CN115605234A

CN115605234A - 止血糊剂及其用途

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Publication number: CN115605234A
Application number: CN201980103302.2A
Authority: CN
Inventors: 滕凌; T·谢; Y·田; 冯登敏; P·王
Original assignee: Guangzhou Bioseal Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Bioseal Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2023-01-13
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: US20230001048A1; CN115605234B; WO2021128050A1

Abstract

本文公开了一种不可流动的且可变形的止血组合物，该不可流动的且可变形的止血组合物由分散在甘油和聚乙二醇(PEG)的基本上无水的共混物内的干凝胶交联粉末状多糖构成，其中该PEG和该甘油分别以按重量计高于1:1.3到低于1:2.7范围内的比率存在，并且其中该组合物中的粉末含量按重量计大于50％。还公开了制备不可流动的组合物的方法以及该组合物在用于治疗伤口或出血组织，诸如骨组织的方法中的用途。

Description

止血糊剂及其用途

技术领域

本发明尤其涉及不可流动的且可变形的组合物、其制备方法以及使用该组合物治疗出血组织的方法。

背景技术

在广泛多样的情况下，包括人在内的动物可由于诸如骨伤口之类伤口或在外科手术期间而发生出血。在一些情况下，出血是相对少量的，并且除施加简单急救之外，正常凝血功能是所需要的一切。在其它情况下，可发生大量出血。这些情况通常需要专门的设备和材料以及受过训练的施加适当援助的人员。

外科手术期间的出血可能以多种形式出现。出血可以是离散的或从大表面积扩散。其可以是来自大血管或小血管、动脉(高压)或静脉(低压)的大量或低量的出血。它可易于接触，或者可源自难以接触的部位。在外科手术中，控制出血对于使失血最小化、减少术后并发症、和缩短手术室中外科手术的持续时间是至关重要和关键的。适用于控制出血的方法或产品的选择取决于许多因素，包括但不限于出血的严重程度、来源的解剖学定位和相邻关键结构的邻近程度、出血是离散来源的还是来自更广泛的表面区域、来源的可见性和精确识别以及来源的可及性。

实现止血的常规方法包括使用外科技术、缝合线、结扎线或夹子以及基于能量的凝聚或烧灼。当这些常规措施无效或不切实际时，通常利用辅助止血技术和产品。

为解决上述问题，已开发出用于控制过量出血或作为止血的辅助手段的材料。局部可吸收止血剂(TAH)广泛用于外科应用中。TAH涵盖各种形式的产品，诸如基于织造或非织造的织物或海绵，并且通常至少部分由可吸收材料制成，该可吸收材料的范围从天然聚合物到合成聚合物及其组合，包括基于丙交酯-乙交酯的共聚物(诸如多聚乳酸910)、氧化纤维素、氧化再生纤维素(ORC)、明胶、胶原蛋白、几丁质、壳聚糖、淀粉等。在有或没有局部凝血酶溶液的情况下以各种形式使用明胶。另外，广泛使用的是具有生物活性的局部止血产品(局部凝血酶溶液、纤维蛋白封合剂等)和各种合成局部封合剂。

为了改善止血性能，基于上述TAH材料的支架可与生物衍生的凝血因子(诸如凝血酶和纤维蛋白原)结合。

纤维蛋白封合剂也称为纤维蛋白胶，已在临床中使用了数十年。通常，纤维蛋白封合剂包括两种液体组分，即包括纤维蛋白原的组分和包括凝血酶的组分，这些组分由于它们固有的不稳定性而被冷冻储存。有时，纤维蛋白封合剂产品包括两种冷冻干燥的组分，这些组分需要在即将使用之前复水以及通过连接的注射器或其它双筒递送装置进行递送。冷冻干燥的制剂通常是稳定的，但是纤维蛋白原组分难以重构。目前市场上可用的或正在开发中的许多止血制剂采用冻干纤维蛋白原，其通常与冻干凝血酶结合，并且止血制剂以干粉、半液体糊剂、液体制剂的形式应用或任选地设置在支承支架(诸如可吸收织物支架)上。

水凝胶是吸收溶剂(诸如水)的材料，其经历快速溶胀而不发生可辨别的溶解，并且维持能够可逆变形的三维网络。

为了使敷料具有增强的止血和组织封合以及粘附性能，已将包括但不限于凝血酶、纤维蛋白和纤维蛋白原的治疗剂与敷料载体或基底(包括基于明胶的载体、基于多糖的载体、基于羟基乙酸或乳酸的载体和胶原蛋白基质)结合。

具有公开号2013/0261192的美国专利申请公开了一种用于骨伤口的医用可吸收止血和伤口愈合促进材料以及其制备方法。基于重量百分比，用于骨伤口的可吸收止血材料由40％-95％的基础材料和5％-60％的佐剂形成，其中该基础材料是寡糖、多糖或寡糖和多糖的混合物，并且该佐剂包括(1)一种或多种多元醇、(2)一种或多种植物油和(3)一种或多种乳化剂。

具有公开号2012/0027817的美国专利申请涉及以机械方式止血的身体可吸收组合物，该组合物具有油灰样稠度，并且包括细粉状多糖和生物相容性液体，该生物相容性液体包括环氧乙烷与环氧丙烷的一种或多种嵌段共聚物。

美国专利号8105622涉及天然、重组或合成来源的药学上可接受的水凝胶聚合物或其杂合体，该聚合物是以干燥、水合程度较低或基本上消溶胀的状态引入到生理环境中并在生理环境中再水合而经历体积膨胀，从而实现组织、组织中的缺损或器官的封合、填补或增强。

高出血量和输血速率在骨科手术期间是重大挑战。类似于单极装置的能量装置更适合被设计用于软组织，而骨蜡一般不能够被身体吸收。

需要改进的止血形式和材料，这些止血形式和材料便于施用于诸如骨伤口之类的伤口上而使其快速止血。

发明内容

目前，使用的止血方法，尤其是在骨科手术中使用的止血方法是有限的。骨蜡是最常用的材料，但它不能够吸收/降解。这可能导致几个问题，包括阻碍骨骼再生和感染。如单极装置之类能量装置在骨科手术中也有使用，但是这些装置对骨组织不太有效。

可以使用所公开的组合物，该组合物有效、安全并且对于人体来说是生物可降解的止血剂。

根据本公开的一个方面，提供了一种不可流动且可变形的止血组合物，该不可流动且可变形的止血组合物包含：干凝胶交联粉末状多糖，该干凝胶交联粉末状多糖分散在甘油和聚乙二醇(PEG)的基本上无水的共混物内，任选地，其中PEG和甘油分别以按重量计高于1:1.3到低于1:2.7之间的比率存在，并且其中该组合物中的粉末含量按重量计是至少50％。

在一些实施方案中，多糖包括选自由以下组成的组的聚合物：羧甲基淀粉(CMS)、透明质酸(HA)和他们的混合物、衍生物或共聚物。

在一些实施方案中，该PEG包括PEG 400。

在一些实施方案中，该干凝胶交联粉末状多糖经过研磨。

在一些实施方案中，交联多糖是经由多官能羧酸交联的，其中通常酸选自苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸以及他们的任何混合物。

在示例性实施方案中，酸包括柠檬酸。

在一些实施方案中，交联CMS呈悬浮粉末的形式，该悬浮粉末具有小于100微米的中值粒度。

在一些实施方案中，该组合物包含按重量计低于5％，任选地低于3％或低于1％的水。

在一些实施方案中，按重量计，甘油以15％至30％的浓度存在，和/或PEG以10％到25％的浓度存在。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖在25℃下、任选地在小于2分钟内具有其重量的至少10倍的水中溶胀能力。

在一些实施方案中，该干凝胶交联粉末状多糖的特征在于按初始重量计60％到80％的体内降解率。

在一些实施方案中，该组合物基本上不含聚丙二醇。

在一些实施方案中，该组合物的特征在于3.5N/m到4.5N/m范围内的最小粘结强度，如根据ASTM F2256-052015，例如通过T型剥离测试所测量的。

在一些实施方案中，该组合物呈糊剂形式。

在一些实施方案中，该组合物的特征在于对腈，例如对腈手套无粘性。

在一些实施方案中，该组合物具有约交联度(ρ)0.0047mol/ml至0.0054mol/ml的交联度(ρ)。

在一些实施方案中，该组合物不含任何支撑基底或薄片。

根据本公开的另一方面，存在一种制备不可流动的组合物的方法，该方法包括以下步骤：提供干凝胶交联粉末状多糖；向干凝胶中添加甘油和PEG的无水共混物，其中该PEG和该甘油分别以按重量计高于1:1.3到低于1:2.7之间的比率存在，并且其中该组合物中的粉末含量按重量计大于60％；并且混合该共混物以形成所述不可流动的组合物。在一些实施方案中，提供了一种通过该方法获得的封合剂层。

根据本公开的另一方面，提供了一种制造伤口敷料的方法，该伤口敷料含有在组合物的实施方案中所公开的组合物，该方法包括将该组合物施加到柔性生物可吸收薄片基底的至少一面上的步骤。

根据本公开的另一方面，提供了在组合物的实施方案中所公开的组合物在用于治疗伤口或出血组织的方法中的用途，该方法包括将在组合物的任何实施方案中所公开的组合物施加到伤口或出血组织。

在一些实施方案中，出血组织是骨组织。在一些实施方案中，该方法是骨科手术或脊柱手术。

根据本公开的另一方面，提供了一种套件，该套件包括：容器，该容器容纳在组合物的实施方案中所公开的组合物；施用装置，该施用装置用于将该组合物施加到组织；以及任选地，使用说明。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实施方案的操作或试验，但下文描述的是示例性方法和材料。如发生矛盾，应以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法和示例仅为示例性的，而非旨在进行必需的限制。

附图说明

图1示出了条形图，展示由不同量的CMS和CA交联剂制成的羧甲基淀粉(CMS)-柠檬酸(CA)干凝胶的溶胀特性(参见表1A)；在每个三元组中，从左至右：1分钟后的溶胀率；10分钟后的溶胀率以及20分钟后溶胀率(数据呈现于表4中；溶胀率是指按重量计，干凝胶的增大倍数，即相较于在浸入液体之前的干凝胶，干凝胶增大的倍数)；

图2示出了条形图，显示所测试的不同制剂样品的粘合力(在表3和表5中详述)：当丙二醇(PG)被聚乙二醇(PEG)400替代时，粘合力降低(p<0.05)；每个三元组是指测试样品，其中Y轴是：粘合性的N/m，以及g测试分散剂/10g糊剂；每个条形都是3份测试样品的平均值；

图3示出了摄影图像，显示对于含有丙二醇和PEG400(1:1重量比)的CMS制剂，止血剂仍然会粘到腈手套；

图4A-图4D分别示出了具有1:1.3、1:1.7、1:2.2和1:2.7四种不同PEG与甘油比率的CMS糊剂的摄影图像：当比率为1:1.3时(图4A)，样品是干燥的并且在用手捏合期间易于破裂；当比率为1:1.7(图4B)和1:2.2(图4C)时，样品易于通过捏合而变形：因此，这些比率被认为是适当的PEG比甘油的范围；当比率增加到1:2.7时，样品太薄，有一定流动性，并且极易粘到手套上(图4D)；

图5示出了条形图，显示根据表7的具有不同交联速率的CMS-CA样品的降解(DE)率(％)；每个条形都是3份测试样品的平均值；

图6A-图6B示出了针对绵羊髂骨缺损模型进行的摄影图像止血评估：产生缺损，并且在10分钟内没有施加治疗以确保止血不是由于自动凝固引起(图6A)；将骨蜡(在标记线上方)和CMS-CA(在标记线下方)施加到同一缺损表面以评估急性止血、持久止血和粘合性(图6B)；并且

图7示出了条形图，显示根据表15的CMS-CA和对照物(骨蜡)的止血％(在冲洗和抽吸情况下)的组合结果。CMS-CA显示与骨蜡类似的性能。

具体实施方式

本发明尤其涉及不可流动的且可变形的组合物，以及用于制造此类组合物和使用此类组合物例如减少例如骨组织中的出血、封合和/或期望的粘合性的方法。

该组合物可用于促进止血和组织封合，并且更具体地说，呈不可流动的糊剂形式的快速溶胀、高吸收性止血组合物，该组合物包括交联多糖与一种或多种分散剂的混合物。一旦与水分(血液)接触，干燥的颗粒就会非常快速地吸收水并溶胀，从而允许填充例如骨组织的微结构或空腔以实现止血。

在一个方面，提供了一种不可流动的且可变形的止血组合物，该不可流动的且可变形的止血组合物包含干凝胶，该干凝胶包含分散在一种或多种分散剂的基本上无水的共混物内的交联粉末状多糖。包含交联的粉末状多糖的干凝胶称为：“干凝胶交联粉末状多糖”。

在一些实施方案中，多糖包括选自以下的聚合物：羧甲基淀粉(CMS)、透明质酸盐以及它们的混合物、共聚物或衍生物。

在本发明的上下文中，当与多糖结合使用时，术语“衍生物”是指由天然多糖通过诸如醚化或酯化之类化学修饰得到的多糖。

在全文中，对于“PEG”、“CMS”、“HA”和“甘油”中的每一者，该术语还意图涵盖其任何衍生物。

淀粉是包含通过糖苷键连接的多个葡萄糖单元的聚合碳水化合物。这种多糖是由大多数绿色植物作为能量储存而产生的。CMS是淀粉醚属改性淀粉的主要品种之一，是水溶性阴离子聚合物化合物。它是常用的钠盐，也称为CMS-Na，其中白色或黄色粉末、无臭、无味、无毒的并且可以吸收水分。

如本文所用，术语“透明质酸”或“HA”意指透明质酸或其任何盐，例如透明质酸钠。此外，当在本文使用时，术语“HA衍生物”意图尤其涵盖其任何盐，特别是HA衍生物的钠盐。

术语“透明质酸”涵盖各种链长和电荷状态的透明质酸(hyaluronic acid)或透明质酸(hyaluronan)的所有变体和变体组合，以及各种化学修饰。也就是说，该术语还涵盖透明质酸的各种透明质酸盐，诸如透明质酸钠。因此，该术语涵盖透明质酸的各种修饰，诸如氧化，例如CH₂OH基团氧化成COOH；邻近羟基的高碘酸盐氧化，任选地随后进行还原或亚胺形成；还原，例如COOH还原成CH₂OH；硫酸化；脱酰胺，任选地随后脱氨或用新酸形成酰胺；酯化；用各种化合物取代，例如使用如本文所述的交联剂。

根据一个实施方案，快速溶胀、超级可吸收、生物可降解止血组合物包含：通过柠檬酸(或类似的多官能羧酸，例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸)交联的按重量计大于50％的羧甲基淀粉(CMS)，如实施例部分中所展示，CMS以细粉形式悬浮或分散在第一无毒含甘油并具吸湿性的分散剂与第二无毒、任选被醇官能化的分散剂的混合物中，在一些实施方案中，该第二无毒、任选被醇官能化的分散剂包括聚乙二醇(PEG)。本发明的止血组合物是糊状和/或面团样、不可流动的，并且具有足够的粘度和粘着性以在放置于平坦、不受约束的平坦表面上以及在空腔或空隙内时在室温下维持连续的单一形式。本发明组合物基本上不含水或无水。在一些实施方案中，两种分散剂都是亲水性的。在全文中，可使用交联透明质酸盐作为交联的CMS干凝胶的替代或补充。

通常，干燥的多糖干凝胶具有三维交联聚合物网络，它能够吸收大量的水、盐水或生理液体而形成水凝胶。在接触时，强大的渗透作用使血液组分脱水并胶凝，并且可以实现溶胀至干燥凝胶重量或体积的超过20倍以填充伤口并且在受限的伤口空间中产生“背压”，以模拟填塞效果或增强内部空隙中的自然凝血过程。这些分散剂(例如PEG和甘油)维持无水环境并且使组合物具有吸湿性。

在另一个实施方案中，本公开的组合物(例如呈止血糊剂形式)可以例如作为药物递送媒剂而用于活性剂的定时或延迟释放。该组合物可以掺入生长因子、抗生素、局部麻醉剂以及可用于改善伤口愈合、防止感染或缓解疼痛的任何药剂。通过掺入凝血活化剂、血小板活化剂或血管收缩剂、纤维蛋白溶解功能抑制剂等，包括例如凝血酶、纤维蛋白原，糊剂的止血效果可得到进一步改善。

在一些实施方案中，形成干凝胶的糊剂/面团样物的主要组分是由柠檬酸交联的多糖，该多糖具有增加的机械稳定性。几种多糖在未修饰状态下显示出高吸收能力，但这些多糖的缺点是溶胀仅在温水中发生并且会发生溶解。这种未修饰/未交联的多糖具有低机械稳定性，并且可经历降解和/或回生和/或脱水收缩(凝胶的收缩伴随液体的分离)。

在一些实施方案中，干凝胶包含选自CMS或HA透明质酸盐的(交联)多糖。

在一些实施方案中，分散剂中的一者包括甘油。在一些实施方案中，分散剂包括甘油和聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，甘油和聚乙二醇(PEG)分别以在1:2.7到2.7:1或1.3:1到2.7:1范围内的重量比存在。在一些实施方案中，甘油和聚乙二醇(PEG)分别以高于1.3:1到小于2.7:1的重量比存在。在一些实施方案中，甘油和聚乙二醇(PEG)分别以1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1或接近2.7:1的重量比存在，包括其间的任何值和范围。在一些实施方案中，甘油和聚乙二醇(PEG)分别以按重量计高于1.3:1到低于2.7:1之间的比率存在。在这方面参考图4A-图4D，示出了当比率为约1:1.3时，样品是干燥的并且在用手捏合期间易于破裂。当比率为1:1.7和1:2.2时，样品易于通过捏合而变形。这些比率被认为是适当的PEG比甘油范围。当比率增加到约1:2.7时，样品太薄，有一定流动性，并且极易粘到腈手套上，这对于外科医生将糊剂放置在出血部位上的实际使用不太有效。另一方面，这些比率仍然满足2.5N/m到4N/m的期望粘合性范围，例如至少3N/m，如使用T型剥离测试所测试的(参见图2以及表5和表6)。

在一些实施方案中，组合物中的粉末含量按重量计大于50％。在一些实施方案中，组合物中的粉末含量按重量计大于60％。在一些实施方案中，组合物中的粉末含量按重量计为约50％到70％。在一些实施方案中，组合物中的粉末含量按重量计为约50％、约55％、约60％、约65％或约70％，包括其间的任何值和范围。

术语“PEG”意指聚乙二醇，即一种具有结构(-CH₂CH₂O-)_n的聚合物，它通常是由环氧乙烷的开环聚合而合成。如本文所用，术语“PEG-400”是指乙二醇的聚合形式，即聚乙二醇，其平均分子量为约400(例如360到440)克/摩尔，称为“PEG 400”。

术语“可变形的”一般是指通常在约室温下，可以响应于诸如压力之类外部现象而变形的任何结构。

如本文所用，在糊剂或面团样组合物的上下文中，术语“不可流动的”或其任何语法变化形式涉及在约室温下的非流体稠度。

术语“不可流动的”还涵盖粘性溶液。术语“粘性溶液”是指这样一种溶液，该溶液具有增加的流动阻力，仍能够变形并且重新形成，通常但不限于具有静态高粘度。在一些实施方案中，糊剂在静止和室温时具有高粘度。在一些实施方案中，糊剂提供交联多糖的基本上均匀的分散体。

如本文所用，术语“高粘度”意味着在施加时，糊剂不能轻松挤出。在一些实施方案中，糊剂的特征还在于在静止状态下具有高粘度(例如高于35Pa·s)，但仍然可以牢固地粘附到组织，诸如骨组织。

该组合物的粘度和效力可足够高以允许外科医生有效使用其止血作用，例如允许将糊剂放置在出血部位上。

术语“液体介质”、“介质”、“分散试剂”或“分散剂”在全文中可以互换地使用。在本文中，术语“分散剂”旨在指液体介质，任选地具有粘度，具有糊状和/或面团样稠度或能够提供糊状和/或面团样稠度的液体介质。

术语“在静止时”在本文中用于指不搅动或流动，例如处于静止状态。

如本文所用，术语“约室温”应理解为意指至少一个在约20℃到约30℃，例如20℃到25℃范围内的温度。

术语“均匀分散体”是指均一混合物，即，肉眼无法辨别混合物中两个或更多个相的分离。

如本文所用，术语“基本上均匀的分散体”意指分散体总量的至少90％，任选地至少99％，并且任选地至少99.9％是均一混合物。

术语“可降解的”可以指尤其是由于化学或热反应、酶降解或由辐射诱导的反应而引起的水解降解。例如，由于血浆中存在淀粉酶，组合物可在生理条件下在短时间段内降解。降解率的实施方案提供于下文中。

生理条件可以涵盖具有在约20℃到约40℃范围内的温度和约6到约8的pH值、约0.8atm到约1.2atm的大气压或对应的大气氧浓度的水性环境。

术语“止血”是指例如通过促进血凝块形成来防止、减少或停止血液例如从伤口，诸如手术或创伤的伤口损失的能力。

术语“粉末”是指固体微粒材料，通常为分散的干燥固体颗粒，例如呈通常在0.1微米到1000微米范围内，有时低于100微米的较小大小为特征的多个固体颗粒的形式。

术语“固体”表征化合物或组合物在室温(例如25℃)和大气压(760mmHg)下的状态，即，在储存期间保持其形态的高稠度的化合物或组合物。在本申请中该术语还涉及非流体颗粒或溶解的物质。与“液体”化合物和组合物相反，固体不在其自身重量下流动。

“粉末状”和“微粒”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“糊剂”涉及组合物在约室温的至少一个温度处的稠度，并且定义固体颗粒的流体混合物。通常，糊剂没有固定形状，并且因此不是固体或气体。根据本公开的术语“糊剂”还可包括浆液、药膏和油膏。浆液可在功能上被认为是稀薄的油状糊剂。根据本公开的糊剂还可包括由可膨胀气体诸如空气构成的孔。因此，在一些实施方案中，组合物是糊剂，或在10℃到37℃范围内的至少一个温度下呈糊状稠度。

在一些实施方案中，该组合物呈不可流动的糊剂的形式。术语“不可流动”(或“不能流动”)的糊剂在本文中也称为“油灰”。术语“油灰”或“面团样”是指在37℃处具有比较像面团的稠度，与“可流动的”糊剂相比，它需要较长的时间来沉降并且具有较佳的形状保持性。这些术语表明材料不能搅拌，而只能捏合。

在一些实施方案中，该组合物是生物可吸收的。术语“生物可吸收的”是指组织相容性材料在植入到无毒产品中之后在体内降解的能力，该无毒产品从身体中消除或代谢。

本发明的实施方案还涉及快速溶胀、可吸收、生物可降解的和不可流动的止血糊剂。在一些实施方案中，组合物(例如呈止血糊剂的形式)包含至少三种组分。第一组分包含干凝胶粉末。第二组分和第三组分包含分散剂。该粉末可以包括如本文所述的交联多糖。在一些实施方案中，交联多糖通过使用多官能羧酸，诸如柠檬酸(替代地但不限于苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸)交联而合成。当例如通过蒸发来去除凝胶的液相时，获得干凝胶。该干凝胶通常展现出按体积计大于(>)90％的收缩。

如本文所用，术语“多糖”是指具有由简单糖构成的多个重复单元的聚合碳水化合物。术语“聚合的”或“聚合物”旨在包括寡聚和聚合单元，并且通常包括具有多于四个重复单体简单糖单元的那些多糖。

干凝胶，诸如交联CMS或透明质酸在与水性环境，诸如体液接触时，可以形成水凝胶。

水凝胶是通常具有亲水性的聚合物链网络，有时以胶态凝胶形式发现，其中水是分散介质。

在一些实施方案中，多糖包括研磨的多糖。术语“研磨”涉及通过本领域已知的任何方法碾磨成例如粉末形式。

术语“基本上无水的共混物”旨在表示共混物中的水含量按重量计不超过约5％或约3％。

在一些实施方案中，交联多糖包括通过经由多官能羧酸的反应而交联的多糖，例如CMS或HA。在一些实施方案中，酸可以选择苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸，或它们的任何混合物。在示例性实施方案中，酸包括柠檬酸。

在一些实施方案中，交联多糖悬浮或分散在甘油和至少一种另外的分散剂(诸如PEG)的基本上无水的共混物内。

在一些实施方案中，交联多糖CMS或HA呈粉末的形式，该粉末具有小于100微米的平均或中值粒度。

在一些实施方案中，该组合物基本上不含水或基本上无水。在一些实施方案中，该组合物还可包含中和碱性试剂。在一些实施方案中，糊剂包含小于5％或小于1％的水。

在一些实施方案中，甘油以15％到30％，例如15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％(包括其间的任何值和范围)的重量浓度存在。

在一些实施方案中，PEG以10％到25％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％(包括其间的任何值和范围)的重量浓度存在。

在一些实施方案中，甘油以15％到30％的重量浓度存在，并且PEG以10％到25％的重量浓度存在。

在一些实施方案中，多糖微粒分散在分散剂中，使得分散剂维持无水环境并使止血组合物具有吸湿性。一旦与水分(血液)接触，干燥颗粒就会非常快速地吸收水并溶胀，从而允许填充例如骨组织的微结构或空腔以实现止血。

在一些实施方案中，多糖基本上不吸收分散剂，该分散剂是无水但具有亲水性的，例如甘油和PEG。尽管甘油和PEG是亲水性的，但在一些实施方案中，颗粒仍能够快速吸收血液、血浆、水或体液。

不希望受任何理论束缚，非水性分散剂在交联的网络颗粒之外，并且不应影响其吸收液体的能力。吸收看来通过消除预溶胀或预载荷而达到最大化。

在一些实施方案中，颗粒不溶胀或吸收所选分散剂，但在提供血浆时可以迅速地溶胀并吸收最大百分比的血浆组分。在一些实施方案中，所选分散剂不应将交联网络颗粒与意图被吸收的血浆组分屏蔽。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖在25℃下，任选地在小于2分钟内，例如约1分钟内具有其干重的至少10倍，例如10倍、15倍、20倍或25倍(包括其间任何值)的水中溶胀能力。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖在25℃下，任选地在小于2分钟内，例如约10分钟到20分钟内具有其干重的至少10倍，例如10倍、15倍、20倍、25倍或30倍(包括其间任何值)的水中溶胀能力。

不受任何特定理论或机制束缚，在放置在水性环境中时，强大的渗透作用脱水允许干凝胶溶胀至干燥干凝胶体积的至少10倍，以填充伤口并且在受限的伤口空间中产生“背压”，以模拟填塞效果并且增强自然凝血过程。本发明组合物的可变形能力还确保其接触狭窄空间以及其施加到不均匀表面，使其成为解决术中出血或渗出的有用材料。本发明组合物特别适合例如骨组织中难以接触的伤口，诸如腔出血。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在3天内按初始重量计75％到95％的降解率。在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在3天内按初始重量计75％、80％、85％、90％或95％的降解率，包括其间的任何值和范围。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在1d内按初始重量计55％到85％的降解率。在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在1d内按初始重量计55％、60％、65％、70％、75％或80％的降解率，包括其间的任何值和范围。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在3小时内按初始重量计50％到80％的降解率。在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在3小时内按初始重量计50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的降解率，包括其间的任何值和范围。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在30分钟内按初始重量计0.1％到25％的降解率。在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)，在30分钟内按初始重量计0.1％、1％、5％、10％或、15％、20％或25％的降解率，包括其间的任何值和范围。

在一些实施方案中，干凝胶交联粉末状多糖的特征在于在生理条件中(例如在体内)在30分钟内按初始重量计0.1％到25％的降解率，以及在生理条件中(例如在体内)在1天内按初始重量计55％到85％的降解率。

在一些实施方案中，该组合物基本上不含聚乙二醇。“基本上不含聚乙二醇”是指聚乙二醇可以按低浓度存在，例如按分散剂的总重量计10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，或完全不存在。就这一点而言，参看图3，示出了摄影图像，显示在PEG比丙二醇为1:1下，糊剂粘到手套上。

在一些实施方案中，该组合物的特征在于2.5N/m到4N/m的粘合性(也称为“粘结强度”)，如使用T型剥离测试所测试的。在一些实施方案中，该组合物的特征在于3.5N/m到4N/m的粘合性，如使用T型剥离测试所测试的。在一些实施方案中，该组合物的特征在于2.5N/m、2.6N/m、2.7N/m、2.8N/m、2.9N/m、3N/m、3.1N/m、3.2N/m、3.3N/m、3.4N/m、3.5N/m、3.6N/m、3.7N/m、3.8N/m、3.9N/m、4N/m、4.1N/m、4.2N/m、4.3N/m、4.4N/m或4.5N/m(包括其间的任何值和范围)的粘合性，如使用T型剥离测试所测试的。

如本文所用，单位“N/m”(即，平均载荷/宽度)是指当将测试主体与封合片粘结在一起，将测试主体与封合片之间的粘结部分切割成某一mm的宽度，并且对作为测试样品的这一切割件进行T型剥离测试时的剥离强度。这一测试被称为“T型剥离”测试，因为当两个粘合体被拉开时，它们形成“T”形。

如本文所用，T型剥离测试是根据名为“有关在通过张力负载进行T型剥离时组织粘合剂的强度特性的标准测试方法(Standard Test Method for Strength Propertiesof Tissue Adhesives in T-Peel by Tension Loading)”的ASTM F2256-05(2015)进行测量的测试，修改之处在于使用硅片而不是猪皮肤。

在一些实施方案中，组合物的特征在于对手套没有粘性。在一些实施方案中，该组合物的特征在于对腈，例如对腈手套无粘性。

如本文所用，术语“无粘性的”是指组合物足够光滑和/或足够结实，使得当将组合物从不期望的表面(诸如腈手套的不期望的表面)去除时，产品的可检测部分将不会保持粘附在该不期望的表面上，并且有时，“无粘性”是指从业人员也可以使用其手套覆盖的手容易地保持组合物，而在从手套去除组合物时，手套上不会留下任何显著或可见的残留物。

在组合物的一些实施方案中，干凝胶的特征在于交联度(也称为“交联密度”；(ρ))为0.0040摩尔/毫升至0.0060摩尔/毫升，或0.0047摩尔/毫升(“0.4×”)至0.0054摩尔/毫升(“4×”)(根据以下实施例部分中描述的方程(1)至(4)，每单位体积交联的摩尔数；参看Omiadin等人,Iranian J.of Polymer Science and Technology,第3卷第2期,1994年)。在组合物的一些实施方案中，干凝胶的特征在于交联密度为0.0040摩尔/毫升、0.0041摩尔/毫升、0.0042摩尔/毫升、0.0043摩尔/毫升、0.0044摩尔/毫升、0.0045摩尔/毫升、0.0046摩尔/毫升、0.0048摩尔/毫升、0.0049摩尔/毫升、0.0050摩尔/毫升、0.0051摩尔/毫升、0.0052摩尔/毫升、0.0053摩尔/毫升、0.0054摩尔/毫升、0.0055摩尔/毫升、0.0056摩尔/毫升、0.0057摩尔/毫升、0.0058摩尔/毫升、0.0059摩尔/毫升或0.0060摩尔/毫升，包括其间的任何值和范围。在示例性实施方案中，交联密度为约0.0047摩尔/毫升。

参看图1，显示通过使CMS与相对较高剂量的柠檬酸(1x或更高)交联制成的干凝胶的溶胀率与柠檬酸的浓度成反比，并且在0.25x至1x交联比情况下，溶胀比例为干凝胶的至少15倍。然而，如图5中所示，就开始时的降解度而言，仅对于交联样品，降解率与交联速率成反比，并且在较长时间点处，所有样品组中的降解率类似，表明CMS-CA的整体降解曲线受交联速率影响因此，总的说来，在一些实施方案中，可能需要0.25×至1×的交联速率。

在一些实施方案中，如本文所用，术语“交联的”和/或“交联”以及其任何语法衍生形式一般是指两条聚合物(例如脱水葡萄糖)单元链通过共价或非共价桥连接的化学过程或其相应产物。由元素、基团或化合物构成的“交联剂”可通过初级化学物质连接链的某些碳原子。本文描述了非限制性示例性交联剂。

在一些实施方案中，该组合物是无菌的。如本文所用，术语“无菌的”意指具有低生物负荷，是有效无菌的，例如不含微生物(例如，细菌和病毒)。灭菌是将生物负荷降低到有效无菌水平的过程。

在一些实施方案中，糊剂被支撑在基底上，该基底是柔性生物可吸收片。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗失血性损伤的方法，将组合物的实施方案中所公开的组合施加至受伤部位(例如是骨组织)中/上。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备不可流动的组合物(例如呈止血糊剂的形式)的方法，该方法包括以下步骤：提供呈粉末形式的交联多糖，该粉末具有小于100微米的平均或中值粒度；将甘油添加到多糖粉末中，并且将甘油与粉末混合，直到形成均匀的不可流动和/或面团样材料；将PEG添加到不可流动/面团样材料中，并且将PEG与不可流动/面团样材料充分混合；由此形成不可流动的组合物(例如呈止血糊剂的形式)。上文描述了非限制性示例性多糖(例如CMS和HA，诸如呈干凝胶形式)。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备不可流动的组合物(例如呈止血糊剂的形式)的方法，该方法包括以下步骤：通过在水存在下，将多糖与交联剂实施方案中的交联剂(诸如柠檬酸)混合，并且使多糖与柠檬酸处于升高的温度，例如高于40℃，诸如约65℃反应来使多糖交联；基本上干燥交联的多糖；将交联的多糖研磨成粉末，该粉末具有小于100微米的平均或中值粒度；将甘油添加到多糖粉末中，并且将甘油与粉末混合，直到形成均匀的面团样材料；将PEG添加到面团样材料中并且将PEG与面团样材料充分混合；由此形成不可流动的组合物(例如呈止血糊剂的形式)。

交联可以通过以按重量计1:7到1:75或1:60到1:72的交联剂比多糖重量比组合交联剂(例如柠檬酸)与多糖(例如CMS)来进行。

在一些实施方案中，干燥通过将多糖和酸的混合物加热至超过60℃或超过100℃，例如约140℃来进行。在一些实施方案中，加热例如在预热的培养箱中进行25分钟。在一些实施方案中，加热允许完成交联。通常，在干燥步骤之前，混合物是面团样的，并且在加热之后，混合物变成硬材料并且可通过碾磨设备碾磨。

在一些实施方案中，该方法还包括溶解中和碱性试剂的步骤，在一些实施方案中，该中和碱性试剂可以在添加到多糖干凝胶之前在高于65℃的温度处存在于含甘油的分散剂中。

根据另一方面，提供了一种制造伤口敷料的方法，该伤口敷料含有在组合物的实施方案中的组合物(例如呈止血糊剂形式)，该方法包括将所公开的组合物(例如止血糊剂)施加到柔性生物可吸收薄片基底的至少一面上的步骤。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种使用组合物实施方案中的组合物(例如呈止血糊剂形式)的方法，该方法包括以下步骤：将该组合物施加到诸如骨组织或伤口之类出血组织上或中。

术语“组织”是指联合执行特定功能的一群细胞和/或细胞组分。组织中的细胞可全为一种类型或超过一种类型。组织可为人工组织，细胞在其中生长成以与生物活体中的组织类似的方式发挥功能。组织可以是人体组织或动物组织、软组织或骨组织。该方法可以例如用于执行组织修复；和/或用于提供组织和器官补充；治疗组织缺损、伤口；和/或补充和更换组织；修复组织缺损；愈合伤口；或需要组织补充。

根据本发明的一些实施方案，提供了在组合物的实施方案中的组合物(例如呈止血糊剂形式)在用于治疗伤口或出血组织的方法中的用途，该方法包括将在组合物的实施方案中的组合物(例如呈止血糊剂形式)施加到伤口或出血组织，诸如骨组织。

在另一方面，本发明还提供了一种止血套件，该套件包括容器，该容器容纳本文在组合物的实施方案中所公开的组合物，例如分散在以下的基本上无水的共混物内的干凝胶交联粉末状多糖：选自甘油和PEG的分散剂，其中PEG和甘油分别以按重量计高于1.3:1到低于2.7:1之间的比率存在，并且其中该组合物中的粉末含量按重量计大于60％。在套件的一些实施方案中，该组合物在约室温处呈糊剂形式。

全文所公开的组合物的任何方面和实施方案都可以并入套件的方面和实施方案中，包括组合物、分散剂和/或干凝胶的实施方案。

替代地，本发明提供一种止血套件，该套件包括：含有本文在干凝胶的实施方案中所公开的干凝胶的容器，以及包括至少一种分散剂(例如PEG或甘油)的另一个容器。在此类实施方案中，该套件可以另外含有测量装置，例如量筒，以测量分散剂的体积。

本发明的止血套件可以是用于减少、预防或停止例如开放性伤口中血流的套件，并且它可以用于减少、预防或停止手术期间，诸如在外科手术诸如腹腔镜手术、神经手术、腹部手术；骨科手术诸如膝关节手术、头颈部手术、手术、关节和脊柱手术期间、之前或之后的血流。该套件可用于减少或预防来自组织的血流。

在一个实施方案中，该套件可在室温，诸如在8℃到40℃范围内的温度或在较低温度储存。

在本文所公开的套件或组合物的任何方面的一些实施方案中，共混物可以包含添加剂，例如钙盐和/或一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂例如选自但不限于一种或多种氨基酸、白蛋白、糖和/或糖衍生物。

术语“添加剂”意图被理解为可以添加到组合物中的任何物质，并且还可以包括如下文所描述的活性添加剂，诸如钙盐。

如本文所用，术语“赋形剂”表示被添加到药物组合物中以例如提供所希望的稠度或稳定作用的非活性剂或非治疗剂。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗伤口和/或骨组织的方法，该方法包括将在组合物的任何方面和实施方案中的组合物施加(例如接触)到有需要的受检者的伤口上和/或中的步骤。

所谓“治疗伤口”进一步意在涵盖减少例如接受外科手术的患者中的组织的出血部位处的失血。

因此，在一些实施方案中，该方法用于减少例如接受外科手术的患者中的组织的出血部位处的失血，包括使在组合物或制剂的一个实施方案中所公开的组合物或制剂与出血部位接触。

如本文所用，术语“受检者”应意指任何动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类或任何其他哺乳动物。在一些实施方案中，受检者是人，例如人类患者。受检者可为雄性或雌性。

在本申请中所公开的所有方面中意图至少包括涉及干凝胶交联粉末状多糖、甘油和PEG的无水共混物、其对应的比率和按重量计组合物中的粉末含量的实施方案。

如本文所用，术语“约”意指也意图包括高于或低于所指示值的±10％的值。一般来讲，本申请中的所有值旨在包括术语“约”。

术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”、“含有(contain/containing)”以及它们的变化形式是指“包括但不限于”。术语“由…组成”是指“包括并且限于”。术语“基本上由…组成”是指组合物、方法或结构可包含附加成分、步骤和/或部件，但前提条件是该附加成分、步骤和/或部件不在本质上改变受权利要求书保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。

词语“示例性”在本文中用于指“用作示例、实例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不一定被理解为比其他实施方案优选或有利并且/或者不包括其他实施方案的特征。

词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方案中提供而在其他实施方案中不提供”。本发明的任何具体实施方案可包括多个“任选的”特征，除非此类特征有冲突。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括它们的混合物)。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这均适用。

每当本文指示数值范围时，其是指包括位于所指示范围内的任何列举的数字(分数或整数)。短语“范围是在”第一指示数字和第二指示数字之间以及“范围是从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换使用，并且是指包括第一指示数字和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所用，医疗上下文中的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状、或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。

如本文所用，术语“出血”是指血液从循环系统的任何组分外渗。因此，“出血”涵盖与外科手术、创伤、组织缺损中或其他形式的组织损伤有关的非期望、不受控并且通常过多的出血以及患有出血性疾病的患者的非期望的出血。

术语“创伤”被定义为由物理力引起的损伤；非限制性示例包括车辆事故、枪击和烧伤的后果。

如本文所用，术语“控制”、“防止”或“减少”(它们在本文中可在出血的上下文中互换使用，包括其任何语法变化)表示与所公开的组合物没有在出血部位中/上接触的情况相比，血液的渗出率基本上被消除或降低初始出血率的10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％。用于确定出血出现的水平的方法在本领域中是已知的。此外，在一些实施方案中，出血上下文中的术语“控制”、“防止”或“减少”还意在涵盖至少部分地封闭出血部位处(例如，软组织中)的血管。

在其中使用类似于“A、B和C中的至少一者等”的惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在具有本领域的技术人员将理解所述惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一者的组合物”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的组合物)。本领域的技术人员还应当理解，实际上，无论在具体实施方式、权利要求还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的转折性词语和/或短语应被理解为涵盖包括所述术语中的一者、所述术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或者“A和B”的可能性。

应理解，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施方案中组合提供。相反，为简便起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征还可分开地或以任何合适的亚组合或如本发明的任何其他所述实施方案中合适地提供。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不应视为那些实施方案的基本特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。

如上文所描述以及如所附权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

实施例1制备止血糊剂和糊剂组合物

羧甲基淀粉(CMS)通过柠檬酸交联如下。使用CMS的钠盐进行水凝胶的合成。首先，将交联剂(来自广州化学试剂厂的柠檬酸)溶解于蒸馏水中，然后与CMS(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd)；对应的量描述于下文)一起充分均质化，产生均匀的面团样产物。然后，将面团样产物切成小块。在预热的烘箱中，在140℃将产物加热25分钟以完成交联。将可以称为干凝胶或干燥的紧实水凝胶的所得产物，即交联CMS(CMS-CA)在70℃干燥过夜，然后碾磨至低于100μm的平均粒度。

交联度计算：在合成过程期间的交联比可称为“x号”，参见下表1A。

使用下面的等式执行对交联度的计算(参见Omidian等人,Iranian J.of PolymerScience and Technology第3卷第2期,1994年)：

ρ＝ρ₁+(1-ρ₁/ρ₂)×C (1)，

其中ρ是水合样品的密度，ρ₁是盐水的密度(1.03g/mL)，ρ₂是干燥的干凝胶的密度，并且C是盐水中水凝胶的浓度(g/mL)；

V_m＝M/ρ₂ (2)，

其中V_m是CMS单体的摩尔体积，并且M是CMS单体的分子量。

CMS链的分子量M_c可以大致计算如下：

M_c应为交联剂(柠檬酸；CA)的M_W；

反应的交联剂的量(mol/mL)或交联度是

(v/V)＝ρ/M_c (3)。

表1A示出了用于不同“x”的柠檬酸的量。因此，使用0.4X、2X和4X的交联CMS样品的溶胀体积测量值来计算交联度(表1B)：在示例性程序中，将干凝胶粉末放置在刻度量筒中以粗略估计干凝胶的V。为了测量V最终，将盐水(氯化钠购自广州化学试剂厂)添加到干凝胶中，然后等待其完全溶胀，然后使用圆筒测量V最终。

表1A用于不同“x”的柠檬酸的量

样品	CMS(g)	CA(g)
			CMS-CA(0.4x)	70	1.04
CMS-CA(0.5x)	70	1.30
			CMS-CA(2.0x)	50	3.74
CMS-CA(3.0x)	50	5.60
			CMS-CA(4.0x)	50	7.47

表1B盐水中交联CMS样品的原始体积和最终体积(92小时)。

	CMS 0.4x	CMS 2x	CMS 4x
				M样品(g)	1	1	1
V干凝胶(cm<sup>3</sup>)	1.4	1.2	1.0
				V最终(mL)	8.5	5.1	3.9

基于等式(1)、等式(2)、等式(3)和等式(4)，在表2中示出了不同交联CMS样品的交联度ρ交联剂。

表2 0.4x、2x和4x的交联CMS样品的交联度。

^*计算示例：1.03+(1-1.03/0.71)×0.26；单体的分子量应为CMS的MW，该MW是7.5×10^5，以及网状链M_W，即M_c，它是柠檬酸的M_W。

将所得交联CMS粉末分散：接下来，将交联CMS粉末与分散剂混合如下。将甘油添加到粉末中，并混合/搅拌直到所有粉末颗粒都被甘油涂覆，形成面团样糊状物。然后，将丙二醇或PEG 400添加到上述糊状物中，并混合/搅拌以形成最终的不可流动的止血糊剂。添加的每种组分的量在表3中示出。

表3 CMS-CA样品的含量表(所有样品的粒度<100；交联比：0.4x^*))

^*已发现，这一骨止血剂中的0.4x比是适当的，参见下文。

^**60％的CMS可以使止血剂不能流动并且易于用手操作。因此，CMS的百分比不应太低，也不应太高，以便维持其当前外观，这被发现适用于骨止血。

实施例2交联CMS和其他多糖的溶胀特性

对于溶胀测试，将一克干凝胶浸入处于室温的过量盐水中，保持一定时间段以达到溶胀平衡。在1分钟、10分钟、20分钟的时间间隔，通过过滤穿过100目筛网将溶胀的样品与未吸收的盐水分离。使用以下公式等式计算每个时间点的溶胀百分比：

SP＝100(M_t-M_d)/M_d，

其中SP是溶胀百分比，M_t和M_d分别是在时间t时溶胀的水凝胶颗粒的重量和干燥的干凝胶颗粒的重量。

参看图1和表4，示出了CMS-CA干凝胶在盐水中浸入后1分钟、10分钟和20分钟时的溶胀情况，并且通过实验观察到在1分钟时约1500％以及在20分钟时约2000％的显著溶胀。

再参看图1和表4，比较了在浸没后暴露于盐水1分钟、10分钟和20分钟时通过不同量的柠檬酸交联的基于CMS的干凝胶的溶胀情况。数据显示，通过使CMS与相对较高剂量的柠檬酸(1x或更高)交联而制成的干凝胶的溶胀率与柠檬酸的浓度成反比。因此，通过添加不同量的柠檬酸，可以调节水凝胶的溶胀率。

表4具有不同交联度的样品的溶胀率数据

*溶胀值是以吸收盐水指定时间后干凝胶重量的时间增加示出：1分钟、10分钟和20分钟；^**未交联。

实施例3分散剂比较和其对粘合性的影响

为了制备糊剂形式的止血剂，使用两种有机分散剂。在每种制剂中都使用甘油。甘油在医学领域中友好使用，并且是安全的。

而另一种分散剂是在丙二醇(PG)与聚乙二醇(PEG)400之间选择。

对于所有样品，除非另有说明，否则按重量计以60％交联0.4x CMS。

参看下表5，10g糊剂中的甘油量为2.52g-2.92g。PG在三种制剂(G180606_1、G180606-_2和G180606_3)中使用，并且PEG400在两种制剂(G180606_4和G180606_5)中使用。然后，使用T型剥离测试对每种制剂的粘合性进行测试。

T型剥离测试的示例性程序是基于ASTM F2256-05(2015)，使用硅酮薄片进行，并且包括：

a.将称取的1g样品(糊剂)施加在硅薄片的表面上，然后喷洒盐水；

b.将另一个硅薄片放置于糊剂上方，并且用重物压缩5分钟；将片段切割成15×2cm的条带以适合硅酮片。

c.将制备的薄片转移到Instron，并且根据ASTM F2256-05(2015)测量粘合力。

d.使用Instron 5944/100N传感器测量将两个粘附层彼此分离所需的力(称为剥离力)。

表5在不同制剂中使用的分散剂和相应的粘合力

图2中示出了比较粘合力的条形图。PG基团的粘合力要比PEG400基团的粘合力强(p<0.05)。尽管如此，如下文所描述，还发现当制剂含有PEG400时，该制剂不太易于粘到手套上。

PEG400剂量确定：为了解决骨出血，一个需求是产品的易用性。通常，从业人员用手使用止血剂，如骨蜡。因此，本概念的一个要求是组合物不会粘到手套上。当PG被PEG400替代时，粘合力的降低提供了PEG400直接促成这一骨止血剂的易用性的直接证据。因此，据目测观察，当制剂含有丙二醇和PEG400(按重量计1:1)两者时，止血剂会粘到手套上，并且当原型含有丙二醇时，止血剂会变粘，并且它会粘附于手套(在示例性程序中使用腈手套)。就这一点来说，丙二醇是不太优选的。在这方面，参看图3，示出了摄影图像，显示PEG比丙二醇为1:1时，糊剂会粘到手套上。

当丙二醇完全被PEG400替代时，尽管粘合性略有降低，但它不再粘附到手套上。另外，含PEG400的原型在止血方面与含丙二醇的原型同样有效，如下所示。

因此，使用PEG400代替丙二醇而用于骨止血剂。

在另外的示例性程序中，测试了四种不同的PEG400比甘油重量比，分别是1:1.3、1:1.7、1:2.2和1:2.7(参见图4A-图4D)。当比率为约1:1.3时，样品是干燥的并且在用手捏合期间易于破裂。当比率为1:1.7和1:2.2时，样品易于通过捏合而变形。这些比率被认为是适当的PEG比甘油范围。当比率增加到约1:2.7时，样品太薄，有一定流动性，并且极易粘到腈手套(又称为丙烯腈丁二烯橡胶；Medicom)上。另外，应注意，PEG比丙二醇按重量计为1:1的糊剂也会使糊剂粘到手套上。

参看表6，当比率为1:1.3时，样品太薄，这意味着它不能停留在出血表面处。此外，当减少PEG400剂量时，样品变得越来越不易流动。

表6具有不同PEG400/甘油重量比的样品(交联比为0.4x)

PEG400/甘油	CMS-CA(g)	甘油(g)	PEG400(g)	粘合性
					1:1.3	6	2.26	1.74	NA(太薄)
1:2.2	6	2.75	1.25	3.96N/m
					1:2.7	6	2.92	1.08	3.99N/m

值得注意的是，如下文所描述，当比率高达1:2.7时，T型剥离测试和体内测试均显示出良好的结果。

实施例4降解率对比交联剂浓度

通常，由于血浆中存在淀粉酶，淀粉基材料可以在非常短的时间段内被身体降解。对于止血剂，为了维持其功能，降解曲线在刚开始时应为缓慢的，并且在达到止血后，应当很快。为了实现这一目标，通过使用不同量的柠檬酸来调节交联速率。已发现，添加的柠檬酸越多，干凝胶颗粒就越凝结。

在示例性程序中，使用了苯酚-硫酸方法来测定降解率：碳水化合物(单糖、寡糖、多糖以及它们的衍生物)在强酸和热存在下反应以产生呋喃衍生物，该呋喃衍生物与苯酚缩合而形成可通过分光光度法测量的稳定金黄色化合物。

因此，在示例性程序中，首先通过将20.12g葡萄糖添加到500mL双蒸馏(dd)水中来制备葡萄糖标准溶液。接下来，然后分别取得0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL和1.8mL的葡萄糖溶液，并且用dd水稀释至20mL。然后，通过向苯酚溶液(80％)中添加1.5mL至18.5mL dd水以制备6％的苯酚溶液，来制备发色溶液。接下来，称取199.85mg和200.01mg CMS以及200.01mg和200.46mg CMS-CA(0.5x、1x和4x)，并将5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液倒入每个样品中。

为了获得标准曲线，将5mL的发色溶液添加到如上所述的每种葡萄糖溶液中。接下来，将5mL发色溶液添加到含有样品的PBS中。将标准曲线溶液和样品溶液在沸水中加热30分钟，此后在冰中冷却。

将标准样品和测试样品添加到96孔板(n＝2)中，随后测量在490nm处的吸光度值。

结果汇总于表7和图5中。开始时，降解率与交联速率成反比。在较长的时间点，所有样品组中的降解率相似，表明CMS-CA的总体降解曲线受交联速率影响。

从结果可以得出结论，凝结的干凝胶颗粒在开始时(刚好在施加止血剂之后)对酶降解具有较高抗性。一旦血浆中的酶与整个颗粒充分接触，根据表7和图5中所示的趋势，降解可能会加速。值得注意的是，骨止血剂需要相对较快的降解率，因为它不应中断骨组织再生。因此，0.5x到1x看来适用于骨止血。

表7在不同交联速率情况下CMS-CA降解的时间系列数据

^*立即，在不到30分钟内；NA：数据不可用。

综上所述，这种降解曲线指示，所公开的骨止血剂一旦施加就可以有效地维持其功能，并且可以进一步快速降解以防止骨组织再生的障碍。具体地说，最多3天，超过80％的CMS样品被降解。因此，为了停止骨出血，从业人员可以使用所公开的组合物，该组合物可以被快速降解，使得它不会阻碍骨再生。

实施例5止血功效–动物研究

方法：

为了评估含有PEG400的CMS-CA(选择PEG400/CMS-CA＝1:2.7重量比，它不会粘附于手套；交联比为0.4x；PEG400/甘油比率：2.2:1，按重量计)的止血功效，使用绵羊髂骨缺损模型进行动物研究。简而言之，已在绵羊髂骨上造成缺损。

在每个缺损表面上，同时施加CMS-CA止血剂和一种对照样品。

在示例性程序中，在施加后立即评估和施加后10分钟评估止血功效。产生缺损，并且在10分钟内不施加治疗以确保止血不是由于自动凝固引起。接下来，将一种对照样品(骨蜡和Ostene(购自Baxter))和CMS-CA或HA-CA施加到同一缺损表面。评估急性止血、持久止血和粘合性。

下面描述详细程序。

在第一组示例性程序中，在肝素施加之前和之后，在体内绵羊模型中评估样品。在非肝素化绵羊模型中进行评估旨在模拟标准手术(例如脊柱手术)期间骨止血剂的使用。在肝素化绵羊模型中进行评估旨在模仿在抗凝心血管患者(例如胸骨切开术)中骨止血剂的使用。目标是八份样品(六份测试样品和两份对照样品)中的每一者在非肝素化动物模型中施加最少五次，并且在肝素化动物模型中施加最少五次。在每只动物中进行非肝素化和肝素化测试。每份样品的实际施加次数由研究中包括的六只动物中可用的可接触施加部位的数量决定。

每只绵羊在每个髂骨上产生四个到六个缺损(平均每个髂骨五个缺损)。将每个骨切片分成两个测试区(外侧和内侧)。因此，对于右侧髂骨和左侧髂骨，每只动物总共有十八至二十二个治疗施加部位可用。测试样品和对照样品施加是随机分组进行。治疗组未被设计成在单一动物中完成。当一个组在一只动物中由于无法产生另外的缺损而没有完成时，在随后的动物中再次挑选该组。每天评估两只动物。对每天麻醉的第一动物分配来自第1组-第5组的治疗。对每天麻醉的第二动物分配来自第6组-第10组的治疗。

在缺损产生之后，外科医生在施加产品之前将出血强度评为轻度、中度或重度。还记录下每个施加部位完成产品施加所需的近似时间，并且捕获关于可用性的主观评论。

适用时，对每个施加程序进行以下终点评估：

·主要终点止血：记录产品在完成施加时提供止血的能力。如果产品在完成施加时没有止血，则对持续出血的质量进行评定或描述。在施加后观察该部位至少2分钟并且最多10分钟，以确定是否持续出血。

·次要终点持久止血：对于主要终点成功的部位，记录下产品在10分钟观察期内继续提供止血的能力。如果在10分钟观察期内的任何时间观察到出血，则记录下检测到出血的时间。继续观察该部位最少2分钟或最多10分钟的终点，以记录突破性出血是否持续。

·另外的终点：对于次要终点确认在10分钟观察期内成功持续/持久止血的部位：记录在抽吸和灌洗同时和之后止血的失败或持续，并通过将治疗部位直接暴露于电灼来评估产品的易燃性。

例外是在第一只动物中进行的两次假治疗，其中使用完整的缺损表面来确认在使用和不使用肝素情况下的模型性能。随后，将这两个部位分成测试区，对于每个测试区进行测试/对照评估，因为在整个10分钟的假治疗观察期间，出血在使用和不使用肝素抗凝作用的情况下保持一致。

模型合理性：已经评估了在绵羊髂骨翼中产生的骨缺损，并且发现它是临床上相关的活动性渗出骨出血的适当模型。该模型允许每只动物存在多个骨缺损并且允许进行连续的骨切片，从而允许重复施加所研究的产品。另外，暴露的出血表面足够宽以允许并排施加两种不同的产品以，同时进行评估。表8汇总了一些方法参数。

表8测试系统中的方法参数

样品制备：测试样品-测试样品是按原样施加。手动施加样品；对照物-骨蜡通过使用带手套的手/手指加热到所希望稠度以处理成适当的形状来制备。然后，将软化的样品施加到骨缺损。

程序：对于每个髂骨，在髋骨结节上沿中心产生曲线形皮肤切口。通过切断与髂骨翼的肌肉附着来产生另外的骨暴露，以使可用于测试的部位最大化。在该程序期间，在进行骨出血评估之前，根据需要使用夹钳、结扎、电灼术或适当的止血剂来控制软组织出血。

缺损/出血部位的产生：使用骨刀或凿子连续横切髂骨翼以产生多个缺损。每个缺损被分成两个测试区(外侧和内侧)。在两侧上进行测试。在测试表面的中点处，相邻的产品施加略有重叠。在注释部分中记下在重叠点处检测到的任何出血，但不归因于任何一种产品。努力抬高和/或烧灼邻近缺损部位的骨膜，以最大限度地减少对于随后评估来自松质骨的骨出血的干扰。

动物的肝素化：使用静脉内肝素来模仿在抗凝心血管患者中骨止血剂的使用。动物仅在两个髂骨栉软组织方法完成之后才接受全身肝素抗凝疗法以增强出血。动物接受300lU/kg的肝素钠初始载量静脉内团注。监测基线和治疗后活化凝血时间(ACT)以调整动物中使用的肝素的剂量。在初始施加肝素后最少10分钟，抽取血液样品，并测量ACT。当ACT大于基线读数的2倍时，对动物进行适当的肝素化。一旦实现肝素化，就大约每60分钟进行一次ACT以监测水平并根据需要施加另外的团注。表9呈现出血分数。

表9出血分数

分数	说明
		轻度	缺损处有少量血液渗出
中等	缺损处有中等量的血液渗出
		重度	缺损处有大量血液渗出

假治疗部位：对处于非肝素化和肝素化状态的一只动物(研究中的第一只动物)进行假施加作为确认本研究的出血模型的第一个治疗部位。对于这些假施加，使骨表面暴露并在10分钟的观察期间观察持续出血，并且定期应用纱布填塞以适当评估该部位处的出血情况。在观察期开始和结束时，如表9中所示分配出血分数。在观察完成后，因为在10分钟的观察期间出血保持一致，所以使用假部位进行第一对产品施加。

测试物和对照物治疗部位：将每只动物暴露的骨盆的第一侧用于非肝素化测试，然后在暴露骨盆的第二侧之后，对动物进行肝素化并且完成剩余的抗凝测试。研究负责人和外科医生都进行了评估并作出相关评论。

对于测试样品和对照样品治疗的部位，在单次施加中将该物品施加到正在出血的缺损部位，其中该物品的量是外科医生认为适合于提供止血的量。将样品施加到缺损的外侧和内侧表面。样品在缺损部位的中点处重叠。记录以下关于测试物和对照物处理和施加的信息：

1.按重量计，所施加的产品的质量。

2.完成产品施加所需的时间。

3.对测试物原型的处理与骨蜡进行主观比较。捕获外科医生关于处理特征的评论。

在施加后，评估测试物和对照物的止血功效达10分钟。评估人员将来自松质骨的出血与由邻近骨膜产生的出血相区分。预期骨膜出血不能通过骨止血剂的施加来控制。

评估以下终点：

1.初级止血-在完成施加时产品是否已控制出血(“是”或“否”)。

a.如果为“是”-移动到终点2

b.如果为“否”-记录失败的时间并根据表9进行出血评分。继续观察部位至少2分钟，并记下在终止测试部位的测试之前延迟止血的任何时间。如果延迟止血在2

c.分钟内实现，则移动到2。如果在2分钟内未实现延迟止血，则终止测试。

i.记录评估人员是否认为他们已充分施加了产品。

2.第二级持久止血–产品是否在整个10分钟观察期内控制出血(“是”或“否”)

a.如果为“是”-移动到终点3

b.如果为“否”-如表9中所示进行出血评分，终止正式测试，或者评估人员可以选择再观察并记录评论2分钟或直至10分钟的观察期结束(以先发生者为准)。

3.次要成功标准-仅适用于那些在10分钟内止血的测试部位。

a.在10分钟的观察期后，产品在直接施加到该部位的灌洗和抽吸下是否会粘附到该部位？(“是”或“否”)

i.如果为“是”-移动到c

ii.如果为“否”-移动到b

b.在产品拿开后，该部位是否会保持2分钟止血？(“是”或“否”)。如果为“否”，则如表1所示，对出血进行评分。

c.产品显示在暴露于直接电灼时是否显示出易燃的迹象？(“是”或“否”)。

i.记录电灼工具的标识和功率设置。

图6A-图6B示出了摄影图像，说明针对绵羊髂骨缺损模型进行的止血评估：产生缺损，并在10分钟内不施加治疗以确保止血不是由于自动凝固引起(图6A)以及当将骨蜡和CMS-CA施加至同一缺损表面时(图6B)。评估急性止血、持久止血和粘合性。

表10示出止血和粘合性的组合结果。分别在非肝素化和肝素化条件下评估测试物和骨蜡的止血作用和骨粘合性。在施加后0分钟和10分钟时评估止血功效。随后，通过用盐水冲洗来研究骨粘合性。

表10终点结果-绵羊模型

^*除非另有说明，否则在本实施例中，“HA-CA”是指HA-CA 0.5X、peg，PEG400比甘油为1:2.2。

在另外的示例性实验中，比较了交联透明质酸(HA)(Shanghai MacklinBiochemical Co.Ltd)糊剂与CMS的止血功效。在绵羊模型上评估这两种原型。

表11示出了骨蜡、Ostene(Baxter)HA-CA和CMS-CA的初级止血作用的比较结果。

表11初级止血

表12示出了骨蜡、Ostene(Baxter)HA-CA和CMS-CA的持久止血作用的比较结果。

表12持久止血

表13示出了骨蜡、Ostene(Baxter)HA-CA和CMS-CA的粘合力的比较结果。

表13粘合力的比较结果

表14示出了骨蜡、Ostene(Baxter)HA-CA和CMS-CA的粘合力的累积性能初始止血+持久止血+粘合力结果。

表14累积性能

表15示出了在冲洗和抽吸后的止血情况(粘合体或非粘合体，但没有后续再出血的迹象)。

表15在冲洗和抽吸之后的止血情况

图7示出了基于表15的CMS-CA和对照物(来自Baxter的骨蜡)的组合止血结果，表明CMS-CA提供与骨蜡类似的止血性能。

表16示出了考虑所有评估的累积性能最终止血评分。

表16累积性能：最终止血评分

因此，可以得出结论，HA-CA和CMS-CA样品都可以停止出血，如缺损模型中所测试的。

HA-CA样品看来比CMS-CA样品更能有效止血。然而，HA样品的降解曲线要慢于CMS的降解曲线。

当在猪股骨横截面模型中评估测试样品的功效时，展示出该蜡的不可吸收、硬质外观以及Ostene的弱粘合性。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变型对于本领域中那些技术人员而言是显而易见的。因此，本文旨在涵盖落入所附权利要求书的实质和广义范围内的所有此类另选形式、修改和变型。

Claims

1.一种不可流动的且可变形的止血组合物，所述不可流动的且可变形的止血组合物包含：干凝胶交联粉末状多糖，所述干凝胶交联粉末状多糖分散在甘油和聚乙二醇(PEG)的基本上无水的共混物内，其中所述PEG和所述甘油分别以按重量计高于1:1.3到低于1:2.7范围内的比率存在，并且其中所述组合物中的粉末含量按重量计大于50％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述多糖包括选自由以下组成的组的聚合物：羧甲基淀粉(CMS)、交联透明质酸盐(HA)以及它们的混合物或共聚物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述PEG包括PEG 400。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述干凝胶交联粉末状多糖经过研磨。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述交联多糖是经由多官能羧酸交联的，其中所述酸选自由以下组成的组：苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸以及它们的任何混合物或组合。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述酸包括柠檬酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述干凝胶交联粉末状多糖例如CMS呈悬浮粉末的形式，所述悬浮粉末具有小于100微米的中值粒度。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物包含按重量计小于3％，任选地小于1％的水。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，按重量计，所述甘油以15％到30％的浓度存在，并且所述PEG以10％到25％的浓度存在。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述干凝胶交联粉末状多糖在25℃下、任选地在小于2分钟内具有按重量计至少10倍的水中溶胀能力。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中，所述干凝胶交联粉末状多糖的特征在于按初始重量计60％到80％的体内降解率。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物基本上不含聚丙二醇。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中的粉末含量按重量计大于60％，任选地为至多70％。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其特征在于2.5N/m到4.5N/m范围内的粘合性，如通过T型剥离测试，例如根据ASTMF2256-052015所测量的。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，所述组合物呈糊剂的形式。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其特征在于对腈，例如对腈手套无粘性。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，所述组合物具有0.0047mol/ml到0.0054mol/ml，任选地约0.0047mol/ml的交联度(ρ)。

18.一种制备不可流动的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供干凝胶交联粉末状多糖；

b.向所述干凝胶中添加甘油和PEG的无水共混物，其中所述PEG和所述甘油分别以按重量计高于1.3:1到低于2.7:1之间的比率存在，并且其中所述组合物中的粉末含量按重量计大于50％；以及

c.混合所述共混物以形成所述不可流动的止血糊剂。

19.一种封合剂层，所述封合剂层通过根据权利要求18所述的方法来获得。

20.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物在用于治疗伤口或出血组织的方法中的用途，所述方法包括将所述组合物施加到伤口或出血组织。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述出血组织是骨组织。

22.根据权利要求20或21所述的用途，其中，所述方法包括骨科手术，例如脊柱手术。

23.一种套件，所述套件包括：

a.容器，所述容器容纳根据权利要求1至17中任一项所述的组合物；

b.施用装置，所述施用装置用于将所述组合物施加到组织；以及任选地

c.使用说明。