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CN115569194A - 一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及其应用 - Google Patents

一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及其应用 Download PDF

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CN115569194A
CN115569194A CN202211337782.9A CN202211337782A CN115569194A CN 115569194 A CN115569194 A CN 115569194A CN 202211337782 A CN202211337782 A CN 202211337782A CN 115569194 A CN115569194 A CN 115569194A
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王哲
屈艳玲
明磊国
董玲娟
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Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co ltd
Original Assignee
Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及其应用，属于糖尿病治疗药物技术领域。温敏水凝胶由人脐静脉内皮细胞混悬液、终浓度为15～20％的P407和终浓度为0.6～0.8％的透明质酸钠的混合液、终浓度为50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、终浓度为0.5％～2％的盐酸利多卡因、终浓度为100～200mg/mL的肿瘤坏死因子α单抗和终浓度为2～5％、长度≤1mm的胰岛细胞‑海藻酸凝胶纤维段混合而成；温敏水凝胶安全无毒，免疫原性低、费用低且治疗效果好；将上述试剂结合无菌耗材制成试剂盒，使用方便，能够更好地应用于糖尿病的治疗中。

Description

一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及 其应用
技术领域
本发明属于糖尿病治疗药物技术领域，具体涉及一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及其应用。
背景技术
糖尿病是胰岛功能减退或衰竭而导致机体糖代谢紊乱的慢性疾病，随着病程延长，患者会发生全身性血管病变，进而导致多器官损害，严重威胁生命健康。糖尿病主要分为两大类，1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病约占糖尿病患者总数的10％，其超过70％的胰岛细胞被破坏，无法及时足量分泌胰岛素来维持正常的血糖水平，患者需终身注射胰岛素来稳定血糖，可能发生严重的低血糖反应，同时还会罹患多种糖尿病并发症。2型糖尿病较为常见，占糖尿病患者总数的80％以上，其中三分之一的中晚期患者也会发展成为1型糖尿病。
目前常见的胰岛素注射等治疗方法只能阶段性地将血糖调节到正常水平，无法模拟正常胰岛对胰岛素分泌时间和剂量的精确调节，因此无法避免低血糖风险及糖尿病并发症的发生，并且大部分降糖药物有强烈副作用，会进一步破坏患者身体健康。为了提高患者的生存质量，研究人员开始采用胰岛移植技术治疗糖尿病。因为糖尿病的出现是胰岛功能受损所致，胰岛移植理论上能根治糖尿病，但实际上这种治疗方法目前还存在许多急需解决的问题，比如胰岛分离提取过程不仅耗时耗力，而且费用较高，需要使用COBE.2991细胞分离机等设备纯化；类似其他器官移植技术，供体不足严重限制了胰岛移植技术的广泛应用；同种异体或者异种胰岛移植后存在较强的免疫排异；且当前的胰岛移植需经B超引导经皮肝脏门静脉穿刺置管后滴注，或者肾包膜下移植，手术操作复杂，需要专业医师，实施过程需要高度专业化的配套设施，以上这些都是胰岛移植应用于临床的障碍。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶、试剂盒、使用方法及其应用，使糖尿病治疗简单、免疫原性更低、费用更低以及治疗效果更好。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，所述温敏水凝胶由人脐静脉内皮细胞混悬液、终浓度为15～20％的P407和终浓度为0.6～0.8％的透明质酸钠的混合液、终浓度为50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、终浓度为0.5％～2％的盐酸利多卡因、终浓度为100～200mg/mL的肿瘤坏死因子α单抗和终浓度为2～5％的胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段混合而成；
其中，人脐静脉内皮细胞的终浓度为5～8×106/mL，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段为胰岛细胞、生理盐水和海藻酸盐混合制得的长度≤1mm、直径为100～300μm的凝胶纤维段。
优选地，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段中，胰岛细胞的终浓度为3～6×106/mL，海藻酸盐的终浓度1.5～3％。
优选地，人脐静脉内皮细胞和胰岛细胞均为低免疫原性细胞。
优选地，所述胰岛细胞由脐带干细胞经胰岛细胞诱导液诱导得到。
本发明还公开了上述一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
本发明还公开了一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒，包括无菌试剂和无菌耗材，所述无菌试剂包括生理盐水、海藻酸钠、氯化钙溶液、P407和透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗；所述无菌耗材包括1mL注射器、2mL注射器、30G针头、14G针头、单面刀片、平皿和100μm细胞筛网。
优选地，还包括胰岛细胞诱导液和双硫腙染色液。
进一步优选地，所述胰岛细胞诱导液包括胰岛细胞A1诱导液和胰岛细胞A2诱导液，胰岛细胞A1诱导液由H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及物质浓度为0.07‰的β-巯基乙醇构成，胰岛细胞A2诱导液由DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL的尼克酰胺构成。
本发明还公开了上述一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒的使用方法，首先将胰岛细胞、生理盐水和海藻酸钠混合，得到胰岛细胞-海藻酸钠凝胶；其次将氯化钙溶液置于平皿中，用带有30G针头的1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，在氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到粗细均匀的凝胶纤维，生理盐水清洗，切段，加入氯化钙溶液进行钙化，再用生理盐水清洗，用100μm细胞筛网过滤，得到胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段；将胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段与人脐静脉内皮细胞、P407和透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀，得到温敏水凝胶，最后用带有14G针头的2mL注射器将温敏水凝胶注射于糖尿病患者皮下。
优选地，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段为通过单面刀片截出的长度≤1mm的凝胶纤维。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段作为胰岛类似物，内部包裹大量胰岛细胞，直径100～300μm，接近天然胰岛的尺寸，在外部毛细血管形成后可长期存活，能够代替机体天然的胰岛分泌胰岛素，控制血糖；纤维段中的海藻酸盐材料自身免疫原性低，具有生物惰性，可在体内存留较长时间，外层海藻酸盐可与Ca2+结合成蛋壳状结构的微囊，包裹内部海藻酸盐形成具有各种形状的凝胶，机械强度较高，能够为包裹其中的胰岛细胞提供一个适宜的生存环境，钙化膜表面孔洞容许小分子物质如营养成分和细胞分泌的代谢产物穿过膜进行交换，而免疫细胞则被隔离在外，降低免疫排斥反应。盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子α单抗在充分利用注射给药有利于移植微囊存活的优势的同时，可极大地抑制注射给药产生的炎症反应，延缓凝胶降解时间，最长至15天，有充足时间保障移植物的血管生成。同时，为了进一步提高血管生成速度，本发明在温敏凝胶中混合大量人脐静脉血管内皮细胞，其可在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子两种因子作用下，迅速形成毛细血管，为胰岛替代物解决缺血缺氧问题导致的细胞死亡，极大地提高移植物的存活率，更好地逆转糖尿病患者的疾病症状。该温敏水凝胶中的P407为温度敏感型凝胶材料，低温为液体状态，便于实验操作，进入体内后因为温度升高转变为凝胶状态，可维持一定的形态；低交联透明质酸钠能够防止P407降解过快，没有足够的空间形成毛细血管，无法为凝胶纤维段中的胰岛细胞供血供氧；P407与低交联透明质酸钠混合，能够作为基质保护其中的人脐静脉血管内皮细胞，提供足够的空间和时间帮助毛细血管生成，为纤维段中的胰岛细胞供血供氧，提高其成活率。该温敏水凝胶可被组织降解，安全无毒、免疫原性低、费用低，治疗糖尿病方法简单且效果好，能够应用于糖尿病的治疗中。
本发明提供的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒，无菌试剂中，生理盐水能够对胰岛细胞、胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段、海藻酸钠等进行清洗和稀释；海藻酸钠作为天然高分子材料，生物相容性极好，在制备胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段过程中能够保证细胞长时间存活；氯化钙溶液可与外层海藻酸钠结合成蛋壳状结构，包裹内部海藻酸钠形成具有各种形状的凝胶，如凝胶球，凝胶纤维等；P407和低交联透明质酸钠用于制备具有温敏特性的凝胶，能够为毛细血管生成提供时间和空间；血管内皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子可加速血管生成，为凝胶中的胰岛细胞提供营养，极大地提高存活率；盐酸利多卡因一方面能起到局部麻醉，降低最初注射后的不适感，另一方面能降低最初注射后的炎症反应；肿瘤坏死因子α单抗能够调节免疫，能在较长一段时间内(2周左右)降低炎症反应，从而延长凝胶中细胞的存活时间(炎症反应会有大量免疫细胞聚集，将外来细胞等异物杀死)；借助无菌耗材进行操作，使用方便，通过该试剂盒可在无菌实验室中获得大量可供注射的胰岛类似物，整体操作简单，无需使用细胞分离机等设备分离胰岛，对硬件设施及技术人员要求大大降低，便于应用推广，且单次实验所得胰岛细胞和内皮细胞可分装冻存，以供后续多次使用。
进一步地，胰岛细胞诱导液能够将脐带干细胞诱导为低免疫原性的胰岛细胞，分泌胰岛素，不易诱发免疫排斥反应；双硫腙染色液可将胰岛细胞染成红棕色，对干细胞诱导的胰岛细胞进行染色鉴定，确保诱导成功。
本发明提供的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒的使用方法，皮下注射简单，方便监测，节省时间，灵活度高，可反复进行，无需B超引导经皮肝脏门静脉穿刺置管后滴注，或者肾包膜下移植，节省数小时的手术时间，大大降低感染风险，也避免了肝脏出血、门脉血栓形成及门脉高压等并发症的发生。
附图说明
图1为本发明的人脐带间充质干细胞图；
图2为本发明的人脐静脉内皮细胞图；
图3为本发明的胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段图；
图4为本发明的胰岛细胞-海藻酸凝胶球图；
图5为本发明的凝胶纤维段和凝胶球中细胞增殖情况对比图；
图6为本发明的糖尿病小鼠血液炎症因子对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶制备试剂盒，包括需冷冻保存的无菌试剂和常温保存的无菌耗材，所述无菌试剂包括：胰岛细胞诱导液、双硫腙染色液、生理盐水、5％海藻酸盐、1.5％氯化钙溶液、25％P407(泊洛沙姆407)和1％低交联透明质酸钠(HA)的混合液、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗；所述无菌耗材包括：1mL注射器×2、2mL注射器×2、30G针头×2、14G针头×2、单面刀片×2、塑料平皿×2和100μm细胞筛网×2；
其中，无菌试剂需冷冻保存，无菌耗材需常温保存，保质期1年；所述胰岛细胞诱导液包括胰岛细胞A1诱导液和胰岛细胞A2诱导液，胰岛细胞A1诱导液由H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及0.07‰(V/V)β-巯基乙醇构成，胰岛细胞A2诱导液由DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL尼克酰胺构成；所述双硫腙染色液由双硫腙粉末溶于二甲基亚砜中制得；所述海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾或海藻酸铵。
本发明提供的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶制备试剂盒的使用方法，步骤如下：
1.细胞材料准备：
1)胰岛细胞诱导
通过胰岛细胞诱导液将脐带干细胞(UC-MSCs)诱导为胰岛细胞；
其中，UC-MSCs可替换为糖尿病患者自体分离脂肪干细胞(ADSCs)或糖尿病患者自体分离骨髓干细胞(BMSC)，用于糖尿病患者自身；胰岛细胞诱导液诱导所得的胰岛细胞可替换为人胎儿胰岛细胞或新生猪胰岛细胞。
2)胰岛细胞鉴定
使用双硫腙染色液对步骤1的1)中获得的胰岛细胞进行染色鉴定：可见红棕色细胞团，说明胰岛细胞诱导成功；
3)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
以酶消化法从人脐静脉组织分离HUVECs，传代培养；倒置显微镜下观察，HUVECs细胞呈典型的鹅卵石样，细胞核明显；其来源可为市售细胞，P3～P5代，需经CD31/vWF免疫荧光鉴定，且纯度在90％以上。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将步骤1的1)中获得的胰岛细胞用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度3～6×106/mL，海藻酸钠终浓度1.5～3％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到粗细均匀的凝胶纤维，倒掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，用单面刀片将平皿中的凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动，使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的3)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407+1％低交联透明质酸钠、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制备的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶；
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度5～8×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度15～20％，HA终浓度0.6～0.8％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段2～5％，盐酸利多卡因0.5％～2％，肿瘤坏死因子α单抗100～200mg/mL。
4.糖尿病治疗：
采用链脲佐菌素破坏小鼠胰腺β细胞诱导1型糖尿病模型。然后在成模小鼠腹股沟皮下注射步骤3所得复合温敏凝胶，单侧1mL，凝胶进入体内后成形，注射完成后均匀按压，扩大凝胶分布面积，降低凝胶厚度，凝胶中的内皮细胞会在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子双因子作用下迅速形成血管，与周围组织血管联通，输送营养物质，盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子α单抗联用可降低移植引起的炎症反应，延缓凝胶体积损耗，多方作用确保植入胰岛细胞的存活，分泌胰岛素，从而起到长期降血糖的作用。
实施例1
1.细胞材料准备：
1)胰岛细胞诱导
从健康新生儿脐带中分离并培养获得人脐带间充质干细胞(UC-MSC)，培养至P5代，显微镜下观察，如图1，细胞呈长梭形，大小均一，漩涡状排列；流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44和CD90表达为阳性，CD34和CD45表达为阴性，鉴定为UC-MSC细胞。
将培养至P5代的UC-MSC按5×105个/孔细胞接种于6孔板内，第二天，细胞融合度70～80％，将培养基替换为胰岛细胞A1诱导液，继续培养24h后去除胰岛细胞A1诱导液，加入胰岛细胞A2诱导液持续诱导，每隔2～3天更换胰岛细胞A2诱导液，并于显微镜下观察诱导情况：诱导至10天左右时出现呈散在分布的胰岛样细胞团，继续诱导至30天左右，得到胰岛细胞；
其中，胰岛细胞A1诱导液包括H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及0.07‰(V/V)β-巯基乙醇；胰岛细胞A2诱导液包括DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL尼克酰胺。
2)胰岛细胞鉴定
取10μL双硫腙染色液与1mL胰岛细胞A2诱导液混合，为步骤1的1)中诱导的胰岛细胞进行染色鉴定，加入6孔板后于37℃孵箱中孵育30min，PBS洗3次，显微镜下观察，细胞团染为红棕色，说明诱导成功。
其中，双硫腙染色液由双硫腙粉末溶于二甲基亚砜中制得，浓度10mg/mL。
3)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
HUVECs原代培养方法：在超净台中，用PBS溶液将脐带冲洗干净，找到脐静脉，用20mL注射器吸取PBS注入脐静脉反复冲洗干净。用止血钳夹闭脐静脉一端，从另外一端灌注0.2％胶原酶Ⅰ(PBS溶液配制)，至脐静脉处于充盈状态，用止血钳夹闭脐静脉。将脐带放入无菌PBS溶液中，在37℃条件下孵育10min左右。孵育过程中，脐静脉中的酶液每3min抽吸/注入1次，促进胶原酶与静脉血管壁充分而均匀的接触。取出脐带，用无菌纱布吸干脐带表面的液体，吸取酶液到50mL离心管，加入等体积含10％FBS的培养基中和。接着用2ml注射器吸取无菌PBS溶液冲洗脐静脉，冲洗液也一并收集，充分混匀后，离心收集细胞，培养基重悬。将细胞悬液接种到细胞培养瓶中，置于5％CO2、37℃培养箱中培养，24h后更换培养液，除去未贴壁细胞。以后每隔2～3天换液，正常传代培养，得到人脐静脉内皮细胞。
HUVECs形态鉴定：通过倒置显微镜观察，如图2，HUVECs细胞呈典型的鹅卵石样，细胞核明显。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将步骤1的1)中获得的胰岛细胞消化离心，用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度3×106/mL，海藻酸钠终浓度1.5％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到直径100～300μm粗细均匀的凝胶纤维，弃掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，在平皿中用单面刀片将凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用，形貌图见图3，胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段的直径为100～300μm，长度≤1mm；
同时，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头匀速挤出，滴入1.5％氯化钙溶液，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，制得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶球，形貌图见图4，直径1000～1500μm，对比凝胶球和凝胶纤维段中细胞的增殖和存活情况，如图5，结果显示凝胶纤维段中细胞增殖存活情况更好，因此更适合作为胰岛类似物进行移植。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的3)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407和1％低交联透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制得的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶。
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度5×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度15％，HA终浓度0.6％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段2％，盐酸利多卡因0.5％，肿瘤坏死因子α单抗100mg/mL。
4.糖尿病治疗：
1)配置链脲佐菌素液(STZ)
配置2.1％柠檬酸水溶液和2.94％柠檬酸钠水溶液，将两种溶液混合，调节pH值到4.2～4.5，加入链脲佐菌素溶解，终浓度10mg/mL，无菌过滤即得。
2)建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型
取6周龄的SPF级ICR雄性小鼠30只，适应性饲养一周后，腹腔注射STZ造模，给药前先禁食和禁水12小时，然后测小鼠体重(g)以及空腹血糖(mmol/L)。注意STZ现配现用，全程避光，剂量为50mg·kg-1，连续6天，每天注射1次。末次注射1周后，用小鼠固定器固定小鼠，使用快速血糖检测仪检测小鼠尾静脉血糖含量，连续3d随机血糖≥16.7mmol/L，表示动物模型构建成功。共得到17只1型糖尿病小鼠。
3)糖尿病小鼠治疗
取16只1型糖尿病小鼠分成2组，其中对照组和治疗组各8只。
将步骤3所得复合温敏凝胶在4℃放置半小时，呈现液体状态，混匀后吸入2mL注射器，用14G针头在治疗组糖尿病小鼠腹股沟位置进行皮下注射，单侧1mL，复合温敏凝胶进入体内后形成半固体状态，注射完成后均匀按压，扩大凝胶分布面积，降低凝胶厚度；对照组注射等量空白凝胶；
其中，所述空白凝胶由5％海藻酸钠、1.5％氯化钙溶液、25％P407和1％低交联透明质酸钠以及生理盐水经相同步骤配置得到。
4)治疗结果监测
连续3月，持续进行小鼠血糖水平与体重监测，具体情况如下：
胰岛类似物注射移植后开始检测小鼠非禁食状态下的血糖水平，每周检测2次，同时每周称重1次，对照组和治疗组小鼠血糖监测结果见表1，对照组和治疗组小鼠体重监测结果见表2。
表1：对照组和治疗组小鼠血糖监测结果
Figure BDA0003915800390000121
表2：对照组和治疗组小鼠体重监测结果
Figure BDA0003915800390000122
表1结果显示，治疗组小鼠第5周开始血糖连续低于11.1mmol/L，表明胰岛移植物正常发挥降血糖功能，在3个月的观察周期中，治疗组小鼠存活率为83％；对照组小鼠血糖均≥16.7mmol/L，在3个月的观察周期中，对照组小鼠陆续全部死亡。表2结果显示，对照组小鼠从第2周开始，体重持续降低，而治疗组小鼠体重呈现增长趋势。
注射24h后尾静脉采血，采血结果如下：
通过ELISA法检测血清细胞因子IL-6和IFN-γ水平，结果如图6，发现与对照组相比，注射后治疗组小鼠血液中的炎性因子显著降低，这说明盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子α单抗联用可降低移植引起的炎症反应，确保了植入胰岛细胞的存活，分泌胰岛素，从而起到长期降血糖的作用。
实施例2
1.细胞材料准备：
1)胰岛细胞诱导
从糖尿病患者自体分离骨髓干细胞(BMSC)，培养至P4代，按5×105个/孔细胞接种于6孔板内，细胞融合度达到70～80％时，将培养基替换为胰岛细胞A1诱导液，继续培养24h后去除胰岛细胞A1诱导液，加入胰岛细胞A2诱导液持续诱导，每隔2～3天更换胰岛细胞A2诱导液，得到胰岛细胞；
其中，胰岛细胞A1诱导液包括H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及0.07‰(V/V)β-巯基乙醇；胰岛细胞A2诱导液包括DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL尼克酰胺。
2)胰岛细胞鉴定
取10μL双硫腙染色液与1mL胰岛细胞A2诱导液混合，为步骤1的1)中诱导的胰岛细胞进行染色鉴定，加入6孔板后于37℃孵箱中孵育30min，PBS洗3次，显微镜下观察诱导情况。
其中，双硫腙染色液由双硫腙粉末溶于二甲基亚砜中制得，浓度10mg/mL。
3)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
步骤同实施例1。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将步骤1的1)中获得的胰岛细胞消化离心，用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度3.8×106/mL，海藻酸钠终浓度2％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到直径100～300μm粗细均匀的凝胶纤维，弃掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，在平皿中用单面刀片将凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的3)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407和1％低交联透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制得的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶。
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度6.6×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度17％，HA终浓度0.68％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段3％，盐酸利多卡因1.1％，肿瘤坏死因子α单抗160mg/mL。
实施例3
1.细胞材料准备：
1)胰岛细胞诱导
从糖尿病患者自体分离脂肪干细胞(ADSCs)，培养至P3代，按5×105个/孔细胞接种于6孔板内，细胞融合度达到70～80％时，将培养基替换为胰岛细胞A1诱导液，继续培养24h后去除胰岛细胞A1诱导液，加入胰岛细胞A2诱导液持续诱导，每隔2～3天更换胰岛细胞A2诱导液，得到胰岛细胞；
其中，胰岛细胞A1诱导液包括H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及0.07‰(V/V)β-巯基乙醇；胰岛细胞A2诱导液包括DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL尼克酰胺。
2)胰岛细胞鉴定
取10μL双硫腙染色液与1mL胰岛细胞A2诱导液混合，为步骤1的1)中诱导的胰岛细胞进行染色鉴定，加入6孔板后于37℃孵箱中孵育30min，PBS洗3次，显微镜下观察诱导情况。
其中，双硫腙染色液由双硫腙粉末溶于二甲基亚砜中制得，浓度10mg/mL。
3)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
步骤同实施例1。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将步骤1的1)中获得的胰岛细胞消化离心，用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度6×106/mL，海藻酸钠终浓度3％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到直径100～300μm粗细均匀的凝胶纤维，弃掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，在平皿中用单面刀片将凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的3)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407和1％低交联透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制得的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶。
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度8×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度20％，HA终浓度0.8％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段5％，盐酸利多卡因2％，肿瘤坏死因子α单抗200mg/mL。
实施例4
1.细胞材料准备：
1)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
步骤同实施例1。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将人胎儿胰岛细胞消化离心，用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度4.5×106/mL，海藻酸钠终浓度1.6％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到直径100～300μm粗细均匀的凝胶纤维，弃掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，在平皿中用单面刀片将凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的1)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407和1％低交联透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制得的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶。
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度7.2×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度16％，HA终浓度0.7％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段4％，盐酸利多卡因1.5％，肿瘤坏死因子α单抗140mg/mL。
实施例5
1.细胞材料准备：
1)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养与形态鉴定
步骤同实施例1。
2.胰岛类似物(胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段)制备：
将新生猪胰岛细胞消化离心，用生理盐水混悬，加入5％海藻酸钠混合均匀，即得胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，细胞终浓度5×106/mL，海藻酸钠终浓度3％；将1.5％氯化钙溶液置于平皿中，用1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，通过30G针头在1.5％氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到直径100～300μm粗细均匀的凝胶纤维，弃掉1.5％氯化钙溶液，将凝胶纤维用生理盐水清洗3次，去除液体，在平皿中用单面刀片将凝胶纤维沿长轴截成小段，长度≤1mm，在平皿中加入1.5％氯化钙溶液，轻轻晃动使凝胶纤维段均匀分布，浸泡2min后，去除液体，用生理盐水清洗3次，100μm细胞筛网过滤，得到全部表面钙化的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段，作为胰岛类似物备用。
3.复合温敏凝胶配置：
将步骤1的1)中所得人脐静脉内皮细胞用生理盐水混悬，与25％P407和1％低交联透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀后，加入步骤2制得的胰岛细胞-海藻酸钠凝胶纤维段混匀，即得复合温敏凝胶。
其中，人脐静脉内皮细胞终浓度6.3×106/mL，血管内皮生长因子终浓度50ng/mL，bFGF终浓度10ng/mL，P407终浓度18％，HA终浓度0.72％，胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段2％，盐酸利多卡因1.9％，肿瘤坏死因子α单抗100mg/mL。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，其特征在于，所述温敏水凝胶由人脐静脉内皮细胞混悬液、终浓度为15～20％的P407和终浓度为0.6～0.8％的透明质酸钠的混合液、终浓度为50ng/mL的血管内皮生长因子、终浓度为10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、终浓度为0.5％～2％的盐酸利多卡因、终浓度为100～200mg/mL的肿瘤坏死因子α单抗和终浓度为2～5％的胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段混合而成；
其中，人脐静脉内皮细胞的终浓度为5～8×106/mL，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段为胰岛细胞、生理盐水和海藻酸盐混合制得的长度≤1mm、直径为100～300μm的凝胶纤维段。
2.根据权利要求1所述的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，其特征在于，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段中，胰岛细胞的终浓度为3～6×106/mL，海藻酸盐的终浓度1.5～3％。
3.根据权利要求1所述的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，其特征在于，人脐静脉内皮细胞和胰岛细胞均为低免疫原性细胞。
4.根据权利要求1所述的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶，其特征在于，所述胰岛细胞由脐带干细胞经胰岛细胞诱导液诱导得到。
5.权利要求1～4任意一项所述的一种具有糖尿病治疗作用的温敏水凝胶在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
6.一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒，其特征在于，包括无菌试剂和无菌耗材，所述无菌试剂包括生理盐水、海藻酸钠、氯化钙溶液、P407和透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗；所述无菌耗材包括1mL注射器、2mL注射器、30G针头、14G针头、单面刀片、平皿和100μm细胞筛网。
7.根据权利要求6所述的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒，其特征在于，还包括胰岛细胞诱导液和双硫腙染色液。
8.根据权利要求7所述的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒，其特征在于，所述胰岛细胞诱导液包括胰岛细胞A1诱导液和胰岛细胞A2诱导液，胰岛细胞A1诱导液由H-DMEM高糖培养基、1.2mg/mL尼克酰胺以及物质浓度为0.07‰的β-巯基乙醇构成，胰岛细胞A2诱导液由DMEM/F12高糖培养基、2％FBS、2％B27以及1.2mg/mL的尼克酰胺构成。
9.权利要求6～8任意一项所述的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒的使用方法，其特征在于，首先将胰岛细胞、生理盐水和海藻酸钠混合，得到胰岛细胞-海藻酸钠凝胶；其次将氯化钙溶液置于平皿中，用带有30G针头的1mL注射器吸取胰岛细胞-海藻酸钠凝胶，在氯化钙溶液中匀速挤出的同时平行画线，得到粗细均匀的凝胶纤维，生理盐水清洗，切段，加入氯化钙溶液进行钙化，再用生理盐水清洗，用100μm细胞筛网过滤，得到胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段；将胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段与人脐静脉内皮细胞、P407和透明质酸钠的混合液、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、盐酸利多卡因和肿瘤坏死因子-α单抗混匀，得到温敏水凝胶，最后用带有14G针头的2mL注射器将温敏水凝胶注射于糖尿病患者皮下。
10.根据权利要求9所述的一种具有糖尿病治疗作用的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述胰岛细胞-海藻酸凝胶纤维段为通过单面刀片截出的长度≤1mm的凝胶纤维。
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