25g CoCl2·6H2O、0.03g Na2MoO4·2H2O、0.01g NiCl2·6H2O、0.01gNa2SeO3·5H2O和0.01g CuCl2·2H2O，硝氮的浓度为200mg/L，好氧培养的时间为120h，温度为30℃。
在实施例5和实施例6中好氧培养的第0、3h、6h、9h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、90h和120h进行测定不同氮源对废水中氨氮、硝态氮、亚硝氮以及废水中湖南假单胞菌PAD-1的OD600和LogOD600的影响，其中硝氮和亚硝氮用离子色谱测定，氨氮用纳氏试剂分光光度法测定，实施例5的结果见图4，实施例6的结果见图5，由图4和图5可知，好氧培养下，菌株PAD-1分别以氨氮和硝氮为唯一氮源时，能稳定生长并实现稳定脱氮。
实施例7黄铁矿含量对湖南假单胞菌PAD-1反硝化脱氮的影响
将湖南假单胞菌PAD-1在反硝化富集培养基中30℃培养至对数期，将对数期的湖南假单胞菌PAD-1接种于含有黄铁矿的富氮废水培养基中，接种量为富氮废水培养基体积的1％，在温度30℃，摇床转速200r/min，好氧培养100h，含有黄铁矿的富氮废水培养基中黄铁矿的浓度分别为0.8g/L、1.6g/L和3.2g/L，该反硝化富集培养基中的C/N为15，以富氮废水培养基为空白对照组，记为Control。
测定不同黄铁矿量对富氮废水中总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮的影响，其中硝氮和亚硝氮用离子色谱测定，氨氮用纳氏试剂分光光度法测定，总氮各种形态氮总和。实验结果如图6所示，发现黄铁矿加入能够显著强化了湖南假单胞菌PAD-1的脱氮过程，当黄铁矿浓度为0.8～1.6g/L，其在18h时的可溶性总氮去除率高于97％，远高于同时期的空白对照组的6％，但持续增强黄铁矿浓度其脱氮强化效果将降低。从图6中左上折线图看出当黄铁矿浓度为3.2g/L时，18h时PAD-1的TN去除率仅为18.6％，但其在24h也能达到97.1％，远高于对照组的28.5％。因此，黄铁矿的最佳添加量为1.6g/L。
实施例8不同C/N比下菌株PAD-1反硝化脱氮情况
将湖南假单胞菌PAD-1分别接种于C/N为0、2:1、5:1、10:1和15:1的反硝化富集培养基中，该部分所使用的培养基为好氧反硝化测试培养基(ADM)，并根据需要调整该培养基中C4H4Na2O4·6H2O的浓度调整C/N，黄铁矿的浓度为1.6g/L，接种量为好氧反硝化测试培养基体积的1％，在温度30℃，摇床转速200r/min，好氧培养60h，记为含黄铁矿的处理组，即Pyrite，分别以无黄铁矿添加的C/N为0、2:1、5:1、10:1和15:1的好氧反硝化测试培养基(ADM)为对照组，即Control。
测定不同黄铁矿量对富氮废水中总氮、氨氮、硝态氮和亚硝氮的影响，其中硝氮和亚硝氮用离子色谱测定，氨氮用纳氏试剂分光光度法测定，总氮各种形态氮总和。实验结果如图7所示，与对照组相比，含有黄铁矿的处理总脱氮率均有所提高。在C/N＝2～15：1范围内，黄铁矿对PAD-1反硝化作用的强化效果与C/N呈正相关。另外，在C/N＝15:1时达到了最佳的强化效果。此外，在C/N＝5：1和C/N＝10：1下，黄铁矿组在60h时总氮的去除率达到90％以上，表现优于对照组。此外，如图7中的c所示，黄铁矿在18小时显著减少了亚硝酸盐的积累，同时增强了反硝化作用。在低C/N时，尤其是在C/N＝2：1时，黄铁矿组中积累了少量氨氮，因此，在极低C/N时，硝酸盐可以与黄铁矿和反硝化剂一起转化为氨氮。
测定黄铁矿对湖南假单胞菌PAD-1呼吸作用和氮转化率的影响，使用GC测定60h时含有黄铁矿组的处理和对照组中CO2和N2生成量，用于各组的呼吸作用和氮转化率，实验结果见表2和图8。
表2不同处理的呼吸作用和氮转化率
实验结果如表2和图8所示，湖南假单胞菌PAD-1的呼吸强度与C/N呈正相关。深入分析后，与对照组相比，含黄铁矿的处理南假单胞菌PAD-1的呼吸速率显着增加，表明黄铁矿可以提高南假单胞菌PAD-1的活性并加快其细胞代谢速率。因此，较高的细胞代谢率将促进有机碳的分解，进一步为反硝化提供更多的电子供体。由图8中的b可知，培养60h后，湖南假单胞菌PAD-1的氮转化率达到38.34％，提高了7.62％。
实施例9黄铁矿对湖南假单胞菌PAD-1电子传递链、蛋白质及酶活的影响
将湖南假单胞菌PAD-1接种于C/N为15:1的好氧反硝化测试培养基(ADM)培养基中，好氧反硝化测试培养基(ADM)培养基，且好氧反硝化测试培养基中黄铁矿的浓度为1.6g/L，接种量为好氧反硝化测试培养基体积的1％，在温度30℃，摇床转速200r/min，好氧培养60h，含黄铁矿的处理组，以无黄铁矿添加的好氧反硝化测试培养基为对照组。
测定对黄铁矿对湖南假单胞菌PAD-1电子传递链、蛋白质及酶活的影响，其中电子传递链的检测方法根据参考文献Zhang Y,Lu C,Chen Z,et al.Multifacetedsynergistic electron transfer mechanism for enhancing denitrification by clayminerals[J].Science of the Total Environment,2022,812.，酶活的检测方法为ELISA试剂盒测定，蛋白质的检测方法为考马斯亮蓝，电子传递链的检测结果见图9、表3和表4，蛋白质和酶活检测结果见图10和表5，图11仅为本发明的电子传递流程图。
表3电子传递链的检测结果
表4电化学阻抗谱图的数据
表5蛋白质及酶活的检测结果
电子传递链的检测结果由图9、表3和表4可知，黄铁矿的加入显着增加了湖南假单胞菌PAD-1的NADH丰度，这为电子传输系统(ETS)提供了更多的电子，并有助于加速电子传输系统活性(ETSA)。图9中c为电化学阻抗谱图(EIS)，该图表明黄铁矿促进了电子转移。对照组和黄铁矿组实际ETSA显示，加入黄铁矿后，菌株PAD-1的电子转移增加了1.8倍。因此，黄铁矿强化了菌株PAD-1的电子传递系统。
蛋白和酶活检测由图10和表5可知，图10中的a表明黄铁矿的加入显着提高了3.07倍的蛋白质含量，这可能有助于增加特定的反硝化酶的数量，以促进加速脱氮。在电子传递链中，NADH通过Complex I的作用产生电子，然后电子转移到复合物III，最后转移到周质中的细胞周期蛋白Cyt C。从图10中的b、c中可以看出，黄铁矿的加入对Complex I没有显著影响，而使Complex III的活性显著提高了28％，这促进了电子输运系统中更多电子的形成。Cyt C是电子传递链中一个重要的电子转运蛋白，负责将电子从Complex III转移到反硝化酶。从图10中的d中可以看出，黄铁矿的加入不影响Cyt C的活性。因此，Cyt C不是电子传递系统活性增加的主要原因。
综上所述可知，本发明所述湖南假单胞菌株PAD-1具有好氧反硝化能力，可直接将硝氮转化为气体产物，亚硝氮和氨氮积累量较少，进一步达到了有效处理低C/N废水的效果，同时还具有成本低、绿色环保的优势。在处理低碳废水中该菌株表现优异的性能，其培养方法操作简单，能耗和成本低。而且本发明所述菌株能够与黄铁矿耦合处理低C/N废水的菌株，使用方便，操作简单，降低了污水处理成本，所述菌株能与黄铁矿耦合后处理低C/N废水，且处理效果更显著。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株湖南假单胞菌株PAD-1(Pseudomonas hunanensis strain PAD-1)，其特征在于，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的保藏编号为CCTCC NO:M20221381。
2.一种废水处理剂，其特征在于，所述废水处理剂的有效成分包括权利要求1所述的湖南假单胞菌株PAD-1和/或湖南假单胞菌株PAD-1制备物。
3.根据权利要求2所述的废水处理剂，其特征在于，所述湖南假单胞菌株PAD-1制备物包括湖南假单胞菌株PAD-1培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清和发酵液提取物中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的废水处理剂，其特征在于，所述废水处理剂中湖南假单胞菌株PAD-1的OD600＝0.91～1.63。
5.根据权利要求2所述的废水处理剂，其特征在于，所述废水处理剂的有效成分还包括黄铁矿。
6.根据权利要求5所述的废水处理剂，其特征在于，所述废水处理剂中黄铁矿的浓度为0.8～3.2g/L。
7.权利要求1所述的湖南假单胞菌株PAD-1或权利要求2～6任一项所述废水处理剂在废水处理中的应用。
8.权利要求1所述的湖南假单胞菌株PAD-1或权利要求2～6任一项所述废水处理剂在富氮废水处理中的应用。
9.一种废水的处理方法，其特征在于，所述处理方法，包括以下步骤：
将权利要求1所述的湖南假单胞菌株PAD-1或权利要求2～6任一项所述废水处理剂与废水混合，进行废水处理。
10.根据权利要求9所述的处理方法，其特征在于，所述的湖南假单胞菌株PAD-1的接种量为废水体积的1％～5％。
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