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CN115521882B - 一种微升级单细胞液滴生成和培养方法以及装置 - Google Patents

一种微升级单细胞液滴生成和培养方法以及装置 Download PDF

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CN115521882B CN202110706877.2A CN202110706877A CN115521882B CN 115521882 B CN115521882 B CN 115521882B CN 202110706877 A CN202110706877 A CN 202110706877A CN 115521882 B CN115521882 B CN 115521882B
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Abstract

本申请公开了一种微升级单细胞液滴生成和培养方法，包括如下步骤：进样：将油相和水相输入微流控芯片内；制备液滴：在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；培养：培养所述初始液滴，得到培养后的液滴。本申请还提供一种微升级单细胞液滴生成和培养装置。本申请提供的单细胞液滴生成和培养方法以及装置，可以生成微升级别的单细胞液滴并在透气性良好的管道内进行培养。可培养常见的单细胞细菌和真菌。

Description

一种微升级单细胞液滴生成和培养方法以及装置
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种微升级单细胞液滴生成和培养方法以及生成和培养装置。
背景技术
工业生物技术中微生物细胞工厂被广泛应用于生产大宗、精细或特种化学品，药物以及应用于食品、饲料或技术应用的酶等物质。而天然分离的微生物由于产量低且对恶劣的工业条件耐受性差，很少直接用于工业规模的生产，需要开发出一些策略来获取具有更高性能的微生物细胞工厂。目前人们已经有很多方法来获取具有多样性的菌株文库，例如使用物理或化学手段进行随机诱变、实验室的适应性进化、定向进化或者基因片段随机组装的策略。而在面对一个大的菌株文库时，如何快速筛选微生物菌株的方法至关重要。
传统的微生物筛选一般是基于摇瓶、孔板和固体平板等培养方法，定时取样检测相关数据来对比菌株的性能。这个过程不仅操作繁琐，人力和物力消耗很大，而且通量都很低(103-104)，平行性也较差。因此需要开发一些高通量的培养和筛选方法来提高微生物菌株的筛选效率。现有的一些微生物高通量筛选技术包括使用菌落选择器(colony picker)和移液工作站(liquid handler)等仪器来自动化进行菌落挑取和移液等工作，其通量可达104-105；或者使用流式细胞仪或者液滴微流控技术进行筛选，其通量可达108-109。但是基于菌落选择器和移液工作站等仪器的方法不仅成本昂贵，而且囿于菌落挑取和移液等工作其通量很难得到进一步提高；基于流式细胞仪的方法不能进行胞外产物的检测；而基于液滴微流控技术的方法目前使用的液滴体积都特别小(nL或pL级别)，不仅对液滴可进行的操作和可检测的参数少，而且较难对微生物进行富集筛选。
而在工业生产中常见的微生物中，现有方法也存在一些问题，提高了自动化高通量筛选微生物的难度。例如放线菌和霉菌都是菌丝体结构，呈分支状，由很多细而长的菌丝交织组成。由于它们结构特殊，在培养和筛选放线菌和霉菌时会遇到许多问题，例如其培养液十分粘稠，难以搅拌；很难在固体平板上形成完整独立的单菌落并进行挑取；孢子容易飘散造成交叉污染；以及菌丝的存在使得一些参数如OD等难以测量。这些问题也会降低筛选效率。
专利文献WO2019233245A1于2019年公开了一种微液滴处理装置，可用于微生物液滴的培养。该装置可以实现通过微流控芯片装载数百个体积在0.5～10μL含有微生物的微液滴，通过在线连续培养、检测和分选，完成微生物的选育。该装置可以实现包括大肠杆菌、植物乳杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、酿酒酵母、毕赤酵母等多种微生物的自动化高通量在线培养和适应性进化。但是由于该装置是多细胞接种，无法进行微生物的单克隆筛选。
为了取代菌落挑取和移液等操作来实现微生物的自动化单克隆筛选，进一步提高筛选的通量和效率，同时又能解决放线菌和丝状真菌在培养中遇到的一些难题，因此需要一种新的技术。
发明内容
针对，本申请提供了一种微升级单细胞液滴生成和培养方法以及培养装置，该方法以及装置可以生成微升级别的单细胞液滴并在透气性良好的管道内进行培养。可培养常见的单细胞细菌和真菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母，以及丝状微生物如霉菌、放线菌等。
本申请提供如下技术方案。
1、一种微升级单细胞液滴生成和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
进样：将油相和水相输入微流控芯片内；
制备液滴：在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；
培养：培养所述初始液滴，得到培养后的液滴。
2、根据项1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片具有一条水相流道和两条油相流道，且水相流道位于两条油相之间，且相互连通，在制备液滴过程中，两条油相流道中油相将水相挤压成所述初始液滴。
3、根据项2所述的方法，其特征在于，为了生成微升级的单细胞液滴，所述水相在所述水相通道内的流速为abμL/s，每条油相通道中的油相流速为0.5abcμL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值。
4、根据项1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片具有相互连通的一条水相流道和一条油相流道，在制备液滴过程中，所述油相流道中油相将水相切割成所述初始液滴。
5、根据项4所述的方法，其特征在于，为了生成微升级的单细胞液滴，所述水相在所述水相流道内的流速为abμL/s，所述油相在所述油相流道内的流速为abcμL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值。
6、根据项2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述水相流道以及油相流道的横截面积均为0.1mm2-3mm2，优选为0.25mm2-1mm2。
7、根据项1所述的方法，其特征在于，所述培养后的液滴通过检测确认所述培养后的液滴中的成分。
8、根据项1所述的方法，其特征在于，所述水相为菌液，所述菌液选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、霉菌、放线菌中的一种。
9、一种微升级单细胞液滴生成和培养装置，其特征在于，包括：进样系统、微流控芯片以及液滴培养系统，其中，
所述进样系统，用于向微流控芯片进样水相和油相；
在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；
所述液滴培养系统，用于培养所述初始液滴。
10、根据项9所述的装置，其特征在于，所述进样系统分别与所述微流控芯片以及所述液滴培养系统连通；当所述初始液滴在所述液滴培养系统内培养结束后，所述进样系统控制所述液滴培养系统内的压强，将所述培养后的液滴驱出所述液滴培养系统。
11、根据项9所述的装置，其特征在于，所述进样系统包括储油容器、第一进样系统和第二进样系统，所述储油容器分别与所述第一进样系统以及所述第二进样系统连通，所述第一进样系统用于向所述微流控芯片输入油相，所述第二进样系统用于向所述微流控芯片输入水相。
12、根据项11所述的装置，其特征在于，所述第一进样系统包括第一动力源，所述第一动力源分别与储油容器以及微流控芯片连通；所述储油容器中的油相通过所述第一动力源进入所述微流控芯片中。
13、根据项11所述的装置，其特征在于，所述第二进样系统包括第二动力源以及进样瓶，所述第二动力源分别与储油容器和进样瓶连接，所述进样瓶还与微流控芯片连接；所述储油容器中的油相通过第二动力源进入所述进样瓶内，所述进样瓶内的水相被所述油相挤压出所述进样瓶，并进入所述微流控芯片中。
14、根据项11所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括液滴检测系统，其用于检测所述微流控芯片内的未培养的初始液滴或培养后的液滴。
15、根据项14所述的装置，其特征在于，所述微流控芯片包括基板、以及形成在所述基板内的多条流道。
16、根据项15所述的装置，其特征在于，所述基板具有通过所述流道连通的第一端口、第二端口、第三端口、第四端口以及第五端口；所述第二端口位于所述第一端口和第三端口之间。
17、根据项16所述的装置，其特征在于，连通所述第一端口的流道与连通所述第二端口的流道以及连通所述第三端口的流道交汇后，形成交汇流道，所述交汇流道的末端分成两支流道，一支通向第四端口，另一支通向所述第五端口；
所述第一端口以及第三端口均与所述第一动力源连通，所述第二端口与所述进样瓶连通，所述第四端口与所述液滴培养系统连通；所述水相通过第二端口进入所述微流控芯片的流道内，所述油相通过第一端口以及第三端口进入所述微流控芯片的流道内，然后所述水相以及油相在所述交汇流道相交，在所述交汇流道内所述油相将所述水相分割成油包水的初始液滴，所述初始液滴通过所述第四端口流入所述液滴培养系统。
18、根据项15所述的装置，其特征在于，所述基板具有通过所述流道连通的第六端口、第七端口、第八端口以及第九端口；所述第六端口与所述进样瓶连通用于输入水相，所述第七端口与所述第一动力源连通，用于输入油相，所述第八端口与所述液滴培养系统连通；
连通所述第六端口的流道与连通所述第七端口的流道交汇，且在靠近交汇处相互垂直。
19、根据项17或18所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括液滴收集系统，所述液滴收集系统与所述微流控芯片连通，所述液滴收集系统用于收集所述微流控芯片内的初始液滴或培养后的液滴；
所述第五端口或第九端口与液滴收集系统连通，且所述第五端口或第九端口与液滴收集系统之间的连通管上设置有控制阀，当所述控制阀开启，所述微流控芯片内的初始液滴或培养后的液滴通过所述连通管进入所述液滴收集系统。
20、根据项17或18所述的装置，其特征在于，与所述第五端口或第九端口连通的流道上设置有检测窗，所述液滴检测系统通过所述检测窗检测通过该流道的初始液滴或培养后的液滴。
21、根据项17或18所述的装置，其特征在于，所述液滴培养系统包括培养盘管、温控箱以及多通阀，所述培养盘管位于所述温控箱内，且所述培养盘管与所述多通阀以及微流控芯片连通，所述多通阀还与所述进样系统连通；当所述初始液滴进入所述培养盘管内后，所述温控箱提供所述初始液滴适合的培养温度，并且所述进样系统通过所述多通阀控制所述液滴培养系统内的压强，从而控制所述液滴培养系统内初始液滴或培养后的液滴的流向。
22、根据项21所述的装置，其特征在于，所述培养盘管的数量至少为一个，所述培养盘管的第一端与所述微流控芯片的第四端口或第八端口连通，所述培养盘管的第二端与所述多通阀连接。
23、根据项22所述的装置，其特征在于，所述多通阀上设置有第一连接口和第二连接口，所述第一连接口与所述储油容器连通，所述第二连接口与所述培养盘管的第二端连接。
24、根据项21所述的装置，其特征在于，所述培养盘管是通过培养管道绕圈盘旋形成圆饼状结构。
25、根据项19所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括控制系统，所述控制系统用于控制所述进样系统、微流控芯片、液滴培养系统、液滴检测系统以及液滴收集系统。
本申请提供的微升级单细胞液滴生成和培养方法，通过将油相和水相输入到所述微流控芯片中，并控制输入的水相和油相的流速，并在所述微流控芯片中油相将水相分割为多个单细胞初始液滴，然后所述初始液滴进入所述液滴培养系统中进行培养，由于水相为菌液，因此所述初始液滴为具有单个菌的液滴，具有单个菌的液滴在所述液滴培养系统中进行培养，培养结束后得到的培养后的液滴，培养后的液滴中含有单个菌生长代谢后的产物，培养后的液滴可以进行检测，通过检测可以确认该培养后的液滴中具体含有的成分。而且初始液滴也可以通过检测确认该液滴中的具体含有的细胞的种类或数量。
本申请提供的微升级单细胞液滴生成和培养装置，通过所述进样系统将油相和水相输入到所述微流控芯片中，并在所述微流控芯片中油相将水相分割为多个初始液滴，然后所述初始液滴进入所述液滴培养系统中进行培养，培养结束后，进样系统和多通阀配合控制所述液滴培养系统内的压力，将所述培养后的液滴压入所述微流控芯片中，然后液滴检测系统检测该培养后的液滴。
本申请提供的微升级单细胞液滴生成和培养装置，可以将单个微生物细胞封装在一个1～10μL左右的液滴中，以模拟微生物的单克隆菌落。由于已经实现液滴的自动化检测和操作，因此可以省去菌落挑取和移液等操作。同时液滴的培养不需要搅拌且互相隔离，因此每个单细胞液滴都是一个完整的单克隆菌落，且可以避免交叉污染，以此解决丝状微生物在培养中遇到的问题。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为本申请提供的单细胞液滴生成和培养装置的结构示意图。
图2为本申请提供的实施例1中单细胞液滴培养24h后液滴荧光表达情况。
图3为本申请提供的实施例1中单细胞液滴理论和实际液滴分布的对比图。
图4为本申请提供的实施例2中米曲霉孢子在液滴内的生长情况。
图5为本申请提供的进样系统的部分结构示意图。
图6为本申请提供的微流控芯片的结构示意图。
图7为本申请提供的培养盘管的结构示意图。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请提供一种微升级单细胞液滴生成和培养方法，包括如下步骤：
步骤一：进样，将油相和水相输入微流控芯片内；
步骤二：制备液滴，在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；
步骤三：培养，培养所述初始液滴，得到培养后的液滴。
所述微流控芯片中的水相流道可以为一条，油相流道可以是一条，也可以是两条。
如图6所示，当所述微流控芯片具有一条水相流道和两条油相流道，且水相流道位于两条油相之间，且相互连通，为了生成微升级的单细胞液滴，在制备液滴过程中，两条油相流道中油相将水相挤压成所述初始液滴。并且所述水相在所述水相流道内的流速为abμL/s，每条油相通道中的油相流速为0.5abcμL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值。
a的取值范围是1-10个/s，优选为1-5个/s；b的取值范围是0.1-10μL，优选为1-5μL；c的取值范围是1-15，优选为4-10。所述初始液滴的长度为0.1-10mm，优选为1-5mm。
水相菌液初始浓度为CFU/mL，其中λ为0.05-0.40。
例如当液滴体积b为2μL时，菌液初始浓度范围为25-200CFU/mL。
当所述微流控芯片具有相互连通的一条水相流道和一条油相流道，为了生成微升级的单细胞液滴，在制备液滴过程中，由于水相流道和油相流道垂直，所述油相流道中油相可以将水相切割成所述初始液滴。并且所述水相在所述水相流道内的流速为abμL/s，所述油相在所述油相流道内的流速为abcμL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值。
水相菌液初始浓度为CFU/mL，其中λ为0.05-0.40。
所述水相流道以及油相流道的横截面积均为0.1mm2-3mm2，优选为0.25mm2-1mm2。
在步骤二获得初始液滴后，所述初始液滴为微升级单细胞液滴，所述初始液滴可以进入液滴培养系统中进行培养。
关于初始液滴中是否包含有微升级单细胞液滴，根据泊松分布的模型计算确定本申请所述方法可以获得微升级单细胞液滴，然后检测所述培养后的液滴，看是否和模型计算的液滴数符合，从而可以以此来确定制备方法中的各项参数。
还可以通过对所述培养后的液滴进行测序来确定初始液滴是否为微升级单细胞液滴。
还可以采用的红绿荧光法验证所述培养后的液滴确定初始液滴是否为微升级单细胞液滴。
在步骤三中，当获得培养后的液滴后，可以通过液滴检测系统确认所述培养后的液滴中的成分。
所述水相为菌液，所述菌液中的菌选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、霉菌、放线菌中的一种。
参考图1、图5-图7，本申请提供一种微升级单细胞液滴生成和培养装置，包括进样系统、微流控芯片以及液滴培养系统，其中，所述进样系统分别与所述微流控芯片以及液滴培养系统连通，所述微流控芯片还与所述液滴培养系统连通；
所述进样系统，用于向微流控芯片进样水相和油相，并向所述液滴培养系统提供压力；当所述初始液滴在所述液滴培养系统内培养结束后，所述进样系统可以控制所述液滴培养系统内的压强，将所述培养后的液滴驱出所述液滴培养系统。
所述进样系统包括储油容器(所述储油容器内存储有油相，所述储油容器可以为油瓶)、第一进样系统和第二进样系统，所述储油容器分别所述第一进样系统与所述第二进样系统连通，所述第一进样系统用于向所述微流控芯片输入油相，所述第二进样系统用于向所述微流控芯片输入水相。
第一进样系统内各个部件均通过第一输液管连通，所述第一进样系统包括第一动力源，所述第一动力源通过第一输液管分别与储油容器以及微流控芯片连通；所述储油容器中的油相通过所述第一动力源进入所述微流控芯片中。
所述第一动力源与所述微流控芯片连通的第一输液管上设置有三通阀，所述三通阀的一个接口与所述第一动力源连通，其他两个接口分别通过所述第一输液管与所述微流控芯片连通。所述第一动力源为注射泵、蠕动泵、隔膜泵和/或柱塞泵，优先选取注射泵。
当需要向所述微流控芯片输入油相时，在第一注射泵的作用下，储油容器中的油通过第一输液管进入所述三通阀，进而分成两路进入所述微流控芯片中。
所述第二进样系统包括第二动力源和进样瓶，所述第二动力源分别与储油容器和进样瓶连接，所述进样瓶还与微流控芯片连接。具体地，第二进样系统内各个部件均通过第二输液管连通，所述第二动力源与所述进样瓶之间的第二输液管与所述进样瓶的顶部连通，所述进样瓶内还设置有进样管，所述进样管的底端伸入进样瓶底部，所述进样管的顶端伸出所述进样瓶与连通所述微流控芯片的所述第二输液管连接。
所述第二动力源为注射泵、蠕动泵、隔膜泵和/或柱塞泵，优先选取注射泵。
当需要水相进样时，在所述第二注射泵的作用下，储油容器中的油通过第二输液管进入所述进样瓶的顶部，由于所述进样瓶中的水相与所述油相不互溶，因此在油相的挤压下，所述进样瓶中的水相通过所述进样管被挤压出所述进样瓶，从而进入连通所述微流控芯片的所述第二输液管，进而进入所述微流控芯片内。
所述进样瓶的数量可以为多个，多个所述进样瓶串联。每个进样瓶内放置有一个搅拌子和瓶下放置一个搅拌器，用于向微液滴处理装置中进样水相。若干个进样瓶串联可以提供足够的水相。进样瓶附加搅拌子和搅拌器的目的是为了充分搅拌水相，使得内容物分散均匀。进样瓶的体积为10-16mL，搅拌子的形状为梭型，横截最大直径为4-8mm，长1-2cm，搅拌器转速为250-400rpm。
所述第一动力源以及第二动力源均为注射泵时，所述注射泵的量程可以为1mL。
所述液滴检测系统，用于检测培养后的液滴。
所述液滴检测系统包括光纤光谱仪、卤素光源和激光光源，卤素光源和激光光源产生光信号，光纤光谱仪收光信号并处理。卤素光源和光纤光谱仪组合可测OD，激光光源和光纤光谱仪组合可测荧光。
所述微流控芯片，由进入所述微流控芯片内的油相将进入所述微流控芯片内的水相分割成多个初始液滴；
所述微流控芯片由两种结构，第一种是所述微流控芯片内有两条油相流道，第二种是所述微流控芯片内有一条油相流道。
第一种所述微流控芯片的具体结构为：所述微流控芯片包括基板、以及形成在所述基板内的多条流道，所述基板具有通过所述流道连通的第一端口、第二端口、第三端口、第四端口以及第五端口；所述第二端口位于所述第一端口和第三端口之间。
连通所述第一端口的流道与连通所述第二端口的流道以及连通所述第三端口的流道交汇后，形成交汇流道，所述交汇流道的末端分成两支流道，一支通向第四端口，另一支通向所述第五端口。即所述微流控芯片内设置的流道分别为a流道、b流道、c流道、d流道、e流道、f流道，a流道与所述第一端口连通，b流道与所述第二端口连通、c流道与第三端口连通，d流道为a流道、b流道、c流道交汇后的流道(交汇流道)，d流道分别与e流道以及f流道连通，且所述e流道与所述第四端口连通，f流道与第五端口连通。所述a流道、b流道、c流道形成类“山”字形流道。
所述第一端口以及第三端口均通过第一输液管与所述第一动力源(第一注射泵)连通，所述第二端口通过第二输液管与所述进样瓶连通，所述第四端口与所述液滴培养系统(培养盘管)连通，所述第五端口与液滴收集系统通过第五输液管连通，且所述第五输液管上设置有控制阀。与所述第五端口连通的流道上设置有检测窗(在所述f流道上设置有检测窗，所述检测窗为透明材料制成)，所述液滴检测系统通过所述检测窗检测通过该流道的液体。
油相通过第一端口和第三端口进入所述a流道和c流道，水相通过所述第二端口进入所述b流道，并且在所述a流道、b流道以及c流道交汇处，a流道的油相和c流道的油相将b流道的油相切断，形成多个单细胞液滴，多个所述单细胞液滴进入所述d流道，然后经过所述d流道，由于所述第五端口处的控制阀关闭，所述液滴首先进入所述e流道，从而进入所述液滴培养系统中，进行培养，培养结束后，调整多通阀，同时打开所述控制阀，液滴依次经过所述e流道、f流道、第五端口，从而进入液滴收集系统。液滴在经过所述f流道处的检测窗时，通过所述液滴检测系统通过所述检测窗可以检测通过该流道的液滴。
第二种所述微流控芯片的具体结构为：所述微流控芯片包括基板、以及形成在所述基板内的多条流道，所述基板具有通过所述流道连通的第六端口、第七端口、第八端口以及第九端口；所述第六端口与所述进样瓶连通用于输入水相，所述第七端口与所述第一动力源连通，用于输入油相，所述第八端口与所述液滴培养系统连通；连通所述第六端口的流道与连通所述第七端口的流道交汇，且在靠近交汇处相互垂直。
在一个具体实施方式中，所述微流控芯片内设置的流道分别与第六端口连通的水相流道、与第七端口连通的油相流道以及液滴流道，且所述水相流道与所述油相流道垂直且交汇，交汇后的流道为液滴流道，所述液滴流道的末端分为两个支路流道，第一个支路流道与所述第八端口连通，从而与所述液滴培养系统连通，第二支路流道与所述第九端口连通。
所述第七端口通过第一输液管与所述第一动力源(第一注射泵)连通，所述第六端口通过第二输液管与所述进样瓶连通，所述第八端口与所述液滴培养系统(培养盘管)连通，所述第九端口与液滴收集系统通过第五输液管连通，且所述第五输液管上设置有控制阀。与所述第九端口连通的第二支路流道上设置有检测窗，所述液滴检测系统通过所述检测窗检测通过该流道的液体。
油相通过第七端口进入所述油相流道，水相通过所述第六端口进入所述水相流道，油相和水相在液滴流道的起始端交汇，并且油相将水相切割成多个所述单细胞初始液滴，所述初始液滴在液滴流道内流动，由于所述第九端口处的控制阀关闭，所述初始液滴首先进入所述第一支路流道，从而进入所述液滴培养系统中，进行培养，培养结束后，调整多通阀，同时打开所述控制阀，所述培养后的液滴依次经过所述第一支路流道、第二支路流道、第九端口，从而进入液滴收集系统。液滴在经过所述第二支路流道处的检测窗时，通过所述液滴检测系统通过所述检测窗可以检测通过该流道的液滴。
上述两种微流控芯片的基板均由玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)形成，优选为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。流道截面形状可选圆形、矩形、椭圆形等任何便于成型及便于液滴流通的形状。所述流道的横截面积的范围为0.1mm2-3mm2，优选为0.25-1mm2。
所述液滴培养系统，用于将从所述微流控芯片进入所述液滴培养系统的初始液滴进行培养，并将培养后的液滴输入所述微流控芯片；所述液滴培养系统包括培养盘管、温控箱以及多通阀，所述培养盘管位于所述温控箱内，且所述培养盘管与所述多通阀以及微流控芯片连通，所述多通阀还与所述进样系统连通；通过所述温控箱可以维持所述培养盘管内液滴中菌落的生长；
所述培养盘管的数量至少为一个，所述培养盘管的第一端通过第三输液管与所述微流控芯片洗液的第四端口或第八端口连接，所述培养盘管的第二端与所述多通阀连接。
所述培养盘管的数量可以根据实际需要来设置，而且多个培养盘管并联，每一个培养盘管可以用来培养一种菌，因此本申请的装置可以同时培养多种菌。由于所述培养盘管是通过培养管道绕圈盘旋形成圆饼状结构(包括但不仅限于此)，因此，每个培养盘管均可以存放大量液滴，而且所述培养盘管占地面积较小。
多通阀上设置有第一连接口和第二连接口，所述第一连接口通过第四输液管与所述储油容器连通，所述第二连接口与所述培养盘管的第二端连接。多通阀上的第二连接口的数量可以多个，且所述第二连接口的数量不小于所述培养盘管的数量，每一个培养盘管对应一个第二连接口，通过所述多通阀可以控制所述培养盘管的开闭，也可以控制所述培养盘管内的压强，进而可以控制培养盘管内液滴的流向。
在图1中，所述多通阀上设置有12个第二连接口，12个所述第二连接口连接有12个培养盘管连接，培养盘管与第二连接口之间的连接管上均设置有阀门，通过所述阀门可以控制其培养盘管与所述多通阀连通或关闭。
所述第一连接口上设置有阀门，所述第一连接口通过第四输液管与所述储油容器连通，当所述培养盘管内的液滴培养结束后，打开所述第一连接口上的阀门，所述储油容器内的油通过所述第四输液管向所述多通阀方向流动，培养盘管内的液滴受到来自多通阀方向的压力，使得所述培养盘管内的液滴向所述微流控芯片流动，从而所述液滴进入所述微流控芯片后，通过f流道或第一支路流道进行检测或进入所述液滴收集系统。
培养盘管的材料选取为透气性好的聚四氟乙烯(PTFE)管道，其外径为1.67±0.20mm，内径为1.07±0.20mm。培养盘管制作方法为将8-10m的聚四氟乙烯(PTFE)管道单层紧密盘列在直径为150mm的培养皿中。首先在培养皿底部用6道双面胶定位，然后将聚四氟乙烯(PTFE)管道逐圈贴在培养皿上，然后用热熔胶枪涂上6道热熔胶作最终固定。
为了提高液滴储存和培养的通量，液滴培养系统中可将若干个培养盘管并联，选取对应数量的多通阀门，可以一次性在若干个培养盘管中生成液滴。培养盘管都置于控温箱中。控温箱包括温度传感器以及控温构件等，温度控制在10～50℃的范围内，温度波动范围控制在±0.5℃以内。
所述液滴收集系统，所述液滴收集系统与所述微流控芯片连通，所述液滴收集系统用于收集所述微流控芯片内的初始液滴或培养后的液滴；所述液滴收集系统包括孔板和废液瓶，所述f流道或第二支路流道连接的第五输液管分成两支，一支与所述孔板连通，另一支与所述废液瓶连通，且每一支输液管上均设置有控制阀。
所述装置还包括控制系统，所述控制系统用于控制所述进样系统、微流控芯片、液滴培养系统、液滴检测系统以及液滴收集系统。
所述控制系统包括控制器和PC机显示控制系统；
所述控制器分别连接进样系统、微流控芯片、液滴培养系统、液滴检测系统以及液滴收集系统，通过控制系统中的数字电路进行控制；
所述PC机显示控制系统对进样系统、微流控芯片、液滴培养系统、液滴检测系统以及液滴收集系统的信息进行显示、储存与分析。
本申请中的第一输液管、第二输液管、第三输液管、第四输液管以及第五输液管均为硬质管道，进一步优选为聚四氟乙烯管(PTFE管)、全氟丙基全氟乙烯基醚与聚四氟乙烯的共聚物管(PFA管)、聚醚醚酮管(PEEK管)、聚碳酸酯管(PC管)、聚苯乙烯管(PS管)中的任一种。
所述输液管的管径为0.5～2mm。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
单细胞液滴的生成以及验证原理在之前的材料中有所描述。在本实施例中，微流控芯片为具有两个油相流道的结构，我们设定液滴生成速度为2个/s，液滴体积为2μL，液滴之间的间隔为8倍液滴体积，此时水相进入所述微流控芯片中的流速为4μL/s，单个油相进入所述微流控芯片中的流速为16μL/s。
使用E.coli BL21(DE3)pET21b-mCherry(红色荧光菌)和E.coli BL21(DE3)pET23a-sfGFP(绿色荧光菌)，过夜培养16h后，使用LB培养基分别逐级稀释约107和106倍后，涂板计数的结果为E.coli BL21(DE3)pET21b-mCherry的菌体浓度为46CFU/mL，E.coliBL21(DE3)pET23a-sfGFP的菌体浓度39CFU/mL。将两种稀释后的菌液按照1：1的体积比混合后，可计算得到λ＝0.086。
进样系统中选取的第一动力源以及第二动力源均为注射泵，量程为1mL。进样瓶的体积为14mL，搅拌子的形状为梭型，横截最大直径为5mm，长1.5cm，搅拌器转速选为300rpm。准备1：1的体积比混合后的菌液约10mL注入进样瓶，将所述第二进样系统中的注射泵注射6-8次，生成约2180个液滴，储存在4个培养盘管里。之后将培养盘管放置在37℃恒温培养箱静置培养24h，并观察荧光情况。其结果如图2所示。图2中，图(a)表示培养0h和24h后单细胞液滴内菌体的荧光表达情况，图(b)表示培养24h后所有液滴的荧光结果，其中红圈中是红色荧光单细胞液滴，绿圈中是绿色荧光单细胞液滴，棕圈中是红绿混合荧光液滴。通过对液滴进行计数，并且和理论液滴分布(λ＝0.086)进行对比，对比结果如图3所示。结果显示实际的液滴分布和理论计算得到的液滴分布十分接近，这说明此方法可以实现单细胞液滴的生成。
实施例2：米曲霉(丝状真菌)的培养
米曲霉是丝状真菌，为了观察米曲霉在液滴内的生长情况，如米曲霉是否能在液滴内正常生长、长出来的菌丝会不会破坏液滴形态等。我们对米曲霉的孢子进行了逐级稀释，稀释后的孢子浓度为500CFU/mL使得其孢子浓度满足λ＝1的条件。采用和实施例1中所述的相同的装置，生成了约2000个液滴。之后将培养盘管取出，放置在30℃恒温培养箱静置培养，并用显微镜定时观察液滴内米曲霉的生长情况，结果如图4所示。米曲霉可以在微升级别液滴中正常生长，随着时间的推移，液滴内菌丝数量逐渐增多。约在33-37h内，菌丝开始延伸出液滴。为了保证液滴形态的稳定以及防止菌丝扩散到液滴外造成交叉污染，此后可以考虑在合适的时间内培养米曲霉。此结果表明此装置具有实现米曲霉单细胞液滴的培养和筛选的潜力。
实施例3
以E.coli MG1655(大肠杆菌)为对象探究油相速度、水相速度以及流道截面积对液滴生成的影响。采用和实施例1中所述的相同的装置，先在摇瓶中培养E.coli MG1655约16h后，使用LB培养基逐级稀释约107倍，得到浓度约为50CFU/mL的菌液。用此菌液在装置中使用不同的油相速度、水相速度以及流道截面积等条件来生成和培养液滴，详情见表1。
实施例4-5与实施例3的不同之处在于油相流速不同，其余参数均相同，详情见表1。
实施例6-7与实施例3的不同之处在于水相流速不同，其余参数均相同，详情见表1。
实施例8-9与实施例3的不同之处在于流道的横截面积，其余参数均相同，详情见表1。
表1
注：泊松分布的参数λ为0.1。
小结：根据泊松分布的原理，当λ在0.1时，理论上体系中空初始液滴占90.1％左右，单细胞初始液滴占9.1％左右，多细胞初始液滴占比很少，因此一般采用此条件来确定菌液浓度和初始液滴体积。同时为了初始液滴能够稳定进行培养，初始液滴长度和初始液滴之间的间隔需要适宜。初始液滴长度和初始液滴间隔太大，则单位长度管道容纳的初始液滴较少，减少了整体的初始液滴通量。如果初始液滴长度太小，不能容纳太多细胞，不宜进行长时间培养；如果初始液滴间隔太小，初始液滴易融合。只要初始液滴能稳定培养，细胞都能在初始液滴中正常生长。根据以上所述原则来评判本申请的实施例，由上述表格可知，在相同的菌液下，本申请的实施例3-实施例9生成的初始液滴中，单细胞的初始液滴的百分比较高，而且稳定性较好，尤其实施例3生成的初始液滴中的单细胞初始液滴的百分比与理论值接近，而且相邻两个初始液滴之间的间隔合适，初始液滴的稳定性较好。而对比例中，对比例1和对比例3的初始液滴长度很小，不宜进行长时间培养。对比例2和对比例4因为油相速度太小，使得水相不能被正常分割，初始液滴不能正常生成。对比例5中，初始液滴的长度和间隔太大，使得液滴生成通量很低；对比例6中的初始液滴的长度和间隔太小，生成的初始液滴易融合，无法稳定培养。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (21)

1.一种微升级单细胞液滴生成和培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
进样：将油相和水相输入微流控芯片内；
制备液滴：在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；
培养：培养所述初始液滴，得到培养后的液滴；
所述微流控芯片具有一条水相流道和两条油相流道，且水相流道位于两条油相之间，且相互连通，在制备液滴过程中，两条油相流道中油相将水相挤压成所述初始液滴；为了生成微升级的单细胞液滴，所述水相在所述水相通道内的流速为ab μL/s，每条油相通道中的油相流速为0.5abc μL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值；
a的取值范围是1-10个/s；b的取值范围是0.1-10μL；c的取值范围是1-15；所述初始液滴的长度为0.1-10 mm；
水相菌液初始浓度为CFU/mL，其中λ为0.05 - 0.40。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相流道以及油相流道的横截面积均为0.1 mm2-3 mm2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相流道以及油相流道的横截面积均为0.25mm2-1 mm2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相为菌液，所述菌液中的菌选自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、霉菌、放线菌中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养后的液滴通过检测确认所述培养后的液滴中的成分。
6.一种微升级单细胞液滴生成和培养装置，其特征在于，包括：进样系统、微流控芯片以及液滴培养系统，其中，
所述进样系统，用于向微流控芯片进样水相和油相；
在所述微流控芯片内油相将水相分割成多个初始液滴，所述初始液滴包含有微升级的单细胞液滴；
所述液滴培养系统，用于培养所述初始液滴；
所述微流控芯片具有一条水相流道和两条油相流道，且水相流道位于两条油相之间，且相互连通，在制备液滴过程中，两条油相流道中油相将水相挤压成所述初始液滴；为了生成微升级的单细胞液滴，所述水相在所述水相通道内的流速为ab μL/s，每条油相通道中的油相流速为0.5abc μL/s，其中，a为所述初始液滴生成的速度，单位为个/s，b为所述初始液滴的体积，单位为μL；c为两个初始液滴之间的间隔和单个初始液滴的长度的比值；
a的取值范围是1-10个/s；b的取值范围是0.1-10μL；c的取值范围是1-15；所述初始液滴的长度为0.1-10 mm；
水相菌液初始浓度为CFU/mL，其中λ为0.05 - 0.40。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述进样系统分别与所述微流控芯片以及所述液滴培养系统连通；当所述初始液滴在所述液滴培养系统内培养结束后，所述进样系统控制所述液滴培养系统内的压强，将培养后的液滴驱出所述液滴培养系统。
8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述进样系统包括储油容器、第一进样系统和第二进样系统，所述储油容器分别与所述第一进样系统以及所述第二进样系统连通，所述第一进样系统用于向所述微流控芯片输入油相，所述第二进样系统用于向所述微流控芯片输入水相。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述第一进样系统包括第一动力源，所述第一动力源分别与储油容器以及微流控芯片连通；所述储油容器中的油相通过所述第一动力源进入所述微流控芯片中。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述第二进样系统包括第二动力源以及进样瓶，所述第二动力源分别与储油容器和进样瓶连接，所述进样瓶还与微流控芯片连接；所述储油容器中的油相通过第二动力源进入所述进样瓶内，所述进样瓶内的水相被所述油相挤压出所述进样瓶，并进入所述微流控芯片中。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括液滴检测系统，其用于检测所述微流控芯片内的未培养的初始液滴或培养后的液滴。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，所述微流控芯片包括基板、以及形成在所述基板内的多条流道。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述基板具有通过所述流道连通的第一端口、第二端口、第三端口、第四端口以及第五端口；所述第二端口位于所述第一端口和第三端口之间；连通所述第一端口的流道与连通所述第二端口的流道以及连通所述第三端口的流道交汇后，形成交汇流道，所述交汇流道的末端分成两支流道，一支通向第四端口，另一支通向所述第五端口；
所述第一端口以及第三端口均与所述第一动力源连通，所述第二端口与所述进样瓶连通，所述第四端口与所述液滴培养系统连通；所述水相通过第二端口进入所述微流控芯片的流道内，所述油相通过第一端口以及第三端口进入所述微流控芯片的流道内，然后所述水相以及油相在所述交汇流道相交，在所述交汇流道内所述油相将所述水相分割成油包水的初始液滴，所述初始液滴通过所述第四端口流入所述液滴培养系统。
14.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述基板具有通过所述流道连通的第六端口、第七端口、第八端口以及第九端口；所述第六端口与所述进样瓶连通用于输入水相，所述第七端口与所述第一动力源连通，用于输入油相，所述第八端口与所述液滴培养系统连通；
连通所述第六端口的流道与连通所述第七端口的流道交汇，且在靠近交汇处相互垂直。
15.根据权利要求13或14所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括液滴收集系统，所述液滴收集系统与所述微流控芯片连通，所述液滴收集系统用于收集所述微流控芯片内的初始液滴或培养后的液滴；
所述第五端口或第九端口与液滴收集系统连通，且所述第五端口或第九端口与液滴收集系统之间的连通管上设置有控制阀，当所述控制阀开启，所述微流控芯片内的初始液滴或培养后的液滴通过所述连通管进入所述液滴收集系统。
16.根据权利要求13或14所述的装置，其特征在于，所述第五端口或第九端口连通的流道上设置有检测窗，所述液滴检测系统通过所述检测窗检测通过该流道的初始液滴或培养后的液滴。
17.根据权利要求13或14所述的装置，其特征在于，所述液滴培养系统包括培养盘管、温控箱以及多通阀，所述培养盘管位于所述温控箱内，且所述培养盘管与所述多通阀以及微流控芯片连通，所述多通阀还与所述进样系统连通；当所述初始液滴进入所述培养盘管内后，所述温控箱提供所述初始液滴适合的培养温度，并且所述进样系统通过所述多通阀控制所述液滴培养系统内的压强，从而控制所述液滴培养系统内初始液滴或培养后的液滴的流向。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述培养盘管的数量至少为一个，所述培养盘管的第一端与所述微流控芯片的第四端口或第八端口连通，所述培养盘管的第二端与所述多通阀连接。
19.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述多通阀上设置有第一连接口和第二连接口，所述第一连接口与所述储油容器连通，所述第二连接口与所述培养盘管的第二端连接。
20.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述培养盘管是通过培养管道绕圈盘旋形成圆饼状结构。
21.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述培养装置还包括控制系统，所述控制系统用于控制所述进样系统、微流控芯片、液滴培养系统、液滴检测系统以及液滴收集系统。
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