CN115569195B

CN115569195B - 血浆激肽释放酶原在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的用途

Info

Publication number: CN115569195B
Application number: CN202110684160.2A
Authority: CN
Inventors: 宋保亮; 王金凯
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2024-08-20
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN115569195A

Abstract

本发明提供血浆激肽释放酶原(PK)及血浆激肽释放酶(PKa)的新用途，所述血浆激肽释放酶原(PK)用于制备治疗高血脂、心脑血管疾病，特别是预防和/或治疗动脉粥样硬化性心血脑管疾病的药物。

Description

血浆激肽释放酶原在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地说涉及血浆激肽释放酶原(PK)及血浆激肽释放酶(PKa)的新用途。

背景技术

动脉粥样硬化性心脑血脑管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是目前全球人口的首位死亡原因(1,2)。ASCVD作为慢性疾病，其根本病因动脉粥样硬化(Atherosclerosis)会经历一个长期的无症状的发展过程，直到动脉粥样硬化斑块突然破裂引起血栓(Atherosclerotic plaque rupture-inducedthrombosis)堵塞血液正常流动，造成急性心脑血管疾病事件，如急性心梗或卒中，严重威胁人类的生命安全(3)。血液循环中含有载脂蛋白 -B(ApolipoproteinB)的脂蛋白颗粒，是诱发动脉粥样硬化的重要危险因子，尤其是富含胆固醇的低密度脂蛋白颗粒(low-density-lipoproteincholesterol,LDL-c)。血液中LDL-c水平过高时，其会内陷于动脉血管壁中，伴随着血液中单核细胞迁移到动脉血管内皮之下，分化为巨噬细胞吞噬这些过多的脂蛋白颗粒，此过程是被广泛接受的动脉粥样硬化起始事件(4,5)。降低血液中LDL-c水平是预防和治疗ASCVD的有效途径。低密度脂蛋受体(low-density-lipoprotein receptor,LDLR)介导的LDL-c的内吞途径是血液中LDL-c清除的主要方式，LDLR主要在胆固醇代谢调控的重要器官肝脏高表达(6,7)。目前临床使用的降血脂药物他汀类药物和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein Convertase Subtilisin/kexin Type 9,PCSK9)均是通过上调细胞表面的LDLR从而达到降低LDL-c的目的(8, 9)。然而，在ASCVD漫长的发展过程中，除了LDLs驱动外，还有许多因素参与该过程，比如炎症或者血栓(10-12)。动脉粥样硬化斑块中富含一系列促凝物质，比如多聚磷酸盐、来自坏死细胞的DNA和RNA以及胶原蛋白和组织因子等。这些物质在斑块破裂的情况下释放到血液中，激起凝血系统形成血栓，导致最终的心脑血管事件(10)。

凝血瀑布反应由两条活化途径起始，组织因子起始的外源凝血途径和接触系统起始的内源性凝血，最后合并到共同途径(图6A)(13,14)。血浆激肽释放酶(plasmakallikrein,PKa)是一种丝氨酸蛋白酶，在内源途径中起到重要的调控作用。人PK是由KLKB1基因(NM_000892.5)编码的血浆激肽释放酶原 (prekallikrein,简称PK,又名：Fletcher factor或plasma prekallikrein)被活化的 12因子(FXIIa)切割R371-L372肽键转换而来，血浆激肽释放酶原(PK)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。与此同时，PKa可以激活因子12(FXII)产生更多的FXIIa，这种相互激活形式快速放大了内源凝血起始信号，产生更多的下游活化因子10(FXa)(15,16)。在外源凝血途径中，组织因子(TissueFactor)暴露于血液中，通过因子7(FVII)激活FX。活化的FXa激活凝血酶原(prothrombin)产生凝血酶(thrombin)，最终促生成纤维蛋白和血小板等交织的血栓(17)。

发明内容

根据本发明的一方面，提供血浆激肽释放酶原在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的用途。所述预防和/或治疗心脑血管疾病是通过抑制或降低所述血浆激肽释放酶原蛋白的表达水平，从而降低或阻断PK和LDLR的相互作用，而降低胆固醇水平。

本发明所述的用途，其中所述血浆激肽释放酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本发明所述抑制或降低所述血浆激肽释放酶原蛋白表达水平可以选自但不限于下述方法：

1)敲除或基因编辑失活Klkb1基因；

2)用抗血浆激肽释放酶原的中和抗体或竞争性多肽阻断血浆激肽释放酶原和LDLR的相互结合；

3)利用选自基因干扰、反义核酸、dCas9介导的基因沉默和Cas13a介导的 RNA切割的方法抑制血浆激肽释放酶原蛋白的表达；

4)用结合血浆激肽释放酶原和/或血浆激肽释放酶的化合物阻断血浆激肽释放酶原和LDLR的相互结合和/或抑制血浆激肽释放酶的活性。

本发明所述心脑血管疾病选自高血脂症、动脉粥样硬化性心脑血管疾病和血栓疾病。更优选的是，其中所述心脑血管疾病为动脉粥样硬化性心血脑管疾病。

根据本发明的另一方面，提供分离的中和抗体，所述中和抗体结合包含SEQ IDNO.1(人源PK或PKa蛋白质氨基酸序列)或SEQ ID NO.2(鼠源PK或PKa 蛋白质氨基酸序列)的血浆激肽释放酶原蛋白，其中所述中和抗体阻断血浆激肽释放酶原与LDLR的相互结合

作为更小的结合单元，PK的601-630区段的氨基酸(SEQ ID NO.3(鼠源) 或SEQ IDNO.4(人源))对PK和LDLR的相互作用及诱导LDLR降解是必要的，因此，本发明所述分离的中和抗原结合蛋白也包括可以结合该区段氨基酸的蛋白。

本发明也提供一种分离的中和抗体，所述中和抗体结合包含SEQ ID NO.3 或SEQID NO.4所示的氨基酸序列的蛋白，其中所述中和抗体阻断血浆激肽释放酶原与LDLR的相互结合。

本发明的抗体或抗原结合蛋白可以用于治疗与高血清胆固醇水平有关的相关心脑血管疾病的药物，也可以用于预防和治疗与血栓形成相关的疾病药物。

本发明首次发现凝血因子血浆激肽释放酶原结合低密度脂蛋白受体，并促进该受体通过溶酶体途径降解。通过基因敲除或抗体中和降低或阻断所述血浆激肽释放酶蛋白表达，能显著升高肝脏低密度脂蛋白受体水平，降低血液胆固醇。同时在人群研究中，血液中低密度脂蛋白胆固醇浓度同血浆激肽释放酶原蛋白水平呈现密切正相关关系。作为凝血因子，血浆激肽释放酶原的缺失有效的抑制斑块破裂引起的血栓，而未检测到出血风险以及生长发育缺陷。综上所述，抑制血浆激肽释放酶原，能够同时达到降低血液胆固醇以及抗血栓的效果，并且无出血风险，这是一个非常好的预防和治疗心脑血管疾病的途径。

附图说明

图1PK促进LDLR降解并减少LDL的内吞

(A)PK和LDLR的免疫共沉淀实验。肝癌Huh7细胞按照如图所示的方案进行转染实验。用偶联抗MYC-标签抗体的琼脂糖凝胶从细胞裂解液中特异结合纯化LDLR-MYC蛋白，最后蛋白质免疫印迹实验验证PK和LDLR相互作用。

(B)在Huh7细胞中过表达PK蛋白会促进LDLR降解。多西环素(DOX) 诱导型稳定转染PK的Huh7细胞，在加或不加洛伐他汀处理的情况下，用DOX 诱导PK表达24小时后，收集细胞经行裂解，然后免疫印迹实验检测LDLR， PK和CHC。

(C)溶酶体抑制剂NH4Cl阻断PK诱导LDLR降解。多西环素(DOX) 诱导型稳定转染PK的Huh7细胞在如图所示的实验方案下，用DOX，NH4Cl 或MG-132处理18小时，随后免疫印迹实验分析。

(D)纯化的PK蛋白可诱导LDLR降解。Huh7细胞在胆固醇饥饿处理12小时后，在培养基中分别加入如图设计方案所示的PK或PCSK9蛋白，处理 8小时后进行免疫印迹实验分析，细胞裂解液检测LDLR和Actin，培养基检测 Flag标签蛋白。

(E)抑制PK蛋白表达升高细胞LDLR蛋白水平。Huh7细胞分别转染靶向 IDOL和KLKB1的siRNA，培养48小时后，收集细胞经行免疫印迹检测。

(F-G)抑制PK表达促进细胞吸收LDL。Huh7细胞转染针对KLKB1的 siRNA，培养36小时后，细胞再进行胆固醇饥饿处理12小时，随后用10μgml^-1的DiI-LDL孵育一个小时。具有代表性的共聚焦荧光显微镜观察结果图片如(F) 所示，并且每组分别选取60个细胞进行荧光定量分析(G)。数据呈现方式为 mean±s.e.m.统计差异采用非配对的双尾学生t-检测。

(H-K)用偏相关分析方法分析血清PK蛋白和TC(H)、TG(I)、LDL-c (J)和HDL-c(K)的相关性，性别和年纪作为控制变量。(n＝198，双尾概率) 图2仓鼠、大鼠和小鼠的Klkb1基因缺失后，其肝脏LDLR蛋白水平更高，血液胆固醇水平更低

(A)利用CRISPR/Cas9技术制作Klkb1基因全身敲除的仓鼠的示意图。

(B-L)五个月大小的雄性仓鼠(n＝7每组)喂养高胆固醇饲料(HCD)三周，分析仓鼠体重(B)和每日进食量(C)，LDLR和CHC在不同组织的表达情况(D，最下面的条带是基因型PCR鉴定结果)，血浆总胆固醇(E)，血浆甘油三酯(F)，胆固醇(G)和甘油三酯(H)在快速蛋白液相色谱分离的不同脂蛋白中的含量，肝脏总胆固醇(I)，肝脏甘油三酯(J)，血浆中的AST(K)和 ALT(L)活性水平。

(M-Q)五个月龄的雌性仓鼠(n＝12每组)喂养高胆固醇饲料4周，分析肝脏中LDLR和CHC的表达情况(M)，血浆中总胆固醇(N)和甘油三酯(O) 含量，胆固醇(P)甘油三酯(Q)在快速蛋白液相色谱分离的不同脂蛋白中的含量。数据呈现方式为mean±s.e.m.，统计差异采用非配对的双尾学生t-检测(B, C,E,F,I-L,N,O)。

图3抗PK的中和抗体阻断PK和LDLR的相互作用，并且在小鼠中升高肝脏 LDLR蛋白水平和降低血浆胆固醇水平

(A)PK蛋白的一系列截短突变体示意图。

(B)PK蛋白的601-630位氨基酸对于PK和LDLR的相互作用是必须的。 Huh7细胞转染如图所示实验方案的表达质粒，培养48小时后，收集细胞，用含有1％NP-40的PBS作为细胞裂解液抽提蛋白，以抗MYC的琼脂糖凝胶作为基质进行免疫共沉淀实验。

(C)抗PK的抗体阻断PK和LDLR细胞外区段蛋白的相互作用。5μg纯化的带有Flag标签的PK蛋白先同5μg抗PK蛋白抗体混合在50μl的结合缓冲溶液中，冰上静置30分钟，随后补加纯化的8μg的LDLR细胞外区段蛋白，混匀，冰上静置1小时。之后用30μl的抗Flag琼脂糖凝胶珠同处理好的蛋白质混合液在4摄氏度翻转混匀2小时。最后用结合缓冲液充分洗涤结合蛋白后的凝胶珠，Flag多肽溶液洗脱结合的蛋白，进行免疫印迹实验分析。

(D)用抗PK抗体处理小鼠的流程图示。14周龄的Ldlr^+/-小鼠先用高胆固醇饲料喂养1周，之后腹腔注射对照IgG或者抗PK的2H5-IgG处理小鼠，给药剂量和频率为30mg每kg每2天，连续给药三次，一星期后，对小鼠进行分析(E-L)。

(E)免疫印迹分析实验，检测肝脏中的LDLR和CHC，血浆中的PK。

(F)快速蛋白液相色谱技术分离血浆脂蛋白后，检测不同脂蛋白中胆固醇的含量。

(G)血浆总胆固醇浓度。

(H)血浆甘油三酯浓度。

(I)肝脏总胆固醇含量。

(J)脏脏甘油三酯含量。

(K)血浆AST酶活水平。

(L)血浆ALT酶活水平。

数据呈现方式为mean±s.e.m.，统计差异采用非配对的双尾学生t-检测 (G-L)

图4小鼠Klkb1缺失后保护性抵抗动脉粥样硬化

八周龄的雄性Klkb1^+/+Apoe^-/-和Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠(n＝12每组)喂养高胆固醇饲料8周时间。小鼠处死后收集样品经行分析，免疫印迹实验分析肝脏 LDLR、CHC和PK表达情况(A)，检测血清总胆固醇浓度(B)，血清甘油三酯浓度(C)，肝脏中总胆固醇(D)和甘油三酯(E)水平。对整个主动脉经行脂质染色观察斑块分布情况，选取代表图片(F)并测定斑块面积占整个动脉面积的百分比(G)，主动脉根部切片油红-O染色，拍照观察斑块大小(H)，并对斑块的绝对面积进行测量(I，n＝6每组)。数据呈现方式为mean±s.e.m.，统计差异采用非配对的双尾学生t-检测(B-E,G,I)

图5PK消除后抑制FeCl₃诱导和斑块破裂诱导形成的血栓

3月龄的雄性Klkb1^+/+和Klkb1^-/-小鼠，在基础饲料的喂养条件下，被用来进行活化部分凝血活酶时间检测(A)，凝血酶原时间检测(B)，以及测定尾尖出血时间(C)。

(D-E)3个月大小的雄性Klkb1^+/+和Klkb1^-/-小鼠，喂养基础饲料，随后进行手术开展FeCl₃诱导颈动脉血栓实验。小鼠颈动脉分离暴露后，用7.5％FeCl₃处理1分钟，在显微镜下监测血栓的形成。(D)具有代表性的FeCl₃诱导的颈动脉血栓的荧光图片，(E)反映血栓大小的荧光信号定量(n＝6每组)

(F-I)八周大小的Klkb1^+/+Apoe^-/-和Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠(n＝8每组)喂养高胆固醇饲料16周，之后被用来进行斑块破裂诱导血栓形成的分析实验。(F)超声诱导斑块破裂的图示，(G)超声诱导斑块破裂后，随着时间延长，荧光显微镜监测到的具有代表性的血栓荧光图片，(H)不同时间点的血栓的荧光信号定量。血栓荧光信号每3秒记录一次，并将观测时间段内同一个血栓最强的荧光信号定义为100％。(I)斑块破裂后指定的时间点的血栓绝对的荧光信号强度定量。 (J)PK调控血液胆固醇水平和斑块破裂后血栓形成的模式图。在野生型动物中，PK结合LDLR，促进其溶酶体途径降解，因此升高了血液LDL-c水平，促进动脉粥样硬化斑块的发展，如果动脉粥样硬化斑块破裂，PK和FXII相互激活，加速血栓形成。当PK被敲除时，肝脏LDLR蛋白水平升高，加速LDL的清除，因此降低了血液胆固醇水平。另外，PK的缺失减缓了FXII的激活，抑制血栓的形成。

图6鉴定出PK结合LDLR

(A)卡通图示显示PK在凝血途径中的作用。凝血级联瀑布被分为三条途径：内源途径，外源途径和共同途径。在内源途径中，像核酸或者其它带负电的表面会激活FXII，活化的FXIIa会激活PK产生PKa，而PKa会反过来切割FXII产生FXIIa，这样会快速放大凝血信号，最终产生活化的凝血因子FXa。在外源途径中，暴露的组织因子通过凝血因子FVII来激活凝血因子FX。在共同途径中，活化的FXa激活凝血酶酶原prothrombin产生凝血酶thrombin，随后凝血酶切割纤维蛋白原形成纤维蛋白，并同血小板及其它血细胞共同形成血栓。

(B)利用质谱分析鉴定去脂蛋白血浆中结合LDLR的蛋白质。从 HEK293T细胞中纯化出LDLR-Flag蛋白，并将其结合在偶连抗Flag抗体的琼脂糖凝胶珠上，随后凝胶珠同去脂蛋白血浆进行孵育。在充分洗涤后，凝胶珠上的结合蛋白用Flag多肽溶液洗脱下来，并进行质谱分析。排名最靠前的部分候选蛋白陈列在图表中。

(C)PK和LDLR的免疫共沉淀实验。Huh7细胞按照如图所示的方案进行转染实验。细胞裂解后，用抗Flag的琼脂糖凝胶珠进行免疫共沉淀实验。

(D)实时定量荧光PCR检测siRNA干扰效率。细胞同Fig.1E是同一批实验。

图7仓鼠的相关特征

(A)雄性仓鼠LDLR的蛋白质组织表达谱。

(B)荧光定量分析仓鼠肝脏中的相关基因的表达情况。选用的样品来自 Fig.2D实验所用的仓鼠。

(C)肝脏切片的H&E和脂质油红-O染色。样品来自Fig.2D实验所用的仓鼠。

图8在LDLR^+/-小鼠中，PK缺失后提升肝脏LDLR蛋白水平，降低血液胆固醇浓度

(A)制作Klkb1全身敲除的小鼠的策略图。

(B-I)6个月大小的雄性Klkb1^+/+Ldlr^+/-和Klkb1^-/-Lldl^+/-小鼠喂养高胆固醇饲料4周，(B)免疫印迹分析肝脏中的LDLR、CHC和PK，(C)血浆中总胆固醇浓度，(D)血浆中的脂蛋白用快速液相色谱分离后测定各组分的胆固醇含量， (E)血浆总胆固醇水平，肝脏中(F)总胆固醇含量和(G)甘油三酯含量，血浆中(H)AST和(I)ALT水平。

图9利用AAV-shRNA敲低大鼠PK蛋白表达降低血液中胆固醇水平

8周龄的SD大鼠(n＝5每组)，喂养基础饲料，尾静脉注射AAV-sh-control 和AAV-sh-Klkb1病毒，每只注射剂量为3×10¹²病毒基因组拷贝数量。自由进食饮水的条件下喂养两周。

(A)免疫印迹实验检测肝脏中LDLR和CHC的蛋白水平以及血液中的PK。

(B)对(A)中LDLR条带信号的定量，结果用Actin条带信号进行校准。

(C)血清中总胆固醇浓度测定结果。

(D)快速液相色谱分离血清脂蛋白后，测定各组分中胆固醇含量的结果。图10生产针对PK的大鼠单克隆抗体

(A)PK不同截短体的示意图。

(B)PK不同截短体对LDLR蛋白稳定性的影响。Huh7细胞转染如图所示的质粒，培养48小时后，裂解细胞进行免疫印迹实验。

(C)生产针对PK的大鼠单克隆抗体的简易模式图。合成PK的601-630 位氨基酸对应的多肽序列，耦连KLH免疫大鼠，制备杂交瘤细胞株，筛选出分泌的抗体特异识别PK的细胞株，用来大规模制备抗体。

(D)用野生型和PK缺失的小鼠血清作为样品经行蛋白免疫印迹实验，显示大鼠单克隆抗体2H5-IgG特异识别血清中的PK蛋白。

(E)考马斯亮蓝染色分析纯化的PK和LDLR-ECD蛋白。将表达带Flag 标签的全长PK蛋白和带HIS标签的LDLR-ECD(胞外段1-788氨基酸)蛋白的质粒载体分别转染到HEK293T细胞中，从培养基中分别用抗Flag的琼脂糖凝胶珠和镍离子琼脂糖珠纯化蛋白。纯化后的蛋白用考马斯亮蓝分析纯度。

图11PK缺失的仓鼠和大鼠的凝血指标检测

(A-B)5月龄的雄性Klkb1^+/+和Klkb1^-/-仓鼠(n＝9每组)，在基础饲料喂养的情况下，检测(A)活化部分凝血活酶时间和(B)凝血酶原时间。

(C-D)6月龄的雄性Klkb1^+/+Ldlr^+/-和Klkb1^-/-Lldl^+/-小鼠(n＝8每组)，喂养高胆固醇饲料4周，检测(C)活化部分凝血活酶时间和(D)凝血酶原时间。

具体实施方式

以下通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明本发明，但并不意味着对本发明进行限制。所有实验材料除特别注明外，均通过商业购买。

1、实验材料和方法

1.1动物

Klkb1全身敲除的叙利亚金黄仓鼠和C57BL/6j小鼠分别由河北石家庄伊维沃生物科技有限公司和南京集萃药康生物科技有限公司运用CRISPR/Cas9技术制作。具体方法简而言之，把一对靶向仓鼠Klkb1的3号外显子内部或小鼠Klkb1 的3号外显子两侧序列的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到受精卵中，对目标序列编辑后导致仓鼠3号外显子缺失83碱基，小鼠3号外显子完全缺失，最终Klkb1 基因编码的蛋白提前终止。5月龄同窝生的野生型和PK全身缺失型仓鼠，喂食高胆固醇饲料(dietresearch，D12109C)3-4周，然后评估PK缺失后对血脂水平的影响。Ldlr全身敲除(Ldlr^-/-)和载脂蛋白E全身敲除(Apoe^-/-)的小鼠从南京集粹药康生物科技有限公司购买。Klkb1^-/-小鼠同Apoe^-/-小鼠和Ldlr^-/-小鼠进行交配，最后得到Klkb1^+/+Apoe^-/-,Klkb1^-/-Apoe^-/-和Klkb1^+/+Ldlr^+/-,Klkb1^-/-Ldlr^+/-小鼠。雄性Ldlr^-/-小鼠和野生型雌性小鼠交配，直接得到Ldlr^+/-小鼠。

8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠购买自湖北疾控中心，随机分组后喂食正常的基础饲料(dietresearch，D10001)一个星期，然后尾静脉注射AAV-sh-control 或AAV-sh-Klkb1病毒，每只注射剂量为3×10¹²病毒基因拷贝数。随后大鼠在自由进食进水的情况下喂养基础饲料2周，最后安乐死取样分析血脂水平和肝脏 LDLR表达情况。

所有经过CRISPR/Cas9技术基因编辑过的动物，在得到F1代雄性后，均同野生型雌性经行回交至少两代，然后再进行各类实验。所有动物均饲养在SPF 级别动物房的独立通风笼盒中，室温21-23摄氏度，湿度50-60％，12小时光照和12小时黑暗的昼夜循环。在特定实验外，所有动物均自由进食饮水。在分析 LDLR表达和血脂水平的实验中，动物先白天(8：00-20：00)断食，夜晚(20： 00-8：00)进食，然后安乐死前再禁食2小时。

所有动物的饲养和使用均遵从武汉大学实验动物管理使用伦理委员会准则。

1.2材料

细胞培养基购买自Thermo(DMEM,C11995500BT)，胎牛血清购买自Gibco (FBS,10099141)。NH4Cl(A9434)，甲羟戊酸钠(41288)，罗丹明6G(R4217)，FeCl₃(31232)，多聚甲醛(P6148)，苏丹IV(198102)等购买自Sigma。盐酸多西环素(DOX，A600889)购买自生工。苯甲基磺酰氟(PMSF，HY-B0496) 和MG132(HY-13259)购买自MCE。ALLN(208719)和pepstatinA(516481-M) 购买自Calbiochem。二硫苏糖醇(DTT，T5370)购买自Targetmol。大鼠对照血清IgG由戴安生物科技有限公司提供(武汉)。去脂蛋白血清(LPPS，密度大于1.215g ml^-1)由我们实验室利用超速离心方法去除FBS中的脂蛋白得到。

1.3质粒

根据分子克隆技术构建各类表达质粒。简而言之，Klkb1(NM_008455.3), Kng1(NM_001102416.3),Ldlr(NM_010700.3),PCSK9(NM_174936.4)基因的编码序列(不包括终止密码子)同PCR方法从cDNA中扩增出来，然后整合到表达载体pCMV-14-3×Flag载体中。pCMV-LDLR-MYC质粒表达小鼠的LDLR蛋白并在C端融合5×MYC标签，pCMV-LDLR-ECD-HIS表达小鼠LDLR蛋白胞外段1-788位氨基酸并在C端融合6×HIS标签，pLVX-Tet-on-PK编码小鼠全长的PK蛋白。PK的各类截短变体由快速点突变PCR技术得到。

1.4细胞培养

Huh7肝癌细胞和HEK293T胎肾细胞培养在含有10％FBS的DMEM培养基，并补加100单位每毫升的青霉素和100微克每毫升的链霉素(mediumA)。细胞在培养皿中贴住皿底单层生长，置于温度维持在37摄氏度，二氧化碳浓度5.5％的培养箱中培养。去除胆固醇的培养基是以DMEM为基础，补加5％的LPPS，并添加1微摩尔每升的洛伐他汀(Lovastatin)和50微摩尔每升的甲羟戊酸钠。

1.5蛋白质免疫印迹实验

将处理过的细胞或者动物组织利用RIPA裂解液经行蛋白SDS-PAGE电泳样品制备。RIPA裂解液配方如下：50mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,2mM MgCl₂,1.5％NP-40,0.1％SDS,and 0.5％sodium deoxycholate，使用时补加蛋白酶抑制剂，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,10μM MG132,10μg ml^-1leupeptin, 5μg ml^-1pepstatin,25μg ml^- ¹ALLN和1mM dithiothreitol。制备好的蛋白裂解液中的蛋白浓度用BCA法蛋白试剂盒测定(Thermo)。同组实验各个样品蛋白浓度用裂解液调整为同一水平后，补加4×Loading溶液(150mM Tris-HCl,pH 6.8, 12％SDS,30％glycerol,6％2-mercaptoethanol and 0.02％bromophenol blue)，混匀后95摄氏度煮沸10分钟。按照每个上样孔总蛋白量为40微克进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离不同大小的蛋白，然后将蛋白电泳迁移到PVDF薄膜上。结合蛋白条带的薄膜在含有5％脱脂牛奶的TBST溶液(25mM Tris,137mM NaCl,2.7mM KCl,0.075％Tween-20)中室温封闭孵育1小时后，同特定的初级抗体在4 摄氏度孵育12-16小时，初级抗体配制在TBST溶液中并补加质量体积分数为5％的牛血清白蛋白(BSA)。在用TBST溶液充分洗涤后，薄膜再同耦连辣根过氧化物酶体(HRP)的二级抗体在室温孵育1-2小时，二级抗体配制在TBST溶液中并补加质量分数为5％的脱脂牛奶。随后用TBST溶液充分洗涤薄膜至少三次后，用Pierce ECL Plus蛋白印迹底物(Thermo)进行条带可视化观察记录。蛋白免疫印迹所使用的初级抗体如下：识别Flag标签的单克隆抗体(M2克隆细胞株)购买自Sigma(F1804,0.5μg ml^-1)；识别MYC标签的鼠源单克隆抗体 (9E10，0.5μg ml^-1)从杂交瘤细胞株(ATCC)培养上清中纯化；识别LDLR 的兔源多克隆抗体(0.5μg ml^-1)由我们实验室制备抗原免疫新西兰大白兔后，从血清纯化得到；识别PK的羊源克隆抗体购买自R&D(AF2498,0.5μgml^-1)；识别CHC的鼠源单克隆抗体购买自BD Transduction Laboratories(610500,0.2μgml^-1)；识别β-Actin的鼠源单克隆抗体购买自Sigma(A1978,0.1μg ml^-1)；识别 GAPDH的兔源多克隆抗体购买自Proteintech(10494,0.1μg ml^-1)。使用的二级抗体如下：从JacksonImmuno Research Laboratories购买耦连HRP的识别小鼠的IgG的二级抗体(115-035-003,0.1μg ml^-1)和识别兔的IgG的二级抗体 (111-035-144,0.1μg ml^-1)；从Santa CruzBiotechnology购买识别羊的IgG二级抗体(sc-2354,0.1μg ml^-1)。针对PK的大鼠来源的单克隆抗体2H5-IgG由武汉戴安公司制备，抗原多肽序列为

GCARKDQPGVYTKVSEYMDWILEKTQSSDV(SEQ ID NO.3)。

1.6鉴定去脂蛋白血浆中LDLR的结合蛋白

将HEK293T细胞以8000K每盘的密度接种到15cm的培养皿中，培养基为含有10％FBS的DMEM。细胞完全贴壁后，将20μgpCMV-LDLR-Flag的质粒转染到细胞中。培养24小时后，去除培养基，用PBS清洗细胞两次，然后将培养更换为含有5％LPPS的DMEM培养基。再培养24小时后，去除培养基，细胞用预冷的PBS清洗多次，每盘细胞用1ml的裂解液(PBS,1％NP-40,10μM MG132,10μg ml^-1leupeptin,5μg ml^-1pepstatin,25μg ml^-1ALLN)重悬裂解，用 22G针头的注射器吸吹15次，使细胞充分裂解。细胞裂解液在4摄氏度以13200 rpm的转速离心10分钟，收集上清，将其和proteinA/G琼脂糖凝胶珠在4摄氏度孵育2小时去除非特异结合蛋白。然后以2000g的速度分离细胞裂解液和凝胶珠，并收集上清细胞裂解液同抗Flag的琼脂糖凝胶珠(Sigma)在4摄氏度孵育8小时，使得LDLR蛋白结合到琼脂糖凝胶珠上。结合蛋白的凝胶珠用裂解液充分洗涤后，再用pH＝8的Tris溶液(20mmol^-1Tris,100mmol^-1NaCl,0.5mmol^-1CaCl₂,pH＝8.0)和pH＝5的醋酸钠溶液(56mmol^-1sodium acetate,100 mmol^-1NaCl,0.5mmol^-1CaCl₂,pH＝5.0)分别轮转洗涤两轮(实验组)。对照组细胞转染pCDNA3空载质粒，其余操作与实验组完全一致。

收集新鲜的小鼠血浆，用滤膜截留分子量为100KDa的超滤柱(Millipore, MWCO,100,000)离心血浆，收集去除脂蛋白的血浆滤出液。然后用抗Flag的琼脂糖凝胶珠同血浆滤出液孵育去除非特异结合凝胶珠的蛋白。随后将处理好的血浆滤出液同结合LDLR的凝胶珠或对照凝胶珠在4摄氏度孵育过夜。充分洗涤后，结合在凝胶珠上的蛋白用Flag多肽溶液(0.5mg ml^-1in PBS)竞争洗脱下来。用质谱技术鉴定样品中的蛋白。

1.7免疫共沉淀实验

处理好的细胞用1ml的细胞裂解液在冰上裂解20分钟，然后收集裂解产物到1.5ml离心管，充分涡旋20秒钟使细胞完全裂解。裂解产物在4摄氏度以 13200rpm的速度离心10分钟，收集上清液。90μl的上清液加入30μl的 4×loading溶液(150mmol l^-1Tris-HCl,pH6.8,12％SDS,30％glycerol,6％ 2-mercaptoethanol and 0.02％bromophenol blue)，作为input样品。800μl的上清液同30μl的抗MYC或抗Flag的琼脂糖凝胶珠混匀后在4摄氏度孵育2-4小时。结合蛋白的凝胶珠在用细胞裂解液充分洗涤5次后，和120μl的1×loading溶液混匀并在95摄氏度金属浴中煮沸10分钟，离心后收集上清，作为pellet样品。最后取20μl的样品进行蛋白免疫印迹实验。

1.8多西环素诱导PK在Huh7细胞表达

用HEK293T细胞包装PK蛋白Tet-on诱导表达型并带有blast抗性的慢病毒整合表达病毒颗粒。包装好的病毒颗粒感染Huh7细胞16小时。随后用30μgml^-1的blasticidin筛选PK整合的阳性细胞。得到的阳性细胞以3×10⁵每孔的接种密度接种到6孔板中，培养24小时后，加入2μgml^-1的DOX。诱导24小时后，收集细胞进行免疫印迹实验。

1.9真核纯化重组蛋白

HEK293T细胞以8×10⁶每盘的密度接种到15cm直径规格的培养皿中，24 小时后，转染20μg的表达质粒到细胞中(质粒编码蛋白分别为：PK-3×Flag， PCSK9-3×Flag，LDLR-ECD_1-788-6×HIS)。转染24小时后，将培养基更换为DMEM，再继续培养24小时。收集细胞培养基，2000g离心10分钟去除细胞及细胞碎片。对于含有PK-3×Flag或PCSK9-3×Flag蛋白的培养基上清，将其在四度缓慢的引流经过抗Flag的琼脂糖凝胶珠填充柱，使得蛋白结合在凝胶珠上，随后用 PBS加大流速充分洗涤填料，去除非特异结合蛋白。最后用3×Flag多肽的PBS 溶液竞争洗脱结合在凝胶珠上的蛋白。对于含有LDLR-ECD_1-788-6×HIS蛋白的培养基上清液，先利用超滤柱(50KDa-cutt-off,Millipore)将溶液离心置换为含有1mmoll-1CaCl2的PBS，随后再利用镍离子琼脂糖凝胶珠(Qiagen)纯化LDLR 蛋白。所有洗脱下来的蛋白，利用分子截留大小为10KDa的超滤柱去除小分子量的杂质如多肽或咪唑，并将蛋白质的溶液置换实验所需的溶液。纯化好的蛋白由BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳后考马斯亮蓝染色分析蛋白纯度。蛋白分装成小份，-80摄氏度冻存，避免反复冻融。

1.10PK或PCSK9蛋白诱导LDLR降解

Huh7细胞以5×10⁵每孔的密度接种到6孔板中，培养24小时后，将培养基更换为去除胆固醇的培养基，培养16小时。之后细胞用PBS清洗两次后，加入含有如图所示浓度的PK或PCSK9蛋白DMEM培养基(含有10μgml^-1的 leupeptin)，在37摄氏度诱导8小时。随后收集细胞和培养基进行免疫印迹实验。细胞用RIPA裂解液溶解制样。培养基在离心去除细胞或碎片后，直接按比例加入4×loading溶液，95摄氏度煮10分钟使蛋白变性。

1.11RNA干扰实验

siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成。序列信息如下：靶向IDOL的是 5’-GACTTTAGCCCAATTAATA-3’(SEQ ID NO.5)；靶向KLKB1的两条分别是 5’-GTGTAAGTGTTTCTTAAGA-3’(SEQ ID NO.6)和 5’-CCCAGAAGACTGTAAGGAA-3’(SEQ ID NO.7)；对照siRNA序列为 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’(SEQ ID NO.8)。利用脂质体转染试剂RNAiMAX(Invitrogen)将siRNA转如到Huh7细胞中，培养48小时后，收集细胞经行检测。

1.12准备腺相关病毒(AAV)

将包装AAV的三种质粒(AAV-U6-shRNAvector,delta F6 helper plasmid,Revcap 2/9vector)转染到HEK293T细胞中从而产生病毒颗粒。转染后培养60小时，收集细胞，用Tris细胞裂解液(150mM NaCl,20mM Tris,pH8.0)重悬，然后反复冻融三次使细胞破碎并释放病毒颗粒。用核酸酶(Sigma,E8263)将溶液中的游离的核酸片段消化掉。细胞裂解液中的病毒颗粒利用碘克沙醇密度梯度溶液(17％-25％-40％-60％)在14摄氏度以53000rpm速度离心160分钟进行分离，收集病毒颗粒所在的40％浓度的液层，再用100KDa截留的超滤柱离心将病毒颗粒溶液置换成PBS。最后利用实时荧光定量PCR技术对病毒载体基因拷贝数定量。

1.13PK和LDLR-ECD的体外结合实验

5μg的PK-Flag蛋白同5μg的2H5-IgG混合在50ul的结合溶液(PBS,pH＝7.4, 5％glycerol,0.1％Tween-20,1mM CaCl₂)中，在冰上静置30分钟。随后，在 PK蛋白溶液或者PK/2H5-IgG混合物中加入8μgLDLR-ECD蛋白，混匀后在冰上静置1小时。LDLR蛋白直接加入结合溶液中作为阴性对照。再接着，在上述体系中加入800ul的结合缓冲溶液，混匀后留取部分作为input样品，余下溶液和30μl的抗Flag的凝胶珠在4摄氏度孵育2小时。结合蛋白后的琼脂糖凝胶用结合缓冲液充分洗涤后，其所结合的蛋白用Flag多肽溶液洗脱下来。最后，所得样品进行蛋白免疫印迹实验分析。

1.14LDL内吞实验

实验收集了部分人血液样品，用密度梯度离心法分离出其中的LDL，再用12ul的6mgml^-1的DiI染料(Invitrogen)同1ml的0.5mgml^-1的LDL混合，在 37摄氏度孵育3小时，以此来标记LDL。DiI-LDL溶液用0.45μm的滤膜过滤后即可使用。生长在玻片上的Huh-7细胞在转染siRNA后，先用去除胆固醇的培养基培养12小时，再用含有10μg ml^-1DiI-LDL的DMEM在37摄氏度培养1 小时。细胞在用预冷的PBS清洗三次后，用4％的PFA溶液在黑暗环境中固定25分钟。封片后用共聚焦荧光显微镜检测荧光信号。

1.15人群中血清PK蛋白含量检测

这部分研究由新疆医科大学第一附属医院提供帮助。在实验进展前，所有提供血液样品的参与者均签署知情同意书。这些参与的志愿者均是成年的汉族大学生(n＝198，男性86人，女性112人，年龄17-25岁)。血清中的PK蛋白绝对浓度用人的PK的ELISA试剂盒测定(Novus Biologicals)。

1.16小鼠尾尖出血时间测定

小鼠用水合氯醛腹腔注射进行麻醉，剂量为400mg kg^-1，然后放置在37摄氏度的加热板上保持体温。尾尖用锋利的手术刀片切断约5mm的片段，然后立即将剪过的尾尖浸入到37摄氏度预热的生理盐水中(装在15ml透明的离心管)，观察出血情况，并记录出血时间(停止出血至少30秒)。

1.17凝血指标APTT和PT测定

部分活化凝血酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)利用试剂盒根据其说明书测定。APTT试剂盒(上海江莱，JL TC0305)，PT试剂盒(上海太阳生物， E103)。

1.18FeCl₃诱导劲动脉血栓实验

3月龄的C57BL/6j雄性Klkb1^+/+和Klkb1^-/-小鼠喂养正常基础饲料，在经尾静脉注射罗丹明6G生理盐水溶液后(罗丹明6G溶液浓度为0.5mgml^-1，注射剂量为5ulkg^-1体重)，将小鼠用水合氯醛麻醉，腹侧向上固定在加热板上。剪开皮肤和筋膜，分离出藏于肌肉和软组织下的颈动脉，注意不要在手术过程中对血管造成损伤。将一小块深蓝色橡胶薄膜放置在颈动脉下来减少背景荧光信号干扰。把小块7.5％FeCl₃水溶液浸润的滤纸贴于暴露的颈动脉上1分钟，滤纸去除后立马用生理盐水清洗颈动脉并在荧光显微镜下观察记录受损部位血栓的形成。

1.19斑块破裂诱导的动脉粥样硬化性血栓实验

8周龄的Klkb1^+/+Apoe^-/-和Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠喂养高胆固醇饲料(ResearchDiet,D12109C)16周。在小鼠麻醉20分钟前，皮下注射罗丹明6G染料，随后如同之前的方法分离暴露颈动脉。在体式显微镜下，将直径为1mm的超声波探头顶到斑块的边侧部位，随后运用超声仪(瞬玛，ST-250)以100W的功率处理30秒钟使得斑块破裂。立马在荧光显微体式镜下观察记录血栓的形成(Olympus CCD camera,DP-74)，至少记录10分钟。血栓的大小用荧光信号强度来反应，并用ImageJ软件分析定量。

1.20动脉粥样硬化斑块的分析

8周龄的Klkb1^+/+Apoe^-/-和Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠喂养高胆固醇饲料(ResearchDiet,D12109C)8周。收集血液后，小鼠被颈椎脱臼安乐死。然后经左心室灌流约20ml的生理盐水去除体内残留血液。将肝脏组织收集起来，液氮速冻后保存在-80摄氏度。将心脏连同整个主动脉小心分离下来，浸泡在4％的PFA固定液中，4摄氏度静置24小时。在剥离一些黏附的脂肪组织及小的动脉分支后，将主动脉分离下来(主动脉弓到腰髂动脉分支)，并从侧部剪开，然后固定在黑色橡胶板上，用苏丹IV溶液染色脂质15分钟，随后用70的乙醇溶液清洗3分钟。最后将动脉浸泡在PBS溶液中，并用体式显微镜(Olympus SZX16)观察记录斑块染色情况。心脏在15％和30％的蔗糖溶液中分步脱水沉糖后，用OCT包埋剂包埋固定。一系列的8μm后的连续冰冻切片得到后，选取每个心脏相同部位的切片进行油红-O染色。斑块的大小用ImageJ软件定量评估。

1.21血液收集

用异氟烷将动物麻醉后，从眼球静脉丛或者心脏进行采血。在测定凝血指标时，收集血液按照体积比为9:1同0.109M柠檬酸钠混合。血液收集后，4摄氏度以2000g的速度离心30分钟，取上上清液得到血浆或者血清。

1.22快速蛋白液相色谱(FPLC)

同一实验中，相同体积的不同组样品分别注入到复合凝胶柱中(GE Healthcare，Superdex 75 10/300GL)，然后用FPLC系统(AKTA,GE Healthcare)分离。各组分样品在含有5mmol l^-1EDTA的PBS溶液以0.3ml每分钟的速度进行洗脱分离，每个组分收集300μl洗脱液。每个组分取40μl经行脂质定量分析。胆固醇和甘油三脂的分布曲线是将各组分的测定结果用graphPad软件分析生成。

1.23血液和肝脏化学分析

取约60mg的肝脏组织，用1.2ml的氯仿甲醇(体积比2：1)匀浆萃取其中的脂质。在通风橱中，50摄氏度条件下烘干脂质存在的有机液体，再用乙醇溶解脂质。每个实验中，取等体积的血浆、血清或者肝脂提取物用试剂盒(科华总胆固醇试剂盒和甘油三脂试剂盒)测定脂质水平。血浆中的AST和ALT根据试剂盒说明书进行测定(南京建成，AST-C010-2-1，ALT-C009-2-1)。

1.24实时定量荧光PCR

组织或细胞中的RNA利用TriZol试剂(Invitrogen)提取。2μg的RNA同0.1μg的随机引物混合在25μl的反转录体系中合成cDNA，反转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)。用翊圣生物的Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen Biotech)配制q-PCR反应体系，然后在Bio-Rad CFX96型号PCR仪中运行程序检测分析。

2、实验结果

2.1PK促进LDLR降解

为探求血液循环中新的影响LDLR的蛋白质，在HEK293T细胞中表达全长并且C端带有Flag标签的LDLR蛋白，以该重组蛋白作为诱饵蛋白从小鼠去脂蛋白血浆中捕获与其相互作用的蛋白。通过质谱分析，鉴定出一系列候选相互作用蛋白，其中KLKB1基因编码的PK蛋白排名靠前(图6B)。通过免疫共沉淀实验，在以血液因子缓激肽酶原(Kininogen1)为阴性对照和PCSK9作为阳性对照的情况下，进一步确认PK确实同LDLR相互作用(图1A，图6C)。为了进一步探索PK对LDLR的影响，构建多西环素(doxycycline，DOX)诱导过表达型PK稳定整合转染肝癌Huh-7细胞株，利用DOX诱导PK高表达，可以有效降低细胞内LDLR蛋白水平，即使在他汀药物促进LDLR表达量升高的情况下，PK降解LDLR效果依旧显著(图1B)。溶酶体抑制剂NH₄Cl有效抑制 PK降解LDLR，而蛋白酶体抑制剂MG-132则不影响PK降解LDLR，说明PK 是通过溶酶体途径降解LDLR(图1C)。同PCSK9类似(18)，PK主要在肝脏表达，然后分泌到血液中(19)。将纯化的PK蛋白加入到细胞培养基中，检测到同PCSK9 能力相当的降解细胞LDLR的效果(图1D)。利用小干扰RNA(siRNA)抑制细胞内PK的蛋白表达，检测到LDLR蛋白水平显著升高(图1E)。选用的阳性对照IDOL是诱导LDLR泛素化途径降解的泛素连接酶(20,21)。在DiI-LDL内吞实验中，抑制PK后升高的LDLR蛋白有效促进LDL的内吞，表明LDLR内吞 LDL的功能活性不受影响(图1F和图1G)。

进一步收集测定198名大学生志愿者血清中PK蛋白浓度，发现PK蛋白浓度与LDL-c，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)存在着显著的正相关关系，但是同高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)没有显著相关性(图1H-K)。这些数据表明 PK结合LDLR，影响LDLR的稳定性，从而调控血液中LDL-c水平。

2.2在仓鼠、小鼠和大鼠中，PK缺失后肝脏LDLR蛋白水平显著升高，血液中 LDL-c水平显著下降

叙利亚金黄仓鼠在血脂代谢方面比小鼠更接近于人类，特别是仓鼠的血脂分布谱同人类相似(22)，有着较高水平的LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)，而且易于用高胆固醇饲料诱导高血脂症(23)，并且LDLR在仓鼠的肝脏表达水平高 (图7A)。利用CRISPR/Cas9技术敲除仓鼠的Klkb1基因(图2A)，得到PK蛋白全身缺失的纯合子仓鼠(Klkb1^-/-)，以此来研究PK在动物水平对血脂的影响。同野生型仓鼠对比，Klkb1^-/-仓鼠外观、行为、生殖能力、体重和进食量等方面与野生型仓鼠相比没有区别(图2B,2C)。然而，Klkb1^-/-仓鼠的肝脏及其它组织的 LDLR蛋白水平显著升高(图2D)，与之对应的LDLR和胆固醇代谢相关基因的 mRNA没有显著变化(图7B)，这证明PK是通过降解LDLR蛋白的方式来影响 LDLR(图1)。在Klkb1^-/-仓鼠的血浆中，总胆固醇(totalcholesterol,TC)和甘油三酯 (triglyceride,TG)分别下降46.3％和43.6％(图2E,F)，快速蛋白液相色谱分析结果表明血脂的下降是以LDL的降低为主的形式(图2G,H)。另外，在野生型和 Klkb1^-/-仓鼠其它方面的比较中，肝脏TC和TG含量相近(图2I,J)，血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平也无显著区别(图2K,L)，肝脏切片H&E染色未观察到形态学差异，油红-O染色也未见脂质明显堆积(图7C)，这些数据表明Klkb1的缺失不会造成肝脏损伤。同雄性仓鼠一致，雌性Klkb1^-/-仓鼠肝脏LDLR蛋白水平显著升高(图2M)，血浆中TC和TG也是明显下降，并且血脂的下降主要是由于LDL和VLDL水平的降低所导致的(图2,P，Q)。综合以上结果，抑制PK 可以增加肝脏LDLR蛋白水平，加速血浆中LDL-c的清除。

小鼠血液中LDL-c水平很低，这点与人类血液中LDL-c水平含量高有所区别，可能是由于小鼠肝脏LDLR蛋白水平表达本底水平较高有关(24,25)。因此，我们在Ldlr^+/-背景小鼠中研究PK缺失后对胆固醇代谢的影响(图8A)，结果同仓鼠的研究数据几乎一致，Klkb1^-/-Ldlr^+/-小鼠同Klkb1^+/+Ldlr^+/-小鼠相比，肝脏 LDLR蛋白水平显著升高(图8B)，血浆中胆固醇水平下降达42％(图8C)，并且主要是由LDL-c水平降低所贡献(图8D),而血液中TG水平略微下降，肝脏中TC 和TG水平有所升高(图8,E-G)，这表明PK缺失后，肝脏高水平的LDLR吸收更多的血液循环中的胆固醇到肝细胞中。该实验中，未观察两组小鼠血液中代表肝脏损伤的标志物AST和ALT酶活的差异(图8,H，I)。

我们也利用腺相关病毒作为载体递送shRNA到大鼠体内，抑制PK蛋白的表达。同对照组AAV-sh-control相比，实验组AAV-sh-Klkb1血清中PK蛋白水平明显下降，肝脏LDLR蛋白水平显著上升(图9,A，B)，血清中TC水平下降 21％左右(图9C)，FPLC分析显示主要是LDL-c的下降导致的血脂降低(图9D)。

2.3针对PK的中和抗体处理小鼠后，小鼠肝脏LDLR蛋白水平显著升高，血液胆固醇水平显著下降

利用分子克隆技术以及细胞分子生物学实验，研究PK的不同截短体对LDLR 的稳定性影响，并试图找到介导二者相互作用的PK的关键区段。全长形式的 PK(FL)、截短体b(Δ20-390)和d(Δ20-390&631-638)在免疫共沉淀实验中显示同LDLR有着很强的相互作用，并且强有力的降低LDLR蛋白水平(图3,A， B)，这表明在这些截短体中包含PK介导LDLR降解的关键区段。与之相反， PK的截短体a(Δ391-638)和c(Δ21-390&601-638)未显示同LDLR相互作用，并且不能诱导LDLR降解(图3B)。去掉PK的601-638区段完全消除了PK对LDLR蛋白的降解活性，然而PK缺失631-638区段后不影响其降解LDLR活性 (图10,A，B)。综合以上结果，可以得出结论，PK的601-630区段(SEQ ID NO.4) 的氨基酸对PK和LDLR的相互作用及诱导LDLR降解是必要的。

合成PK的601-630位氨基酸对应的多肽(SEQ ID NO.3)，偶联KLH后免疫大鼠，最终得到针对PK的601-630区段的大鼠单克隆抗体(2H5-IgG)(图10C)。免疫印迹实验显示，2H5-IgG非常特异的识别血清中的PK蛋白(图10D)，并且在体外结合实验中能有效阻断LDLR细胞外区段蛋白LDLR-ECD同PK的相互作用(图3C,图10E)。随后，在小鼠水平探索PK的中和抗体2H5-IgG是否有降低血液胆固醇的效果。小鼠喂养高胆固醇饲料一周后，腹腔注射对照抗体或者 PK中和抗体，每两天注射一次，每次注射计量为30mg/kg，一周后进行检测(图 3D)。2H5-IgG处理组同对照组相比，小鼠肝脏LDLR蛋白水平显著升高(图3E)，血液TC下降达32％，主要是由于LDL-c下降所贡献(图3,F，G)。血浆TG水平未检测到改变(图3H)，肝脏中TC和TG水平有上升趋势，但是没有统计学差异(图3,I，J)。2H5-IgG处理后，血浆中代表肝细胞损伤的AST和ALT水平未升高(图3,K,L)。以上结果表明利用中和抗体阻断PK和LDLR的相互作用，可以提高肝脏LDLR蛋白水平，促进LDL-c的清除，从而降低血液胆固醇水平。

2.4PK缺失保护型抑制动脉粥样硬化的发展

为了探索PK缺失后对动脉粥样硬化的发展的影响。我们比较PK和apolipoproteinE双敲除的小鼠(Klkb1^-/-Apoe^-/-)和对照组apolipoproteinE单敲除的小鼠(Klkb1^+/+Apoe^-/-)的斑块发展情况。在喂食高胆固醇饲料8周后，同对照组Klkb1^+/+Apoe^-/-小鼠相比，实验组Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠肝脏LDLR蛋白水平升高，血液胆固醇水平显著下降。血液TG水平两组没有显著差别(图4,A，B 和C)，肝脏中TC和TG在实验组中略有升高(图4,D，E)。在血液胆固醇下降的基础上，Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠的整个动脉斑块面积和主动脉根部斑块面积相对于同窝生对照组Klkb1^+/+Apoe^-/-小鼠分别下降50％和40％(图4,F-I)。说明抑制PK可以有效阻断动脉粥样硬化的发展。

2.5PK缺失抑制血栓的形成

PK通过放大激活内源凝血途径起始因子FXII来调节血栓形成(图6A)。在凝血功能检测实验中，实验组Klkb1^-/-小鼠和同窝生对照组Klkb1^+/+小鼠相比较，反映内源凝血途径的指标活化部分凝血活酶时间(APTT)显著延长(图5A)。而反应外源凝血途径的指标凝血酶原时间(PT)以及尾尖出血时间在两组小鼠中没有显著差别(图5B，C)。这也与之前报道一致，PK所在的接触系统对止血并不重要(26)。随后，我们也验证了PK在FeCl₃诱导的颈动脉血栓中的作用，对照组Klkb1^+/+小鼠的劲动脉在FeCl₃处理后，6分钟左右便形成堵塞血管的血栓，而实验组小鼠在20分钟的观测过程中，几乎完全抑制阻塞血管的血栓形成(图5D)，这些结果均与之前的研究报道相一致(27-30)。我们同样在Klkb1^-/-仓鼠和 Klkb1^-/-Ldlr^+/-小鼠中检测到APTT显著延长，而PT没有改变(图11,A-D)。

尽管FeCl₃诱导血栓模型被广泛研究应用，但是这种人为造成血管损伤诱发的血栓，同病理条件下斑块破裂形成的血栓有着很大区别的。一般在剧烈体力活动或者高血压等因素的诱导下，斑块会破裂，形成常见的斑块性血栓(31)。我们喂养Klkb1^+/+Apoe^-/-小鼠和Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠高胆固醇饲料16周，使动脉粥样硬化斑块得到充分发展，减少两组小鼠颈动脉斑块大小的差异。之后利用超声处理促使斑块破裂，荧光显微镜观察监测血栓的形成(32,33)(图5F)。我们发现，在两组小鼠颈动脉斑块大小相差不大的情况下，对照组Klkb1^+/+Apoe^-/-小鼠的颈动脉斑块破裂后在60秒左右血栓达到最大程度，之后一直保持最大程度，在观测时间段内未衰减(图5G)。而实验组Klkb1^-/-Apoe^-/-小鼠斑块血栓在60秒左右达到最大值，而且代表血栓大小的荧光信号强度此时和对照组相比没有显著区别，但是血栓达到最大值后，其信号便快速衰减(图5,G-I)。这表明超声处理后斑块破裂，血小板首先激活在受损部位形成血栓，紧接着由FXII起始放大的凝血途径使凝血酶激活，产生纤维蛋白来稳定血栓。因此，在两组小鼠中，超声处理后最开始的血栓形成在第一阶段血小板激活扩散过程中无差别，但是 PK缺失后对第二阶段的血栓增长和稳固有着显著的影响。总结在一起，这些结果说明抑制PK是很好的抗血栓策略并且无出血风险。

我们的实验结果显示消除PK后，促进了LDL的清除，从而抵抗动脉粥样硬化的发展同时抑制动脉斑块血栓的形成。血液循环中的PK结合LDLR，促进其溶酶体途径降解而不是再循环到细胞表面，因此血液中的LDL-c水平升高，加速斑块的发展。一旦富含脂质的斑块破裂，便会激起血栓。在PK激活放大FXII 起始的凝血信号后，更大更稳定的血栓会形成，阻塞血管造成严重的心脑血管事件。在PK缺失的情况下，低水平的LDL-c预防动脉粥样硬化斑块的发展，并且在斑块破裂的情况下，不易于形成血栓。因此，PK可能是一个非常理想的治疗心脑血管疾病的靶点(图5J)。

3、讨论

在这项研究中，我们发现了凝血因子PK的两个新功能：诱导LDLR降解和在动脉粥样硬化斑块破裂诱发血栓形成过程中有着重要作用。通过基因敲除或抗体中和抑制PK，在多种动物模型中均检测到肝脏LDLR水平升高，血脂水平下降。PK的中和抗体同目前已经投入临床使用的降血脂药物PCSK9中和抗体作用效果类似。除降低血脂效果外，抑制PK可以有效的避免斑块破裂诱发大而稳固的血栓，同时没有出血风险(图5)。PK同时调节脂蛋白代谢和血栓形成，这也证明了这两个完全不同的系统存在着确切的内在联系。与此一致，之前也有研究报道高水平的血液LDL或血液胆固醇水平，会促进血小板聚集和凝血瀑布进程(34)。

无数的证据表明血液中高水平的LDL-c加速动脉粥样硬化的发展，而降低血液胆固醇是有效的治疗和预防动脉粥样硬化的方法(7)。目前有多种药物通过不同的途径调节血液胆固醇水平。比如他汀类药物抑制胆固醇的合成，提高LDLR 表达水平。依折麦布抑制胆固醇在小肠的吸收，而PCSK9抑制剂直接升高LDLR 蛋白水平促进LDL-c从血液中的清除。然而仅仅控制胆固醇水平对动脉粥样硬化性心脑血管疾病还是远远不够的。除了胆固醇外，还有其它众多危险因素对心脑血管疾并发展起着重要作用，比如克隆性炎症、造血、高血压、空气污染、睡眠紊乱等等(11,35)。心梗病人在首次出现临床症状后，即使降胆固醇控制在很好的水平，依旧至少有20％的病人在3年内出现反复性心梗(36)，表明除了降血脂外，亟待其它的方法来进一步降低心脑血管疾病或与之相关疾病的死亡率。

动脉粥样硬化斑块是一个慢性的渐进的过程。斑块起始于内陷到血管壁中的单核细胞或巨噬细胞吞噬过多的胆固醇(37)。于此同时，斑块会持续的发生小的破损如斑块破裂或者斑块糜烂，随后激起血栓并修复受损部位，而这个过程一般是无临床症状的，但是这种小的破损修复循环过程会加速斑块发展进程并使血管越发狭窄。最终这个大的斑块破裂引起血管堵塞，造成灾难性心脑血管事件。因此，抗血栓药物可能不仅仅在急性心脑血管事件中起作用，可能延缓动脉粥样硬化斑块的发展(38,39)。

不幸的是，目前临床使用的抗血栓药物，包括抗血小板药物或者抗凝血因子药物，都存在着显著的出血性副作用(13)。阿司匹林和P2Y12受体抑制剂，如氯吡格雷，属于抗血小板药物，在治疗心脑血管疾病方面已经使用多年。尽管它们可以有效降低心脑血管事件，但是有很多人存在着出血问题或者对阿司匹林不敏感。抗凝血因子药物如凝血酶抑制剂或凝血因子FX抑制剂，虽然在降动脉粥样硬化性心脑血管疾病事件时，但是也会造成严重的出血风险，因而最终停止使用。目前的抗血栓药物存在的出血风险极大的限制了其在动脉粥样硬化性心脑血管疾病中的运用。

目前的研究提示外源凝血途径是一个快速的过程，并且对止血起着主要的作用，而内源凝血途径反应相对较慢，并且其接触系统对止血无关紧要。最近新兴的针对FXI或FXII的反义链RNA和中和抗体抑制剂表现出治疗血栓的强大潜力而无明显的出血风险(14)。同凝血因子FXI或FXII类似，PK处于内源凝血途径上游，通过激活凝血因子FXII参与凝血过程，同时我们以及其它研究均揭示其对止血是非必须的(27,28)。事实上，PK在人群中缺失的表型首次被发现时表现为APTT显著延长，但是没有止血障碍(40)。随后报道的更多的人群PK缺失案例均未显示出血风险(41)。鲸鱼在进化的过程中，丢失PK蛋白来减少深潜后上浮而诱发血栓的风险(42)。这些信息均表明PK缺失后显著抑制血栓但并不影响止血，并且减少PK是安全的。靶向抑制PK除了抗血栓外，还能通过升高 LDLR水平来达到降低血液胆固醇水平的有益效果。总结来说，我们的研究提示抑制PK是一个新的治疗高血脂症、动脉粥样硬化性心脑血管疾病以及其它血栓疾病的方法。

说明书中涉及的序列：

SEQ ID NO.1：人源PK或PKa蛋白质氨基酸序列：

MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLK

DSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTNNIRCQFFSYATQTFHKA

EYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFF

TFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQE

TCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWG

EWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEG

NHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQR

MVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA

SEQ ID NO.2：鼠源PK或PKa蛋白质氨基酸序列：

MILFNRVGYFVSLFATVSCGCMTQLYKNTFFRGGDLAAIYTPDAQYCQKMCTFHPRCLLFSFLAVTPPKETNKRFGCFMK

ESITGTLPRIHRTGAISGHSLKQCGHQISACHRDIYKGLDMRGSNFNISKTDNIEECQKLCTNNFHCQFFTYATSAFYRP

EYRKKCLLKHSASGTPTSIKSADNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHSAFADLNVSQVITPDAFVCRTICTFHPNCLFF

TFYTNEWETESQRNVCFLKTSKSGRPSPPIPQENAISGYSLLTCRKTRPEPCHSKIYSGVDFEGEELNVTFVQGADVCQE

TCTKTIRCQFFIYSLLPQDCKEEGCKCSLRLSTDGSPTRITYGMQGSSGYSLRLCKLVDSPDCTTKINARIVGGTNASLG

EWPWQVSLQVKLVSQTHLCGGSIIGRQWVLTAAHCFDGIPYPDVWRIYGGILSLSEITKETPSSRIKELIIHQEYKVSEG

NYDIALIKLQTPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKEQGETQNILQKATIPLVPNEECQKKYRDYVINKQ

MICAGYKEGGTDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCARKDQPGVYTKVSEYMDWILEKTQSSDVRALETSSA

SEQ ID NO.3：GCARKDQPGVYTKVSEYMDWILEKTQSSDV(鼠源，抗体制备的抗原序列)

SEQ ID NO.4

GCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDG(人源，人的该段序列和鼠源抗原序列SEQ IDNO.3具有高度同源性)

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SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 血浆激肽释放酶原在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的药物中的用途

<130> WH1954-21P150425

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Ser Val Thr Gly Thr Leu Pro Lys Val His Arg Thr Gly Ala Val

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Ser Gly His Ser Leu Lys Gln Cys Gly His Gln Ile Ser Ala Cys His

100 105 110

Arg Asp Ile Tyr Lys Gly Val Asp Met Arg Gly Val Asn Phe Asn Val

115 120 125

Ser Lys Val Ser Ser Val Glu Glu Cys Gln Lys Arg Cys Thr Asn Asn

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Glu Tyr Arg Asn Asn Cys Leu Leu Lys Tyr Ser Pro Gly Gly Thr Pro

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Thr Phe Tyr Thr Asn Val Trp Lys Ile Glu Ser Gln Arg Asn Val Cys

245 250 255

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Glu Glu Leu Asn Val Thr Phe Val Lys Gly Val Asn Val Cys Gln Glu

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420 425 430

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450 455 460

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485 490 495

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Gly Glu Ile Gln Asn Ile Leu Gln Lys Val Asn Ile Pro Leu Val Thr

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Asn Glu Glu Cys Gln Lys Arg Tyr Gln Asp Tyr Lys Ile Thr Gln Arg

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> si-control RNA （DNA）

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ttctccgaac gtgtcacgtt t 21

Claims

1.一种序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的多肽作为抗原在制备降低受试者低密度脂蛋白水平的单克隆抗体中的用途，所述单克隆抗体为针对血浆激肽释放酶原序列第601-630位氨基酸的、阻断所述血浆激肽释放酶原蛋白与低密度脂蛋白受体结合的抗体，其中所述血浆激肽释放酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。