CN115724955B

CN115724955B - 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1及其应用

Info

Publication number: CN115724955B
Application number: CN202211149172.6A
Authority: CN
Inventors: 陈宇; 蓝柯; 吴莹; 张贞; 刘芳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2024-09-10
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: CN115724955A

Abstract

本发明提供了一种靶向RBD的高中和活性抗SARS‑CoV‑2全人源单克隆抗体14B1及其应用，所述全人源单克隆抗体14B1包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：EFTIDDYA、ISGDGGRT和AK，所述轻链可变区具有的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：QNISAN、GAS和QHYNNWP。所述全人源单克隆抗体14B1具有高效、特异的抗SARS‑COV‑2中和活性、高表达、全人源、稳定性好，可用于制备新冠病毒检测产品或预防和治疗新冠病毒疾病的药物。

Description

靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1 及其应用

技术领域

本发明属于微生物学和免疫学领域，涉及一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1及其应用。

背景技术

冠状病毒是一类在自然界中广泛存在的包膜正链RNA病毒，它可以感染禽类、蝙蝠及人类等多个物种，引起胃肠道、肝脏、呼吸系统和神经系统等疾病，对人及家畜存在重大威胁。已知可感染人的冠状病毒共有七种，其中四种低致病性的HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1呈全球性分布且在人群中普遍存在，通常只引起呼吸道感染，临床症状较轻，为发热，流涕，咳嗽等。2019冠状病毒病(COVID-19)，其病原体SARS-CoV-2 在进化上与SARS-CoV具有很近的亲缘关系，两者的临床症状也具有极高的相似性，感染早期均以发热、干咳、全身乏力等症状为主，晚期则易发展至不同程度的呼吸衰竭和急性肺炎，免疫力低下和患有基础疾病的人群病死率较高。SARS-CoV-2具有极强的传播能力和致病性。SARS-CoV-2病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约80～160nm。病毒颗粒最外层为脂质双分子层组成的囊膜，囊膜上有大量末端膨大的棘突，病毒颗粒内为病毒的非节段单股正链RNA和核衣壳蛋白(N)组成的核心。病毒基因组大小约30 kb，共编码29种蛋白质，其中包括16种非结构蛋白(nsp1-nsp16)、4种结构蛋白(S、E、M、N)和9种辅助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、ORF9c和ORF10)。病毒颗粒囊膜上含有三种不同的糖蛋白，分别为刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、小囊膜蛋白(E)。S蛋白是冠状病毒主要抗原蛋白，其结构是囊膜伸出末端的球状结构，功能为介导病毒与宿主细胞受体的结合及促进病毒包膜与细胞膜融合过程。

到目前为止，虽有针对新冠病毒的各类疫苗上市，但随着病毒的不断变异，疫苗的保护效果也受到严重挑战。另外，目前治疗冠状病毒的特效药物相对缺乏，经济成本高，临床上一般采用非特异性治疗，预防严重的并发症，降低重症发病率和死亡率，提高治愈率。因此，研发具有高保护效率的通用型新冠状病毒疫苗和特异性治疗药物成为全球应急科研攻关的首要任务。

因此，亟需开发一种针对COVID-19具有良好保护效果的全人源单克隆治疗性抗体。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1及其应用，该全人源单克隆治疗性抗体针对COVID-19具有良好保护效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1，所述全人源单克隆抗体14B1包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：EFTIDDYA、ISGDGGRT和AK，所述轻链可变区具有的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：QNISAN、GAS和QHYNNWP。

进一步地，所述单克隆抗体14B1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，所述单克隆抗体14B1的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，轻链恒定区的氨基酸序列均如SEQ ID NO：7所示。

进一步地，所述单克隆抗体还包括：

所述单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体；

或者包括具有与所述重链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的重链可变区；和与所述轻链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。

在另外一些实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的V_H和V_L区高度(即80％或更高)同源的V_H和V_L区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQIDNO：1-6的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能。

在其他实施方式中，可采用将可变区基因转化为scFv基因，一旦获得编码V_H和V_L片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。

在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。

进一步地，编码所述单克隆抗体14B1的重链可变区和轻链可变区的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。

进一步地，编码所述单克隆抗体14B1的重链恒定区的多核苷酸序列均如SEQ IDNO：6所示，轻链恒定区的多核苷酸序列均如SEQ ID NO：8所示。

在本发明的第三方面，提供了一种包含所述核酸的表达载体，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

所述载体具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或哺乳动物表达载体。本发明具体采用哺乳动物表达载体。

在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了所述的单克隆抗体在制备COVID-19治疗药物或新冠病毒检测产品中的应用。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体14B1显示出对SARS-COV-2感染细胞良好的中和保护效果。本发明的结果显示，所述抗体在制备COVID-19治疗药物中具有广泛应用的前景。具体地，本发明公开的单克隆抗体还具有以下的技术优势：

（1）全人源，在临床应用上，不需要进行人源化改造。

（2）高中和活性，在SARS-COV-2感染的细胞模型上，14B对SARS-CoV-2野生型的半数有效浓度（EC50）为7.664 ng/mL；14B对SARS-CoV-2 Delta株（B.1.617.2）的半数有效浓度（EC50）为8.548 ng/mL。

（3）作用机制明确：14B1与RBD高度特异结合，显示单抗是靶向受体结合区域的，通过特异性阻断病毒与受体的结合发挥抗病毒效应。

（4）稳定性好：因为单抗基因来自人体的同一个细胞，是天然配对的，已知人体内IgG1抗体的半衰期是21～28天，理论上公开的单抗具有一致的人体内半衰期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为流式细胞仪单细胞分选图；

图2为单克隆抗体可变区基因扩增自动核酸电泳仪检测图谱；

图3为亲和层析纯化后的变性SDS-PAGE检测图谱；

图4为检测14B1和RBD蛋白的结合活性随浓度变化的曲线图；

图5为抗体在假病毒细胞模型上的EC50测定曲线图；其中，图5A为单克隆抗体14B1对SARS-CoV-2野生型的半数有效浓度；图5B为单克隆抗体14B1对SARS-CoV-2 Delta株（B.1.617.2）的半数有效浓度；

图6为抗体在真病毒细胞模型上的EC50测定曲线图；其中，图6左图为单克隆抗体14B对SARS-CoV-2野生型的半数有效浓度；图6右图为单克隆抗体14B1对SARS-CoV-2 Delta株（B.1.617.2）的半数有效浓度。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的单克隆抗体及其制备方法与应用效果进行详细说明。

实施例1、人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体的筛选和制备1、准备96孔板：每孔20μl去RNA酶水+20U RNA酶抑制剂，盖好封板膜，放4℃待用2、准备样品：(1)复苏细胞：将冻存的分离自新冠肺炎恢复者外周血的PBMC细胞从-80℃取出，迅速置于37℃的温水中，待细胞融化后，800rpm离心5min，倒去上清；用2-3ml FPBS重悬到流式管中，配平后800rpm离心5min，倒去上清；再用2-3ml FPBS重悬，离心，倒上清。最后加入100μl FPBS重悬，吸取2μl稀释10倍进行细胞计数。

(2)单染管：7管(FVS-780、CD3-BV510、CD4-BV510、CD8-BV510、CD19-PE、IgD-BB700、CD20-BV421、CD38-FITC), 每管3× 10⁶个细胞，按照说明书推荐的抗体浓度将染料分别加入到装有细胞的流式管中，用FPBS将各反应体积补足50μl。(3)裸细胞对照：1管，3×10⁶个细胞，用FPBS补足50μl(4)用来分选的细胞：1管，先确定细胞的数量，终浓度为100μl体系 (1×10⁶cells)，同时加入FVS-780、CD3-BV510、CD4-BV510、CD8-BV510、CD19-PE、IgD-BB700、CD20-BV421、CD38-FITC和Biotin-S1荧光染料。

(5)将样品于4℃避光孵育1h。

(6)每管加入3ml FPBS，于4℃，800g离心5min，倒去上清，重复清洗两次。

(7)用400μl FPBS重悬后，用40μm细胞筛去除细胞团，4℃避光保存供分选。

3、流式分选：选择CD19⁺，CD3^-，CD4^-，CD8^-，IgD^-，CD38⁺，CD20^-，S1⁺的细胞进行分选。流式分选的结果见图1，首先选出淋巴细胞，然后选出未粘连的单个细胞，然后选出活细胞，然后选出CD19⁺、CD3^－、CD4^－、CD8^－的B细胞，然后选出IgD^－的成熟B细胞，最后选出S1⁺的成熟B细胞，即为我们的目标细胞。

4、利用单细胞-PCR技术扩增全人源单抗可变区基因

4.1反转录PCR参考说明书(QIAGEN，210212)，程序简单介绍如下：通过流式细胞仪分选了94个细胞。向每个反应体系中同时加入以下全部的针对重链(heavy chain，H)、Kappa轻链(kappa chain，κ)、Lamda轻链(Lamda chain，λ)各亚型的特异引物(引物序列见表1)。

引物：H：5′L-VH 1、L-VH 3、L-VH 4/6，5′L-VH 5、Hu IgG-const-anti、3′CμCH1

κ：5′L Vκ1/2、5′L Vκ3、5′L Vκ4、3′Cκ543–566λ：5′L Vλ1、5′L Vλ2、5′L Vλ3、5′LVλ4/5、5′L Vλ6、5′L Vλ7、5′L Vλ8、3′Cλ

表1-反转录PCR引物

引物名称	序列(5'-3')
		5'L-VH 1	ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
5'L-VH 3	AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
		5'L-VH 4/6	CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5'L-VH 5	CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
		Hu IgG-const-anti	TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCT
3'Cm CH1	GGGAATTCTCACAGGAGACGA
		5'L Vκ 1/2	ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
5'L Vκ 3	CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
		5'L Vκ 4	ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
3'Cκ 543-566	GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
		5'L Vλ1	GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG
5'L Vλ2	GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
		5'L Vλ3	GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5'L Vλ4/5	GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
		5'L Vλ6	GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5'L Vλ7	GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
		5'L Vλ8	GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
3'Cλ	CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG

PCR反应体系中包含：5×缓冲液6μL、dNTP 1 .2μL、反转录酶(Takara生物技术有限公司，RR036A)1 .2μL、引物如上、模板为单细胞，水补齐至30μL。

PCR反应条件为：50℃反转录30min；接着，95℃预变性15min，95℃40s，55℃30s，72℃1min，40个循环，最后72℃延伸10min。

4.2巢式PCR

取反转录产物1ul为模板，进行PCR反应扩增H、κ、λ的可变区：扩增重链可变区、kappa轻链可变区和λ轻链可变区的引物如下表2所示。

表2.巢式PCR引物

注：单独划线部分用于与上游片段融合，划线黑体部分用于与下游片段的融合。

PCR反应体系中包含：DNA聚合酶混合物(康为世纪生物科技有限公司，CW2849)12.5μL、引物如上、模板为反转录产物1μL、水补齐至25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性4min，接着，94℃30s，57℃30s，72℃45min，40个循环，最后72℃延伸10min。

4.3自动核酸电泳仪进行检测

自动核酸电泳检测的部分结果见图2，图中仅显示了14B1的重链和轻链可变区条带。

5、可变区序的多核苷酸序列的合成

委托苏州金唯智生物科技有限公司，根据上述多核苷酸序列合成抗体的可变区DNA序列。在抗体重链可变区和轻链可变区前添加信号肽序列和限制性酶切位点（5’-GAATTCGCCACCATGGAGACAGACACCCTGCTCCTGTGGGTGCTGCTG-3’），尾部添加限制性酶切位点（5’-GGTACC-3’）。

6、质粒表达载体的构建

委托苏州金唯智生物科技有限公司，根据抗体重链恒定区DNA序列和轻链恒定区DNA区序列，在重链和轻链恒定区DNA序列前添加限制性酶切位点（5’-GAGCTCGGTACC-3’）,序列尾部添加限制性酶切位点（5’-GCTAGC-3’），合成带有限制性酶切位点的抗体重链恒定区DNA序列和轻链恒定区DNA区序列（重链恒定区序列由SEQ ID NO:5所示，DNA编码序列由SEQ ID NO:6所示，Kappa型轻链恒定区序列由SEQ ID NO:7所示，DNA编码序列由SEQ IDNO:8所示)。利用限制性内切酶Nhe I和Sac I对pCAGGS空载质粒（可购买于上海远慕生物科技有限公司，货号P0165）和抗体重链恒定区DNA序列进行酶切，酶切后的质粒和抗体恒定区DNA片段利用T4 DNA连接酶进行连接即可得到含有抗体重链恒定区的质粒载体。利用限制性内切酶Nhe I和Sac I对pCAGGS空载质粒和抗体轻链恒定区DNA序列进行酶切，酶切后的质粒和抗体恒定区DNA片段利用T4 DNA连接酶进行连接即可得到含有抗体轻链恒定区的质粒载体。

利用限制性内切酶EcoR I和Kpn I对构建的含有抗体重链恒定区的质粒载体和第5步中合成的抗体重链可变区进行酶切，对酶切产物连接，即得到了可用于表达14B1抗体重链的真核表达载体。利用限制性内切酶EcoR I和Kpn I对构建的含有抗体轻链恒定区的质粒载体和第5步中合成的抗体轻链可变区进行酶切，利用T4 DNA连接酶对酶切产物连接，即得到了可用于表达14B1抗体轻链的真核表达载体。上述两个载体即可通过转染真核细胞的方式，进行抗体表达。

单克隆抗体14B1的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1第35-42、60-67、106-107位氨基酸序列所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQID NO:3第36-41、59-61、98-104位氨基酸序列所示。具体如表3所示。

表3

7、单抗的瞬时表达和亲和层析纯化

使用Expi293表达系统，取15ug重链和15ug轻链混合后转染Expi 293F细胞，按照转染试剂的说明书进行操作(上海李记生物科技有限公司，EZ Trans Plus，AC04L011)，5-6天后收获培养液，离心后上清约50ml，使用体积为5ml的预装Protein A亲和层析柱，上样前使用20mM PBS平衡，待电导显示到基线后进样，上样结束后，使用20mM PBS洗涤色谱柱至基线平稳，使用0.1M pH3.0的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，待OD280近基线后，停止收集，使用至少3个柱体积的20mM的PBS洗涤色谱柱，至基线平稳后，用20％的乙醇洗涤色谱柱。亲和层析纯化后的单抗SDS-PAGE检测结果见图3。由图3可知，成功纯化获得单克隆抗体14B1。

实施例2、人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体14B1与RBD的结合活性分析

1、包被：取RBD抗原用包被液稀释至浓度3μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。

2、封闭：每孔加入300μL PBST洗液，洗涤3次× 3min/次；拍净孔内液体，加入2％BSA，250μL/孔，37℃封闭1h。

3、样品孵育：每孔加入300μL PBST洗液，洗涤3次× 3min/次；拍净孔内液体，加入PBS稀释后的纯化单抗，首孔9ug/ml ,3倍系列稀释100μL/孔，37℃孵育2 h。

4、二抗孵育：洗涤5次，操作同上；加入HRP羊抗人FC二抗(1:20000稀释)，100μL/孔，37℃孵育1 h。

5、显色：洗涤5次，操作同上；每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃显色15 min后每孔加50μL终止液终止反应，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。使用Graph Pad非线性回归，四参数拟合绘制标准曲线，并根据标准曲线及稀释倍数计算单抗的EC50浓度。

6、结果：见图4。图4中，曲线显示14B1与RBD的检测结果，显示特异结合呈现剂量反应关系，表明单抗是RBD特异的。

实施例3、SARS-CoV-2假病毒细胞模型上中和活性分析

1、假病毒包装：根据野生型SARS-CoV-2和SARS-CoV-2突变株刺突蛋白（S蛋白）包装不同的假病毒。将hACE2基因稳定转染入BHK-21细胞，构建稳定表达人ACE2的细胞hACE2-BHK-21细胞。通过lipofectamine 2000 (Biosharp，BL623B)将表达不同S蛋白的质粒转染Vero-E6细胞。24 h后，用DMEM稀释5 h的VSV-dG-fLuc(1×10⁶%组织培养感染剂量[TCID50]/mL)接种转染细胞，然后补充含有vsv - g单克隆抗体(I1 -杂交瘤，培养上清，1:20)的生长培养基(DMEM, 10%胎牛血清)。24小时后，收集含SARS-CoV-2假病毒的上清液，在3000 rpm 离心10分钟，分装，80℃冷冻保存。假病毒的TCID50用一系列稀释法感染BHK-21-hACE2细胞，并按Reed-Muench方法计算。

2、稀释抗体：SARS-CoV-2假病毒(3×10⁵TCID50/孔)与稀释后的血清在96孔白色平板上室温孵育30 min，然后与胰蛋白酶处理过的BHK-21-hACE2细胞以2×10⁴/孔的密度混合。

3、检测Luciferase读值并分析：培养16 h后，去除感染细胞的培养基，用1×Bright-Glo荧光素酶测定试剂(Promega)裂解细胞，使用SpectraMax iD3多孔发光仪(Molecular devices)进行化学发光检测。用GraphPad Prism 7软件计算50%中和稀释效价(NT50)，非线性回归曲线拟合。

结果：见图5(横坐标表示抗体浓度，纵坐标表示相对阴性对照组的中和效果％)。在SARS-COV-2的假病毒模型上，14B1对SARS-CoV-2野生型假病毒的半数有效浓度（EC₅₀）为3.581 ng/mL；14B1对SARS-CoV-2 Delta假病毒株（B.1.617.2）的半数有效浓度（EC₅₀）为5.822 ng/mL。

实施例4、SARS-CoV-2感染时细胞模型上中和活性分析

1、将Vero E6细胞用0 .25％的胰酶消化后，用培养基(DMEM+10％FBS)稀释至5×10⁵cells/mL浓度，接种到24孔细胞培养板中，接种体积0.5 mL/孔，置37℃，5％ CO2细胞培养箱培养过夜。

2、实验当天，将抗体用培养基DMEM+2％FBS自初始浓度，5倍系列稀释，加入空白的24孔培养板，体积300 μL/孔；随即每孔加入300 μL COVID-19病毒悬液(用DMEM+2％FBS稀释病毒，加入120 PFU/孔)，充分混匀，置细胞培养箱孵育1h。

3、弃去24孔板中细胞培养上清，每孔加入500μL共孵育后的病毒-抗体混合悬液；另设置存活对照(不加病毒和抗体)和死亡对照(只加病毒)，置37℃5％CO2细胞培养箱继续培养2 h。弃去培养基，加入含1%甲基纤维素的培养基继续培养。

4、72h后弃去细胞培养上清，加入500μL结晶紫染色液室温染色30min，弃去染液，加入1 mL/孔纯水，重复洗涤3次。

5、弃尽洗液，用吸水纸拍干板孔中水份，统计病毒空斑的个数并记录，计算抗体EC50值。

6、单抗在细胞模型上的保护效果和EC50的结果，在SARS-COV-2感染的细胞模型上，14B1对SARS-CoV-2野生型的半数有效浓度（EC50）为7.664 ng/mL；14B对SARS-CoV-2Delta株（B.1.617.2）的半数有效浓度（EC50）为8.548 ng/mL。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体，其特征在于，所述全人源单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

3.根据权利要求1所述的一种靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括：所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。

4.一种编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。

6.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码所述单克隆抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

7.一种包含权利要求4-6任一项所述核酸分子的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

8.一种包含权利要求7所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。

9.权利要求1-3任一所述的单克隆抗体在制备COVID-19治疗药物或新冠病毒检测产品中的应用。